Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Visualisering av inflammatoriske caspaser indusert nærhet i humane monocytt-avledede makrofager

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63162
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology, Department of Molecular and Cellular Biology, Texas Children’s Hospital William T. Shearer Center for Human Immunobiology, Baylor College of Medicine

Summary

Denne protokollen beskriver arbeidsflyten for å oppnå monocytter-avledede makrofager (MDM) fra menneskelige blodprøver, en enkel metode for effektivt å introdusere inflammatorisk caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) reportere i human MDM uten å gå på kompromiss med cellens levedyktighet og oppførsel, og en bildebasert tilnærming for å måle inflammatorisk caspase-aktivering i levende celler.

Abstract

Inflammatoriske caspaser inkluderer caspase-1, -4, -5, -11 og -12 og tilhører undergruppen av initiatorpaser. Caspase-1 er nødvendig for å sikre riktig regulering av inflammatorisk signalering og aktiveres ved nærhetsindusert dimerisering etter rekruttering til inflammasomer. Caspase-1 er rikelig i den monocytiske cellelinjen og induserer modning av de proinflammatoriske cytokinene interleukin (IL)-1β og IL-18 til aktive utskilte molekyler. De andre inflammatoriske caspasene, caspase-4 og -5 (og deres murine homolog caspase-11) fremmer IL-1β-frigjøring ved å indusere pyroptose. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) er et verktøy som brukes til å måle inflammatorisk caspase indusert nærhet som en avlesning av caspase aktivering. Caspase-1, -4 eller -5 prodomainet, som inneholder regionen som binder seg til inflammasomet, smeltes sammen til ikke-fluorescerende fragmenter av det gule fluorescerende proteinet Venus (Venus-N [VN] eller Venus-C [VC]) som forbinder for å reformere det fluorescerende Venus-komplekset når caspasene gjennomgår indusert nærhet. Denne protokollen beskriver hvordan du introduserer disse reporterne i primære humane monocytt-avledede makrofager (MDM) ved hjelp av nukleofeksjon, behandler cellene for å indusere inflammatorisk caspase-aktivering, og måler caspase-aktivering ved hjelp av fluorescens og konfokal mikroskopi. Fordelen med denne tilnærmingen er at den kan brukes til å identifisere komponentene, kravene og lokaliseringen av det inflammatoriske caspase-aktiveringskomplekset i levende celler. Imidlertid må forsiktige kontroller vurderes for å unngå å kompromittere celle levedyktighet og oppførsel. Denne teknikken er et kraftig verktøy for analyse av dynamiske caspase interaksjoner på inflammasome nivå samt for avhør av inflammatoriske signalkaskader i levende MDM og monocytter avledet fra menneskelige blodprøver.

Introduction

Caspases er en familie av cystein aspartate proteaser som kan grupperes i initiator caspases og bøddel caspases. Bøddel caspases består av caspase-3, -6 og -7. De finnes naturlig i celler som dimmere og er spaltet av initiator caspases for å utføre apoptose1. Initiator caspases inkluderer menneskelig caspase-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 og -12. De er funnet som inaktive zymogens (pro-caspases) som aktiveres av nærhet-indusert dimerization og stabilisert av auto-proteolytisk spalting 2,3. De inflammatoriske caspasene er en undergruppe av initiator caspases2 og omfatter caspase-1, -4, -5 og -12 hos mennesker, og caspase-1, -11 og -12 i mus 4,5. I stedet for en apoptotisk rolle, spiller de en sentral rolle i betennelse. De formidler proteolytisk prosessering og sekresjon av pro-interleukin (IL)-1β og pro-IL-18 6,7, som er de første cytokinene som slippes ut som svar på patogene inntrengere 8,9. Caspase-1 aktiveres ved rekruttering til aktiveringsplattformen; et stort molekylvektproteinkompleks kalt inflammasomet (figur 1A)10. Dimerisering av caspase-4, -5 og -11 skjer uavhengig av disse plattformene gjennom en ikke-kanonisk inflammasomvei11,12.

Kanoniske inflammasomer er cytosoliske multimeriske proteinkomplekser som består av et inflammasomsensorprotein, adapterproteinet ASC (apoptose-assosiert flekklignende protein som inneholder et CARD), og effektorproteinet caspase-110. De mest studerte kanoniske inflammasomene er den NOD-lignende reseptorfamilien som inneholder et pyrindomene (NLRP), NLRP1 og NLRP3, NLR-familien som inneholder et KORT (NLRC), NLRC4 og fraværende i melanom 2 (AIM2). Hver av dem inneholder et pyrindomene, et KORT eller begge domenene. CARD-domenet formidler samspillet mellom KORT-inneholdende caspaser og deres oppstrømsaktivatorer. Stillasmolekylet ASC, som består av et N-terminalt pyrindomene (PYD) og et C-terminalt KORTmotiv13,14, er derfor nødvendig for rekruttering av caspase-1 til NLRP110, NLRP315 og AIM216 inflammasomes.

Hvert inflammasom er oppkalt etter sitt unike sensorprotein som gjenkjenner distinkte proinflammatoriske stimuli (figur 1B). Aktivatorer av denne banen kalles kanoniske stimuli. Inflammasomer fungerer som sensorer for mikrobielle komponenter og vevsstress, og monteres for å utløse en robust inflammatorisk respons gjennom aktivering av de inflammatoriske caspases17. Inflammasome montering initierer caspase-1 aktivering for å megle modning og sekresjon av sine viktigste substrater pro-IL-1β og pro-IL-18. Denne prosessen skjer via en to-trinns mekanisme. For det første oppregulerer en priming stimulus uttrykket av visse inflammasome proteiner og pro-IL-1β gjennom aktivering av NF-κB-banen. For det andre induserer en intracellulær (kanonisk) stimulus inflammasommontering og rekruttering av procaspase-1 6,7.

Caspase-4 og caspase-5 er de menneskelige ortologene av murin caspase-1111. De aktiveres på en inflammasomuavhengig måte ved intracellulær lipopolysakkarid (LPS), et molekyl som finnes i den ytre membranen av Gram-negative bakterier 18,19,20, og ved ekstracellulært heme, et produkt av rødblodcelle hemolyse 21. Det er foreslått at LPS binder seg direkte til CARD-motivet til disse proteinene og induserer deres oligomerisering20. Aktivering av caspase-4 eller caspase-5 fremmer IL-1β-frigjøring ved å indusere en inflammatorisk form for celledød kalt pyroptose gjennom spalting av poredannende proteingassdermin D (GSDMD)18,19. I tillegg induserer efflux av kaliumioner som følge av caspase-4 og GSDMD-mediert pyroptotisk død aktivering av NLRP3 inflammasome og påfølgende aktivering av caspase-122,23. Derfor anses caspase-4, -5 og -11 som intracellulære sensorer for LPS som er i stand til å indusere pyroptose og caspase-1-aktivering som svar på spesifikke stimuli11,24.

Figure 1
Figur 1: Inflammatoriske caspaser og caspase-bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay. (A) Diagram som viser caspase-BiFC-systemet, hvor to caspase-1 prodomainer (C1-pro) knyttet til hvert ikke-fluorescerende fragment av Venus (Venus-C eller Venus-N) rekrutteres til NLRP3-aktiveringsplattformen, og tvinger Venus til å refolde og fluorisere. Dette komplekset fremstår som et grønt sted under mikroskopet og fungerer som en avlesning for inflammatorisk caspase-indusert nærhet, som er det første trinnet i initiator caspase aktivering. (B) Skjematisk som viser domeneorganisasjonen av inflammasomkomponenter og inflammatoriske caspaser. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Det er vanskelig å måle spesifikk initiator caspases-aktivering, og det er ikke mange metoder tilgjengelig for å gjøre det ved avbildningsmetoder. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) kan brukes til å visualisere inflammatorisk kaspaseaktivering direkte i levende celler (figur 1A)25. Denne teknikken har nylig blitt tilpasset for bruk i humane monocytt-avledede makrofager (MDM)21. Caspase BiFC måler det første trinnet i inflammatorisk kaspaseaktivering, indusert nærhet for å lette dimerisering. Uttrykk for plasmider som koder det CARD-inneholdende caspase prodomain smeltet sammen til ikke-fluorescerende fragmenter av det fotostabile gule fluorescerende proteinet Venus (Venus-C [VC]) og Venus-N [VN]) brukes. Når de to caspase-prodomenene rekrutteres til aktiveringsplattformen eller gjennomgår indusert nærhet, blir de to halvdelene av Venus brakt i nærheten og tvunget til å brette og fluoresce (se figur 1A, B). Dette gir en sanntidsavlesning av spesifikk inflammatorisk kaspaseaktivering.

Human MDM uttrykker rikelig inflammasome gener og mønstergjenkjenningsreseptorer som identifiserer faresignaler og patogenprodukter. Dette gir en ideell celletype for avhør av inflammatoriske caspase-veier. I tillegg kan de avledes fra perifert blod og til og med fra pasientprøver for å vurdere inflammatorisk kaspaseaktivering i en bestemt sykdomstilstand. Denne protokollen beskriver hvordan man introduserer BiFC caspase-reportere i MDM ved hjelp av nukleofeksjon, en elektroporasjonsbasert transfeksjonsmetode, hvordan man behandler cellene for å indusere inflammatorisk caspase-aktivering, og hvordan du visualiserer de aktive caspase-kompleksene ved hjelp av mikroskopiske tilnærminger. I tillegg kan denne metoden tilpasses for å bestemme den molekylære sammensetningen av disse kompleksene, subcellulær lokalisering, kinetikk og størrelse på disse høyt bestilte strukturene 25,26,27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokollen følger retningslinjene fra Baylor College of Medicines forskningsetiske komité for manipulering av menneskelige prøver. Blodprøver håndteres i følge institusjonelle sikkerhetsretningslinjer for menneskelige prøver. Blodprøver oppnås hos en regional blodbank, hvor de samles inn med citratfosfat dextrose (CPD) løsning. Imidlertid kan blod samlet med andre antikoagulantia som natrium heparin, litium heparin eller EDTA også brukes til denne protokollen28,29.

1. Isolering av menneskelige monocytter og differensiering i makrofager

  1. Få antikoagulert blod fra av-identifiserte friske individer i en regional blodbank og isoler perifere blodmonylære celler (PBMCer) som angitt nedenfor.
    MERK: Utfør alle trinnene i en vevskultur laminær strømningshette. Bruk kun sterile rør og bruk hansker. Tilsett 10% blekemiddel til alle blodrelaterte produkter ved avhending. Steril PBS (1x) eller DPBS (uten Ca2+ og Mg2+) kan brukes om hverandre.
    1. Forbered fortynningsbufferen: Tilsupper 1x steril PBS med 2% FBS og 0,5 mM EDTA.
    2. Forbered kulturmediet: Supplement RPMI-1640 medium med FBS (10% (v / v)), glutamax (2 mM) og Penicillin / Streptomycin (50 I.U./50 μg / ml)
    3. Forkjøl den løpende bufferen (Materiallisten) i henhold til produsentens protokoll.
    4. Fortynn hele blodet med to mengder fortynningsbuffer. Bruk en serologisk pipet, overfør 15 ml av det antikoagulerte blodet til et 50 ml rør som inneholder 30 ml av fortynningsbufferen. Bland forsiktig ved inversjon.
    5. For hver 10 ml fullblod eller 30 ml fortynnet blod, tilsett 15 ml av tetthetsgradientmediet til et 50 ml tomt rør.
    6. Legg tetthetsgradientmediet fra trinn 1,1,5 med 30 ml fortynnet blod sakte og jevnt ved hjelp av en 25 ml serologisk pipet. Hold tuppen av røret mot veggen på røret og røret i vippevinkel.
    7. Overfør rørene forsiktig til en svingende bøtte sentrifuge. Unngå å forstyrre de to fasene. Sentrifuger rørene ved 400 x g ved romtemperatur (RT) i 25 minutter med akselerasjon og retardasjon satt til minimumsverdien.
    8. Fjern forsiktig det øverste (klare) plasmalaget ved hjelp av en 10 ml pipet og kast det i en beholder med blekemiddel (10%).
    9. Samle det interfase (hvite) laget av perifere mononukleære celler i blodet (PBMCer, figur 2) med en 10 ml pipet og overfør til et friskt 50 ml rør. Kombiner det hvite laget fra forskjellige rør av samme donor i et 50 ml rør opp til 30 ml.
    10. Ta hvert rør til et totalt volum på 50 ml med fortynningsbufferen fra trinn 1.1.1 og sentrifuge ved 300 x g og 4 °C i 10 minutter. Fjern supernatanten med en 10 ml pipet og kast den i en beholder med blekemiddel (10%).
    11. Resuspend hver cellepellet i 1 ml av den forhåndskjølte løpebufferen fra trinn 1.1.3 ved hjelp av en p1000 mikropipette. Kombiner cellesuspensjoner fra samme donor i et nytt 15 ml rør. Ta volumet på hvert rør til 15 ml med forhåndskjølt løpebuffer og bland godt ved inversjon.
    12. Ta en 20 μL aliquot av cellefjæringen fra trinn 1.1.11 og lag en 1:100 fortynning ved hjelp av 1x steril PBS. Bestem cellenummeret ved hjelp av et hemocytometer.
    13. Sentrifuger cellefjæringen fra trinn 1.1.11 ved 300 x g og 4 °C i 10 minutter og fjern supernatanten med en 10 ml pipet. Bruk om nødvendig en p200 mikropipette for å fjerne supernatanten helt.
    14. Bruk de isolerte PBMCene på nytt i 80 μL forhåndskjølt MACS-buffer for hver 1 x 107 celler, og legg til maksimalt 800 μL av bufferen.
    15. Tilsett 20 μL antimenneskelig CD14 MicroBeads per hver 1 x 107 celler eller opptil 100 μL per blodprøve (~100 ml ufortynnet blod). Bland godt ved inversjon og legg på en rørrotator i 20 min med kontinuerlig blanding ved 4 °C.
    16. Fjern prøvene fra rørrotatoren, tilsett 10 ml forkjølt løpebuffer til hvert rør, og sentrifuger ved 300 x g (akselerasjon = 5, retardasjon = 5) og 4 °C i 10 minutter.
    17. Fjern supernatanten med en 10 ml pipet og resuspend opp til 1 x 108 celler i 500 μL forhåndskjølt løpebuffer (2 x 108 / ml).
    18. Utfør isolering av CD14-positive celler ved magnetisk cellesortering ved hjelp av et manuelt eller automatisert system (Materialfortegnelser) i henhold til produsentens instruksjoner.
    19. Ta en 20 μL aliquot av celle suspensjon fra trinn 1.1.18 etter CD14-positiv utvalg og forberede en 1:100 fortynning ved hjelp av 1x steril PBS. Bestem cellenummeret ved å telle cellene på et hemocytometer.
    20. Sentrifuger CD14-positive celler ved 300 x g og RT i 10 minutter. Fjern supernatanten ved hjelp av en 10 ml pipet eller et vakuumsystem.
    21. Resuspend cellepellet fra trinn 1.1.20 i forvarmet kulturmedium fra trinn 1.1.2 til en endelig celletetthet på 1 x 107 celler / ml.
  2. Frø de isolerte CD14-positive monocyttene med en celletetthet på 5 x 106 celler.
    1. På en 10 cm vevskulturrett, tilsett 10 ml kulturmedium fra trinn 1.1.2 supplert med 50 ng/ml granulocytt-makrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF).
    2. Tilsett 0,5 ml av cellesuspensjonen fra trinn 1.1.21 til kulturmediet dråpevis og virvle platen forsiktig. Inkuber celler i en fuktet vevskulturinkubator (37 °C, 5 % CO2) over natten.
    3. Neste dag aspirerer du mediet ved hjelp av et vakuumsystem for å fjerne celler som ikke festet over natten. Tilsett 10 ml fersk kultur medium supplert GM-CSF (50 ng/ml) og inkuber celler i en fuktet vevskulturinkubator (37 °C, 5 % CO2) i 7 dager for å tillate fullstendig differensiering (se figur 3A for utseendet på CD14+ monocytter på ulike stadier av differensiering i GM-CSF ). Bytt kulturmediet hver 2-3 dager og suppler med fersk GM-CSF (50 ng/ml) hver gang.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk oversikt over den eksperimentelle arbeidsflyten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

2. Fremstilling av elektroporasjonskomponenter

MERK: Denne protokollen er designet for en 10 μL-Neon spiss (Materialbord). For hver transfeksjon bruker du 1-2 x 105 celler. Det anbefales å frø transfekterte celler på en 48-brønns plate eller 8-brønns kamret tallerken (10 μL-transfekerte celler per brønn). 1x steril DPBS (uten Ca2+ og Mg2+) kan brukes i stedet for PBS.

  1. På dag 7, forberede antibiotikafritt medium ved å supplere RPMI-1640 medium med FBS (10 % (v/v)) og glutamax (2 mM).
  2. Plasser serumfri RPMI-1640 medium, trypsin-EDTA (0,25%) oppløsning, 1x steril PBS (uten Ca2+ og Mg2+), og komplett kulturmedium fra trinn 1.1.2 i et 37 °C vannbad.
  3. Hvis du bruker glassbunnede retter (for konfokal mikroskopi) belegges rettene med poly-D-lysinhydrobromid.
    1. Belegge en 8 velkammeret tallerken med 200 μL poly-D-lysinhydrobromid (0,1 mg/ml i 1x steril PBS) og inkuber i 5 min ved RT.
    2. Aspirer poly-D-lysinoppløsningen og vask glasset en gang med 1x steril PBS. Aspirer PBS og fortsett med trinn 2.4.
  4. Tilsett 200 μL antibiotikafritt medium per brønn på 48 brønnplaten eller 8 godt kamret tallerken og pre-inkuber i en fuktet vevskulturinkubator (37 °C, 5 % CO2) til de transfekterte cellene er klare til plater.

3. Forberedelse av celler for elektroporasjon

MERK: Utbyttet av MDM fra en 10 cm tallerken på slutten av 7-dagers differensieringsperioden er ca. 1,5 x 106 celler. 1x steril DPBS (uten Ca2+ og Mg2+) kan brukes i stedet for PBS. Denne protokollen ble optimalisert slik at de fleste makrofager løsnes fra platen med vedlikehold av celle levedyktighet og integritet. MDM er vanskelig å løsne fra cellekulturplater. Derfor kan det være nødvendig å utføre trinn 3.2 og 3.3 to ganger for å fjerne cellene. Pass på at hver inkubasjonstid med trypsin-EDTA (0,25%) ikke overstiger 5 min.

  1. Aspirer mediet fra fullt differensierte makrofager på 10 cm retter og vask cellemonolayeren med varmt serumfritt RPMI-1640 medium. Pass på å fjerne mediet helt.
  2. Høst cellene ved å tilsette 2 ml varm trypsin-EDTA (0,25%) løsning per 10 cm tallerken og inkubere i en fuktet vevskulturinkubator (37 °C, 5 % CO2) i 5 minutter.
  3. Fullfør celleavløsningen ved å forsiktig pipettere trypsin-EDTA (0,25%) oppløsning opp og ned over hele parabolområdet ved hjelp av en p1000 mikropipette. Overfør cellefjæringen til et 15 ml konisk rør som inneholder 5 ml varmt komplett kulturmedium fra trinn 1.1.2.
  4. Ta parabolen til et lyst feltmikroskop og se etter celleavløsning i ulike synsfelt. Hvis det fortsatt er knyttet en betydelig mengde celler, gjentar du trinn 3.2-3.3.
  5. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 250 x g i 5 minutter ved RT.
  6. Aspirer mediet og resuspender cellene i 10 ml 1x steril PBS forvarmet til 37 °C. Ta en 20 μL aliquot for å bestemme cellenummeret ved hjelp av et hemocytometer.
  7. Ta 1-2 x 105 celler per tiltenkt transfeksjon og plasser i et 15 ml rør. Ta med til et endelig volum på 15 ml med forvarmet 1x steril PBS. Sentrifuge ved 250 x g i 5 min på RT.
  8. Aspirer PBS og sentrifuger en gang til i 1 min ved 250 x g. Fjern eventuell gjenværende PBS fra cellepellet ved hjelp av en p200 mikropipette.

4. Nukleofeksjon av caspase BiFC-komponenter i humane monocytt-avledede makrofager

MERK: Denne delen av protokollen utføres ved hjelp av Neon Transfection System (Materialliste). Denne protokollen skisserer trinnene for å transfektere 1-2 x 105 celler ved hjelp av en 10 μL neonspiss (materialfortegnelse). Hvis du bruker en 100 μL neonspiss, skalerer du opp tilsvarende. Unngå å utsette celler for resuspension buffer R i mer enn 15 min, da dette kan redusere cellens levedyktighet og transfeksjonseffektivitet.

  1. Fortynn reporterplasmid (dvs. mCherry eller dsRedmito ved 100 ng/μL) i nukleasefritt vann eller 0,5x TE-buffer for å visualisere de transfiserte cellene.
  2. Fortynn caspase BiFC-plasmidene til en passende konsentrasjon i nukleasefritt vann eller 0,5x TE-buffer, slik at det totale volumet av plasmider ikke overstiger 30% av det totale transfeksjonsvolumet på 10 μL (dvs. 300 ng/μL C1 Pro-VC og 300 ng/μL C1 Pro-VC og 300 ng/μL C1 Pro-VC).
  3. Forbered en 1,5 ml steril mikrotube per tiltenkt transfeksjon og tilsett riktig mengde reporterplasmid (dvs. 50 ng eller 0,5 μL) og kassett BiFC-plasmider (dvs. 300 ng eller 1 μL C1 Pro-VC og 300 ng eller 1 μL C1 Pro-VC og 300 ng eller 1 μL C1 Pro-VC). Hold mikrorørene i panseret til enhver tid.
  4. Plasser pipettestasjonen, enheten, spissene, elektroporasjonsrørene og pipetten i en steril laminær strømningshette.
    MERK: Pipettestasjonen, enheten, spissene, elektroporasjonsrørene og pipetten er inkludert i Neon Transfection System.
  5. Koble høyspennings- og sensorkontakten på pipettestasjonen til bakportene på enheten i henhold til produsentens anvisninger. Hold pipettestasjonen nær enheten.
  6. Koble strømledningen til det bakre strøminntaket og fortsett å koble enheten til stikkontakten. Trykk på strømbryteren for å slå på enheten.
  7. Angi transfeksjonsparameterne på oppstartsskjermen som vises når enheten slås på og kobles til på riktig måte. Trykk på Spenning, skriv inn 1000, og trykk på Ferdig for å sette spenningen til 1000 V. Trykk på Bredde, skriv inn 40, og trykk på Ferdig for å stille pulsvarigheten til 40 ms. Til slutt trykker du på # Pulser, skriver inn 2 og trykker på Ferdig for å sette antall elektriske pulser til 2.
  8. Ta et av elektroporasjonsrørene (følger med i settet) og fyll det med 3 ml elektrolytisk buffer E (for 10 μL spisser og medfølgende i settet) på RT. Sett elektroporasjonsrøret inn i pipetteholderen på pipettestasjonen. Kontroller at elektroden på siden av røret vender innover og at det høres en klikklyd når røret settes inn.
  9. Ta cellepellet fra trinn 3.8 og tilsett 10 μL forforvarmet resuspension R-buffer (som følger med i settet) for hver 1-2 x 105 celler. Bland forsiktig med en p20 mikropipette. Tilsett 10 μL av celleopphenget i hvert rør som er satt opp i trinn 4.3, og bland forsiktig med en p20 mikropipette.
  10. Ta pipetten og sett inn en spiss ved å trykke på trykknappen til det andre stoppet. Pass på at klemmen fanger opp stempelets monteringsstamme helt i spissen, og at det ikke er observert noe mellomrom i pipettens øverste hode.
  11. For å aspirere prøven, trykk på trykk på trykknappen på pipetten til første stopp og dypp inn i det første røret som inneholder celle / plasmid DNA-blanding. Aspirer blandingen langsomt inn i pipettespissen.
    MERK: Unngå luftbobler, da de kan forårsake lysbue under elektroporasjon, og hvis det oppdages av enheten, kan forhindre levering av den elektriske pulsen. Hvis det observeres luftbobler, slipper du innholdet inn i røret og prøver å aspirere igjen.
  12. Sett pipetten med prøven svært forsiktig inn i pipetteholderen. Kontroller at pipetten klikker og at den er riktig plassert.
  13. Trykk start på berøringsskjermen og vent til de elektriske pulsene er levert. En melding på skjermen indikerer at den er fullført.
  14. Fjern pipetten langsomt fra stasjonen og legg umiddelbart den transfekterte cellefjæringen inn i den tilsvarende brønnen med forvarmet antibiotikafritt medium fra trinn 2.4 ved å sakte trykke på trykknappen til første stopp.
    MERK: Dette tipset kan brukes på nytt opptil tre ganger for samme plasmid; Ellers kan du kaste den i en biofare avfallsbeholder ved å trykke på trykknappen til det andre stoppet.
  15. Gjenta trinn 4.10-4.14 for hvert rør som inneholder en celle / plasmid DNA-blanding.
  16. Gyng platen forsiktig med transfekterte celler og inkuber i 1-3 timer i en fuktet vevskulturinkubator (37 °C, 5 % CO2).
  17. Legg til hver brønn 200 μL for forhåndsvarmet kulturmedium (komplett medium) fra trinn 1.1.2. Plasser retten i den fuktede vevskulturinkubatoren (37 °C, 5 % CO2) igjen. La det være minst 24 timer for genuttrykk.
  18. Neste dag inspiserer du cellens levedyktighet og transfeksjonseffektivitet ved hjelp av et epifluorescensmikroskop.
    1. Slå på epifluorescensmikroskopet og den fluorescerende lyskildeboksen i henhold til produsentens instruksjoner og plasser kulturretten på mikroskopstadiet.
    2. Velg målsettingen 10x eller 20x og 568 nm (RFP).
    3. Hvis du vil beregne celle levedyktighet, trykker du på LED-knappen (Sendet lys) (TL) for å visualisere alle cellene i det valgte feltet. Mens du ser på mikroskopokularet, dreier du fokusknappen til cellene blir observert og ser etter cellevedlegg i det valgte feltet.
      MERK: Helt vedlagte celler representerer de levedyktige cellene mens flytende celler representerer ikke-levedyktige celler. Hvis sammenløpet av brønnen er høyt, kan tilstedeværelsen av ikke-tilknyttede celler være et resultat av en overestimering av cellenummer og ikke resultatet av lav levedyktighet. Imidlertid betyr lav samløp ledsaget av høyt innhold av flytende celler lav levedyktighet som kan skyldes lysbue under elektroporasjon, plasmid toksisitet eller overeksponering for resuspension R-buffer. Ikke bruk brønner som viser sistnevnte oppførsel.
    4. For å estimere transfeksjonseffektivitet, fokuser på celler i det valgte feltet under overført lys som beskrevet ovenfor. Telle totalt antall celler i det merkede feltet. Når LED-lampen for sendt lys (TL) er slått av, trykker du på LED-knappen (Reflected Light) (RL) for å slå på.
    5. Fint fokus på reportergenets fluorescens (røde celler) og tell det totale antallet røde fluorescerende celler. Gjenta disse trinnene (4.18.4-4.18.5) for minst to felt per brønn.

5. Behandling av transfektert MDM- og caspase BiFC-datainnsamling

MERK: Hvis du planlegger å avbilde cellene ved hjelp av et epifluorescens eller konfokalt mikroskop, anbefales behandling med qVD-OPh (20 μM) i 1 time tidligere behandling med den valgte stimulansen for å forhindre kassettavhengig celledød (overveiende apoptose). Dette brukes i avbildning for å forhindre at celler løfter av på grunn av apoptose, noe som gjør dem svært vanskelige å avbilde når de beveger seg ut av fokusplanet. Vær oppmerksom på at caspase rekruttering til aktiveringsplattformen og tilhørende caspase BiFC ikke er avhengig av katalytisk aktivitet av caspase, og følgelig vil caspase hemming ikke påvirke dette trinnet.

  1. Behandle med valgt stimulus ca 24 timer etter transfeksjon og inkubere så lenge det er nødvendig for hvert legemiddel.
    1. Forbered bildemediet ved å supplere kulturmediet fra trinn 1.1.2 med Hepes (20 mM, pH 7,2-7,5) og 2-mercaptoetanol (55 μM).
    2. Tilsett ønsket konsentrasjon av stimulans til det forvarmede bildemediet og bland forsiktig.
    3. Fjern mediet forsiktig fra cellene med en p1000 mikropipette og tilsett 500 μL av stimulansløsningen fra trinn 5.1.2 nedover siden av brønnen.
    4. For å kjøre ubehandlede kontrollbrønner, tilsett bildemiddel uten stimulans.
    5. Inkuber cellene i en fuktet vevskulturinkubator (37 °C, 5 % CO2) så lenge det er angitt for hver behandling.
  2. Visualiser cellene ved hjelp av epifluorescens eller konfiskert mikroskop.
    1. Slå på mikroskopet og lyskilden ved å følge produsentens anvisninger.
    2. Velg målet 10x eller 20x og plasser kulturretten på mikroskopstadiet.
    3. Bruk mikroskopokularet til å finne celler under 568 nm-filteret og fokuser på cellene som uttrykker dsRedmito/mCherry-reporteren (røde celler).
    4. Tell alle de røde cellene i synsfeltet, og registrer tallet.
    5. Mens du er i samme synsfelt, endrer du til 488- eller 512-filteret (GFP eller YFP), fortsetter å telle antall røde celler som også er grønne (Venus-positive eller BiFC-positive) og registrerer tallet.
    6. Tell minst 100 dsRedmito/mCherry -positive celler fra minst tre individuelle visuelle felt.
    7. Beregn prosentandelen av Venus-positive transfiserte celler per synsfelt og gjennomsnittet av de resulterende prosentene for hver behandling (brønn) for å få standardavviket.
  3. Bilde cellene ved hjelp av en epifluorescens eller konfiskert mikroskop
    MERK: For å skaffe konfokale bilder ved hjelp av et 20x mål eller en større forstørrelse, bør cellene være belagt på glassretter med mindre mikroskopet er utstyrt med et langt passmål.
    1. Følg trinn 5.2.1-5.2.3. Hvis du bruker et konfokalt mikroskop med oljemålet 40x, 60x eller 63x, sett en dråpe olje på målet.
    2. Visualiser live-bildet av cellene på dataskjermen slik kameraet har anskaffet seg. Bruk epifluorescence lyskilden for fluorescerende bilder eller bytt lyskilden til laserne for konfiske bilder.
    3. Finjuster fokus og posisjon for cellene ved hjelp av styrespakkontrollen og fokushjulet.
    4. Still inn prosentandelen lasereffekt og eksponeringstid for laserne 512 nm eller 488 nm (YFP eller GFP) og 568 nm (RFP) slik at signalet i bildet ser bra ut og ikke når metning.
    5. Slå på live-opptaket og undersøk det resulterende bildet. Sørg for at det ses en tydelig topp for hver fluor i displayets histogrammer for begge kanalene.
    6. Juster lasereffekten og eksponeringstiden etter behov. Hold disse verdiene så lave som mulig, samtidig som de kan oppdage både fluorescerende signaler (RFP og GFP/YFP).
    7. Mens du visualiserer det levende bildet av cellene, ta flere representative bilder av et felt som inneholder en eller flere celler som uttrykker mCherry / dsRedmito-reporteren for hver brønn på platen og lagre dataene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ordningen som vises i figur 2 gir en oversikt over hvordan man får tak i, transfekterer og bilder av menneskelig MDM. Etter inkubasjon av de valgte CD14+ monocyttene med GM-CSF i 7 dager, endres cellemorfologien i løpet av differensieringsperioden (figur 3A), går fra sfæriske suspensjonsceller til spindly og fullt festet (dag 3 og 4), og til slutt til mer spredte celler når de er fullstendig differensiert (dag 7). Fullt differensierte celler løsnes deretter fra platen og transfekeres med caspase BiFC-parene (VC og VN) sammen med reporterplasmiden (f.eks. dsRedmito, en plasmid som koder et rødt fluorescerende protein rettet mot mitokondriene), som brukes til å merke de transfiserte cellene (figur 3B) og brukes til å vurdere effektiviteten av transfeksjonen etter 24 h. Figur 3B-D viser et eksempel på BiFC-resultater ved hjelp av caspase-1 pro BiFC transfected celler behandlet i 20 timer med nigericin (5 μM), en kjent proinflammatorisk stimulus som utløser montering av NLRP3 inflammasome30,31. Ubehandlede celler viser ingen Venus-fluorescens (figur 3B), og i nigericinbehandlede celler vises caspase-1 BiFC som en enkelt punktlighet med den typiske formen på ASC-flekker 32,33,25 (figur 3C). Figur 3D viser et eksempel på kvantitet av Venus-positiv MDM. Den høyeste prosentandelen av caspase-1 BiFC ses i behandlingsgruppen LPS + nigericin (figur 3D). Dette resultatet er i samsvar med aktivering av et kanonisk inflammasom, hvor både et grunnsignal (LPS) og et intracellulært signal (nigericin) kreves for aktivering av capase-1.

Figure 3
Figur 3: Differensiering av CD14-monocytter og transfeksjon av menneskelig MDM. (A) Representative lysfeltbilder av CD14+ monocytter fra perifert blod eksponert for GM-CSF på dag 1, 3, 4 og 7 av differensiering (skalastang, 100 μm). (B-C) Human MDM ble transfected med caspase-1 pro BiFC par og transfection reporter dsRedmito (50 ng, rød). 24 timer senere ble cellene primet med og uten LPS (100 ng/ml) i 3 timer og behandlet med nigericin (5 μM) i bildemiddel i 20 timer. Representative konfokale bilder av ubehandlede og nigericinbehandlede celler vises (Skalalinje, 10 μm). BiFC vises i grønt. (D) Celler fra (C) ble vurdert for prosentandelen av dsRedmito-positive celler (røde, transfekterte celler) som var Venus-positive (grønn, caspase-1 BiFC-kompleks) ved 20 timer. Feilfelt representerer SD på minst to uavhengige tellinger per brønn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Et eksempel på plasmidtitrering er vist i figur 4, hvor økende mengder av hver BiFC-plasmid blir transfektert. Dette gjør det mulig å velge den optimale dosen av plasmid, noe som resulterer i et bestemt signal og minimal bakgrunn. Figur 4A viser resultatene av menneskelig MDM transfektert med økende konsentrasjoner av caspase-1, -4 og -5 pro BiFC par (VC og VN) behandlet med heme, et svært proinflammatorisk molekyl som skyldes rød blodcelle ødeleggelse34. Den høyeste prosentandelen av Venus-positive celler for caspase-1, -4 og -5 pro BiFC par er et resultat av henholdsvis 400 ng, 500 ng og 1000 ng transfektert plasmid. Bruk av den høyeste mengden plasmid risikerer imidlertid også å øke ikke-spesifikk bakgrunn (figur 4B). For eksempel resulterer transfeksjon av 1000 ng av caspase-5 pro BiFC-paret i nesten 40% ikke-spesifikk bakgrunn. Derfor anses bruk av det nedre 700 ng-beløpet som optimalt for dette plasmidparet (figur 4B). I figur 4C vises representative konfokale bilder oppnådd med et 20x mål om et felt av celler 24 t etter transfeksjon. I dette bildet kan man se at de ubehandlede transfekterte cellene er levedyktige basert på utseendet på mitokondriene (mitokondrier i døde celler er svært fragmenterte) og morfologien til cellene (apoptotiske celler krympes). Etter behandling med heme vises caspase-1-komplekset som en enkelt grønn punktering som ligner den som er indusert av nigericin i figur 3C, og utseendet ble ledsaget av cellekrymping.

Figure 4
Figur 4: Human MDM transfektert med forskjellige mengder inflammatorisk kaspase pro BiFC par. (A) Titrering av caspase-1 pro; caspase-4 pro; eller caspase-5 pro BiFC-par. Human MDM ble transfektert med de angitte mengdene av caspase pro BiFC-parene med dsRedmito som transfeksjonsreporter (50 ng) og inkubert over natten. Dagen etter ble kulturmediet fjernet fra alle brønner, og cellene ble behandlet med og uten heme (50 μM) i 0,1% FBS-medium. Etter 1 time ble en lik mengde komplett medium lagt til alle brønner for å rekonstituere FBS-konsentrasjonen til 5% og forhindre at heme dreper cellene. Etter en total behandling på 20 timer ble celler vurdert for prosentandelen dsRedmito-positive transfekterte celler som var Venus-positive, bestemt fra minst 300 celler per brønn. Feilfelt representerer SD på minst tre uavhengige tellinger per brønn. (B) Human MDM ble transfektert med utvalgte mengder caspase-1 pro; caspase-4 pro; eller caspase-5 pro BiFC par, sammen med dsRedmito (50 ng) som reporter for transfeksjon. 24 timer etter transfeksjon, celler ble behandlet med eller uten heme (50 μM) i 0,1% FBS. Etter 1 time ble FBS rekonstituert til 5% for å hemme ekstracellulært heme. Celler ble vurdert for prosentandelen av dsRedmito-positive celler (røde, transfekterte celler) som var Venus-positive (grønne, caspase BiFC-komplekset) ved 20 timer bestemt fra minst 300 celler per brønn. Resultatene representeres som prosentvise Venus-positive celler. Feilfelt representerer SD på minst tre uavhengige tellinger per brønn. (C) Representative konfokale bilder oppnådd med et 20x mål om et felt av celler 24 h post-transfection og behandlet med og uten heme som beskrevet i (B). Rød: dsRedmito-positive celler; Grønn: Venus-positive celler; Skalalinje, 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver arbeidsflyten for å få makrofager fra monocytter isolert fra menneskelige blodprøver og en metode for effektivt å introdusere de inflammatoriske caspase BiFC-reporterne i menneskelig MDM uten å gå på kompromiss med cellens levedyktighet og oppførsel.

Denne protokollen drar nytte av BiFC-teknikken35 for å merke de inflammatoriske caspasene på caspase rekrutteringsdomenet (CARD) med ikke-fluorescerende fragmenter av det splittede fluorescerende proteinet Venus. Inflammatoriske caspaser koder et katalytisk domene som består av en stor (p20) og en liten (p10) underenhet, og et konservert proteinproteininteraksjonsmotiv kalt et KORT ved N-terminus eller prodomain36 (figur 1B). Rekruttering av inflammatoriske caspases til deres aktiveringsplattformer er avhengig av et intakt KORT. For denne tilnærmingen genereres to caspase prodomainkonstruksjoner (koding av KORTmotivet), hver knyttet til de ikke-fluorescerende fragmentene av det fotostabile gule proteinet Venus (Venus-C [VC]) og Venus-N [VN]) sammen med en fluorescerende transfeksjonsreporter for å tillate visualisering av cellene før eller i fravær av aktivering av caspase BiFC-reporteren. Fluorescens observeres bare når interagerende proteiner kommer i nærheten av nok nærhet som vil tillate dimerisering og aktivering (se figur 1A). Effektiviteten av denne prosessen kan kvantifiseres ved hjelp av en standard epifluorescence eller et konfokalt mikroskop. I kombinasjon med encellet avbildning tillater denne protokollen visualisering av asynkrone hendelser som kan være uutslettelige i bulkpopulasjoner, og avhengig av oppløsningen til bildene, kan brukes til å bestemme størrelsen og lokaliseringen av BiFC-komplekset som er knyttet til hver kaspase.

Denne protokollen kan tilpasses en rekke proteiner som aktiveres ved oligomerisering, og dens anvendbarhet er ikke begrenset til mikroskopimetoder. Denne tilnærmingen muliggjør også undersøkelse av differensialkrav for inflammatorisk kaspasesmontering. For eksempel kan siRNA brukes til å identifisere oppstrømskomponenter / krav til spesifikk inflammatorisk kaspaseaktivering. Caspase-BiFC-sondene og siRNA oligo (brukes til å kneble et målprotein) kan transfekeres samtidig til MDM. Dette kan identifisere potensielle proteinpartnere eller essensielle komponenter i hver aktiveringsplattform. For eksempel ble en siRNA oligo som retter seg mot ASC-adaptermolekylet, som kreves for montering av NLRP1, NLRP3 og AIM2 inflammasomes, brukt til å vise at hemeindusert aktivering av caspase-1 krevde disse kanoniske inflammasomene mens caspase-4 og -5 ikkegjorde 21. Denne metoden kan også tilpasses tidsforløpmikroskopi, slik at kinetikken til den inflammatoriske caspase-aktiveringen kan bestemmes i enkeltceller. Ved hjelp av en slik tilnærming kan man vurdere når caspase dimerization oppstår ved å nøyaktig oppdage tidspunktet for utseendet til BiFC-utbruddet i forhold til tidspunktet da cellen gjennomgår døden ved å overvåke tap av fluorescens av transfeksjonsreporteren (mCherry) som en indikasjon på cellelys. Det er flere måter å skaffe og analysere caspase BiFC-data på; valget vil avhenge av spørsmålet som skal besvares og hvilken type mikroskop og programvare som er tilgjengelig. For eksempel kan enkelttidspunktdata som brukes til å bestemme effektiviteten av aktivering samt tidsforløpanalyse, være spesielt effektive hvis en automatisk anskaffelsesfunksjon levert av noe mikroskopprogramvare er tilgjengelig. Dette tillater objektiv avbildning, da forhåndsbestemte posisjoner er anskaffet fra hver brønn av en multi-brønnplate. Bilder kan kvantiseres både ved visuell inspeksjon og ved å bruke automatisert bildebehandlingsprogramvare som CellProfiler, ImageJ eller MATLAB for å øke nøyaktigheten og objektiviteten.

Å undersøke caspase veier i primære celler er viktig for å forstå de fysiologiske rollene til disse proteinene fullt ut. I tillegg, fordi caspase-4 og caspase-5 erstattes av en enkelt caspase-11 hos mus, er det viktig å kunne vurdere menneskelige celler. På grunn av lav transfeksjonseffektivitet og toksisiteter forbundet med mange leveringssystemer i primærceller, kan det imidlertid være vanskelig å maksimere bruken av tilgjengelige plasmidbaserte reportere. Den inflammatoriske caspase BiFC-protokollen beskriver en enkel metode for å transfekte MDM fra perifert blod hos enten pasienter eller friske personer, noe som reduserer antall celler som kreves per transfeksjon. Dette gjør det mulig for forskere å utføre mer komplekse eksperimenter med dyrebare celler som makrofager uten å gå på kompromiss med celle levedyktighet og cellulære egenskaper. Evnen til å bruke pasientprøver gir en stor fordel ved å kunne vurdere inflammatorisk kaspaseaktivering i spesifikke sykdomstilstander. Faktisk, med noen mindre optimaliseringer, kan denne protokollen lett tilpasses andre murine eller menneskelige primærceller.

Denne protokollen bruker en elektroporasjonsbasert tilnærming til transfekt MDM. Neon-systemet er spesielt fordelaktig siden det ikke induserer en IFN-γ respons i MDM, noe som kan forstyrre den spesifikke immunresponsen til cellene37. Dette er et lite elektroporasjonssystem som bruker et 10 μL transfeksjonsvolum med høy celletetthet for å muliggjøre effektiv overføring av eksogent DNA til et stort antall celler. Det skaper midlertidige porer i cellemembranen slik at plasmider kan passere raskt, unngå sen endokytose som oppstår under kjemisk transfeksjon, og som kan utløse plasmid nedbrytning. Denne protokollen bruker en organisk syrebasert bufferformulering (buffer R) som introduserer minimal celletoksisitet sammenlignet med andre buffere med kloridioner38. Det lille volumet og utformingen av pipettespissens kammerhjelpemiddel i å generere et ensartet elektrisk felt for å opprettholde fysiologiske forhold som resulterer i høye overlevelsesrater. Transfeksjonseffektivitet og celleoverlevelse er svært avhengig av bufferens kjemiske sammensetning, celletettheten, pulsens styrke og plasmidkonsentrasjonen39. Derfor er det viktig å optimalisere disse forholdene for hver celletype og plasmid introdusert. I MDM leverte lavere spenninger med lengre pulsvarigheter plasmider mer effektivt samtidig som cellene var levedyktige og sunne. Følgelig var innstillingene som ble brukt for denne protokollen 1000 V og 2 pulser på 40 ms som resulterte i transfeksjonseffektivitet mellom 40-60% med celle levedyktighet høyere enn 90% basert på cellenes evne til å feste seg til platen etter transfeksjon. Mens denne protokollen er optimalisert for menneskelig MDM, kan variere spenningsinnstillingene fra 500 V til 1700 V, øke antall pulser fra 1 til 3, og testlengden på pulser fra 10 til 40 ms kan balansere transfeksjonseffektivitet og celle levedyktighet i flere celletyper og eksperimentelle innstillinger.

Det er flere viktige hensyn for optimal ansettelse av BiFC-teknikken. 1) Det er viktig at brukeren bestemmer den optimale mengden av hver caspase plasmid som skal innføres, da dette kan variere for forskjellige proteiner og celletyper. Dette er nødvendig for å sikre maksimal følsomhet og spesifisitet i analysen. Det anbefales å kjøre en pilottitrering av caspase BiFC-plasmidene (VC- og VN-fragmenter) mellom 200 ng og 1000 ng som vist i figur 4A-B. Det optimale spekteret av plasmid introdusert er forskjellig for hver enkelt kaspase, og derfor må de vurderes individuelt. Velg en plasmid mengde som gir det høyeste spesifikke signalet med minimal bakgrunn. Ideelt sett bør bakgrunnsnivået være mindre enn 10%, men opptil 20% kan brukes hvis det spesifikke signalet er høyt. Det er også viktig å unngå tøffe forhold og overdreven manipulering av disse cellene under differensiering, transfeksjon og behandling. Dette kan også resultere i spontan aktivering, og høye bakgrunnsnivåer av caspase-aktivering som kan skjule de spesifikke resultatene siden aktivering av immunceller som monocytt eller makrofager er en naturlig prosess, hvor de kan skaffe seg proinflammatoriske funksjoner40. Hvis du bruker pasientceller, kan det være vanskelig å kontrollere for noen iboende variasjoner i nivåer av inflammasomaktivering og genetisk bakgrunn som kan sensibilisere eller desensibilisere dem til stimuli og endringer i deres lokale mikromiljø. For eksempel kan makrofagfunksjon påvirkes hos immun-kompromitterte individer eller personer som bekjemper en infeksjon, da denne typen celler spiller viktige homeostatiske funksjoner og er involvert i kontroll av betennelse, blant andre funksjoner. Disse genetiske og miljømessige faktorene må vurderes når man skal avgjøre om en høy bakgrunn er ikke-spesifikk eller en biologisk effekt. Bruk av tett matchede sunne kontroller (f.eks. tilpasset kjønn og alder) kan bidra til å vurdere den biologiske betydningen av et høyt bakgrunnsnivå av caspase BiFC. 2) Det er kritisk at VC- og VN-fragmentene innføres i like store mengder, siden ulikt uttrykk for ett Venus-fragment kan føre til rekruttering til plattformen ved høyere frekvenser og maskere hele fluorescerende signalet, noe som gir et falskt negativt resultat. Derfor bør integriteten og konsentrasjonen til hver enkelt plasmid valideres før hver transfeksjon for å unngå å introdusere forskjellige mengder VC- og VN-fragmenter. 3) Siden denne tilnærmingen er basert på det eksogene uttrykket til caspase-reporterne, bør ytterligere kontroller for spesifisitet inkluderes. Caspase-BiFC-konstruksjoner som inneholder enkeltpunktmutasjoner som forstyrrer bindingen mellom caspase og aktiveringsplattformen eller silencing av en av komponentene i aktiveringsplattformen ved hjelp av siRNA, kan brukes til å bekrefte at det fluorescerende signalet skyldes spesifikk binding av caspase til inflammasomet. Dette kontrolleksperimentet bør resultere i reduserte nivåer av Venus-positive celler. 4) Uttrykk for caspase BiFC-konstruksjonene kan utløse eller påvirke nedstrømshendelser som celledød. For å omgå dette anbefales ikke-enzymatiske versjoner av caspase for BiFC-reporterne, for eksempel caspase prodomain eller caspase i full lengde der katalytiske cysteinrester er mutert og inaktivert. For ytterligere kontroll for dette bør kontroll ikke-transfekerte behandlede og ubehandlede brønner inkluderes i forsøket og bør vise lignende oppførsel som for de transfekterte brønnene. 5) Endogen kaspaseaktivitet kan muligens påvirke BiFC-avlesningen. For å kontrollere for dette kan man uttrykke caspase reporter i celler mangelfull for caspase under studie med forventning om at BiFC-effektiviteten ville være den samme.

En av de viktigste ulempene ved denne tilnærmingen er at den ikke måler caspase-aktivering i seg selv, men det induserte nærhetstrinnet som kreves for at aktiveringen skal skje. Dette er et subtilt, men viktig skille. Ved design inneholder prodomenet ikke katalytiske domener av caspase som faktisk dimmerize. Derfor fungerer refolding og fluorescens av Venus-fragmentene som en proxy for kaspase dimerisering, da de bare kan brettes om hvis caspasene er nær nok til å dimme. Dermed måler BiFC spesielt indusert nærhet. Det er mulig at posttranslasjonelle modifikasjoner i katalytiske domener kan hindre dimerisering uten å påvirke BiFC-signalet. For eksempel er caspase-2 fosforilert på sitt katalytiske domene, og dette hindrer dimerisering uten å forhindre rekruttering av caspase-2 til aktiveringsplattformen41. Derfor må observasjoner ved hjelp av BiFC-tilnærmingen suppleres med funksjonelle studier for å bekrefte at fluorescensen som observeres er representativ for caspase-aktivering. Til tross for denne ulempen, hvis kontrollene som er diskutert her er inkludert, kan måling av indusert nærhet av caspase BiFC gi en nøyaktig representasjon av spesifikk caspase-aktivering.

Til slutt er caspase BiFC et kraftig verktøy for analyse av dynamiske caspase interaksjoner på brennbart nivå. Denne protokollen tillater avhør av inflammatorisk kaspase som signaliserer kaskader i levende immunceller. Denne tilnærmingen gir ikke bare en teknikk for å spesifikt og nøyaktig måle det første trinnet i caspase-aktivering, men ved å bli brukt på primære immunceller, har potensial til å avsløre egenskaper til inflammatoriske caspases som ikke kunne identifiseres ved hjelp av konvensjonelle metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi takker medlemmene av LBHs lab fortid og nåtid som bidro til utviklingen av denne teknikken. Dette laboratoriet støttes av NIH/NIDDK T32DK060445 (BEB), NIH/NIDDK F32DK121479 (BEB), NIH/NIGMS R01GM121389 (LBH). Figur 2 ble tegnet ved hjelp av Biorender-programvare.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
48 well tissue culture2:34 plates Genesee Scientific 25-108
10 cm Tissue Culture Dishes VWR 25382-166
2 Mercaptoethanol 1000x Thermo Fisher Scientific 21985023
8 well chambered coverglass with 1.5 HP coverglass Cellvis c8-1.5H-N
AutoMACS columns Miltenyi (Biotec) 130-021-101 For automated separation using AutoMACS Pro Separator only
AutoMACS Pro Separator Miltenyi (Biotec) 130-092-545 For automated separation using AutoMACS Pro Separator only
AutoMACS Pro Washing Solution Miltenyi (Biotec) 130-092-987 For automated separation using AutoMACS Pro Separator only
AutoMACS Rinsing Solution Miltenyi (Biotec) 130-091-222 For automated separation using AutoMACS Pro Separator only
AutoMacs running buffer Miltenyi (Biotec) 130-091-221 For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator
Axio Observer Z1 motorized inverted microscope equipped with a CSU-X1A 5000 spinning disk unit Zeiss Any confocal microscope equipped with a laser module fitted with laser lines of 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used
AxioObserver A1, Research Grade Inverted Microscope Zeiss Any epifluorescence microscope with fluorescence filters capable of exciting 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used
CD14+ MICROBEADS Miltenyi (Biotec) 130-050-201 For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator
DPBS without calcium chloride and magnesium chloride Sigma D8537-6x500ML
DsRed mito plasmid Clontech 632421 Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 10437028
Ficoll-Paque PLUS 6 x 100 mL Sigma GE17-1440-02
GlutaMAX Supplement (100x) Thermo Fisher Scientific 35050079
GM-CSF Thermo Fisher Scientific PHC2011
Hemin BioXtra, from Porcine, ≥96.0% (HPLC) Sigma 51280-1G
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630106
Inflammatory caspase BiFC plasmids Available by request from LBH lab
LPS-EB Ultrapure Invivogen TLRL-3PELPS
LS Columns Miltenyi (Biotec) 130-042-401 For manual separation using QuadroMACS Separator only
MACS 15 mL Tube Rack Miltenyi (Biotec) 130-091-052 For manual separation using QuadroMACS Separator only
MACS MultiStand Miltenyi (Biotec) 130-042-303 For manual separation using QuadroMACS Separator only
mCherry plasmid Yungpeng Wang Lab Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene
Neon Transfection System Thermo Fisher Scientific MPK5000 Includes Neon electroporation device, pipette and pipette station
Neon Transfection System 10 µL Kit Thermo Fisher Scientific MPK1096 Includes resuspension buffer R, resuspension buffer T, electrolytic buffer E, 96 x 10 µL Neon tips and Neon electroporation tubes
Nigericin sodium salt, ready made solution Sigma SML1779-1ML
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122
Poly-D-Lysine Hydrobromide Sigma P7280-5mg
QuadroMACS Separator Miltenyi (Biotec) 130-090-976 For manual separation using QuadroMACS Separator only
qVD-OPh Fisher (ApexBio) 50-101-3172
RPMI 1640 Medium Thermo Fisher Scientific 11875119
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Fisher Scientific 25200072
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific 15575020
Zeiss Zen 2.6 (blue edition) software Zeiss Any software used to operate the confocal microscope of choice

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Molecular Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
  2. Pop, C., Salvesen, G. S. Human caspases: activation, specificity, and regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).
  3. Boice, A., Bouchier-Hayes, L. Targeting apoptotic caspases in cancer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1867 (6), 118688 (2020).
  4. Bolívar, B. E., Vogel, T. P., Bouchier-Hayes, L. Inflammatory caspase regulation: maintaining balance between inflammation and cell death in health and disease. The FEBS Journal. 286 (14), 2628-2644 (2019).
  5. Martinon, F., Tschopp, J. Inflammatory caspases: linking an intracellular innate immune system to autoinflammatory diseases. Cell. 117 (5), 561-574 (2004).
  6. Lamkanfi, M., Vishva, M. D. Mechanisms and functions of inflammasomes. Cell. 157 (5), 1013-1022 (2014).
  7. Viganò, E., et al. Human caspase-4 and caspase-5 regulate the one-step noncanonical inflammasome activation in monocytes. Nature Communications. 6, 8761 (2015).
  8. Cerretti, D. P., et al. Molecular cloning of the interleukin-1 beta converting enzyme. Science. 256 (5053), 97 (1992).
  9. van de Veerdonk, F. L., Netea, M. G., Dinarello, C. A., Joosten, L. A. Inflammasome activation and IL-1β and IL-18 processing during infection. Trends in Immunology. 32 (3), 110-116 (2011).
  10. Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Molecular Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
  11. Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation targets caspase-11. Nature. 479 (7371), 117-121 (2011).
  12. Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4. Science. 341 (6151), 1246-1249 (2013).
  13. Masumoto, J., et al. ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. The Journal of Biological Chemistry. 274 (48), 33835-33838 (1999).
  14. Bertin, J., DiStefano, P. S. The PYRIN domain: a novel motif found in apoptosis and inflammation proteins. Cell Death and Differentiation. 7 (12), 1273-1274 (2000).
  15. Agostini, L., et al. NALP3 forms an IL-1beta-processing inflammasome with increased activity in Muckle-Wells autoinflammatory disorder. Immunity. 20 (3), 319-325 (2004).
  16. Bürckstümmer, T., et al. An orthogonal proteomic-genomic screen identifies AIM2 as a cytoplasmic DNA sensor for the inflammasome. Nature Immunology. 10 (3), 266-272 (2009).
  17. Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A. Activation and regulation of the inflammasomes. Nature Reviews Immunology. 13 (6), 397-411 (2013).
  18. Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves gasdermin D for noncanonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
  19. Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
  20. Shi, J., et al. Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS. Nature. 514 (7521), 187-192 (2014).
  21. Bolívar, B. E., et al. Noncanonical Roles of Caspase-4 and Caspase-5 in Heme-Driven IL-1β Release and Cell Death. The Journal of Immunology. 206 (8), 1878-1889 (2021).
  22. Schmid-Burgk, J. L., et al. Caspase-4 mediates noncanonical activation of the NLRP3 inflammasome in human myeloid cells. European Journal of Immunology. 45 (10), 2911-2917 (2015).
  23. Baker, P. J., et al. NLRP3 inflammasome activation downstream of cytoplasmic LPS recognition by both caspase-4 and caspase-5. European Journal of Immunology. 45 (10), 2918-2926 (2015).
  24. Cullen, S. P., Kearney, C. J., Clancy, D. M., Martin, S. J. Diverse activators of the NLRP3 inflammasome promote IL-1β secretion by triggering necrosis. Cell Reports. 11 (10), 1535-1548 (2015).
  25. Sanders, M. G., et al. Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes. Cell Death & Disease. 6, 1813 (2015).
  26. Charendoff, C. I., Bouchier-Hayes, L. Lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), e57316 (2018).
  27. Bouchier-Hayes, L., et al. Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity. Molecular Cell. 35 (6), 830-840 (2009).
  28. Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Peripheral blood mononuclear cells: Isolation, Freezing, thawing, and culture. Methods in Molecular Biology. 1304, 53-61 (2016).
  29. Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Current Pathobiology Reports. 7 (2), 17-27 (2019).
  30. Perregaux, D., et al. IL-1 beta maturation: evidence that mature cytokine formation can be induced specifically by nigericin. The Journal of Immunology. 149 (4), 1294-1303 (1992).
  31. Cheneval, D., et al. Increased mature interleukin-1β (IL-1β) secretion from THP-1 cells induced by nigericin is a result of activation of p45 IL-1β-converting enzyme processing. Journal of Biological Chemistry. 273 (28), 17846-17851 (1998).
  32. Fernandes-Alnemri, T., et al. The pyroptosome: a supramolecular assembly of ASC dimers mediating inflammatory cell death via caspase-1 activation. Cell Death and Differentiation. 14 (9), 1590-1604 (2007).
  33. Lu, A., et al. Unified polymerization mechanism for the assembly of ASC-dependent inflammasomes. Cell. 156 (6), 1193-1206 (2014).
  34. Muller-Eberhard, U., Javid, J., Liem, H. H., Hanstein, A., Hanna, M. Brief report: Plasma concentrations of hemopexin, haptoglobin and heme in patients with various hemolytic diseases. Blood. 32 (5), 811-815 (1968).
  35. Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).
  36. Thornberry, N. A., et al. A novel heterodimeric cysteine protease is required for interleukin-1βprocessing in monocytes. Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).
  37. Jensen, K., Anderson, J. A., Glass, E. J. Comparison of small interfering RNA (siRNA) delivery into bovine monocyte-derived macrophages by transfection and electroporation. Veterinary Immunology and Immunopathology. 158 (3-4), 224-232 (2014).
  38. Tada, Y., Sakamoto, M., Fujimura, T. Efficient gene introduction into rice by electroporation and analysis of transgenic plants: use of electroporation buffer lacking chloride ions. Theoretical and Applied Genetics. 80 (4), 475-480 (1990).
  39. Bhowmik, P., et al. Targeted mutagenesis in wheat microspores using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 8 (1), 6502 (2018).
  40. Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. What's the difference between CD80 and CD86. Trends in Immunology. 24 (6), 314-319 (2003).
  41. Kurokawa, M., Kornbluth, S. Caspases and kinases in a death grip. Cell. 138 (5), 838-854 (2009).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 182
Visualisering av inflammatoriske caspaser indusert nærhet i humane monocytt-avledede makrofager
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bolívar, B. E., Bouchier-Hayes, … More

Bolívar, B. E., Bouchier-Hayes, L. Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (182), e63162, doi:10.3791/63162 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter