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Immunology and Infection

मानव मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज में भड़काऊ प्रेरित निकटता का विज़ुअलाइज़ेशन

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63162
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology, Department of Molecular and Cellular Biology, Texas Children’s Hospital William T. Shearer Center for Human Immunobiology, Baylor College of Medicine

Summary

यह प्रोटोकॉल मानव रक्त के नमूनों से मोनोसाइट्स-व्युत्पन्न मैक्रोफेज (एमडीएम) प्राप्त करने के लिए वर्कफ़्लो का वर्णन करता है, सेल व्यवहार्यता और व्यवहार से समझौता किए बिना मानव एमडीएम में भड़काऊ द्वि-आणविक प्रतिदीप्ति पूरकता (बीआईएफसी) पत्रकारों को कुशलतापूर्वक पेश करने का एक सरल तरीका है, और जीवित कोशिकाओं में भड़काऊ सक्रियण को मापने के लिए एक इमेजिंग-आधारित दृष्टिकोण है।

Abstract

भड़काऊ में शामिल हैं- 1, -4, -5, -11, और -12 और प्रारंभकर्ता के उपसमूह से संबंधित हैं। भड़काऊ सिग्नलिंग के सही विनियमन को सुनिश्चित करने के लिए -1 की आवश्यकता होती है और सूजन के लिए भर्ती के बाद निकटता-प्रेरित dimerization द्वारा सक्रिय किया जाता है। मोनोसाइटिक सेल वंश में प्रचुर मात्रा में है और सक्रिय स्रावित अणुओं के लिए प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स इंटरल्यूकिन (आईएल) -1 और आईएल -18 की परिपक्वता को प्रेरित करता है। अन्य भड़काऊ, और -5 (और उनके मुरीन होमोलॉग -11) पाइरोप्टोसिस को प्रेरित करके आईएल -1 π रिलीज को बढ़ावा देते हैं। Bimolecular प्रतिदीप्ति पूरकता (BiFC) एक उपकरण है जिसका उपयोग भड़काऊ को मापने के लिए किया जाता है। -1, -4, या -5 प्रोडोमेन, जिसमें वह क्षेत्र होता है जो भड़काऊ को बांधता है, पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन वीनस (वीनस-एन [वीएन] या वीनस-सी [वीसी]) के गैर-फ्लोरोसेंट टुकड़ों से जुड़ा हुआ है, जो फ्लोरोसेंट वीनस कॉम्प्लेक्स को सुधारने के लिए संबद्ध करता है जब प्रेरित निकटता से गुजरते हैं। यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि इन पत्रकारों को प्राथमिक मानव मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज (एमडीएम) में न्यूक्लियोफेक्शन का उपयोग करके कैसे पेश किया जाए, सूजन सक्रियण को प्रेरित करने के लिए कोशिकाओं का इलाज किया जाए, और प्रतिदीप्ति और कन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सक्रियण को मापा जा सके। इस दृष्टिकोण का लाभ यह है कि इसका उपयोग जीवित कोशिकाओं में भड़काऊ सक्रियण परिसर के घटकों, आवश्यकताओं और स्थानीयकरण की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, सेल व्यवहार्यता और व्यवहार से समझौता करने से बचने के लिए सावधानीपूर्वक नियंत्रण पर विचार करने की आवश्यकता है। यह तकनीक भड़काऊ स्तर पर गतिशील के विश्लेषण के साथ-साथ जीवित एमडीएम और मानव रक्त के नमूनों से प्राप्त मोनोसाइट्स में भड़काऊ सिग्नलिंग कैस्केड की पूछताछ के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।

Introduction

सिस्टीन एस्पार्टेट प्रोटीज का एक परिवार है जिसे सर्जक और जल्लाद में वर्गीकृत किया जा सकता है। जल्लाद में -3, -6 और -7 शामिल हैं। वे स्वाभाविक रूप से डिमर के रूप में कोशिकाओं में पाए जाते हैं और एपोप्टोसिस1 को निष्पादित करने के लिए प्रारंभकर्ता द्वारा क्लीव किए जाते हैं। प्रारंभकर्ता में मानव-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 और -12 शामिल हैं। वे निष्क्रिय zymogens (समर्थक-pro-flexes) के रूप में पाए जाते हैं जो निकटता-प्रेरित dimerization द्वारा सक्रिय होते हैं और ऑटो-प्रोटियोलिटिक दरार 2,3 द्वारा स्थिर होते हैं। भड़काऊ 2 का एक सबसेटहै और मनुष्यों में -1, -4, -5, और -12, और माउस 4,5 में -1, -11, और -12 शामिल है। एक एपोप्टोटिक भूमिका के बजाय, वे सूजन में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं। वे प्रो-इंटरल्यूकिन (आईएल) -1 π और प्रो-आईएल -18 6,7 के प्रो-इंटरल्यूकिन प्रसंस्करण और स्रावकी मध्यस्थता करते हैं, जो रोगजनक आक्रमणकारियों 8,9 के जवाब में जारी किए जाने वाले पहले साइटोकिन्स हैं। इसके सक्रियण प्लेटफ़ॉर्म पर भर्ती होने पर सक्रिय किया जाता है; एक बड़े आणविक भार प्रोटीन परिसर को भड़काऊ (चित्रा 1A)10 कहा जाता है। एक noncanonical inflammasomepathway 11,12 के माध्यम से इन प्लेटफार्मों से स्वतंत्र रूप से होता है।

कैनोनिकल इंफ्लेमोसोम साइटोसोलिक मल्टीमेरिक प्रोटीन कॉम्प्लेक्स हैं जिनमें एक भड़काऊ सेंसर प्रोटीन, एडेप्टर प्रोटीन एएससी (एपोप्टोसिस से जुड़े धब्बेदार प्रोटीन जैसे एक कार्ड होते हैं), और प्रभावकारी प्रोटीन -110 होते हैं। सबसे अच्छी तरह से अध्ययन किए गए विहित inflammasomes NOD-जैसे रिसेप्टर परिवार हैं जिसमें एक पाइरिन डोमेन (NLRP), NLRP1 और NLRP3, NLR परिवार जिसमें एक कार्ड (NLRC), NLRC4, और मेलेनोमा 2 (AIM2) में अनुपस्थित है। उनमें से प्रत्येक में एक पाइरिन डोमेन, एक कार्ड, या दोनों डोमेन होते हैं। CARD डोमेन CARD-युक्त और उनके अपस्ट्रीम activators के बीच बातचीत की मध्यस्थता करता है। इसलिए, पाड़ अणु एएससी, जो एक एन-टर्मिनल पाइरिन डोमेन (पीवाईडी) और सी-टर्मिनल कार्ड मोटिफ13,14 से बना है, एनएलआरपी 1 10, एनएलआरपी 3 15, और एआईएम 216 इंफ्लेमेटरी के लिए -1 की भर्ती के लिए आवश्यक है।

प्रत्येक inflammasome अपने अद्वितीय सेंसर प्रोटीन है कि अलग समर्थक भड़काऊ उत्तेजनाओं (चित्रा 1 बी) को पहचानता है के नाम पर नाम दिया है। इस मार्ग के उत्प्रेरकों को विहित उत्तेजना कहा जाता है। Inflammasomes माइक्रोबियल घटकों और ऊतक तनाव के लिए सेंसर के रूप में कामकरते हैं, और भड़काऊ के सक्रियण के माध्यम से एक मजबूत भड़काऊ प्रतिक्रिया को ट्रिगर करने के लिए इकट्ठा करते हैं। Inflammasome असेंबली अपने मुख्य substrates प्रो-IL-1π और प्रो-IL-18 की परिपक्वता और स्राव की मध्यस्थता करने के लिए सक्रियण शुरू करती है। यह प्रक्रिया एक दो-चरणीय तंत्र के माध्यम से होती है। सबसे पहले, एक प्राइमिंग उत्तेजना कुछ भड़काऊ प्रोटीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करती है और एनएफ-एचबी मार्ग के सक्रियण के माध्यम से प्रो-आईएल -1 π। दूसरा, एक इंट्रासेल्युलर (विहित) उत्तेजना भड़काऊ असेंबली और प्रोकैस्पेज़ -1 6,7 की भर्ती को प्रेरित करती है।

4 और 5 के मानव ऑर्थोलॉगहैं। वे इंट्रासेल्युलर लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) द्वारा एक भड़काऊ-स्वतंत्र तरीके से सक्रिय होते हैं, जो ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया18,19,20 की बाहरी झिल्ली में पाया जाने वाला एक अणु है, और बाह्य कोशिकीय हीम द्वारा, लाल रक्त कोशिका हेमोलिसिस21 का एक उत्पाद है। यह प्रस्तावित किया गया है कि एलपीएस सीधे इन प्रोटीनों के कार्ड मोटिफ को बांधता है और उनके ओलिगोमेराइजेशन20 को प्रेरित करता है। रंध्र बनाने वाले प्रोटीन गैसडर्मिन डी (जीएसडीएमडी) 18,19 की दरार के माध्यम से पाइरोप्टोसिस नामक कोशिका मृत्यु के एक भड़काऊ रूप को प्रेरित करके आईएल -1 को सक्रिय करना आईएल -1 π रिलीज को बढ़ावा देता है। इसके अलावा, पोटेशियम आयनों का एफीलेक्स-4 और GSDMD-मध्यस्थता पायरोप्टोटिक मौत के परिणामस्वरूप NLRP3 inflammasome के सक्रियण और बाद में सक्रियण को प्रेरित करता है। इसलिए, एलपीएस के लिए इंट्रासेल्युलर सेंसर -4, -5, और -11 को माना जाता है जोविशिष्ट उत्तेजनाओं 11,24 के जवाब में पाइरोप्टोसिस और सक्रियण को प्रेरित करने में सक्षम हैं।

Figure 1
चित्रा 1: भड़काऊ और bfopes-bimolecular प्रतिदीप्ति पूरकता (BiFC) परख. (A) आरेख जो कि वीनस-बीआईएफसी प्रणाली को दर्शाता है, जहां शुक्र-सी या वीनस-एन) के प्रत्येक गैर-फ्लोरोसेंट टुकड़े से जुड़े दो-1 प्रोडोमेन (सी 1-प्रो) को एनएलआरपी 3 सक्रियण मंच पर भर्ती किया जाता है, जिससे शुक्र को फिर से मोड़ने और फ्लोरेसेस करने के लिए मजबूर किया जाता है। यह परिसर माइक्रोस्कोप के तहत एक हरे रंग के धब्बे के रूप में दिखाई देता है और भड़काऊ-प्रेरित निकटता के लिए एक रीडआउट के रूप में कार्य करता है, जो कि सर्जक सक्रियण में पहला कदम है। (बी) भड़काऊ घटकों और भड़काऊ के डोमेन संगठन को दर्शाने वाली योजनाबद्ध। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

विशिष्ट प्रारंभकर्ता को मापना सक्रियण मुश्किल है, और इमेजिंग दृष्टिकोण द्वारा ऐसा करने के लिए कई तरीके उपलब्ध नहीं हैं। Bimolecular प्रतिदीप्ति पूरकता (BiFC) का उपयोग जीवित कोशिकाओं (चित्रा 1A) 25 में सीधे भड़काऊ सक्रियण की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है। इस तकनीक को हाल ही में मानव मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज (एमडीएम) 21 में उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया है। DiFC भड़काऊ सक्रियण में पहला कदम उपाय करता है, जो dimerization को सुविधाजनक बनाने के लिए निकटता को प्रेरित करता है। कार्ड-युक्त प्रोडोमेन को एन्कोडिंग करने वाले प्लास्मिडों की अभिव्यक्ति फोटोटेबल पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन वीनस (वीनस-सी [वीसी]) और वीनस-एन [वीएन]) के गैर-फ्लोरोसेंट टुकड़ों से जुड़ी हुई है। जब दो प्रोडोमेन को उनके सक्रियण मंच पर भर्ती किया जाता है या प्रेरित निकटता से गुजरते हैं, तो शुक्र के दो हिस्सों को निकटता में लाया जाता है और फिर से मोड़ने और फ्लोरेसेस करने के लिए मजबूर किया जाता है ( चित्रा 1 ए, बी देखें)। यह विशिष्ट भड़काऊ सक्रियण का एक वास्तविक समय रीडआउट प्रदान करता है।

मानव एमडीएम प्रचुर मात्रा में भड़काऊ जीन और पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स को व्यक्त करता है जो खतरे के संकेतों और रोगज़नक़ उत्पादों की पहचान करते हैं। यह भड़काऊ मार्गों की पूछताछ के लिए एक आदर्श सेल प्रकार प्रदान करता है। इसके अलावा, उन्हें परिधीय रक्त से और यहां तक कि रोगी के नमूनों से भी प्राप्त किया जा सकता है ताकि एक विशिष्ट रोग की स्थिति में भड़काऊ सक्रियण का आकलन किया जा सके। यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि न्यूक्लियोफेक्शन का उपयोग करके एमडीएम में BiFC को कैसे पेश किया जाए, एक इलेक्ट्रोपोरेशन-आधारित अभिकर्मक विधि, कैसे कोशिकाओं का इलाज करने के लिए भड़काऊ सक्रियण को प्रेरित करने के लिए, और माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण का उपयोग करके सक्रिय परिसरों की कल्पना कैसे करें। इसके अतिरिक्त, इस पद्धति को इन परिसरों की आणविक संरचना, उपकोशिकीय स्थानीयकरण, कैनेटीक्स और इन अत्यधिक आदेशित संरचनाओं के आकार को निर्धारित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकताहै 25,26,27।

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Protocol

यह प्रोटोकॉल मानव नमूनों के हेरफेर के लिए Baylor College of Medicine की मानव अनुसंधान नैतिकता समिति के दिशानिर्देशों का पालन करता है। मानव नमूनों के लिए संस्थागत सुरक्षा दिशानिर्देशों का पालन करते हुए रक्त के नमूनों को संभाला जाता है। रक्त के नमूने एक क्षेत्रीय रक्त बैंक में प्राप्त किए जाते हैं, जहां उन्हें साइट्रेट फॉस्फेट डेक्सट्रोज (सीपीडी) समाधान के साथ एकत्र किया जाता है। हालांकि, सोडियम हेपरिन, लिथियम हेपरिन, या ईडीटीए जैसे अन्य एंटीकोआगुलंट्स के साथ एकत्र किए गए रक्त का उपयोग इस प्रोटोकॉल28,29 के लिए भी किया जा सकता है।

1. मानव monocytes और मैक्रोफेज में भेदभाव का अलगाव

  1. एक क्षेत्रीय रक्त बैंक में डी-आइडेंटिफाइड स्वस्थ व्यक्तियों से एंटीकोएगुलेटेड रक्त प्राप्त करें और परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) को अलग करें जैसा कि नीचे इंगित किया गया है।
    नोट: एक ऊतक संस्कृति लैमिनर प्रवाह हुड में सभी चरणों का प्रदर्शन करें। बाँझ ट्यूबों का ही प्रयोग करें और दस्ताने पहनें। निपटान करते समय सभी रक्त से संबंधित उत्पादों में 10% ब्लीच जोड़ें। बाँझ PBS (1x) या DPBS (Ca के बिना)2+ और Mg2+) का परस्पर उपयोग किया जा सकता है।
    1. कमजोर पड़ने बफर तैयार करें: 2% FBS और 0.5 mM EDTA के साथ पूरक 1x बाँझ PBS.
    2. संस्कृति माध्यम तैयार करें: एफबीएस (10% (v / v)), ग्लूटामैक्स (2 mM), और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (50 I.U./ 50 μg / mL) के साथ पूरक RPMI-1640 माध्यम
    3. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार चल रहे बफ़र (सामग्री की तालिका) को प्रीकूल करें।
    4. तनुकरण बफर के दो संस्करणों के साथ पूरे रक्त को पतला करें। एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करते हुए, एंटीकोएगुलेटेड रक्त के 15 मिलीलीटर को 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें कमजोर पड़ने वाले बफर के 30 मिलीलीटर होते हैं। व्युत्क्रम द्वारा धीरे से मिलाएं।
    5. पूरे रक्त के प्रत्येक 10 मिलीलीटर या पतले रक्त के 30 मिलीलीटर के लिए, 50 एमएल खाली ट्यूब में घनत्व ग्रेडिएंट माध्यम के 15 एमएल जोड़ें।
    6. चरण 1.1.5 से घनत्व ग्रेडिएंट माध्यम को 30 मिलीलीटर पतला रक्त के साथ धीरे-धीरे और लगातार 25 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके परत करें। ट्यूब की दीवार के खिलाफ पिपेट की नोक और एक झुके हुए कोण पर ट्यूब रखें।
    7. ध्यान से एक झूलते बाल्टी सेंट्रीफ्यूज करने के लिए ट्यूबों हस्तांतरण. दो चरणों को परेशान करने से बचें। 25 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर 400 x g पर ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करें, जिसमें त्वरण और मंदी न्यूनतम मूल्य पर सेट की जाती है।
    8. ध्यान से एक 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करके शीर्ष (स्पष्ट) प्लाज्मा परत को हटा दें और ब्लीच (10%) के साथ एक कंटेनर में निपटाएं।
    9. परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMCs, चित्रा 2) की interphase (सफेद) परत को 10 mL पिपेट के साथ इकट्ठा करें और एक ताजा 50 mL ट्यूब में स्थानांतरित करें। एक ही दाता के विभिन्न ट्यूबों से सफेद परत को 30 मिलीलीटर तक 50 मिलीलीटर ट्यूब में मिलाएं।
    10. प्रत्येक ट्यूब को चरण 1.1.1 से कमजोर पड़ने वाले बफर के साथ 50 मिलीलीटर की कुल मात्रा में लाएं और 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज और 10 मिनट के लिए 4 °C पर सेंट्रीफ्यूज करें। एक 10 मिलीलीटर पिपेट के साथ supernatant निकालें और ब्लीच (10%) के साथ एक कंटेनर में इसका निपटान करें।
    11. एक p1000 micropipette का उपयोग कर चरण 1.1.3 से पूर्व-ठंडा चल रहे बफर के 1 mL में प्रत्येक सेल गोली resuspend. एक नए 15 एमएल ट्यूब में एक ही दाता से सेल निलंबन गठबंधन. पूर्व ठंडा चल बफर के साथ 15 मिलीलीटर करने के लिए प्रत्येक ट्यूब की मात्रा लाओ और व्युत्क्रम द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण।
    12. चरण 1.1.11 से सेल निलंबन का 20 μL ऐलीकोट लें और 1x बाँझ पीबीएस का उपयोग करके 1: 100 कमजोर पड़ने की तैयारी करें। हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल संख्या निर्धारित करें।
    13. 10 मिनट के लिए 300 x g और 4 °C पर चरण 1.1.11 से सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें और 10 mL पिपेट के साथ supernatant को हटा दें। यदि आवश्यक हो, तो supernatant को पूरी तरह से हटाने के लिए एक p200 माइक्रोपिपेट का उपयोग करें।
    14. प्रत्येक 1 x 107 कोशिकाओं के लिए बफर चलाने वाले पूर्व-ठंडा MACS के 80 μL में पृथक PBMCs को फिर से निलंबित कर दिया, बफर के अधिकतम 800 μL तक जोड़ दिया।
    15. प्रत्येक 1 x 107 कोशिकाओं के प्रति मानव विरोधी CD14 माइक्रोबीड्स के 20 μL जोड़ें या प्रति रक्त के नमूने के प्रति 100 μL तक (~ 100 मिलीलीटर undiluted रक्त)। व्युत्क्रम द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर निरंतर मिश्रण के साथ 20 मिनट के लिए एक ट्यूब रोटेटर पर रखें।
    16. ट्यूब रोटेटर से नमूनों को निकालें, प्रत्येक ट्यूब के लिए पूर्व-ठंडा चलने वाले बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ें, और 300 x g (त्वरण = 5, मंदी = 5) और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    17. एक 10 mL पिपेट के साथ supernatant निकालें और पूर्व-ठंडा चल बफर (2 x 108 / mL) के 500 μL में 1 x 108 कोशिकाओं तक resuspend।
    18. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक मैनुअल या स्वचालित प्रणाली (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके चुंबकीय सेल सॉर्टिंग द्वारा CD14-सकारात्मक कोशिकाओं के अलगाव का प्रदर्शन करें।
    19. CD14-सकारात्मक चयन के बाद चरण 1.1.18 से सेल निलंबन का 20 μL ऐलीकोट लें और 1x बाँझ PBS का उपयोग करके 1:100 कमजोर पड़ने की तैयारी करें। हेमोसाइटोमीटर पर कोशिकाओं की गणना करके कक्ष संख्या निर्धारित करें।
    20. 300 x g पर CD14-सकारात्मक कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें और 10 मिनट के लिए RT। एक 10 mL पिपेट या एक वैक्यूम सिस्टम का उपयोग कर supernatant निकालें।
    21. चरण 1.1.20 से चरण 1.1.2 से चरण 1.1.2 से 1 x 107 कोशिकाओं / एमएल के अंतिम सेल घनत्व के लिए चरण 1.1.20 से सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
  2. 5 x 10 6 कोशिकाओं के सेल घनत्व पर अलग-थलग CD14-सकारात्मक मोनोसाइट्स को बीजदें ।
    1. एक 10 सेमी ऊतक संस्कृति पकवान पर, 50 एनजी / एमएल ग्रैनुलोसाइट्स-मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) के साथ पूरक चरण 1.1.2 से 10 एमएल संस्कृति माध्यम जोड़ें।
    2. चरण 1.1.21 से सेल निलंबन के 0.5 मिलीलीटर को संस्कृति माध्यम ड्रॉपवाइज में जोड़ें और धीरे से प्लेट को घुमाएं। एक humidified ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में कोशिकाओं को रात भर इनक्यूबेट करें।
    3. अगले दिन, उन कोशिकाओं को हटाने के लिए वैक्यूम सिस्टम का उपयोग करके माध्यम को एस्पिरेट करें जो रात भर संलग्न नहीं थे। पूर्ण विभेदन की अनुमति देने के लिए 7 दिनों के लिए एक ह्यूमिडिफाइड टिश्यू कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में 10 मिलीलीटर ताजा संस्कृति माध्यम पूरक जीएम-सीएसएफ (50 एनजी / एमएल) और इनक्यूबेट कोशिकाओं के 10 एमएल जोड़ें (जीएम-सीएसएफ में भेदभाव के विभिन्न चरणों में सीडी 14 + मोनोसाइट्स की उपस्थिति के लिए चित्रा 3 ए देखें)। हर 2-3 दिनों में संस्कृति माध्यम का आदान-प्रदान करें और हर बार ताजा जीएम-सीएसएफ (50 एनजी / एमएल) के साथ पूरक करें।

Figure 2
चित्र 2: प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो का योजनाबद्ध अवलोकन. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

2. electroporation घटकों की तैयारी

नोट:: यह प्रोटोकॉल एक 10 μL-नियॉन टिप (सामग्री की तालिका) के लिए डिज़ाइन किया गया है। प्रत्येक अभिकर्मक के लिए, 1-2 x 105 कोशिकाओं का उपयोग करें। यह एक 48-अच्छी तरह से प्लेट या 8-अच्छी तरह से चेंबर्ड डिश (10 μL-transfected कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से) पर transfected कोशिकाओं को बीज करने की सिफारिश की जाती है। 1x बाँझ DPBS (Ca2+ और Mg2+ के बिना) PBS के स्थान पर इस्तेमाल किया जा सकता है।

  1. दिन 7 पर, FBS (10% (v / v)) और ग्लूटामैक्स (2 mM) के साथ RPMI-1640 माध्यम को पूरक करके एंटीबायोटिक मुक्त माध्यम तैयार करें।
  2. सीरम-मुक्त RPMI-1640 मध्यम, ट्रिप्सिन-EDTA (0.25%) समाधान, 1x बाँझ PBS (Ca2+ और Mg2+ के बिना), और 37 °C पानी के स्नान में चरण 1.1.2 से पूर्ण संस्कृति माध्यम रखें।
  3. यदि ग्लास-बॉटम वाले व्यंजनों का उपयोग कर रहे हैं (कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए) पॉली-डी-लाइसिन हाइड्रोब्रोमाइड के साथ व्यंजनों को कोट करें।
    1. पॉली-डी-लाइसिन हाइड्रोब्रोमाइड (1x बाँझ पीबीएस में 0.1 मिलीग्राम / एमएल) के 200 μL के साथ एक 8 अच्छी तरह से कक्षवाले पकवान को कोट करें और आरटी में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. पॉली-डी-लाइसिन समाधान को एस्पिरेट करें और 1x बाँझ पीबीएस के साथ एक बार ग्लास को धो लें। PBS aspirate और चरण 2.4 के साथ आगे बढ़ें।
  4. 48 अच्छी तरह से प्लेट या 8 अच्छी तरह से कक्षवाले पकवान के प्रति एंटीबायोटिक-मुक्त माध्यम के 200 μL जोड़ें और एक humidified ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में पूर्व-इनक्यूबेट करें जब तक कि ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं को प्लेट करने के लिए तैयार न हो।

3. electroporation के लिए कोशिकाओं की तैयारी

नोट: 7-दिवसीय विभेदन अवधि के अंत में 10 सेमी डिश से MDM की उपज लगभग 1.5 x 106 कोशिकाएं हैं। 1x बाँझ DPBS (Ca2+ और Mg2+ के बिना) PBS के स्थान पर इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया था ताकि अधिकांश मैक्रोफेज को सेल व्यवहार्यता और अखंडता के रखरखाव के साथ प्लेट से अलग कर दिया जाए। एमडीएम सेल संस्कृति प्लेटों से अलग करना मुश्किल है। इसलिए, कोशिकाओं को अलग करने के लिए चरण 3.2 और 3.3 को दो बार निष्पादित करना आवश्यक हो सकता है। सुनिश्चित करें कि ट्रिप्सिन-ईडीटीए (0.25%) के साथ प्रत्येक इनक्यूबेशन समय 5 मिनट से अधिक नहीं है।

  1. 10 सेमी बर्तनों पर पूरी तरह से विभेदित मैक्रोफेज से मीडिया को एस्पिरेट करें और गर्म सीरम-मुक्त आरपीएमआई -1640 माध्यम के साथ सेल मोनोलेयर को धोएं। माध्यम को पूरी तरह से हटाना सुनिश्चित करें।
  2. 2 मिलीलीटर गर्म ट्रिप्सिन-ईडीटीए (0.25%) समाधान प्रति 10 सेमी डिश जोड़कर कोशिकाओं को काटें और 5 मिनट के लिए एक ह्यूमिडिफाइड टिशू कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में इनक्यूबेट करें।
  3. धीरे से ट्रिप्सिन-ईडीटीए (0.25%) समाधान को एक p1000 माइक्रोपिपेट का उपयोग करके पूरे डिश क्षेत्र में ऊपर और नीचे पाइप करके सेल टुकड़ी को पूरा करें। चरण 1.1.2 से गर्म पूर्ण संस्कृति माध्यम के 5 मिलीलीटर युक्त एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लिए सेल निलंबन स्थानांतरित करें।
  4. डिश को एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप में ले जाएं और दृश्य के विभिन्न क्षेत्रों में सेल टुकड़ी की जांच करें। यदि अभी भी काफी मात्रा में कक्ष अनुलग्न हैं, तो चरण 3.2-3.3 दोहराएँ।
  5. RT पर 5 मिनट के लिए 250 x g पर सेल निलंबन centrifuge.
  6. मध्यम aspirate और 1x बाँझ PBS के 10 mL में कोशिकाओं resuspend पूर्व 37 डिग्री सेल्सियस करने के लिए गर्म. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल संख्या निर्धारित करने के लिए 20 μL ऐलीकोट लें।
  7. 1-2 x 105 कोशिकाओं प्रति इच्छित अभिकर्मक लें और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में जगह। पूर्व गर्म 1x बाँझ PBS के साथ 15 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए लाओ. आरटी पर 5 मिनट के लिए 250 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  8. 250 x g पर 1 मिनट के लिए PBS और centrifuge एक और बार एस्पिरेट करें। एक p200 micropipette का उपयोग कर सेल गोली से किसी भी अवशिष्ट PBS निकालें.

4. मानव मोनोसाइट व्युत्पन्न मैक्रोफेज में BiFC घटकों के न्यूक्लियोफेक्शन

नोट:: प्रोटोकॉल का यह अनुभाग नियॉन अभिकर्मक सिस्टम (सामग्री की तालिका) का उपयोग कर किया जाता है। यह प्रोटोकॉल 10 μL नियॉन टिप (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके 1-2 x 105 कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के चरणों को रेखांकित करता है। यदि 100 μL नियॉन टिप का उपयोग कर रहे हैं, तो तदनुसार स्केल करें। 15 मिनट से अधिक समय के लिए पुनर्सस्पेंशन बफर आर के लिए कोशिकाओं को उजागर करने से बचें, क्योंकि यह सेल व्यवहार्यता और अभिकर्मक दक्षता को कम कर सकता है।

  1. रिपोर्टर प्लास्मिड (यानी, mCherry या dsRedmito पर 100 ng / μL) न्यूक्लिएज मुक्त पानी या 0.5x TE बफर में पतला transfected कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए।
  2. न्यूक्लिएज-मुक्त पानी या 0.5x TE बफर में एक उपयुक्त एकाग्रता के लिए BiFC प्लास्मिड को पतला करें, ताकि प्लास्मिड की कुल मात्रा 10 μL की कुल अभिकर्मक मात्रा के 30% से अधिक न हो (यानी, C1 Pro-VC के 300 ng / μL और C1 Pro-VN के 300 ng / μL)।
  3. एक 1.5 mL बाँझ माइक्रोट्यूब प्रति इरादा अभिकर्मक तैयार करें और रिपोर्टर प्लास्मिड (यानी, 50 ng या 0.5 μL) और BieFC plasmids (यानी, 300 ng या C1 प्रो-VN टुकड़ा के 1 μL) की उचित मात्रा जोड़ें। हर समय हुड में microtubes रखें.
  4. पिपेट स्टेशन, डिवाइस, टिप्स, इलेक्ट्रोपोरेशन ट्यूब, और पिपेट को बाँझ लैमिनर प्रवाह हुड में रखें।
    नोट:: पिपेट स्टेशन, डिवाइस, युक्तियाँ, electroporation ट्यूब, और पिपेट नियॉन अभिकर्मक प्रणाली में शामिल हैं।
  5. निर्माता के निर्देशों के अनुसार डिवाइस पर रियर पोर्ट के लिए पिपेट स्टेशन पर उच्च वोल्टेज और सेंसर कनेक्टर को कनेक्ट करें। पिपेट स्टेशन को डिवाइस के करीब रखें।
  6. पावर कॉर्ड को रियर एसी इनलेट से कनेक्ट करें और डिवाइस को इलेक्ट्रिकल आउटलेट से कनेक्ट करने के लिए आगे बढ़ें। डिवाइस को चालू करने के लिए पावर स्विच दबाएँ.
  7. डिवाइस चालू और उचित रूप से कनेक्ट किया गया है, जब प्रदर्शित स्टार्टअप स्क्रीन में अभिकर्मक पैरामीटर दर्ज करें। वोल्टेज पर प्रेस, 1000 दर्ज करें, और 1000 V. चौड़ाई पर प्रेस करने के लिए वोल्टेज सेट करने के लिए किया पर प्रेस, 40 दर्ज करें, और 40 ms करने के लिए पल्स अवधि सेट करने के लिए किया पर प्रेस। अंत में, # दालों पर प्रेस, 2 दर्ज करें, और बिजली की दालों की संख्या 2 पर सेट करने के लिए डन पर दबाएं।
  8. इलेक्ट्रोपोरेशन ट्यूबों में से एक (किट में प्रदान की गई) लें और इसे आरटी पर इलेक्ट्रोलाइटिक बफर ई (10 μL युक्तियों के लिए और किट में प्रदान किए गए) के 3 मिलीलीटर के साथ भरें। पिपेट स्टेशन पर पिपेट धारक में इलेक्ट्रोपोरेशन ट्यूब डालें। सुनिश्चित करें कि ट्यूब के किनारे पर इलेक्ट्रोड अंदर की ओर का सामना कर रहा है और जब ट्यूब डाला जाता है तो एक क्लिक ध्वनि सुनाई देती है।
  9. चरण 3.8 से सेल गोली ले लो और प्रत्येक 1-2 x 105 कोशिकाओं के लिए पूर्व-गर्म resuspension R बफर (किट में प्रदान की गई) के 10 μL जोड़ें। एक p20 माइक्रोपिपेट के साथ धीरे से मिश्रण. चरण 4.3 में स्थापित प्रत्येक ट्यूब के लिए सेल निलंबन के 10 μL जोड़ें और एक p20 माइक्रोपिपेट के साथ धीरे से मिश्रण।
  10. पिपेट लें और दूसरे स्टॉप पर पुश बटन दबाकर एक टिप डालें। सुनिश्चित करें कि क्लैंप पूरी तरह से टिप में पिस्टन के बढ़ते स्टेम को उठाता है और पिपेट के शीर्ष-सिर में कोई अंतर नहीं देखा जाता है।
  11. नमूने को एस्पिरेट करने के लिए, पिपेट पर पुश बटन को पहले स्टॉप पर दबाएं और सेल / प्लास्मिड डीएनए मिश्रण युक्त पहली ट्यूब में डुबकी लगाएं। धीरे-धीरे मिश्रण को पिपेट टिप में एस्पिरेट करें।
    नोट: हवा के बुलबुले से बचें क्योंकि वे इलेक्ट्रोपोरेशन के दौरान आर्किंग का कारण बन सकते हैं, और यदि डिवाइस द्वारा पता लगाया जाता है, तो इलेक्ट्रिक पल्स के वितरण को रोक सकता है। यदि हवा के बुलबुले देखे जाते हैं, तो सामग्री को ट्यूब में छोड़ दें और फिर से एस्पिरेटिंग का प्रयास करें।
  12. पिपेट धारक में बहुत सावधानी से नमूने के साथ पिपेट डालें। सुनिश्चित करें कि पिपेट क्लिक करता है और यह ठीक से रखा गया है।
  13. टचस्क्रीन पर स्टार्ट दबाएं और इलेक्ट्रिक दालों के वितरित होने तक प्रतीक्षा करें। स्क्रीन पर एक संदेश पूरा होने का संकेत देगा।
  14. धीरे-धीरे स्टेशन से पिपेट को हटा दें और तुरंत पहले स्टॉप पर पुश-बटन को धीरे-धीरे दबाकर चरण 2.4 से पूर्व-गर्म एंटीबायोटिक-मुक्त माध्यम के साथ संबंधित अच्छी तरह से ट्रांसफेक्टेड सेल निलंबन जोड़ें।
    नोट: इस टिप को एक ही प्लास्मिड के लिए तीन बार तक पुन: उपयोग किया जा सकता है; अन्यथा, इसे दूसरे स्टॉप पर पुश बटन दबाकर एक बायोहैजार्ड अपशिष्ट कंटेनर में छोड़ दें।
  15. एक सेल / प्लास्मिड डीएनए मिश्रण युक्त प्रत्येक ट्यूब के लिए चरण 4.10-4.14 को दोहराएं।
  16. धीरे से ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं के साथ प्लेट को रॉक करें और एक ह्यूमिडिफाइड टिशू कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) में 1-3 घंटे के लिए इनक्यूबेटकरें।
  17. चरण 1.1.2 से पूर्व-गर्म संस्कृति माध्यम (पूर्ण माध्यम) के प्रत्येक अच्छी तरह से 200 μL में जोड़ें। डिश को ह्यूमिडिफाइड टिश्यू कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में फिर से रखें। जीन अभिव्यक्ति के लिए कम से कम 24 घंटे की अनुमति दें।
  18. अगले दिन, एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता और अभिकर्मक दक्षता का निरीक्षण करें।
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप और फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत बॉक्स को चालू करें और माइक्रोस्कोप चरण पर संस्कृति पकवान रखें।
    2. 10x या 20x उद्देश्य और 568 nm (RFP) फ़िल्टर का चयन करें।
    3. कक्ष व्यवहार्यता का अनुमान लगाने के लिए, चयनित फ़ील्ड में सभी कक्षों को विज़ुअलाइज़ करने के लिए प्रेषित लाइट LED (TL) बटन दबाएँ. माइक्रोस्कोप आईपीस में देखते समय, फोकस घुंडी को तब तक चालू करें जब तक कि कोशिकाओं को नहीं देखा जाता है और चयनित क्षेत्र में सेल अनुलग्नक की जांच करें।
      नोट:: पूरी तरह से संलग्न कक्ष व्यवहार्य कक्षों का प्रतिनिधित्व करते हैं जबकि फ़्लोटिंग कक्ष गैर-व्यवहार्य कक्षों का प्रतिनिधित्व करते हैं। यदि कुएं की confluency उच्च है, तो गैर-संलग्न कोशिकाओं की उपस्थिति सेल संख्या के एक अतिरेक का परिणाम हो सकती है और कम व्यवहार्यता का परिणाम नहीं हो सकती है। हालांकि, फ्लोटिंग कोशिकाओं की एक उच्च सामग्री के साथ कम confluency कम व्यवहार्यता को दर्शाती है जो इलेक्ट्रोपोरेशन, प्लास्मिड विषाक्तता, या पुनर्सस्पेंशन आर बफर के लिए ओवरएक्सपोजर के दौरान आर्किंग के परिणामस्वरूप हो सकती है। उन कुओं का उपयोग न करें जो बाद के व्यवहार को प्रदर्शित करते हैं।
    4. अभिकर्मक दक्षता का अनुमान लगाने के लिए, ऊपर वर्णित संचारित प्रकाश के तहत चयनित क्षेत्र में कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करें। चयनित फ़ील्ड में कक्षों की कुल संख्या की गणना करें. संचारित लाइट LED (TL) बंद करने के साथ, चालू करने के लिए परावर्तित लाइट LED बटन (RL) दबाएँ.
    5. रिपोर्टर जीन प्रतिदीप्ति (लाल कोशिकाओं) पर ठीक ध्यान केंद्रित करें और लाल फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करें। इन चरणों (4.18.4-4.18.5) को प्रति अच्छी तरह से कम से कम दो और फ़ील्ड के लिए दोहराएँ।

5. transfected MDM के उपचार और BiFC डेटा अधिग्रहण

नोट: यदि एक एपिफ्लोरेसेंस या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कोशिकाओं की छवि बनाने की योजना बना रहे हैं, तो चुने हुए उत्तेजना के साथ 1 घंटे पहले के उपचार के लिए qVD-OPh (20 μM) के साथ उपचार को सलाह दी जाती है कि वे एपोप्टोसिस-निर्भर सेल मृत्यु (मुख्य रूप से एपोप्टोसिस) को रोकें। इसका उपयोग एपोप्टोसिस के कारण कोशिकाओं को उठाने से रोकने के लिए इमेजिंग में किया जाता है, जिससे उन्हें फोकल प्लेन से बाहर निकलने के रूप में छवि बनाना बहुत मुश्किल हो जाता है। ध्यान दें कि सक्रियण प्लेटफ़ॉर्म और संबंधित BiFC के लिए भर्ती, की उत्प्रेरक गतिविधि पर निर्भर नहीं है, और परिणामस्वरूप, इस चरण को प्रभावित नहीं करेगा।

  1. प्रत्येक दवा के लिए आवश्यक होने तक अभिकर्मक और इनक्यूबेट के बाद लगभग 24 घंटे के लिए चुने हुए उत्तेजना के साथ इलाज करें।
    1. हेप्स (20 mM, pH 7.2-7.5) और 2-mercaptoethanol (55 μM) के साथ चरण 1.1.2 से संस्कृति माध्यम को पूरक करके इमेजिंग माध्यम तैयार करें।
    2. पूर्व गर्म इमेजिंग माध्यम के लिए उत्तेजना की वांछित एकाग्रता जोड़ें और धीरे से मिश्रण।
    3. एक p1000 micropipette के साथ ध्यान से कोशिकाओं से मीडिया को निकालें और अच्छी तरह से पक्ष के नीचे चरण 5.1.2 से उत्तेजना समाधान के 500 μL जोड़ें।
    4. अनुपचारित नियंत्रण कुओं को चलाने के लिए, उत्तेजना के बिना इमेजिंग माध्यम जोड़ें।
    5. एक humidified ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें जब तक कि प्रत्येक उपचार के लिए संकेत दिया जाता है।
  2. एक एपिफ्लोरेसेंस या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कोशिकाओं की कल्पना करें।
    1. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए माइक्रोस्कोप और फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत को चालू करें।
    2. 10x या 20x उद्देश्य का चयन करें और माइक्रोस्कोप चरण पर संस्कृति पकवान जगह।
    3. माइक्रोस्कोप आईपीस का उपयोग करते हुए, 568 एनएम फिल्टर के तहत कोशिकाओं को ढूंढें और dsRedmito / mCherry रिपोर्टर (लाल कोशिकाओं) को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करें।
    4. दृश्य फ़ील्ड में सभी लाल कक्षों की गणना करें और संख्या रिकॉर्ड करें।
    5. जबकि एक ही दृश्य क्षेत्र में, 488 या 512 फ़िल्टर (जीएफपी या वाईएफपी) में बदलें, लाल कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए आगे बढ़ें जो हरे (शुक्र-सकारात्मक या बीआईएफसी-पॉजिटिव) भी हैं और संख्या रिकॉर्ड करते हैं।
    6. कम से कम तीन अलग-अलग दृश्य क्षेत्रों से कम से कम 100 dsRedmito / mCherry -positive कोशिकाओं की गणना करें।
    7. प्रति दृश्य क्षेत्र में शुक्र-सकारात्मक ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना करें और मानक विचलन प्राप्त करने के लिए प्रत्येक उपचार (अच्छी तरह से) के लिए परिणामी प्रतिशत का औसत करें।
  3. एक epifluorescence या confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कोशिकाओं की छवि
    नोट: एक 20x उद्देश्य या एक अधिक आवर्धन का उपयोग कर confocal छवियों को प्राप्त करने के लिए, कोशिकाओं को कांच के व्यंजनों पर मढ़वाया जाना चाहिए जब तक कि माइक्रोस्कोप एक लंबे पास उद्देश्य से सुसज्जित न हो।
    1. चरणों का पालन करें 5.2.1-5.2.3. यदि 40x, 60x या 63x तेल उद्देश्य के साथ एक confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग कर रहे हैं, तो उद्देश्य पर तेल की एक बूंद रखें।
    2. कैमरे द्वारा अधिग्रहित के रूप में कंप्यूटर स्क्रीन पर कोशिकाओं की लाइव छवि विज़ुअलाइज़ करें। फ्लोरोसेंट छवियों के लिए epifluorescence प्रकाश स्रोत का उपयोग करें या confocal छवियों के लिए लेजर के लिए प्रकाश स्रोत स्विच।
    3. जॉयस्टिक नियंत्रण और फोकस व्हील का उपयोग करके कोशिकाओं के फोकस और स्थिति को ठीक करें।
    4. 512 एनएम या 488 एनएम (वाईएफपी या जीएफपी) और 568 एनएम (आरएफपी) लेजर के लिए प्रतिशत लेजर शक्ति और एक्सपोजर समय सेट करें ताकि छवि में सिग्नल अच्छा दिखे और संतृप्ति तक न पहुंचे।
    5. लाइव कैप्चर चालू करें और परिणामी छवि की जांच करें। सुनिश्चित करें कि दोनों चैनलों के लिए प्रदर्शन हिस्टोग्राम में प्रत्येक फ्लोर के लिए एक अलग चोटी देखी जाती है।
    6. आवश्यक के रूप में लेजर शक्ति और जोखिम समय को समायोजित करें। इन मूल्यों को जितना संभव हो उतना कम रखें, जबकि अभी भी फ्लोरोसेंट सिग्नल (आरएफपी और जीएफपी / वाईएफपी) दोनों का पता लगाने में सक्षम हैं।
    7. कोशिकाओं की लाइव छवि को विज़ुअलाइज़ करते समय, एक फ़ील्ड की कई प्रतिनिधि छवियां लें जिसमें प्लेट के प्रत्येक कुएं के लिए mCherry / dsRedmito रिपोर्टर को व्यक्त करने वाली एक या अधिक कोशिकाएं होती हैं और डेटा को सहेजती हैं।

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Representative Results

चित्र 2 में दर्शाई गई योजना मानव MDM को प्राप्त करने, ट्रांसफ़ेक्ट करने और छवि बनाने के तरीके का अवलोकन देती है। 7 दिनों के लिए GM-CSF के साथ चयनित CD14+ मोनोसाइट्स के इनक्यूबेशन के बाद, विभेदन अवधि (चित्रा 3A) के दौरान सेल आकृति विज्ञान में परिवर्तन होता है, जो गोलाकार निलंबन कोशिकाओं से स्पिन्डली और पूरी तरह से संलग्न (दिन 3 और 4) तक जाता है, और अंत में अधिक फैलने वाली कोशिकाओं के लिए जब पूरी तरह से विभेदित (दिन 7)। पूरी तरह से विभेदित कोशिकाओं को तब प्लेट से अलग कर दिया जाता है और रिपोर्टर प्लास्मिड (उदाहरण के लिए, dsRedmito, एक प्लास्मिड एन्कोडिंग एक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन माइटोकॉन्ड्रिया के लिए लक्षित) के साथ-साथ बीआईएफसी जोड़े (वीसी और वीएन) के साथ ट्रांसफेक्ट किया जाता है, जिसका उपयोग ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं (चित्रा 3 बी) को लेबल करने के लिए किया जाता है और 24 घंटे के बाद अभिकर्मक की दक्षता का आकलन करने के लिए नियोजित किया जाता है। नाइजेरिसिन (5 μM) के साथ 20 ज के लिए इलाज किए गए बीआईएफसी परिणामों का एक उदाहरण दिखाएं, जो एक ज्ञात प्रो-इंफ्लेमेटरी उत्तेजना है जो एनएलआरपी 3 इंफ्लेमेटरी30,31 की असेंबली को ट्रिगर करता है। अनुपचारित कोशिकाएं कोई शुक्र प्रतिदीप्ति (चित्रा 3 बी) नहीं दिखाती हैं, और नाइजेरिसिन-उपचारित कोशिकाओं में, एएससी के विशिष्ट आकार के साथ एक एकल पंक्टम के रूप में दिखाई देता है32,33,25 (चित्रा 3 सी)। चित्र 3D शुक्र-धनात्मक MDM की मात्रा का एक उदाहरण दर्शाता है। LPS + नाइजेरिसिन उपचार समूह (चित्र 3D) में 1 BiFC का उच्चतम प्रतिशत देखा जाता है। यह परिणाम एक विहित ज्वलनशील के सक्रियण के अनुरूप है, जहां कैपेस -1 के सक्रियण के लिए एक प्राइमिंग सिग्नल (एलपीएस) और एक इंट्रासेल्युलर सिग्नल (नाइजरिसिन) दोनों की आवश्यकता होती है।

Figure 3
चित्रा 3: CD14-monocytes का विभेदन और मानव MDM का अभिकर्मक(A) परिधीय रक्त से CD14+ मोनोसाइट्स की प्रतिनिधि उज्ज्वल-क्षेत्र छवियां GM-CSF के संपर्क में दिन 1, 3, 4, और 7 में विभेदन (स्केल बार, 100 μm)। (B-C) मानव MDM को 1 समर्थक BiFC जोड़े और अभिकर्मक रिपोर्टर dsRedmito (50 ng, लाल) के साथ transfected थे। 24 घंटे बाद, कोशिकाओं को 3 घंटे के लिए एलपीएस (100 एनजी / एमएल) के साथ और बिना प्राइम किया गया था और 20 घंटे के लिए इमेजिंग माध्यम में नाइजरिसिन (5 μM) के साथ इलाज किया गया था। अनुपचारित और नाइजेरिसिन-उपचारित कोशिकाओं की प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियों को दिखाया गया है (स्केल बार, 10 μm)। BiFC हरे रंग में दिखाया गया है। (डी) (सी) से कोशिकाओं का मूल्यांकन डीएसरेडमाइटो-पॉजिटिव कोशिकाओं (लाल, ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं) के प्रतिशत के लिए किया गया था जो 20 घंटे में वीनस-पॉजिटिव (हरे, 1 बीआईएफसी कॉम्प्लेक्स) थे। त्रुटि सलाखों प्रति अच्छी तरह से कम से कम दो स्वतंत्र गिनती के एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्लास्मिड अनुमापन का एक उदाहरण चित्रा 4 में दिखाया गया है, जहां प्रत्येक BiFC प्लास्मिड की बढ़ती मात्रा transfected है। यह प्लास्मिड की इष्टतम खुराक के चयन के लिए अनुमति देता है, जिसके परिणामस्वरूप एक विशिष्ट संकेत और न्यूनतम पृष्ठभूमि होती है। चित्रा 4A मानव MDM के परिणामों को दिखाता है जो कि हेम के साथ इलाज किए गए -1, -4, और -5 समर्थक BiFC जोड़े (वीसी और वीएन) की बढ़ती सांद्रता के साथ संक्रमित होते हैं, एक अत्यधिक समर्थक भड़काऊ अणु जो लाल रक्त कोशिका विनाश34 के परिणामस्वरूप होता है। 400 एनजी, 500 एनजी, और 1000 एनजी ट्रांसफेक्टेड प्लास्मिड के परिणामस्वरूप क्रमशः 400 एनजी, -4, और -5 समर्थक बीआईएफसी जोड़े के लिए शुक्र-सकारात्मक कोशिकाओं का उच्चतम प्रतिशत। हालांकि, प्लास्मिड की उच्चतम मात्रा का उपयोग करने से गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि (चित्रा 4 बी) में वृद्धि का खतरा भी होता है। उदाहरण के लिए, 1000 एनजी के अभिकर्मक-5 समर्थक BiFC जोड़ी के परिणामस्वरूप लगभग 40% गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि होती है। इसलिए, कम 700 एनजी राशि का उपयोग करना इस प्लास्मिड जोड़ी (चित्रा 4 बी) के लिए इष्टतम माना जाता है। चित्रा 4C में, 24 h पोस्ट-ट्रांसफ़ेक्शन कोशिकाओं के क्षेत्र के 20x उद्देश्य के साथ प्राप्त प्रतिनिधि कन्फोकल छवियों को दिखाया गया है। इस छवि में, कोई भी देख सकता है कि अनुपचारित ट्रांसफेक्टेड कोशिकाएं माइटोकॉन्ड्रिया की उपस्थिति के आधार पर व्यवहार्य हैं (मृत कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रिया अत्यधिक खंडित होते हैं) और कोशिकाओं की आकृति विज्ञान (एपोप्टोटिक कोशिकाएं सिकुड़ जाती हैं)। हीम के साथ उपचार के बाद, एक एकल हरे रंग का पंक्टम के रूप में दिखाई देता है जो चित्रा 3 सी में नाइजेरिसिन द्वारा प्रेरित एक के समान है, और इसकी उपस्थिति सेल सिकुड़न के साथ थी।

Figure 4
चित्रा 4: मानव एमडीएम विभिन्न मात्रा में भड़काऊ प्रो BiFC जोड़े के साथ transfected. (ए) का अनुमापन -1 प्रो; -4 प्रो; या 5 समर्थक BiFC जोड़े। मानव एमडीएम को एक अभिकर्मक रिपोर्टर (50 एनजी) के रूप में dsRedmito के साथ समर्थक BiFC जोड़े की संकेतित मात्रा के साथ संक्रमित किया गया था और रात भर इनक्यूबेट किया गया था। अगले दिन, संस्कृति माध्यम को सभी कुओं से हटा दिया गया था, और कोशिकाओं को 0.1% एफबीएस माध्यम में हीम (50 μM) के साथ और बिना इलाज किया गया था। 1 घंटे के बाद, एफबीएस एकाग्रता को 5% तक पुनर्गठित करने और कोशिकाओं को मारने से हीम को रोकने के लिए सभी कुओं में समान मात्रा में पूर्ण माध्यम जोड़ा गया था। 20 ज के कुल उपचार के बाद, कोशिकाओं को dsRedmito-positive transfected कोशिकाओं के प्रतिशत के लिए मूल्यांकन किया गया था जो शुक्र-सकारात्मक थे, जो प्रति अच्छी तरह से कम से कम 300 कोशिकाओं से निर्धारित किए गए थे। त्रुटि सलाखों प्रति अच्छी तरह से कम से कम तीन स्वतंत्र गिनती के एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं। (बी) मानव मध्याह्न भोजन को चयनित मात्रा में -1 प्रो के साथ संक्रमित किया गया था; -4 प्रो; या dsRedmito (50 ng) के साथ-साथ अभिकर्मक के लिए एक रिपोर्टर के रूप में-5 समर्थक BiFC जोड़े। 24 ज पोस्ट-ट्रांसफेक्शन, कोशिकाओं को 0.1% एफबीएस में हीम (50 μM) के साथ या बिना इलाज किया गया था। 1 घंटे के बाद, एफबीएस को एक्स्ट्रासेल्युलर हीम को बाधित करने के लिए 5% तक पुनर्गठित किया गया था। कोशिकाओं का मूल्यांकन dsRedmito-positive cells (red, transfected cells) के प्रतिशत के लिए किया गया था, जो शुक्र-पॉजिटिव (हरे, बीआईएफसी कॉम्प्लेक्स) थे, जो प्रति अच्छी तरह से कम से कम 300 कोशिकाओं से निर्धारित 20 घंटे पर थे। परिणाम प्रतिशत शुक्र-सकारात्मक कोशिकाओं के रूप में दर्शाया जाता है। त्रुटि सलाखों प्रति अच्छी तरह से कम से कम तीन स्वतंत्र गिनती के एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं। (सी) प्रतिनिधि कन्फोकल छवियों को कोशिकाओं के क्षेत्र के 20x उद्देश्य के साथ प्राप्त किया गया 24 ज पोस्ट-ट्रांसफैक्शन और हेम के साथ और बिना इलाज किया जाता है जैसा कि (बी) में वर्णित है। लाल: dsRedmito-सकारात्मक कोशिकाओं; ग्रीन: शुक्र-सकारात्मक कोशिकाएं; स्केल बार, 20 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल मानव रक्त के नमूनों से अलग मोनोसाइट्स से मैक्रोफेज प्राप्त करने के लिए वर्कफ़्लो का वर्णन करता है और सेल व्यवहार्यता और व्यवहार से समझौता किए बिना मानव एमडीएम में भड़काऊ बिएफसी पत्रकारों को कुशलतापूर्वक पेश करने की एक विधि है।

यह प्रोटोकॉल BiFC तकनीक35 का लाभ उठाता है ताकि स्प्लिट फ्लोरोसेंट प्रोटीन वीनस के गैर-फ्लोरोसेंट टुकड़ों के साथ भर्ती डोमेन (CARD) पर भड़काऊ को टैग किया जा सके। भड़काऊ एक बड़े (p20) और एक छोटे (p10) सबयूनिट से बने एक उत्प्रेरक डोमेन को एन्कोड करते हैं, और एक संरक्षित प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन मोटिफ को उनके एन-टर्मिनस या प्रोडोमेन36 (चित्रा 1 बी) में कार्ड कहा जाता है। उनके सक्रियण प्लेटफार्मों के लिए भड़काऊ की भर्ती एक बरकरार कार्ड पर निर्भर है। इस दृष्टिकोण के लिए, दो प्रोडोमेन निर्माण (कार्ड मोटिफ को एन्कोडिंग) उत्पन्न होते हैं, जिनमें से प्रत्येक फोटोटेबल पीले प्रोटीन वीनस (वीनस-सी [वीसी]) और वीनस-एन [वीएन]) के गैर-फ्लोरोसेंट टुकड़ों से जुड़ा होता है, साथ ही एक फ्लोरोसेंट अभिकर्मक रिपोर्टर के साथ-साथ कोशिकाओं के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देने के लिए या उसके सक्रियण की अनुपस्थिति में। प्रतिदीप्ति केवल तभी देखी जाती है जब बातचीत करने वाले प्रोटीन पर्याप्त निकटता में आते हैं जो dimerization और सक्रियण के लिए अनुमति देगा ( चित्रा 1A देखें)। इस प्रक्रिया की दक्षता को एक मानक एपिफ्लोरेसेंस या एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके परिमाणित किया जा सकता है। एकल-सेल इमेजिंग के साथ संयोजन में, यह प्रोटोकॉल अतुल्यकालिक घटनाओं के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है जो थोक आबादी में अप्रभेद्य हो सकते हैं, और छवियों के रिज़ॉल्यूशन के आधार पर, प्रत्येक के साथ जुड़े BiFC परिसर के आकार और स्थानीयकरण को निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल को प्रोटीन की एक श्रृंखला के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जो ओलिगोमेराइजेशन द्वारा सक्रिय होते हैं, और इसकी प्रयोज्यता माइक्रोस्कोपी पद्धतियों तक सीमित नहीं है। यह दृष्टिकोण भी भड़काऊ विधानसभा के लिए विभेदक आवश्यकताओं की जांच के लिए अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, siRNA का उपयोग विशिष्ट भड़काऊ सक्रियण के लिए अपस्ट्रीम घटकों / आवश्यकताओं की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। एक साथ एमडीएम में ट्रांसमिट-बीआईएफसी जांच और एसआईआरएनए ओलिगो (एक लक्ष्य प्रोटीन को चुप करने के लिए उपयोग किया जाता है) को एक साथ एमडीएम में स्थानांतरित किया जा सकता है। यह संभावित प्रोटीन भागीदारों या प्रत्येक सक्रियण मंच के आवश्यक घटकों की पहचान कर सकता है। उदाहरण के लिए, एक siRNA ओलिगो जो एएससी एडेप्टर अणु को लक्षित करता है, जो NLRP1, NLRP3, और AIM2 inflammasomes की असेंबली के लिए आवश्यक है, का उपयोग यह दिखाने के लिए किया गया था कि हेम-प्रेरित सक्रियण -1 के लिए इन विहित ज्वलनशीलता की आवश्यकता होती है, जबकि21 नहीं था। इस पद्धति को समय-अंतराल माइक्रोस्कोपी के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है, इसलिए भड़काऊ सक्रियण के कैनेटीक्स को एकल कोशिकाओं में निर्धारित किया जा सकता है। इस तरह के एक दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, कोई भी यह आकलन कर सकता है कि जब सेल लाइसिस के संकेत के रूप में अभिकर्मक रिपोर्टर (mCherry) के प्रतिदीप्ति के नुकसान की निगरानी करके सेल मृत्यु से गुजरता है, तो उस समय के सापेक्ष BiFC शुरुआत की उपस्थिति के समय का सटीक रूप से पता लगाने के द्वारा dimerization होता है। BiFC डेटा प्राप्त करने और विश्लेषण करने के कई तरीके हैं; विकल्प उत्तर दिए जाने वाले प्रश्न और माइक्रोस्कोप और उपलब्ध सॉफ़्टवेयर के प्रकार पर निर्भर करेगा। उदाहरण के लिए, सक्रियण की दक्षता के साथ-साथ समय-चूक विश्लेषण को निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाने वाला एकल-समय बिंदु डेटा विशेष रूप से प्रभावी हो सकता है यदि कुछ माइक्रोस्कोप सॉफ़्टवेयर द्वारा प्रदान की गई एक ऑटो-अधिग्रहण सुविधा उपलब्ध है। यह उद्देश्य इमेजिंग की अनुमति देता है, क्योंकि पूर्व निर्धारित पदों सरणियों को एक बहु-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं से प्राप्त किया जाता है। छवियों को दृश्य निरीक्षण द्वारा और सटीकता और निष्पक्षता बढ़ाने के लिए CellProfiler, ImageJ, या MATLAB जैसे स्वचालित इमेजिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके परिमाणित किया जा सकता है।

इन प्रोटीनों की शारीरिक भूमिकाओं को पूरी तरह से समझने के लिए प्राथमिक कोशिकाओं में मार्गों की जांच करना आवश्यक है। इसके अलावा, क्योंकि चूहों में एक एकल -11 द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है, इसलिए मानव कोशिकाओं का आकलन करने में सक्षम होना आवश्यक है। हालांकि, प्राथमिक कोशिकाओं में कई वितरण प्रणालियों से जुड़ी कम अभिकर्मक क्षमता और विषाक्तता के कारण, उपलब्ध प्लास्मिड-आधारित पत्रकारों के उपयोग को अधिकतम करना मुश्किल हो सकता है। भड़काऊ BiFC प्रोटोकॉल या तो रोगियों या स्वस्थ विषयों के परिधीय रक्त से MDM को संक्रमित करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन करता है, प्रति अभिकर्मक आवश्यक कोशिकाओं की संख्या को कम करता है। यह शोधकर्ताओं को सेल व्यवहार्यता और सेलुलर गुणों से समझौता किए बिना मैक्रोफेज जैसी कीमती कोशिकाओं के साथ अधिक जटिल प्रयोग करने की अनुमति देता है। रोगी के नमूनों का उपयोग करने की क्षमता विशिष्ट रोग राज्यों में भड़काऊ सक्रियण का आकलन करने में सक्षम होने का एक बड़ा लाभ प्रदान करती है। दरअसल, कुछ मामूली अनुकूलन के साथ, इस प्रोटोकॉल को आसानी से अन्य मुरीन या मानव प्राथमिक कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

यह प्रोटोकॉल MDM को ट्रांसफ़ेक्ट करने के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करता है। नियॉन सिस्टम विशेष रूप से फायदेमंद है क्योंकि यह MDM में IFN-γ प्रतिक्रिया को प्रेरित नहीं करता है, जो कोशिकाओं की विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बाधित कर सकताहै। यह एक छोटे पैमाने पर इलेक्ट्रोपोरेशन सिस्टम है जो बड़ी संख्या में कोशिकाओं के लिए बहिर्जात डीएनए के कुशल हस्तांतरण को सक्षम करने के लिए एक उच्च सेल घनत्व के साथ 10 μL अभिकर्मक मात्रा का उपयोग करता है। यह कोशिका झिल्ली में अस्थायी छिद्र बनाता है ताकि प्लास्मिड जल्दी से गुजर सकें, देर से एंडोसाइटोसिस से बच सकें जो रासायनिक अभिकर्मक के दौरान होता है और जो प्लास्मिड गिरावट को ट्रिगर कर सकता है। यह प्रोटोकॉल एक कार्बनिक एसिड-आधारित बफर फॉर्मूलेशन (बफर आर) का उपयोग करता है जो क्लोराइड आयनों के साथ अन्य बफर की तुलना में न्यूनतम सेल विषाक्तता का परिचय देताहै। छोटी मात्रा और पिपेट टिप चैंबर का डिजाइन शारीरिक स्थितियों को बनाए रखने के लिए एक समान विद्युत क्षेत्र उत्पन्न करने में सहायता करता है जिसके परिणामस्वरूप उच्च जीवित रहने की दर होती है। अभिकर्मक दक्षता और सेल उत्तरजीविता बफर की रासायनिक संरचना, सेल घनत्व, नाड़ी की ताकत और प्लास्मिड एकाग्रता39 पर अत्यधिक निर्भर करती है। इसलिए, प्रत्येक सेल प्रकार और प्लास्मिड पेश किए गए के लिए इन स्थितियों को अनुकूलित करना आवश्यक है। एमडीएम में, लंबी नाड़ी अवधि के साथ कम वोल्टेज ने कोशिकाओं को व्यवहार्य और स्वस्थ रखते हुए प्लास्मिड को अधिक कुशलता से वितरित किया। नतीजतन, इस प्रोटोकॉल के लिए उपयोग की जाने वाली सेटिंग्स 1000 वी और 40 एमएस की 2 दालें थीं, जिसके परिणामस्वरूप 40-60% के बीच अभिकर्मक क्षमता थी, जिसमें सेल व्यवहार्यता 90% से अधिक थी, जो कोशिकाओं की क्षमता के आधार पर ट्रांसफैक्शन के बाद प्लेट में फिर से संलग्न करने की क्षमता पर आधारित थी। जबकि इस प्रोटोकॉल को मानव एमडीएम के लिए अनुकूलित किया गया है, वोल्टेज सेटिंग्स को 500 वी से 1700 वी तक अलग-अलग करना, दालों की संख्या को 1 से 3 तक बढ़ाना, और 10 से 40 एमएस तक की दालों की परीक्षण लंबाई अतिरिक्त सेल प्रकारों और प्रयोगात्मक सेटिंग्स में अभिकर्मक दक्षता और सेल व्यवहार्यता को संतुलित कर सकती है।

BiFC तकनीक के इष्टतम रोजगार के लिए कई महत्वपूर्ण विचार हैं। 1) यह महत्वपूर्ण है कि उपयोगकर्ता पेश किए जाने वाले प्रत्येक प्लास्मिड की इष्टतम मात्रा निर्धारित करता है, क्योंकि यह विभिन्न प्रोटीन और सेल प्रकारों के लिए भिन्न हो सकता है। यह अधिकतम संवेदनशीलता और परख की विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है। यह सलाह दी जाती है कि 200 एनजी और 1000 एनजी के बीच बीआईएफसी प्लास्मिड (वीसी और वीएन टुकड़े) का एक पायलट अनुमापन चलाएं जैसा कि आंकड़े 4 ए-बी में दिखाया गया है। पेश किए गए प्लास्मिड की इष्टतम सीमा प्रत्येक व्यक्ति के लिए अलग-अलग होती है, और इसलिए, उन्हें व्यक्तिगत रूप से मूल्यांकन किया जाना चाहिए। एक प्लास्मिड राशि चुनें जो न्यूनतम पृष्ठभूमि के साथ उच्चतम विशिष्ट संकेत प्रदान करती है। आदर्श रूप से, पृष्ठभूमि का स्तर 10% से कम होना चाहिए, लेकिन यदि विशिष्ट संकेत उच्च है तो 20% तक का उपयोग किया जा सकता है। भेदभाव, अभिकर्मक और उपचार के दौरान कठोर परिस्थितियों और इन कोशिकाओं के अत्यधिक हेरफेर से बचने के लिए भी महत्वपूर्ण है। इसके परिणामस्वरूप सहज सक्रियण भी हो सकता है, और सक्रियण के उच्च पृष्ठभूमि स्तर जो विशिष्ट परिणामों को अस्पष्ट कर सकते हैं क्योंकि मोनोसाइट या मैक्रोफेज जैसी प्रतिरक्षा कोशिकाओं का सक्रियण एक प्राकृतिक प्रक्रिया है, जहां वे प्रो-इंफ्लेमेटरी कार्यों को प्राप्त कर सकते हैं। यदि रोगी कोशिकाओं का उपयोग कर रहे हैं, तो भड़काऊ सक्रियण और आनुवंशिक पृष्ठभूमि के स्तर में कुछ अंतर्निहित भिन्नता के लिए नियंत्रित करना मुश्किल हो सकता है जो उन्हें अपने स्थानीय माइक्रोएन्वायरमेंट में उत्तेजनाओं और परिवर्तनों के लिए संवेदनशील या असंवेदनशील बना सकते हैं। उदाहरण के लिए, मैक्रोफेज फ़ंक्शन प्रतिरक्षा-समझौता व्यक्तियों या संक्रमण से लड़ने वाले व्यक्तियों में प्रभावित हो सकता है, क्योंकि इस प्रकार के सेल महत्वपूर्ण होमोस्टेटिक कार्यों को निभाते हैं और अन्य कार्यों के बीच सूजन के नियंत्रण में शामिल होते हैं। इन आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों पर विचार करने की आवश्यकता है जब यह निर्धारित किया जाता है कि क्या एक उच्च पृष्ठभूमि गैर-विशिष्ट या जैविक प्रभाव है। बारीकी से मिलान किए गए स्वस्थ नियंत्रणों का उपयोग करना (उदाहरण के लिए, लिंग और उम्र के लिए मिलान किया गया) एक उच्च पृष्ठभूमि स्तर के जैविक महत्व का आकलन करने में मदद कर सकता है। 2) यह महत्वपूर्ण है कि वीसी और वीएन टुकड़ों को समान मात्रा में पेश किया जाता है क्योंकि एक वीनस टुकड़े की असमान अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप उच्च आवृत्तियों पर मंच पर भर्ती हो सकती है और पूर्ण फ्लोरोसेंट सिग्नल को मुखौटा कर सकती है, जिससे एक गलत नकारात्मक परिणाम उत्पन्न हो सकता है। इसलिए, प्रत्येक व्यक्तिगत प्लास्मिड की अखंडता और एकाग्रता को वीसी और वीएन टुकड़ों की विभिन्न मात्राओं को पेश करने से बचने के लिए हर अभिकर्मक से पहले मान्य किया जाना चाहिए। 3) चूंकि यह दृष्टिकोण पत्रकारों की बहिर्जात अभिव्यक्ति पर आधारित है, इसलिए विशिष्टता के लिए अतिरिक्त नियंत्रण शामिल किए जाने चाहिए। एकल बिंदु उत्परिवर्तन वाले एकल बिंदु उत्परिवर्तन वाले निर्माण जो सक्रियण मंच के बीच बंधन को बाधित करते हैं या siRNA का उपयोग करके सक्रियण प्लेटफ़ॉर्म के घटकों में से एक को शांत करते हैं, इसका उपयोग यह पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है कि फ्लोरोसेंट सिग्नल भड़काऊ के लिए विशिष्ट बंधन के कारण है। इस नियंत्रण प्रयोग के परिणामस्वरूप शुक्र-सकारात्मक कोशिकाओं के स्तर में कमी आनी चाहिए। 4) BiFC निर्माणों की अभिव्यक्ति इस तरह के सेल मृत्यु के रूप में डाउनस्ट्रीम घटनाओं को ट्रिगर या प्रभावित कर सकते हैं। इसे दरकिनार करने के लिए, BiFC पत्रकारों के लिए गैर-एंजाइमेटिक संस्करणों की सिफारिश की जाती है, जैसे कि प्रोडोमेन या पूर्ण लंबाई का जहां उत्प्रेरक सिस्टीन अवशेष उत्परिवर्तित और निष्क्रिय हो जाते हैं। इसके लिए आगे नियंत्रण करने के लिए, गैर-संक्रमित उपचारित और अनुपचारित कुओं को नियंत्रण करने के लिए प्रयोग में शामिल किया जाना चाहिए और ट्रांसफेक्टेड कुओं के समान व्यवहार दिखाना चाहिए। 5) अंतर्जात गतिविधि संभवतः BiFC रीडआउट को प्रभावित कर सकती है। इसके लिए नियंत्रण करने के लिए, कोई भी इस उम्मीद के साथ अध्ययन के तहत अध्ययन के तहत कमी वाली कोशिकाओं में रिपोर्टर को व्यक्त कर सकता है कि बीआईएफसी दक्षता समान होगी।

इस दृष्टिकोण की मुख्य कमियों में से एक यह है कि यह प्रति सक्रियण को मापता नहीं है, लेकिन सक्रियण के लिए आवश्यक प्रेरित निकटता चरण होता है। यह एक सूक्ष्म लेकिन महत्वपूर्ण अंतर है। डिजाइन के अनुसार, prodomain वास्तव में dimerize के उत्प्रेरक डोमेन शामिल नहीं है। इसलिए, शुक्र के टुकड़ों की रीफोल्डिंग और प्रतिदीप्ति एक प्रॉक्सी के रूप में कार्य करती है क्योंकि वे केवल तभी फिर से मुड़ सकते हैं जब वे डिमराइज़ करने के लिए पर्याप्त करीब हों। इस प्रकार, BiFC विशेष रूप से प्रेरित निकटता को माप रहा है। यह संभव है कि उत्प्रेरक डोमेन में पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन बीआईएफसी सिग्नल को प्रभावित किए बिना डाइमराइजेशन को बाधित कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, इसके उत्प्रेरक डोमेन पर फॉस्फोराइलेटेड है, और यह अपने सक्रियण प्लेटफ़ॉर्म41 के लिए -2 की भर्ती को रोकने के बिना dimerization को बाधित करता है। इसलिए, BiFC दृष्टिकोण का उपयोग करने वाली टिप्पणियों को कार्यात्मक अध्ययनों के साथ पूरक किया जाना चाहिए ताकि यह पुष्टि की जा सके कि मनाया गया प्रतिदीप्ति सक्रियण का प्रतिनिधि है। इस खामी के बावजूद, यदि यहां चर्चा किए गए नियंत्रण शामिल हैं, तो बीआईएफसी द्वारा प्रेरित निकटता का माप विशिष्ट सक्रियण का सटीक प्रतिनिधित्व प्रदान कर सकता है।

अंत में, बीआईएफसी ज्वलनशील स्तर पर गतिशील इंटरैक्शन के विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। यह प्रोटोकॉल जीवित प्रतिरक्षा कोशिकाओं में भड़काऊ सिग्नलिंग कैस्केड की पूछताछ के लिए अनुमति देता है। यह दृष्टिकोण न केवल सक्रियण में पहले चरण को विशेष रूप से और सटीक रूप से मापने के लिए एक तकनीक प्रदान करता है, बल्कि प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर लागू होने से, भड़काऊ के गुणों को प्रकट करने की क्षमता रखता है जिन्हें पारंपरिक तरीकों का उपयोग करके पहचाना नहीं जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

हम एलबीएच के प्रयोगशाला अतीत और वर्तमान के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं जिन्होंने इस तकनीक के विकास में योगदान दिया। यह प्रयोगशाला NIH/NIDDK T32DK060445 (BEB), NIH/NIDDK F32DK121479 (BEB), NIH/NIGMS R01GM121389 (LBH) द्वारा समर्थित है। चित्रा 2 Biorender सॉफ्टवेयर का उपयोग कर तैयार किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
48 well tissue culture2:34 plates Genesee Scientific 25-108
10 cm Tissue Culture Dishes VWR 25382-166
2 Mercaptoethanol 1000x Thermo Fisher Scientific 21985023
8 well chambered coverglass with 1.5 HP coverglass Cellvis c8-1.5H-N
AutoMACS columns Miltenyi (Biotec) 130-021-101 For automated separation using AutoMACS Pro Separator only
AutoMACS Pro Separator Miltenyi (Biotec) 130-092-545 For automated separation using AutoMACS Pro Separator only
AutoMACS Pro Washing Solution Miltenyi (Biotec) 130-092-987 For automated separation using AutoMACS Pro Separator only
AutoMACS Rinsing Solution Miltenyi (Biotec) 130-091-222 For automated separation using AutoMACS Pro Separator only
AutoMacs running buffer Miltenyi (Biotec) 130-091-221 For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator
Axio Observer Z1 motorized inverted microscope equipped with a CSU-X1A 5000 spinning disk unit Zeiss Any confocal microscope equipped with a laser module fitted with laser lines of 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used
AxioObserver A1, Research Grade Inverted Microscope Zeiss Any epifluorescence microscope with fluorescence filters capable of exciting 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used
CD14+ MICROBEADS Miltenyi (Biotec) 130-050-201 For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator
DPBS without calcium chloride and magnesium chloride Sigma D8537-6x500ML
DsRed mito plasmid Clontech 632421 Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 10437028
Ficoll-Paque PLUS 6 x 100 mL Sigma GE17-1440-02
GlutaMAX Supplement (100x) Thermo Fisher Scientific 35050079
GM-CSF Thermo Fisher Scientific PHC2011
Hemin BioXtra, from Porcine, ≥96.0% (HPLC) Sigma 51280-1G
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630106
Inflammatory caspase BiFC plasmids Available by request from LBH lab
LPS-EB Ultrapure Invivogen TLRL-3PELPS
LS Columns Miltenyi (Biotec) 130-042-401 For manual separation using QuadroMACS Separator only
MACS 15 mL Tube Rack Miltenyi (Biotec) 130-091-052 For manual separation using QuadroMACS Separator only
MACS MultiStand Miltenyi (Biotec) 130-042-303 For manual separation using QuadroMACS Separator only
mCherry plasmid Yungpeng Wang Lab Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene
Neon Transfection System Thermo Fisher Scientific MPK5000 Includes Neon electroporation device, pipette and pipette station
Neon Transfection System 10 µL Kit Thermo Fisher Scientific MPK1096 Includes resuspension buffer R, resuspension buffer T, electrolytic buffer E, 96 x 10 µL Neon tips and Neon electroporation tubes
Nigericin sodium salt, ready made solution Sigma SML1779-1ML
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122
Poly-D-Lysine Hydrobromide Sigma P7280-5mg
QuadroMACS Separator Miltenyi (Biotec) 130-090-976 For manual separation using QuadroMACS Separator only
qVD-OPh Fisher (ApexBio) 50-101-3172
RPMI 1640 Medium Thermo Fisher Scientific 11875119
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Fisher Scientific 25200072
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific 15575020
Zeiss Zen 2.6 (blue edition) software Zeiss Any software used to operate the confocal microscope of choice

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 182
मानव मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज में भड़काऊ प्रेरित निकटता का विज़ुअलाइज़ेशन
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Bolívar, B. E., Bouchier-Hayes, … More

Bolívar, B. E., Bouchier-Hayes, L. Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (182), e63162, doi:10.3791/63162 (2022).

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