Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Visualisatie van inflammatoire caspasen geïnduceerde nabijheid in menselijke monocyt-afgeleide macrofagen

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63162
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology, Department of Molecular and Cellular Biology, Texas Children’s Hospital William T. Shearer Center for Human Immunobiology, Baylor College of Medicine

Summary

Dit protocol beschrijft de workflow om monocyten-afgeleide macrofagen (MDM) te verkrijgen uit menselijke bloedmonsters, een eenvoudige methode om inflammatoire caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) -verslaggevers efficiënt in menselijke MDM te introduceren zonder de levensvatbaarheid en het gedrag van cellen in gevaar te brengen, en een op beeldvorming gebaseerde benadering om inflammatoire caspase-activering in levende cellen te meten.

Abstract

Inflammatoire caspasen omvatten caspase-1, -4, -5, -11 en -12 en behoren tot de subgroep van initiator caspasen. Caspase-1 is vereist om een correcte regulatie van inflammatoire signalering te garanderen en wordt geactiveerd door nabijheidsgeïnduceerde dimerisatie na rekrutering voor inflammasomen. Caspase-1 is overvloedig aanwezig in de monocytische cellijn en induceert rijping van de pro-inflammatoire cytokines interleukine (IL)-1β en IL-18 tot actieve uitgescheiden moleculen. De andere inflammatoire caspasen, caspase-4 en -5 (en hun murine homolog caspase-11) bevorderen il-1β afgifte door pyroptose te induceren. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is een hulpmiddel dat wordt gebruikt om inflammatoire caspase geïnduceerde nabijheid te meten als een uitlezing van caspase-activering. Het caspase-1, -4 of -5 prodomein, dat het gebied bevat dat zich bindt aan het inflammasoom, is gefuseerd met niet-fluorescerende fragmenten van het gele fluorescerende eiwit Venus (Venus-N [VN] of Venus-C [VC]) die zich associëren om het fluorescerende Venus-complex te hervormen wanneer de caspasen geïnduceerde nabijheid ondergaan. Dit protocol beschrijft hoe deze verslaggevers kunnen worden geïntroduceerd in primaire menselijke monocyt-afgeleide macrofagen (MDM) met behulp van nucleofection, de cellen kunnen worden behandeld om inflammatoire caspase-activering te induceren en caspase-activering te meten met behulp van fluorescentie en confocale microscopie. Het voordeel van deze aanpak is dat het kan worden gebruikt om de componenten, vereisten en lokalisatie van het inflammatoire caspase-activeringscomplex in levende cellen te identificeren. Er moeten echter zorgvuldige controles worden overwogen om te voorkomen dat de levensvatbaarheid en het gedrag van cellen in gevaar komen. Deze techniek is een krachtig hulpmiddel voor de analyse van dynamische caspase-interacties op inflammasoomniveau en voor de ondervraging van de inflammatoire signaalcascades in levende MDM en monocyten afgeleid van menselijke bloedmonsters.

Introduction

De caspasen zijn een familie van cysteïne aspartaat proteasen die kunnen worden gegroepeerd in initiator caspasen en beul caspasen. Beul caspasen bestaan uit caspase-3, -6 en -7. Ze komen van nature voor in cellen als dimeren en worden door de initiator caspasen gesplitst om apoptose1 uit te voeren. Initiator caspasen omvatten human caspase-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 en -12. Ze worden gevonden als inactieve zymogenen (pro-caspasen) die worden geactiveerd door nabijheidsgeïnduceerde dimerisatie en gestabiliseerd door auto-proteolytische splitsing 2,3. De inflammatoire caspasen zijn een subset van de initiator caspasen2 en omvatten caspase-1, -4, -5 en -12 bij mensen, en caspase-1, -11 en -12 bij muis 4,5. In plaats van een apoptotische rol, spelen ze een centrale rol bij ontstekingen. Ze bemiddelen proteolytische verwerking en secretie van pro-interleukine (IL)-1β en pro-IL-18 6,7, de eerste cytokines die vrijkomen als reactie op pathogene indringers 8,9. Caspase-1 wordt geactiveerd bij werving op zijn activeringsplatform; een eiwitcomplex met een groot molecuulgewicht dat het inflammasoom wordt genoemd (figuur 1A)10. Dimerisatie van caspase-4, -5 en -11 vindt onafhankelijk van deze platforms plaats via een niet-canonieke inflammasoomroute11,12.

Canonieke inflammasomen zijn cytosolische multimere eiwitcomplexen die bestaan uit een inflammasoomsensoreiwit, het adaptoreiwit ASC (apoptose-geassocieerd speck-achtig eiwit dat een CARD bevat) en het effectoreiwit caspase-110. De best bestudeerde canonieke inflammasomen zijn de NOD-achtige receptorfamilie met een pyrinedomein (NLRP), NLRP1 en NLRP3, de NLR-familie met een CARD (NLRC), NLRC4 en de afwezige in melanoom 2 (AIM2). Ze bevatten elk een pyrinedomein, een CARD of beide domeinen. Het CARD-domein bemiddelt de interactie tussen CARD-bevattende caspasen en hun upstream activators. Daarom is het steigermolecuul ASC, dat bestaat uit een N-terminal pyrinedomein (PYD) en een C-terminal CARD-motief13,14, vereist voor de rekrutering van caspase-1 voor deNLRP1 10, NLRP315 en AIM216 inflammasomen.

Elk inflammasoom is vernoemd naar zijn unieke sensoreiwit dat verschillende pro-inflammatoire stimuli herkent (figuur 1B). Activatoren van deze route worden canonieke stimuli genoemd. Inflammasomen dienen als sensoren voor microbiële componenten en weefselstress en assembleren om een robuuste ontstekingsreactie te veroorzaken door activering van de inflammatoire caspasen17. Inflammasoomassemblage initieert caspase-1-activering om rijping en secretie van de belangrijkste substraten pro-IL-1β en pro-IL-18 te bemiddelen. Dit proces verloopt via een mechanisme in twee stappen. Ten eerste upreguleert een priming stimulus de expressie van bepaalde inflammasoomeiwitten en pro-IL-1β door activering van de NF-κB-route. Ten tweede induceert een intracellulaire (canonieke) stimulus inflammasoomassemblage en rekrutering van procaspase-1 6,7.

Caspase-4 en caspase-5 zijn de menselijke orthologen van murine caspase-1111. Ze worden op een inflammasoomonafhankelijke manier geactiveerd door intracellulair lipopolysaccharide (LPS), een molecuul dat wordt aangetroffen in het buitenmembraan van Gram-negatieve bacteriën 18,19,20, en door extracellulair heem, een product van hemolyse van rode bloedcellen 21. Er is voorgesteld dat LPS zich rechtstreeks bindt aan het CARD-motief van deze eiwitten en hun oligomerisatie induceert20. Activering van caspase-4 of caspase-5 bevordert de afgifte van IL-1β door het induceren van een inflammatoire vorm van celdood die pyroptose wordt genoemd door splitsing van het porievormende eiwit gasdermin D (GSDMD)18,19. Bovendien induceert de efflux van kaliumionen als gevolg van caspase-4 en GSDMD-gemedieerde pyroptotische dood activering van het NLRP3-inflammasoom en daaropvolgende activering van caspase-1 22,23. Daarom worden caspase-4, -5 en -11 beschouwd als intracellulaire sensoren voor LPS die pyroptose en caspase-1-activering kunnen induceren als reactie op specifieke stimuli11,24.

Figure 1
Figuur 1: Inflammatoire caspasen en caspase-bimoleculaire fluorescentiecomplementatie (BiFC) assay. (A) Diagram met het caspase-BiFC-systeem, waarbij twee caspase-1 prodomeinen (C1-pro) gekoppeld aan elk niet-fluorescerend fragment van Venus (Venus-C of Venus-N) worden gerekruteerd naar het NLRP3-activeringsplatform, waardoor Venus wordt gedwongen om opnieuw te vouwen en te fluoresceren. Dit complex verschijnt als een groene vlek onder de microscoop en dient als een uitlezing voor inflammatoire caspase-geïnduceerde nabijheid, wat de eerste stap is in initiator caspase-activering. (B) Schema dat de domeinorganisatie van inflammasoomcomponenten en inflammatoire caspasen weergeeft. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het meten van specifieke initiator caspases activering is moeilijk, en er zijn niet veel methoden beschikbaar om dit te doen door middel van imaging benaderingen. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) kan worden gebruikt om inflammatoire caspase-activering direct in levende cellen te visualiseren (figuur 1A)25. Deze techniek is onlangs aangepast voor gebruik in menselijke monocyten-afgeleide macrofagen (MDM)21. Caspase BiFC meet de eerste stap in inflammatoire caspase-activering, geïnduceerde nabijheid om dimerisatie te vergemakkelijken. Expressie van plasmiden die coderen voor het CARD-bevattende caspase-prodomein gefuseerd tot niet-fluorescerende fragmenten van het fotostabiele gele fluorescerende eiwit Venus (Venus-C [VC]) en Venus-N [VN]) worden gebruikt. Wanneer de twee caspase-prodomeinen worden gerekruteerd naar hun activeringsplatform of geïnduceerde nabijheid ondergaan, worden de twee helften van Venus in de nabijheid gebracht en gedwongen om opnieuw te vouwen en te fluoresceren (zie figuur 1A,B). Dit biedt een real-time uitlezing van specifieke inflammatoire caspase-activering.

Menselijke MDM brengt overvloedig inflammasoomgenen en patroonherkenningsreceptoren tot expressie die gevaarsignalen en pathogene producten identificeren. Dit biedt een ideaal celtype voor de ondervraging van inflammatoire caspase-routes. Bovendien kunnen ze worden afgeleid uit perifeer bloed en zelfs uit patiëntmonsters om inflammatoire caspase-activering in een specifieke ziektetoestand te beoordelen. Dit protocol beschrijft hoe de BiFC caspase-verslaggevers in MDM kunnen worden geïntroduceerd met behulp van nucleofection, een op elektroporatie gebaseerde transfectiemethode, hoe de cellen moeten worden behandeld om inflammatoire caspase-activering te induceren en hoe de actieve caspase-complexen kunnen worden gevisualiseerd met behulp van microscopiebenaderingen. Bovendien kan deze methodologie worden aangepast om de moleculaire samenstelling van deze complexen, subcellulaire lokalisatie, kinetiek en grootte van deze zeer geordende structuren te bepalen 25,26,27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dit protocol volgt de richtlijnen van de ethische commissie voor menselijk onderzoek van Baylor College of Medicine voor de manipulatie van menselijke monsters. Bloedmonsters worden behandeld volgens de institutionele veiligheidsrichtlijnen voor menselijke monsters. Bloedmonsters worden verkregen bij een regionale bloedbank, waar ze worden verzameld met citraatfosfaat dextrose (CPD) oplossing. Bloed verzameld met andere anticoagulantia zoals natriumheparine, lithiumheparine of EDTA kan echter ook worden gebruikt voor dit protocol28,29.

1. Isolatie van menselijke monocyten en differentiatie in macrofagen

  1. Verkrijg antistollingsbloed van niet-geïdentificeerde gezonde personen bij een regionale bloedbank en isoleer perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) zoals hieronder aangegeven.
    OPMERKING: Voer alle stappen uit in een weefselkweek laminaire flow hood. Gebruik alleen steriele buizen en draag handschoenen. Voeg 10% bleekmiddel toe aan alle bloedgerelateerde producten bij het weggooien. Steriel PBS (1x) of DPBS (zonder Ca2+ en Mg2+) kan door elkaar worden gebruikt.
    1. Bereid de verdunningsbuffer voor: Vul 1x steriel PBS aan met 2% FBS en 0,5 mM EDTA.
    2. Bereid het kweekmedium voor: Supplement RPMI-1640 medium met FBS (10% (v/v)), glutamax (2 mM) en Penicilline/Streptomycine (50 I.U./50 μg/ml)
    3. Onderkoel de lopende buffer (Tabel met materialen) volgens het protocol van de fabrikant.
    4. Verdun volbloed met twee volumes verdunningsbuffer. Breng met behulp van een serologische pipet 15 ml van het antistollingsbloed over naar een buis van 50 ml met 30 ml verdunningsbuffer. Meng zachtjes door inversie.
    5. Voeg voor elke 10 ml volbloed of 30 ml verdund bloed 15 ml van het dichtheidsgradiëntmedium toe aan een lege buis van 50 ml.
    6. Breng het medium van de dichtheidsgradiënt uit stap 1.1.5 langzaam en gestaag aan met 30 ml verdund bloed met behulp van een serologische pipet van 25 ml. Houd de punt van de pipet tegen de wand van de buis en de buis in een schuine hoek.
    7. Breng de buizen voorzichtig over in een centrifuge met zwenkbak. Vermijd het verstoren van de twee fasen. Centrifugeer de buizen bij 400 x g bij kamertemperatuur (RT) gedurende 25 minuten met versnelling en vertraging ingesteld op de minimumwaarde.
    8. Verwijder voorzichtig de bovenste (heldere) plasmalaag met een pipet van 10 ml en gooi deze weg in een container met bleekmiddel (10%).
    9. Verzamel de interfase (witte) laag van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's, figuur 2) met een pipet van 10 ml en breng over naar een verse buis van 50 ml. Combineer de witte laag van verschillende buizen van dezelfde donor in een buis van 50 ml tot 30 ml.
    10. Breng elke buis met de verdunningsbuffer uit stap 1.1.1 tot een totaal volume van 50 ml en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g en 4 °C. Verwijder het supernatant met een pipet van 10 ml en gooi het weg in een container met bleekmiddel (10%).
    11. Resuspend elke celkorrel in 1 ml van de voorgekoelde lopende buffer uit stap 1.1.3 met behulp van een p1000 micropipette. Combineer celsuspensies van dezelfde donor in een nieuwe buis van 15 ml. Breng het volume van elke buis op 15 ml met voorgekoelde loopbuffer en meng goed door inversie.
    12. Neem een aliquot van 20 μL van de celsuspensie uit stap 1.1.11 en bereid een verdunning van 1:100 met behulp van 1x steriel PBS. Bepaal het celgetal met behulp van een hemocytometer.
    13. Centrifugeer de celsuspensie vanaf stap 1.1.11 bij 300 x g en 4 °C gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant met een pipet van 10 ml. Gebruik indien nodig een p200 micropipette om het supernatant volledig te verwijderen.
    14. Resuspend de geïsoleerde PBMC's in 80 μL voorgekoelde MACS-lopende buffer voor elke 1 x 107 cellen, wat neerkomt op maximaal 800 μL van de buffer.
    15. Voeg 20 μL anti-humane CD14 MicroBeads toe per elk 1 x 107 cellen of tot 100 μL per bloedmonster (~ 100 ml onverdund bloed). Meng goed door inversie en plaats op een buisrotator gedurende 20 minuten met continu mengen bij 4 °C.
    16. Verwijder de monsters van de buisrotator, voeg 10 ml voorgekoelde loopbuffer toe aan elke buis en centrifugeer bij 300 x g (versnelling = 5, vertraging = 5) en 4 °C gedurende 10 minuten.
    17. Verwijder het supernatant met een pipet van 10 ml en resuspend tot 1 x 108 cellen in 500 μL voorgekoelde lopende buffer (2 x 108/ml).
    18. Voer de isolatie van CD14-positieve cellen uit door magnetische celsortering met behulp van een handmatig of geautomatiseerd systeem (Tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant.
    19. Neem een aliquot van 20 μL van de celsuspensie uit stap 1.1.18 na CD14-positieve selectie en bereid een verdunning van 1:100 met 1x steriel PBS. Bepaal het celnummer door de cellen op een hemocytometer te tellen.
    20. Centrifugeer de CD14-positieve cellen bij 300 x g en RT gedurende 10 minuten. Verwijder het supernatant met een pipet van 10 ml of een vacuümsysteem.
    21. Resuspend de celkorrel van stap 1.1.20 in voorverwarmd kweekmedium van stap 1.1.2 tot een uiteindelijke celdichtheid van 1 x 107 cellen/ml.
  2. Zaai de geïsoleerde CD14-positieve monocyten bij een celdichtheid van 5 x 106 cellen.
    1. Voeg op een 10 cm weefselkweekschaal 10 ml kweekmedium uit stap 1.1.2 toe, aangevuld met 50 ng / ml granulocyt-macrofaagkoloniestimulerende factor (GM-CSF).
    2. Voeg 0,5 ml van de celsuspensie uit stap 1.1.21 druppelsgewijs toe aan het kweekmedium en draai de plaat voorzichtig rond. Incubateer cellen in een bevochtigde weefselkweekincubator (37 °C, 5% CO2) gedurende de nacht.
    3. Zuig de volgende dag het medium op met behulp van een vacuümsysteem om cellen te verwijderen die zich 's nachts niet hechten. Voeg 10 ml vers kweekmedium aangevuld met GM-CSF (50 ng /ml) toe en incubate cellen in een bevochtigde weefselkweekincubator (37 °C, 5% CO2) gedurende 7 dagen om volledige differentiatie mogelijk te maken (zie figuur 3A voor het verschijnen van CD14+ monocyten in verschillende stadia van differentiatie in GM-CSF ). Wissel het kweekmedium om de 2-3 dagen uit en vul het aan met verse GM-CSF (50 ng/ml) elke keer.

Figure 2
Figuur 2: Schematisch overzicht van de experimentele workflow. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Bereiding van elektroporatiecomponenten

OPMERKING: Dit protocol is ontworpen voor een 10 μL-Neon tip (Table of Materials). Gebruik voor elke transfectie 1-2 x 105 cellen. Het wordt aanbevolen om getransfecteerde cellen te zaaien op een 48-well plaat of 8-well chambered dish (10 μL-getransfecteerde cellen per put). 1x steriele DPBS (zonder Ca2+ en Mg2+) kan worden gebruikt in plaats van PBS.

  1. Bereid op dag 7 een antibioticavrij medium door rpmi-1640 medium aan te vullen met FBS (10% (v/v)) en glutamax (2 mM).
  2. Breng serumvrij RPMI-1640 medium, trypsine-EDTA (0,25%) oplossing, 1x steriel PBS (zonder Ca2+ en Mg2+) en volledig kweekmedium vanaf stap 1.1.2 in een waterbad van 37 °C.
  3. Als u schotels met glazen bodem gebruikt (voor confocale microscopie), bedekt u de gerechten met poly-D-lysinehydrobromide.
    1. Bestrijk een 8 goed kamervormige schaal met 200 μL poly-D-lysine hydrobromide (0,1 mg / ml in 1x steriel PBS) en incubeer gedurende 5 minuten bij RT.
    2. Zuig de poly-D-lysine-oplossing op en was het glas eenmaal met 1x steriel PBS. Zuig de PBS op en ga verder met stap 2.4.
  4. Voeg 200 μL antibioticavrij medium toe per put van de 48 putplaat of 8 goed gekamerde schaal en incubeer in een bevochtigde weefselkweekincubator (37 °C, 5% CO2) totdat u klaar bent om de getransfecteerde cellen te vergulden.

3. Voorbereiding van cellen voor elektroporatie

OPMERKING: De opbrengst van MDM uit een schaal van 10 cm aan het einde van de differentiatieperiode van 7 dagen is ongeveer 1,5 x 106 cellen. 1x steriele DPBS (zonder Ca2+ en Mg2+) kan worden gebruikt in plaats van PBS. Dit protocol is geoptimaliseerd zodat de meeste macrofagen van de plaat worden losgemaakt met behoud van de levensvatbaarheid en integriteit van cellen. MDM is moeilijk los te maken van celkweekplaten. Daarom kan het nodig zijn om stap 3.2 en 3.3 tweemaal uit te voeren om de cellen te dissociëren. Zorg ervoor dat elke incubatietijd met trypsine-EDTA (0,25%) niet langer is dan 5 minuten.

  1. Zuig de media op uit volledig gedifferentieerde macrofagen op 10 cm vaat en was de celmonolaag met warm serumvrij RPMI-1640 medium. Zorg ervoor dat u het medium volledig verwijdert.
  2. Oogst de cellen door 2 ml warme trypsine-EDTA (0,25%) oplossing per schaal van 10 cm toe te voegen en incubeer gedurende 5 minuten in een bevochtigde weefselkweekincubator (37 °C, 5% CO2).
  3. Voltooi de celloslating door de trypsine-EDTA (0,25%) oplossing voorzichtig op en neer te pipetteren over het hele schaalgebied met behulp van een p1000 micropipette. Breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 ml met 5 ml warm volledig kweekmedium uit stap 1.1.2.
  4. Breng de schotel naar een heldere veldmicroscoop en controleer op celloslating in verschillende gezichtsvelden. Als er nog een aanzienlijke hoeveelheid cellen is bevestigd, herhaalt u stap 3.2-3.3.
  5. Centrifugeer de celsuspensie bij 250 x g gedurende 5 minuten bij RT.
  6. Zuig het medium op en resuspend de cellen in 10 ml 1x steriel PBS voorverwarmd tot 37 °C. Neem een aliquot van 20 μL om het celgetal te bepalen met behulp van een hemocytometer.
  7. Neem 1-2 x 105 cellen per beoogde transfectie en plaats in een buis van 15 ml. Breng tot een eindvolume van 15 ml met voorverwarmde 1x steriele PBS. Centrifugeer bij 250 x g gedurende 5 min bij RT.
  8. Zuig de PBS aan en centrifugeer nog één keer gedurende 1 minuut bij 250 x g. Verwijder eventuele resterende PBS uit de celkorrel met behulp van een p200 micropipette.

4. Nucleofection van caspase BiFC-componenten in van menselijke monocyten afgeleide macrofagen

OPMERKING: Dit gedeelte van het protocol wordt uitgevoerd met behulp van het Neon Transfection System (Tabel met Materialen). Dit protocol schetst de stappen om 1-2 x 105 cellen te transfecteren met behulp van een 10 μL Neon tip (Table of Materials). Als u een Neon-tip van 100 μL gebruikt, schaal dan dienovereenkomstig op. Vermijd het blootstellen van cellen aan resuspensiebuffer R gedurende meer dan 15 minuten, omdat dit de levensvatbaarheid van de cel en de transfectie-efficiëntie kan verminderen.

  1. Verdun het reporter plasmide (d.w.z. mCherry of dsRedmito bij 100 ng/μL) in nucleasevrij water of 0,5x TE buffer om de getransfecteerde cellen te visualiseren.
  2. Verdun de caspase BiFC-plasmiden tot een geschikte concentratie in nucleasevrij water of 0,5x TE-buffer, zodat het totale volume plasmiden niet groter is dan 30% van het totale transfectievolume van 10 μL (d.w.z. 300 ng/μL C1 Pro-VC en 300 ng/μL C1 Pro-VN).
  3. Bereid een steriel microbuisje van 1,5 ml per beoogde transfectie en voeg de juiste hoeveelheid reporterplasmide (d.w.z. 50 ng of 0,5 μL) en caspase BiFC-plasmiden (d.w.z. 300 ng of 1 μL C1 Pro-VC en 300 ng of 1 μL C1 Pro-VN-fragment) toe. Houd de microbuisjes te allen tijde in de kap.
  4. Plaats het pipetstation, apparaat, tips, elektroporatiebuizen en pipet in een steriele laminaire stroomkap.
    OPMERKING: Het pipetstation, het apparaat, de tips, de elektroporatiebuizen en de pipet zijn inbegrepen in het Neon Transfection System.
  5. Sluit de hoogspannings- en sensorconnector op het pipetstation aan op de achterste poorten van het apparaat volgens de instructies van de fabrikant. Houd het pipetstation dicht bij het apparaat.
  6. Sluit het netsnoer aan op de achterste ac-inlaat en sluit het apparaat aan op het stopcontact. Druk op de aan/uit-schakelaar om het apparaat in te schakelen.
  7. Voer de transfectieparameters in het opstartscherm in dat wordt weergegeven wanneer het apparaat is ingeschakeld en op de juiste manier is aangesloten. Druk op Voltage, voer 1000 in en druk op Gereed om de spanning in te stellen op 1000 V. Druk op Breedte, voer 40 in en druk op Gereed om de pulsduur in te stellen op 40 ms. Druk ten slotte op # Pulsen, voer 2 in en druk op Gereed om het aantal elektrische pulsen in te stellen op 2.
  8. Neem een van de elektroporatiebuizen (meegeleverd in de kit) en vul deze met 3 ml elektrolytische buffer E (voor 10 μL tips en meegeleverd in de kit) bij RT. Steek de elektroporatiebuis in de pipethouder op het pipetstation. Zorg ervoor dat de elektrode aan de zijkant van de buis naar binnen is gericht en dat er een klikgeluid te horen is wanneer de buis wordt ingebracht.
  9. Neem de celkorrel uit stap 3.8 en voeg 10 μL voorverwarmde resuspensie R-buffer (meegeleverd in de kit) toe voor elke 1-2 x 105 cellen. Meng voorzichtig met een p20 micropipette. Voeg 10 μL van de celsuspensie toe aan elke buis die in stap 4.3 is ingesteld en meng voorzichtig met een p20 micropipette.
  10. Neem de pipet en plaats een punt door op de drukknop naar de tweede stop te drukken. Zorg ervoor dat de klem de bevestigingssteel van de zuiger in de punt volledig oppakt en dat er geen opening wordt waargenomen in de bovenkop van de pipet.
  11. Om het monster op te zuigen, drukt u op de drukknop op de pipet tot de eerste stop en dompelt u in de eerste buis met cel/plasmide DNA-mengsel. Zuig het mengsel langzaam op in de pipetpunt.
    OPMERKING: Vermijd luchtbellen omdat ze tijdens elektroporatie boogvorming kunnen veroorzaken en, indien gedetecteerd door het apparaat, de afgifte van de elektrische puls kunnen voorkomen. Als er luchtbellen worden waargenomen, laat u de inhoud los in de buis en probeert u opnieuw te aspirateren.
  12. Steek de pipet met het monster heel voorzichtig in de pipethouder. Zorg ervoor dat de pipet klikt en dat deze goed geplaatst is.
  13. Druk op Start op het touchscreen en wacht tot de elektrische pulsen worden geleverd. Een bericht op het scherm geeft de voltooiing aan.
  14. Verwijder de pipet langzaam uit het station en voeg onmiddellijk de getransfecteerde celsuspensie toe aan de overeenkomstige put met voorverwarmd antibioticumvrij medium uit stap 2.4 door langzaam op de drukknop tot de eerste stop te drukken.
    OPMERKING: Deze tip kan tot drie keer worden hergebruikt voor hetzelfde plasmide; Gooi het anders weg in een biorisico afvalcontainer door op de drukknop tot de tweede stop te drukken.
  15. Herhaal stap 4.10-4.14 voor elke buis die een cel/plasmide-DNA-mengsel bevat.
  16. Laat de plaat voorzichtig schommelen met getransfecteerde cellen en incubeer gedurende 1-3 uur in een bevochtigde weefselkweekincubator (37 °C, 5% CO2).
  17. Voeg aan elke put 200 μL voorverwarmd kweekmedium (volledig medium) toe vanaf stap 1.1.2. Plaats de schaal opnieuw in de bevochtigde weefselkweekincubator (37 °C, 5% CO2). Houd rekening met ten minste 24 uur voor genexpressie.
  18. Inspecteer de volgende dag de levensvatbaarheid van de cel en de transfectie-efficiëntie met behulp van een epifluorescentiemicroscoop.
    1. Schakel de epifluorescentiemicroscoop en de fluorescerende lichtbrondoos in volgens de instructies van de fabrikant en plaats de kweekschaal op het microscooppodium.
    2. Selecteer het 10x- of 20x-objectief en het 568 nm (RFP)-filter.
    3. Als u de levensvatbaarheid van cellen wilt schatten, drukt u op de TL-knop (Transmitted Light LED) om alle cellen in het geselecteerde veld te visualiseren. Terwijl u in het oculair van de microscoop kijkt, draait u aan de focusknop totdat cellen worden waargenomen en controleert u op celaanhechting in het geselecteerde veld.
      OPMERKING: Volledig gehechte cellen vertegenwoordigen de levensvatbare cellen, terwijl zwevende cellen niet-levensvatbare cellen vertegenwoordigen. Als de samenvloeiing van de put hoog is, kan de aanwezigheid van niet-gehechte cellen het gevolg zijn van een overschatting van het celaantal en niet het gevolg van een lage levensvatbaarheid. Een lage confluïteit vergezeld van een hoog gehalte aan zwevende cellen betekent echter een lage levensvatbaarheid die het gevolg kan zijn van boogvorming tijdens elektroporatie, plasmidetoxiciteit of overmatige blootstelling aan resuspensie R-buffer. Gebruik geen putten die het laatste gedrag vertonen.
    4. Om de transfectie-efficiëntie te schatten, richt u zich op cellen in het geselecteerde veld onder doorgelaten licht zoals hierboven beschreven. Tel het totale aantal cellen in het geselecteerde veld. Terwijl de LED (TL) is uitgeschakeld, drukt u op de LED-knop (RL) voor gereflecteerd licht om in te schakelen.
    5. Fijne focus op de reporter gen fluorescentie (rode bloedcellen) en tel het totale aantal rode fluorescerende cellen. Herhaal deze stappen (4.18.4-4.18.5) voor nog minstens twee velden per put.

5. Behandeling van getransfecteerde MDM en caspase BiFC data acquisitie

OPMERKING: Als u van plan bent om de cellen in beeld te brengen met behulp van een epifluorescentie of confocale microscoop, wordt behandeling met qVD-OPh (20 μM) gedurende 1 uur voorafgaand aan de gekozen stimulus geadviseerd om caspase-afhankelijke celdood (voornamelijk apoptose) te voorkomen. Dit wordt gebruikt in beeldvorming om te voorkomen dat cellen opstijgen als gevolg van apoptose, waardoor ze erg moeilijk in beeld te brengen zijn als ze uit het brandpuntsvlak bewegen. Merk op dat caspase-rekrutering naar het activeringsplatform en de bijbehorende caspase BiFC niet afhankelijk is van de katalytische activiteit van de caspase, en bijgevolg zal caspase-remming deze stap niet beïnvloeden.

  1. Behandel met gekozen stimulus ongeveer 24 uur na transfectie en incubeer zo lang als nodig is voor elk medicijn.
    1. Bereid het beeldvormingsmedium voor door het kweekmedium uit stap 1.1.2 aan te vullen met Hepes (20 mM, pH 7,2-7,5) en 2-mercaptoethanol (55 μM).
    2. Voeg de gewenste stimulusconcentratie toe aan het voorverwarmde beeldmedium en meng voorzichtig.
    3. Verwijder de media voorzichtig uit de cellen met een p1000 micropipette en voeg 500 μL van de stimulusoplossing uit stap 5.1.2 toe aan de zijkant van de put.
    4. Om onbehandelde controleputten uit te voeren, voegt u beeldvormend medium toe zonder de stimulus.
    5. Incubeer de cellen in een bevochtigde weefselkweekincubator (37 °C, 5% CO2) zolang als voor elke behandeling is aangegeven.
  2. Visualiseer de cellen met behulp van een epifluorescentie of confocale microscoop.
    1. Schakel de microscoop en de fluorescerende lichtbron in volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Selecteer het 10x of 20x objectief en plaats de kweekschaal op het microscooppodium.
    3. Zoek met behulp van het microscoop-oculair cellen onder het 568 nm-filter en concentreer je op de cellen die de dsRedmito / mCherry-reporter (rode bloedcellen) tot expressie brengen.
    4. Tel alle rode bloedcellen in het gezichtsveld en noteer het nummer.
    5. Terwijl u zich in hetzelfde gezichtsveld bevindt, schakelt u over naar het 488- of 512-filter (GFP of YFP), gaat u verder met het tellen van het aantal rode bloedcellen dat ook groen is (Venus-positief of BiFC-positief) en registreert u het aantal.
    6. Tel ten minste 100 dsRedmito/mCherry-positieve cellen uit minimaal drie afzonderlijke gezichtsvelden.
    7. Bereken het percentage Venus-positieve getransfecteerde cellen per gezichtsveld en gemiddelde de resulterende percentages voor elke behandeling (put) om de standaarddeviatie te krijgen.
  3. Stel de cellen voor met behulp van een epifluorescentie of confocale microscoop
    OPMERKING: Om confocale beelden te verkrijgen met behulp van een 20x-objectief of een grotere vergroting, moeten cellen op glazen schalen worden geplaatst, tenzij de microscoop is uitgerust met een long pass-objectief.
    1. Volg de stappen 5.2.1-5.2.3. Als u een confocale microscoop gebruikt met het 40x, 60x of 63x olieobjectief, plaats dan een druppel olie op het objectief.
    2. Visualiseer het live beeld van de cellen op het computerscherm zoals verkregen door de camera. Gebruik de epifluorescentielichtbron voor fluorescerende beelden of schakel de lichtbron over naar de lasers voor confocale beelden.
    3. Pas de focus en positie van de cellen af met behulp van de joystickbediening en het scherpstelwiel.
    4. Stel het percentage laservermogen en belichtingstijd in voor de lasers van 512 nm of 488 nm (YFP of GFP) en 568 nm (RFP), zodat het signaal in het beeld er goed uitziet en geen verzadiging bereikt.
    5. Schakel de live-opname in en bekijk de resulterende afbeelding. Zorg ervoor dat er voor elke fluor een duidelijke piek wordt gezien in de histogrammen van het display voor beide kanalen.
    6. Pas het laservermogen en de belichtingstijd indien nodig aan. Houd deze waarden zo laag mogelijk terwijl u beide fluorescerende signalen (RFP en GFP/YFP) kunt detecteren.
    7. Terwijl u het livebeeld van de cellen visualiseert, neemt u meerdere representatieve afbeeldingen van een veld dat een of meer cellen bevat die de mCherry / dsRedmito-reporter voor elke put van de plaat tot expressie brengen en slaat u de gegevens op.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het schema in figuur 2 geeft een overzicht van hoe menselijke MDM kan worden verkregen, getransfecteerd en in beeld gebracht. Na incubatie van de geselecteerde CD14+ monocyten met GM-CSF gedurende 7 dagen, verandert de celmorfologie in de loop van de differentiatieperiode (figuur 3A), gaande van bolvormige suspensiecellen tot spichtig en volledig gehecht (dag 3 en 4), en ten slotte naar meer verspreide cellen wanneer volledig gedifferentieerd (dag 7). Volledig gedifferentieerde cellen worden vervolgens losgemaakt van de plaat en getransfecteerd met de caspase BiFC-paren (VC en VN) samen met het reporterplasmide (bijv. dsRedmito, een plasmide dat codeert voor een rood fluorescerend eiwit gericht op de mitochondriën), dat wordt gebruikt om de getransfecteerde cellen te labelen (figuur 3B) en wordt gebruikt om de efficiëntie van de transfectie na 24 uur te beoordelen. Figuren 3B-D tonen een voorbeeld van BiFC-resultaten met behulp van de caspase-1 pro BiFC getransfecteerde cellen die gedurende 20 uur zijn behandeld met nigericine (5 μM), een bekende pro-inflammatoire stimulus die de assemblage van het NLRP3-inflammasoom30,31 activeert. Onbehandelde cellen vertonen geen Venusfluorescentie (figuur 3B) en in met nigericine behandelde cellen verschijnt caspase-1 BiFC als een enkel punctum met de typische vorm van ASC-stippen 32,33,25 (figuur 3C). Figuur 3D toont een voorbeeld van kwantificering van Venus-positieve MDM. Het hoogste percentage caspase-1 BiFC wordt gezien in de LPS + nigericine behandelingsgroep (Figuur 3D). Dit resultaat komt overeen met de activering van een canoniek inflammasoom, waarbij zowel een primingsignaal (LPS) als een intracellulair signaal (nigericine) nodig zijn voor activering van capase-1.

Figure 3
Figuur 3: Differentiatie van CD14-monocyten en transfectie van menselijke MDM. (A) Representatieve heldere veldbeelden van CD14+ monocyten uit perifeer bloed blootgesteld aan GM-CSF op dag 1, 3, 4 en 7 van differentiatie (Schaalbalk, 100 μm). (B-C) Menselijke MDM werden getransfecteerd met caspase-1 pro BiFC-paren en de transfectieverslaggever dsRedmito (50 ng, rood). 24 uur later werden cellen geprimed met en zonder LPS (100 ng / ml) gedurende 3 uur en behandeld met nigericine (5 μM) in beeldvormingsmedium gedurende 20 uur. Representatieve confocale beelden van onbehandelde en met nigericine behandelde cellen worden getoond (schaalbalk, 10 μm). De BiFC wordt in het groen weergegeven. (D) Cellen van (C) werden beoordeeld voor het percentage dsRedmito-positieve cellen (rode, getransfecteerde cellen) die Venus-positief waren (groen, caspase-1 BiFC-complex) na 20 uur. Foutbalken vertegenwoordigen SD van ten minste twee onafhankelijke tellingen per put. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Een voorbeeld van plasmidetitratie is weergegeven in figuur 4, waarbij toenemende hoeveelheden van elk BiFC-plasmide worden getransfecteerd. Dit maakt de selectie van de optimale dosis plasmide mogelijk, wat resulteert in een specifiek signaal en minimale achtergrond. Figuur 4A toont de resultaten van humane MDM getransfecteerd met toenemende concentraties van de caspase-1, -4 en -5 pro BiFC-paren (VC en VN) behandeld met heem, een zeer pro-inflammatoir molecuul dat het gevolg is van vernietiging van rode bloedcellen34. Het hoogste percentage Venus-positieve cellen voor caspase-1, -4 en -5 pro BiFC-paren is het resultaat van respectievelijk 400 ng, 500 ng en 1000 ng getransfecteerd plasmide. Het gebruik van de hoogste hoeveelheid plasmide loopt echter ook het risico op een toename van de niet-specifieke achtergrond (figuur 4B). Transfectie van 1000 ng van het caspase-5 pro BiFC-paar resulteert bijvoorbeeld in bijna 40% niet-specifieke achtergrond. Daarom wordt het gebruik van de lagere hoeveelheid van 700 ng als optimaal beschouwd voor dit plasmidepaar (figuur 4B). In figuur 4C worden representatieve confocale beelden getoond die zijn verkregen met een 20x objectief van een veld van cellen 24 uur na transfectie. In deze afbeelding kan men zien dat de onbehandelde getransfecteerde cellen levensvatbaar zijn op basis van het uiterlijk van de mitochondriën (mitochondriën in dode cellen zijn sterk gefragmenteerd) en de morfologie van de cellen (apoptotische cellen zijn gekrompen). Na behandeling met heem verschijnt het caspase-1-complex als een enkel groen punctum vergelijkbaar met het door nigericine geïnduceerde mes in figuur 3C, en het uiterlijk ging gepaard met celkrimp.

Figure 4
Figuur 4: Humane MDM getransfecteerd met verschillende hoeveelheden inflammatoire caspase pro BiFC-paren. (A) Titratie van caspase-1 pro; caspase-4 pro; of caspase-5 pro BiFC paren. Humane MDM werd getransfecteerd met de aangegeven hoeveelheden van de caspase pro BiFC-paren met dsRedmito als transfectieverslaggever (50 ng) en 's nachts geïncubeerd. De volgende dag werd het kweekmedium uit alle putten verwijderd en werden de cellen behandeld met en zonder heem (50 μM) in 0,1% FBS-medium. Na 1 uur werd een gelijke hoeveelheid volledig medium aan alle putten toegevoegd om de FBS-concentratie te reconstitueren tot 5% en te voorkomen dat heem de cellen doodde. Na een totale behandeling van 20 uur werden cellen beoordeeld op het percentage dsRedmito-positieve getransfecteerde cellen dat Venus-positief was, bepaald uit minimaal 300 cellen per put. Foutbalken vertegenwoordigen SD van ten minste drie onafhankelijke tellingen per put. (B) Humane MDM werden getransfecteerd met geselecteerde hoeveelheden caspase-1 pro; caspase-4 pro; of caspase-5 pro BiFC paren, samen met dsRedmito (50 ng) als verslaggever voor transfectie. 24 uur na transfectie werden cellen behandeld met of zonder heem (50 μM) in 0,1% FBS. Na 1 uur werd FBS gereconstitueerd tot 5% om extracellulair vlies te remmen. Cellen werden beoordeeld op het percentage dsRedmito-positieve cellen (rode, getransfecteerde cellen) die Venus-positief waren (groen, caspase BiFC-complex) na 20 uur bepaald uit minimaal 300 cellen per put. Resultaten worden weergegeven als percentage Venus-positieve cellen. Foutbalken vertegenwoordigen SD van ten minste drie onafhankelijke tellingen per put. (C) Representatieve confocale beelden verkregen met een 20x objectief van een veld van cellen 24 uur na transfectie en behandeld met en zonder heem zoals beschreven in (B). Rood: dsRedmito-positieve cellen; Groen: Venus-positieve cellen; Schaalbalk, 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol beschrijft de workflow om macrofagen te verkrijgen uit monocyten geïsoleerd uit menselijke bloedmonsters en een methode om de inflammatoire caspase BiFC-verslaggevers efficiënt in menselijke MDM te introduceren zonder de levensvatbaarheid en het gedrag van cellen in gevaar te brengen.

Dit protocol maakt gebruik van de BiFC-techniek35 om de inflammatoire caspasen op het caspase recruitment domein (CARD) te taggen met niet-fluorescerende fragmenten van het gespleten fluorescerende eiwit Venus. Inflammatoire caspasen coderen voor een katalytisch domein dat bestaat uit een grote (p20) en een kleine (p10) subeenheid, en een geconserveerd eiwit-eiwitinteractiemotief dat een CARD wordt genoemd op hun N-eindpunt of prodomein36 (figuur 1B). Rekrutering van inflammatoire caspasen naar hun activeringsplatforms is afhankelijk van een intacte CARD. Voor deze benadering worden twee caspase prodomeinconstructen (coderend voor het CARD-motief) gegenereerd, elk gekoppeld aan de niet-fluorescerende fragmenten van het fotostabare gele eiwit Venus (Venus-C [VC]) en Venus-N [VN]) samen met een fluorescerende transfectiereporter om visualisatie van de cellen mogelijk te maken voorafgaand aan of bij afwezigheid van activering van de caspase BiFC-reporter. Fluorescentie wordt alleen waargenomen wanneer interagerende eiwitten dicht genoeg bij elkaar komen die dimerisatie en activering mogelijk maken (zie figuur 1A). De efficiëntie van dit proces kan worden gekwantificeerd met behulp van een standaard epifluorescentie of een confocale microscoop. In combinatie met single-cell imaging maakt dit protocol visualisatie mogelijk van asynchrone gebeurtenissen die mogelijk niet te onderscheiden zijn in bulkpopulaties, en afhankelijk van de resolutie van de beelden, kan worden gebruikt om de grootte en lokalisatie van het BiFC-complex geassocieerd met elke caspase te bepalen.

Dit protocol kan worden aangepast aan een reeks eiwitten die worden geactiveerd door oligomerisatie, en de toepasbaarheid ervan is niet beperkt tot microscopiemethoden. Deze aanpak maakt het ook mogelijk om differentiële vereisten voor de assemblage van inflammatoire caspasen te onderzoeken. SiRNA kan bijvoorbeeld worden gebruikt om upstream componenten / vereisten voor specifieke inflammatoire caspase-activering te identificeren. De caspase-BiFC-sondes en het siRNA-oligo (gebruikt om een doeleiwit het zwijgen op te leggen) kunnen gelijktijdig worden getransfecteerd in MDM. Dit kan potentiële eiwitpartners of essentiële componenten van elk activeringsplatform identificeren. Een siRNA-oligo dat zich richt op het ASC-adaptermolecuul, dat nodig is voor de assemblage van de NLRP1-, NLRP3- en AIM2-inflammasomen, werd bijvoorbeeld gebruikt om aan te tonen dat heem-geïnduceerde activering van caspase-1 deze canonieke inflammasomen vereiste, terwijl caspase-4 en -5 niet21. Deze methodologie kan ook worden aangepast aan time-lapse microscopie, zodat de kinetiek van de inflammatoire caspase-activering in afzonderlijke cellen kan worden bepaald. Met behulp van een dergelijke benadering kan men beoordelen wanneer caspase-dimerisatie optreedt door nauwkeurig de timing van het verschijnen van het BiFC-begin te detecteren ten opzichte van het tijdstip waarop de cel de dood ondergaat door het verlies van fluorescentie van de transfectieverslaggever (mCherry) te volgen als een indicatie van cellysis. Er zijn meerdere manieren om caspase BiFC-gegevens te verkrijgen en te analyseren; de keuze hangt af van de te beantwoorden vraag en het soort microscoop en software dat beschikbaar is. Gegevens met één tijdstip die worden gebruikt om de efficiëntie van activering en time-lapse-analyse te bepalen, kunnen bijvoorbeeld bijzonder effectief zijn als een automatische acquisitiefunctie van sommige microscoopsoftware beschikbaar is. Dit maakt objectieve beeldvorming mogelijk, omdat vooraf bepaalde posities arrays worden verkregen uit elke put van een multi-well plaat. Beelden kunnen zowel door visuele inspectie als door het gebruik van geautomatiseerde beeldvormingssoftware zoals CellProfiler, ImageJ of MATLAB worden gekwantificeerd om de nauwkeurigheid en objectiviteit te vergroten.

Het onderzoeken van caspase-routes in primaire cellen is essentieel om de fysiologische rollen van deze eiwitten volledig te begrijpen. Omdat caspase-4 en caspase-5 bij muizen worden vervangen door een enkele caspase-11, is het bovendien essentieel om menselijke cellen te kunnen beoordelen. Vanwege de lage transfectie-efficiëntie en toxiciteiten die verband houden met veel toedieningssystemen in primaire cellen, kan het echter moeilijk zijn om het gebruik van beschikbare op plasmide gebaseerde verslaggevers te maximaliseren. Het inflammatoire caspase BiFC-protocol beschrijft een eenvoudige methode om MDM te transfecteren uit perifeer bloed van patiënten of gezonde proefpersonen, waardoor het aantal cellen dat nodig is per transfectie wordt verminderd. Dit stelt onderzoekers in staat om complexere experimenten uit te voeren met kostbare cellen zoals macrofagen zonder de levensvatbaarheid van cellen en cellulaire eigenschappen in gevaar te brengen. De mogelijkheid om patiëntmonsters te gebruiken biedt een groot voordeel van het kunnen beoordelen van inflammatoire caspase-activering in specifieke ziektetoestanden. Inderdaad, met enkele kleine optimalisaties kan dit protocol gemakkelijk worden aangepast aan andere muizen of menselijke primaire cellen.

Dit protocol maakt gebruik van een op elektroporatie gebaseerde benadering om MDM te transfecteren. Het Neon-systeem is bijzonder voordelig omdat het geen IFN-γ respons in MDM induceert, wat de specifieke immuunrespons van de cellen zou kunnen verstoren37. Dit is een kleinschalig elektroporatiesysteem dat een transfectievolume van 10 μL met een hoge celdichtheid gebruikt om de efficiënte overdracht van exogene DNA naar een groot aantal cellen mogelijk te maken. Het creëert tijdelijke poriën in het celmembraan, zodat plasmiden snel kunnen passeren, waardoor de late endocytose wordt vermeden die optreedt tijdens chemische transfectie en die plasmideafbraak kan veroorzaken. Dit protocol maakt gebruik van een op organisch zuur gebaseerde bufferformulering (buffer R) die minimale celtoxiciteit introduceert in vergelijking met andere buffers met chloride-ionen38. Het kleine volume en het ontwerp van de pipetpuntkamer helpen bij het genereren van een uniform elektrisch veld om fysiologische omstandigheden te handhaven, wat resulteert in hoge overlevingskansen. Transfectie-efficiëntie en celoverleving zijn sterk afhankelijk van de chemische samenstelling van de buffer, de celdichtheid, de sterkte van de puls en de plasmideconcentratie39. Daarom is het essentieel om deze omstandigheden te optimaliseren voor elk celtype en plasmide dat wordt geïntroduceerd. In MDM leverden lagere spanningen met langere pulsduur plasmiden efficiënter af terwijl cellen levensvatbaar en gezond bleven. Bijgevolg waren de instellingen die voor dit protocol werden gebruikt 1000 V en 2 pulsen van 40 ms die resulteerden in transfectie-efficiënties tussen 40-60% met cel levensvatbaarheid hoger dan 90% op basis van het vermogen van de cellen om zich opnieuw aan de plaat te hechten na transfectie. Hoewel dit protocol is geoptimaliseerd voor menselijke MDM, kan het variëren van de spanningsinstellingen van 500 V tot 1700 V, het verhogen van het aantal pulsen van 1 tot 3 en het testen van de lengte van pulsen variërend van 10 tot 40 ms transfectie-efficiëntie en cel levensvatbaarheid in extra celtypen en experimentele instellingen in evenwicht brengen.

Er zijn verschillende belangrijke overwegingen voor een optimale inzet van de BiFC-techniek. 1) Het is belangrijk dat de gebruiker de optimale hoeveelheid van elk in te brengen caspase plasmide bepaalt, omdat dit kan variëren voor verschillende eiwitten en celtypen. Dit is nodig om maximale gevoeligheid en specificiteit van de test te garanderen. Geadviseerd wordt een proeftitratie uit te voeren van de caspase BiFC-plasmiden (VC- en VN-fragmenten) tussen 200 ng en 1000 ng zoals weergegeven in figuur 4A-B. Het optimale bereik van plasmide dat wordt geïntroduceerd, verschilt voor elke individuele caspase en daarom moeten ze individueel worden beoordeeld. Kies een plasmidehoeveelheid die het hoogste specifieke signaal biedt met minimale achtergrond. Idealiter zou het achtergrondniveau minder dan 10% moeten zijn, maar tot 20% kan worden gebruikt als het specifieke signaal hoog is. Het is ook van cruciaal belang om zware omstandigheden en overmatige manipulatie van deze cellen te voorkomen tijdens differentiatie, transfectie en behandeling. Dit kan ook resulteren in spontane activering en hoge achtergrondniveaus van caspase-activering die de specifieke resultaten kunnen verdoezelen, omdat activering van immuuncellen zoals monocyten of macrofagen een natuurlijk proces is, waar ze pro-inflammatoire functies kunnen verwerven40. Als patiëntencellen worden gebruikt, kan het moeilijk zijn om te controleren op een inherente variatie in niveaus van inflammasoomactivatie en genetische achtergrond die hen kunnen sensibiliseren of desensibiliseren voor stimuli en veranderingen in hun lokale micro-omgeving. De macrofaagfunctie kan bijvoorbeeld worden beïnvloed bij immuungecompromitteerde personen of personen die een infectie bestrijden, omdat dit type cel belangrijke homeostatische functies speelt en betrokken is bij de controle van ontstekingen, naast andere functies. Deze genetische en omgevingsfactoren moeten in overweging worden genomen bij het bepalen of een hoge achtergrond niet-specifiek of een biologisch effect is. Het gebruik van nauw op elkaar afgestemde gezonde controles (bijv. afgestemd op geslacht en leeftijd) kan helpen om de biologische betekenis van een hoog achtergrondniveau van caspase BiFC te beoordelen. 2) Het is van cruciaal belang dat de VC- en VN-fragmenten in gelijke hoeveelheden worden geïntroduceerd, omdat ongelijke expressie van één Venus-fragment kan resulteren in rekrutering naar het platform bij hogere frequenties en het volledige fluorescerende signaal kan maskeren, wat een vals negatief resultaat oplevert. Daarom moeten de integriteit en concentratie van elk afzonderlijk plasmide vóór elke transfectie worden gevalideerd om te voorkomen dat verschillende hoeveelheden van de VC- en VN-fragmenten worden geïntroduceerd. 3) Aangezien deze benadering is gebaseerd op de exogene uitdrukking van de caspase-melders, moeten aanvullende controles op specificiteit worden opgenomen. Caspase-BiFC-constructies die single point mutaties bevatten die de binding tussen de caspase en zijn activeringsplatform verstoren of het uitschakelen van een van de componenten van het activeringsplatform met behulp van siRNA kunnen worden gebruikt om te bevestigen dat het fluorescerende signaal te wijten is aan specifieke binding van de caspase aan het inflammasoom. Dit controle-experiment zou moeten resulteren in verminderde niveaus van Venus-positieve cellen. 4) Expressie van de caspase BiFC-constructies kan stroomafwaartse gebeurtenissen zoals celdood veroorzaken of beïnvloeden. Om dit te omzeilen, worden niet-enzymatische versies van de caspase aanbevolen voor de BiFC-melders, zoals het caspase-prodomein of het caspase over de volledige lengte waarbij het katalytische cysteïneresidu wordt gemuteerd en geïnactiveerd. Om dit verder te controleren, moeten niet-getransfecteerde behandelde en onbehandelde putten in het experiment worden opgenomen en vergelijkbaar gedrag vertonen als dat van de getransfecteerde putten. 5) Endogene caspase-activiteit kan mogelijk van invloed zijn op de BiFC-uitlezing. Om dit te controleren, kan men de caspase reporter uitdrukken in cellen met een tekort aan de caspase die wordt bestudeerd met de verwachting dat de BiFC-efficiëntie hetzelfde zou zijn.

Een van de belangrijkste nadelen van deze aanpak is dat het niet per se caspase-activering meet, maar de geïnduceerde nabijheidsstap die nodig is om activering te laten plaatsvinden. Dit is een subtiel maar belangrijk onderscheid. Door het ontwerp bevat het prodomein niet de katalytische domeinen van de caspase die daadwerkelijk dimeriseren. Daarom fungeren het hervouwen en fluoresceren van de Venusfragmenten als een proxy voor caspase-dimerisatie, omdat ze alleen kunnen hervouwen als de caspasen dichtbij genoeg zijn om te dimmen. De BiFC meet dus specifiek geïnduceerde nabijheid. Het is mogelijk dat posttranslationele modificaties in de katalytische domeinen dimerisatie kunnen belemmeren zonder het BiFC-signaal te beïnvloeden. Caspase-2 wordt bijvoorbeeld gefosforyleerd op zijn katalytisch domein en dit belemmert dimerisatie zonder de rekrutering van caspase-2 naar zijn activeringsplatform41 te voorkomen. Daarom moeten waarnemingen met behulp van de BiFC-benadering worden aangevuld met functionele studies om te bevestigen dat de waargenomen fluorescentie representatief is voor caspase-activering. Ondanks dit nadeel, als de hier besproken controles zijn opgenomen, kan de meting van geïnduceerde nabijheid door caspase BiFC een nauwkeurige weergave geven van specifieke caspase-activering.

Kortom, caspase BiFC is een krachtig hulpmiddel voor de analyse van dynamische caspase-interacties op inflammasoomniveau. Dit protocol maakt het mogelijk om de inflammatoire caspase signaleringscascades in levende immuuncellen te ondervragen. Deze aanpak biedt niet alleen een techniek om specifiek en nauwkeurig de eerste stap in caspase-activering te meten, maar heeft, door te worden toegepast op primaire immuuncellen, het potentieel om eigenschappen van inflammatoire caspasen te onthullen die niet met conventionele methoden konden worden geïdentificeerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

We bedanken de leden van LBH's lab uit heden en verleden die hebben bijgedragen aan de ontwikkeling van deze techniek. Dit lab wordt ondersteund door NIH/NIDDK T32DK060445 (BEB), NIH/NIDDK F32DK121479 (BEB), NIH/NIGMS R01GM121389 (LBH). Figuur 2 is getekend met behulp van Biorender software.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
48 well tissue culture2:34 plates Genesee Scientific 25-108
10 cm Tissue Culture Dishes VWR 25382-166
2 Mercaptoethanol 1000x Thermo Fisher Scientific 21985023
8 well chambered coverglass with 1.5 HP coverglass Cellvis c8-1.5H-N
AutoMACS columns Miltenyi (Biotec) 130-021-101 For automated separation using AutoMACS Pro Separator only
AutoMACS Pro Separator Miltenyi (Biotec) 130-092-545 For automated separation using AutoMACS Pro Separator only
AutoMACS Pro Washing Solution Miltenyi (Biotec) 130-092-987 For automated separation using AutoMACS Pro Separator only
AutoMACS Rinsing Solution Miltenyi (Biotec) 130-091-222 For automated separation using AutoMACS Pro Separator only
AutoMacs running buffer Miltenyi (Biotec) 130-091-221 For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator
Axio Observer Z1 motorized inverted microscope equipped with a CSU-X1A 5000 spinning disk unit Zeiss Any confocal microscope equipped with a laser module fitted with laser lines of 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used
AxioObserver A1, Research Grade Inverted Microscope Zeiss Any epifluorescence microscope with fluorescence filters capable of exciting 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used
CD14+ MICROBEADS Miltenyi (Biotec) 130-050-201 For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator
DPBS without calcium chloride and magnesium chloride Sigma D8537-6x500ML
DsRed mito plasmid Clontech 632421 Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 10437028
Ficoll-Paque PLUS 6 x 100 mL Sigma GE17-1440-02
GlutaMAX Supplement (100x) Thermo Fisher Scientific 35050079
GM-CSF Thermo Fisher Scientific PHC2011
Hemin BioXtra, from Porcine, ≥96.0% (HPLC) Sigma 51280-1G
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630106
Inflammatory caspase BiFC plasmids Available by request from LBH lab
LPS-EB Ultrapure Invivogen TLRL-3PELPS
LS Columns Miltenyi (Biotec) 130-042-401 For manual separation using QuadroMACS Separator only
MACS 15 mL Tube Rack Miltenyi (Biotec) 130-091-052 For manual separation using QuadroMACS Separator only
MACS MultiStand Miltenyi (Biotec) 130-042-303 For manual separation using QuadroMACS Separator only
mCherry plasmid Yungpeng Wang Lab Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene
Neon Transfection System Thermo Fisher Scientific MPK5000 Includes Neon electroporation device, pipette and pipette station
Neon Transfection System 10 µL Kit Thermo Fisher Scientific MPK1096 Includes resuspension buffer R, resuspension buffer T, electrolytic buffer E, 96 x 10 µL Neon tips and Neon electroporation tubes
Nigericin sodium salt, ready made solution Sigma SML1779-1ML
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122
Poly-D-Lysine Hydrobromide Sigma P7280-5mg
QuadroMACS Separator Miltenyi (Biotec) 130-090-976 For manual separation using QuadroMACS Separator only
qVD-OPh Fisher (ApexBio) 50-101-3172
RPMI 1640 Medium Thermo Fisher Scientific 11875119
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Fisher Scientific 25200072
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific 15575020
Zeiss Zen 2.6 (blue edition) software Zeiss Any software used to operate the confocal microscope of choice

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Molecular Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
  2. Pop, C., Salvesen, G. S. Human caspases: activation, specificity, and regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).
  3. Boice, A., Bouchier-Hayes, L. Targeting apoptotic caspases in cancer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1867 (6), 118688 (2020).
  4. Bolívar, B. E., Vogel, T. P., Bouchier-Hayes, L. Inflammatory caspase regulation: maintaining balance between inflammation and cell death in health and disease. The FEBS Journal. 286 (14), 2628-2644 (2019).
  5. Martinon, F., Tschopp, J. Inflammatory caspases: linking an intracellular innate immune system to autoinflammatory diseases. Cell. 117 (5), 561-574 (2004).
  6. Lamkanfi, M., Vishva, M. D. Mechanisms and functions of inflammasomes. Cell. 157 (5), 1013-1022 (2014).
  7. Viganò, E., et al. Human caspase-4 and caspase-5 regulate the one-step noncanonical inflammasome activation in monocytes. Nature Communications. 6, 8761 (2015).
  8. Cerretti, D. P., et al. Molecular cloning of the interleukin-1 beta converting enzyme. Science. 256 (5053), 97 (1992).
  9. van de Veerdonk, F. L., Netea, M. G., Dinarello, C. A., Joosten, L. A. Inflammasome activation and IL-1β and IL-18 processing during infection. Trends in Immunology. 32 (3), 110-116 (2011).
  10. Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Molecular Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
  11. Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation targets caspase-11. Nature. 479 (7371), 117-121 (2011).
  12. Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4. Science. 341 (6151), 1246-1249 (2013).
  13. Masumoto, J., et al. ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. The Journal of Biological Chemistry. 274 (48), 33835-33838 (1999).
  14. Bertin, J., DiStefano, P. S. The PYRIN domain: a novel motif found in apoptosis and inflammation proteins. Cell Death and Differentiation. 7 (12), 1273-1274 (2000).
  15. Agostini, L., et al. NALP3 forms an IL-1beta-processing inflammasome with increased activity in Muckle-Wells autoinflammatory disorder. Immunity. 20 (3), 319-325 (2004).
  16. Bürckstümmer, T., et al. An orthogonal proteomic-genomic screen identifies AIM2 as a cytoplasmic DNA sensor for the inflammasome. Nature Immunology. 10 (3), 266-272 (2009).
  17. Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A. Activation and regulation of the inflammasomes. Nature Reviews Immunology. 13 (6), 397-411 (2013).
  18. Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves gasdermin D for noncanonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
  19. Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
  20. Shi, J., et al. Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS. Nature. 514 (7521), 187-192 (2014).
  21. Bolívar, B. E., et al. Noncanonical Roles of Caspase-4 and Caspase-5 in Heme-Driven IL-1β Release and Cell Death. The Journal of Immunology. 206 (8), 1878-1889 (2021).
  22. Schmid-Burgk, J. L., et al. Caspase-4 mediates noncanonical activation of the NLRP3 inflammasome in human myeloid cells. European Journal of Immunology. 45 (10), 2911-2917 (2015).
  23. Baker, P. J., et al. NLRP3 inflammasome activation downstream of cytoplasmic LPS recognition by both caspase-4 and caspase-5. European Journal of Immunology. 45 (10), 2918-2926 (2015).
  24. Cullen, S. P., Kearney, C. J., Clancy, D. M., Martin, S. J. Diverse activators of the NLRP3 inflammasome promote IL-1β secretion by triggering necrosis. Cell Reports. 11 (10), 1535-1548 (2015).
  25. Sanders, M. G., et al. Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes. Cell Death & Disease. 6, 1813 (2015).
  26. Charendoff, C. I., Bouchier-Hayes, L. Lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), e57316 (2018).
  27. Bouchier-Hayes, L., et al. Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity. Molecular Cell. 35 (6), 830-840 (2009).
  28. Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Peripheral blood mononuclear cells: Isolation, Freezing, thawing, and culture. Methods in Molecular Biology. 1304, 53-61 (2016).
  29. Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Current Pathobiology Reports. 7 (2), 17-27 (2019).
  30. Perregaux, D., et al. IL-1 beta maturation: evidence that mature cytokine formation can be induced specifically by nigericin. The Journal of Immunology. 149 (4), 1294-1303 (1992).
  31. Cheneval, D., et al. Increased mature interleukin-1β (IL-1β) secretion from THP-1 cells induced by nigericin is a result of activation of p45 IL-1β-converting enzyme processing. Journal of Biological Chemistry. 273 (28), 17846-17851 (1998).
  32. Fernandes-Alnemri, T., et al. The pyroptosome: a supramolecular assembly of ASC dimers mediating inflammatory cell death via caspase-1 activation. Cell Death and Differentiation. 14 (9), 1590-1604 (2007).
  33. Lu, A., et al. Unified polymerization mechanism for the assembly of ASC-dependent inflammasomes. Cell. 156 (6), 1193-1206 (2014).
  34. Muller-Eberhard, U., Javid, J., Liem, H. H., Hanstein, A., Hanna, M. Brief report: Plasma concentrations of hemopexin, haptoglobin and heme in patients with various hemolytic diseases. Blood. 32 (5), 811-815 (1968).
  35. Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).
  36. Thornberry, N. A., et al. A novel heterodimeric cysteine protease is required for interleukin-1βprocessing in monocytes. Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).
  37. Jensen, K., Anderson, J. A., Glass, E. J. Comparison of small interfering RNA (siRNA) delivery into bovine monocyte-derived macrophages by transfection and electroporation. Veterinary Immunology and Immunopathology. 158 (3-4), 224-232 (2014).
  38. Tada, Y., Sakamoto, M., Fujimura, T. Efficient gene introduction into rice by electroporation and analysis of transgenic plants: use of electroporation buffer lacking chloride ions. Theoretical and Applied Genetics. 80 (4), 475-480 (1990).
  39. Bhowmik, P., et al. Targeted mutagenesis in wheat microspores using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 8 (1), 6502 (2018).
  40. Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. What's the difference between CD80 and CD86. Trends in Immunology. 24 (6), 314-319 (2003).
  41. Kurokawa, M., Kornbluth, S. Caspases and kinases in a death grip. Cell. 138 (5), 838-854 (2009).

Tags

Immunologie en infectie nummer 182
Visualisatie van inflammatoire caspasen geïnduceerde nabijheid in menselijke monocyt-afgeleide macrofagen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bolívar, B. E., Bouchier-Hayes, … More

Bolívar, B. E., Bouchier-Hayes, L. Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (182), e63162, doi:10.3791/63162 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter