Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Visualisering af inflammatorisk caspases induceret nærhed i humane monocytafledte makrofager

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63162
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology, Department of Molecular and Cellular Biology, Texas Children’s Hospital William T. Shearer Center for Human Immunobiology, Baylor College of Medicine

Summary

Denne protokol beskriver arbejdsgangen for at opnå monocytterafledte makrofager (MDM) fra humane blodprøver, en simpel metode til effektivt at introducere inflammatorisk caspase Bimolekylær Fluorescenskomplementering (BiFC) journalister i human MDM uden at gå på kompromis med cellelevedygtighed og adfærd og en billeddannelsesbaseret tilgang til måling af inflammatorisk caspaseaktivering i levende celler.

Abstract

Inflammatoriske caspaser indbefatter caspase-1, -4, -5, -11 og -12 og tilhører undergruppen af initiator caspases. Caspase-1 er påkrævet for at sikre korrekt regulering af inflammatorisk signalering og aktiveres ved nærhedsinduceret dimerisering efter rekruttering til inflammasomer. Caspase-1 er rigelig i den monocytiske celleafstamning og inducerer modning af de proinflammatoriske cytokiner interleukin (IL)-1β og IL-18 til aktive udskillede molekyler. De andre inflammatoriske caspaser, caspase-4 og -5 (og deres murinhomolog caspase-11) fremmer IL-1β-frigivelse ved at inducere pyroptose. Caspase Bimolekylær Fluorescenskomplementering (BiFC) er et værktøj, der bruges til at måle inflammatorisk caspaseinduceret nærhed som en aflæsning af caspaseaktivering. Caspase-1, -4 eller -5 prodomænet, som indeholder det område, der binder til inflammasomet, smeltes sammen med ikke-fluorescerende fragmenter af det gule fluorescerende protein Venus (Venus-N [VN] eller Venus-C [VC]), der associerer til at reformere det fluorescerende Venus-kompleks, når caspaserne gennemgår induceret nærhed. Denne protokol beskriver, hvordan man introducerer disse reportere i primære humane monocytafledte makrofager (MDM) ved hjælp af nukleofektion, behandler cellerne for at inducere inflammatorisk caspaseaktivering og måler caspaseaktivering ved hjælp af fluorescens og konfokal mikroskopi. Fordelen ved denne tilgang er, at den kan bruges til at identificere komponenter, krav og lokalisering af det inflammatoriske caspaseaktiveringskompleks i levende celler. Imidlertid skal omhyggelig kontrol overvejes for at undgå at gå på kompromis med cellelevedygtighed og adfærd. Denne teknik er et kraftfuldt værktøj til analyse af dynamiske caspaseinteraktioner på inflammasomniveau samt til forhør af de inflammatoriske signalkaskader i levende MDM og monocytter afledt af humane blodprøver.

Introduction

Caspaserne er en familie af cysteinaspartatproteastaser, der kan grupperes i initiator caspaser og bøddel caspaser. Bøddel caspaser omfatter caspase-3, -6 og -7. De findes naturligt i celler som dimerer og spaltes af initiatoren caspases for at udføre apoptose1. Initiator caspaser omfatter human caspase-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 og -12. De findes som inaktive zymogener (pro-caspaser), der aktiveres ved nærhedsinduceret dimerisering og stabiliseres ved autoproteolytisk spaltning 2,3. De inflammatoriske caspaser er en delmængde af initiatoren caspases2 og omfatter caspase-1, -4, -5 og -12 hos mennesker og caspase-1, -11 og -12 hos mus 4,5. I stedet for en apoptotisk rolle spiller de en central rolle i inflammation. De medierer proteolytisk behandling og sekretion af pro-interleukin (IL)-1β og pro-IL-18 6,7, som er de første cytokiner, der frigives som reaktion på patogene angribere 8,9. Caspase-1 aktiveres ved rekruttering til sin aktiveringsplatform; et proteinkompleks med stor molekylvægt betegnet inflammasomet (figur 1A)10. Dimerisering af caspase-4, -5 og -11 sker uafhængigt af disse platforme gennem en ikke-kanonisk inflammasomvej11,12.

Kanoniske inflammasomer er cytosoliske multimere proteinkomplekser, der består af et inflammasomsensorprotein, adaptorproteinet ASC (apoptose-associeret speck-lignende protein indeholdende et CARD) og effektorproteinet caspase-110. De mest velundersøgte kanoniske inflammasomer er den NOD-lignende receptorfamilie, der indeholder et pyrindomæne (NLRP), NLRP1 og NLRP3, NLR-familien, der indeholder et CARD (NLRC), NLRC4, og det fraværende i melanom 2 (AIM2). De indeholder hver især et pyrindomæne, et CARD eller begge domæner. CARD-domænet formidler interaktionen mellem CARD-holdige caspaser og deres opstrømsaktivatorer. Derfor kræves stilladsmolekylet ASC, der består af et N-terminal pyrindomæne (PYD) og et C-terminal CARD-motiv 13,14, til rekruttering af caspase-1 til NLRP110, NLRP315 og AIM216 inflammasomer.

Hvert inflammasom er opkaldt efter dets unikke sensorprotein, der genkender forskellige proinflammatoriske stimuli (figur 1B). Aktivatorer af denne vej kaldes kanoniske stimuli. Inflammasomer tjener som sensorer til mikrobielle komponenter og vævsstress og samles for at udløse et robust inflammatorisk respons gennem aktivering af de inflammatoriske caspaser17. Inflammasomsamling initierer caspase-1-aktivering for at formidle modning og sekretion af dets vigtigste substrater pro-IL-1β og pro-IL-18. Denne proces sker via en totrinsmekanisme. For det første opregulerer en priming stimulus ekspressionen af visse inflammasomproteiner og pro-IL-1β gennem aktivering af NF-κB-vejen. For det andet inducerer en intracellulær (kanonisk) stimulus inflammasom samling og rekruttering af procaspase-1 6,7.

Caspase-4 og caspase-5 er de menneskelige ortologer af murine caspase-1111. De aktiveres på en inflammasom-uafhængig måde af intracellulær lipopolysaccharid (LPS), et molekyle, der findes i den ydre membran af gramnegative bakterier 18,19,20, og ved ekstracellulær hæm, et produkt af røde blodlegemer hæmolyse 21. Det er blevet foreslået, at LPS binder direkte til CARD-motivet af disse proteiner og inducerer deres oligomerisering20. Aktivering af caspase-4 eller caspase-5 fremmer IL-1β-frigivelse ved at inducere en inflammatorisk form for celledød kaldet pyroptose gennem spaltning af det poredannende protein gasdermin D (GSDMD) 18,19. Desuden inducerer udstrømningen af kaliumioner som følge af caspase-4 og GSDMD-medieret pyroptotisk død aktivering af NLRP3-inflammasomet og efterfølgende aktivering af caspase-122,23. Derfor betragtes caspase-4, -5 og -11 som intracellulære sensorer til LPS, der er i stand til at inducere pyroptose og caspase-1-aktivering som reaktion på specifikke stimuli11,24.

Figure 1
Figur 1: Inflammatoriske caspaser og caspase-bimolekylær fluorescenskomplementering (BiFC) assay. (A) Diagram, der viser caspase-BiFC-systemet, hvor to caspase-1 prodomainer (C1-pro) forbundet med hvert ikke-fluorescerende fragment af Venus (Venus-C eller Venus-N) rekrutteres til NLRP3-aktiveringsplatformen, hvilket tvinger Venus til at folde sig om og fluorescere. Dette kompleks fremstår som en grøn plet under mikroskopet og tjener som en udlæsning for inflammatorisk caspase-induceret nærhed, hvilket er det første skridt i initiator caspase aktivering. (B) Skematisk visning af domæneorganisationen af inflammasomkomponenter og inflammatoriske caspaser. Klik her for at se en større version af denne figur.

Det er vanskeligt at måle specifik initiator caspases aktivering, og der er ikke mange metoder til rådighed til at gøre det ved billeddannelsesmetoder. Caspase Bimolekylær Fluorescenskomplementering (BiFC) kan bruges til at visualisere inflammatorisk caspaseaktivering direkte i levende celler (figur 1A)25. Denne teknik er for nylig blevet tilpasset til brug i humane monocytafledte makrofager (MDM)21. Caspase BiFC måler det første trin i inflammatorisk caspaseaktivering, induceret nærhed for at lette dimerisering. Ekspression af plasmider, der koder for det CARD-holdige caspaseprodomæne smeltet sammen med ikke-fluorescerende fragmenter af det fotostable gule fluorescerende protein Venus (Venus-C [VC]) og Venus-N [VN]) anvendes. Når de to caspase prodomainer rekrutteres til deres aktiveringsplatform eller gennemgår induceret nærhed, bringes de to halvdele af Venus i umiddelbar nærhed og tvinges til at folde sig sammen og fluorescere (se figur 1A,B). Dette giver en realtidsaflæsning af specifik inflammatorisk caspaseaktivering.

Human MDM udtrykker rigeligt inflammasomgener og mønstergenkendelsesreceptorer, der identificerer faresignaler og patogenprodukter. Dette giver en ideel celletype til forhør af inflammatoriske caspaseveje. Derudover kan de stamme fra perifert blod og endda fra patientprøver for at vurdere inflammatorisk caspaseaktivering i en bestemt sygdomstilstand. Denne protokol beskriver, hvordan man introducerer BiFC caspase-reportere i MDM ved hjælp af nukleofektion, en elektroporationsbaseret transfektionsmetode, hvordan man behandler cellerne for at inducere inflammatorisk caspaseaktivering, og hvordan man visualiserer de aktive caspasekomplekser ved hjælp af mikroskopi-tilgange. Derudover kan denne metode tilpasses til at bestemme den molekylære sammensætning af disse komplekser, subcellulær lokalisering, kinetik og størrelse af disse højt ordnede strukturer 25,26,27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokol følger retningslinjerne fra Baylor College of Medicine's humane forskningsetiske komité for manipulation af humane prøver. Blodprøver håndteres efter de institutionelle sikkerhedsretningslinjer for humane prøver. Blodprøver opnås i en regional blodbank, hvor de opsamles med citratphosphatdextrose (CPD) opløsning. Imidlertid kan blod indsamlet med andre antikoagulantia som natriumheparin, lithiumheparin eller EDTA også bruges til denne protokol28,29.

1. Isolering af humane monocytter og differentiering i makrofager

  1. Få antikoaguleret blod fra afidentificerede raske personer i en regional blodbank og isoler mononukleære celler i perifert blod (PBMC'er) som angivet nedenfor.
    BEMÆRK: Udfør alle trin i en laminær flowhætte til vævskultur. Brug kun sterile rør og brug handsker. Tilsæt 10% blegemiddel til alle blodrelaterede produkter, når de bortskaffes. Steril PBS (1x) eller DPBS (uden Ca2+ og Mg2+) kan anvendes i flæng.
    1. Forbered fortyndingsbufferen: Suppler 1x steril PBS med 2% FBS og 0,5 mM EDTA.
    2. Forbered kulturmediet: Supplement RPMI-1640 medium med FBS (10% (v / v)), glutamax (2 mM) og Penicillin / Streptomycin (50 I.U./50 μg / ml)
    3. Forkøl den løbende buffer (Table of Materials) i henhold til producentens protokol.
    4. Fortynd fuldblod med to volumener fortyndingsbuffer. Ved hjælp af en serologisk pipet overføres 15 ml af det antikoagulerede blod til et 50 ml rør indeholdende 30 ml fortyndingsbufferen. Bland forsigtigt ved inversion.
    5. For hver 10 ml fuldblod eller 30 ml fortyndet blod tilsættes 15 ml af densitetsgradientmediet til et 50 ml tomt rør.
    6. Lag densitetsgradientmediet fra trin 1.1.5 med 30 ml fortyndet blod langsomt og støt ved hjælp af en 25 ml serologisk pipet. Hold spidsen af røret mod rørets væg og røret i en vippet vinkel.
    7. Overfør forsigtigt rørene til en svingende spandcentrifuge. Undgå at forstyrre de to faser. Centrifugering af rørene ved 400 x g ved stuetemperatur (RT) i 25 minutter med acceleration og deceleration indstillet til minimumsværdien.
    8. Fjern forsigtigt det øverste (klare) plasmalag ved hjælp af en 10 ml pipet og bortskaf i en beholder med blegemiddel (10%).
    9. Saml det interfasede (hvide) lag af mononukleære celler i perifert blod (PBMC'er, figur 2) med en 10 ml pipet og overfør til et nyt 50 ml rør. Kombiner det hvide lag fra forskellige rør af samme donor i et 50 ml rør op til 30 ml.
    10. Hvert rør bringes til et samlet volumen på 50 ml med fortyndingsbufferen fra trin 1.1.1 og centrifugen ved 300 x g og 4 °C i 10 minutter. Fjern supernatanten med en 10 ml pipet og bortskaf den i en beholder med blegemiddel (10%).
    11. Resuspend hver cellepille i 1 ml af den forkølede løbende buffer fra trin 1.1.3 ved hjælp af en p1000 mikropipette. Kombiner cellesuspensioner fra samme donor i et nyt 15 ml rør. Bring volumenet af hvert rør til 15 ml med forkølet løbende buffer og bland godt ved inversion.
    12. Tag en 20 μL alikvot af cellesuspensionen fra trin 1.1.11 og forbered en 1:100 fortynding ved hjælp af 1x steril PBS. Bestem cellenummeret ved hjælp af et hæmocytometer.
    13. Centrifugering af cellesuspensionen fra trin 1.1.11 ved 300 x g og 4 °C i 10 minutter og fjern supernatanten med en 10 ml pipet. Brug om nødvendigt en p200-mikropipette til at fjerne supernatanten fuldstændigt.
    14. De isolerede PBMC'er suspenderes igen i 80 μL forkølet MACS-buffer for hver 1 x 107 celler, og der tilføjes op til maksimalt 800 μL af bufferen.
    15. Tilsæt 20 μL anti-humane CD14 MicroBeads pr. hver 1 x 107 celler eller op til 100 μL pr. Blodprøve (~ 100 ml ufortyndet blod). Bland godt ved inversion og anbring på en rørrotator i 20 minutter med kontinuerlig blanding ved 4 °C.
    16. Fjern prøverne fra rørrotatoren, tilsæt 10 ml forkølet løbende buffer til hvert rør og centrifugering ved 300 x g (acceleration = 5, deceleration = 5) og 4 °C i 10 minutter.
    17. Supernatanten fjernes med en 10 ml pipet, og dermed op til 1 x 108 celler i 500 μL forkølet løbende buffer (2 x 108/ml).
    18. Udfør isolering af CD14-positive celler ved magnetisk cellesortering ved hjælp af et manuelt eller automatiseret system (Table of Materials) i henhold til producentens anvisninger.
    19. Tag en 20 μL alikvot af cellesuspensionen fra trin 1.1.18 efter CD14-positiv selektion og forbered en 1:100 fortynding ved hjælp af 1x steril PBS. Bestem cellenummeret ved at tælle cellerne på et hæmocytometer.
    20. Centrifugering af CD14-positive celler ved 300 x g og RT i 10 minutter. Fjern supernatanten ved hjælp af en 10 ml pipet eller et vakuumsystem.
    21. Resuspend cellepillen fra trin 1.1.20 i forvarmet dyrkningsmedium fra trin 1.1.2 til en endelig celletæthed på 1 x 107 celler / ml.
  2. Frø de isolerede CD14-positive monocytter ved en celletæthed på 5 x 106 celler.
    1. På en 10 cm vævskulturskål tilsættes 10 ml dyrkningsmedium fra trin 1.1.2 suppleret med 50 ng / ml granulocyt-makrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF).
    2. Tilsæt 0,5 ml af cellesuspensionen fra trin 1.1.21 til kulturmediet dråbevis og hvirvl forsigtigt pladen. Inkubere celler i en befugtet vævskulturinkubator (37 °C, 5 % CO2) natten over.
    3. Den næste dag aspirerer mediet ved hjælp af et vakuumsystem for at fjerne celler, der ikke blev fastgjort natten over. Tilsæt 10 ml friskdyrkningsmedium suppleret GM-CSF (50 ng/ml) og inkuber celler i en inkubator for befugtet vævskultur (37 °C, 5 % CO2) i 7 dage for at muliggøre fuldstændig differentiering (se figur 3A for udseendet af CD14+-monocytter på forskellige stadier af differentiering i GM-CSF). Udskift kulturmediet hver 2-3 dage og suppler med frisk GM-CSF (50 ng / ml) hver gang.

Figure 2
Figur 2: Skematisk oversigt over den eksperimentelle arbejdsgang. Klik her for at se en større version af denne figur.

2. Fremstilling af elektroporationskomponenter

BEMÆRK: Denne protokol er designet til en 10 μL-Neon-spids (Table of Materials). For hver transfektion skal du bruge 1-2 x 105 celler. Det anbefales at frø transfekterede celler på en 48-brønds plade eller 8-brønds kamret skål (10 μL-transfekterede celler pr. Brønd). 1x steril DPBS (uden Ca2+ og Mg2+) kan anvendes i stedet for PBS.

  1. På dag 7 skal du forberede antibiotikafrit medium ved at supplere RPMI-1640 medium med FBS (10 % (v / v)) og glutamax (2 mM).
  2. Anbring serumfri RPMI-1640 medium, trypsin-EDTA (0,25%) opløsning, 1x steril PBS (uden Ca2+ og Mg2+) og komplet kulturmedium fra trin 1.1.2 i et 37 ° C vandbad.
  3. Hvis du bruger glasbundede retter (til konfokal mikroskopi), skal du belægge opvasken med poly-D-lysinhydrobromid.
    1. Coat en 8 velkammeret skål med 200 μL poly-D-lysinhydrobromid (0,1 mg / ml i 1x steril PBS) og inkuber i 5 minutter ved RT.
    2. Aspirer poly-D-lysinopløsningen og vask glasset en gang med 1x steril PBS. Aspirer PBS og fortsæt med trin 2.4.
  4. Tilsæt 200 μL antibiotikafrit medium pr. brønd af 48 brøndpladen eller 8 velkammerfade og forinkubere i en befugtet vævskulturinkubator (37 ° C, 5% CO2), indtil de er klar til at plade de transfekterede celler.

3. Forberedelse af celler til elektroporation

BEMÆRK: Udbyttet af MDM fra en 10 cm skål i slutningen af 7-dages differentieringsperioden er ca. 1,5 x 106 celler. 1x steril DPBS (uden Ca2+ og Mg2+) kan anvendes i stedet for PBS. Denne protokol blev optimeret, så de fleste makrofager løsnes fra pladen med opretholdelse af cellelevedygtighed og integritet. MDM er vanskeligt at løsne fra cellekulturplader. Derfor kan det være nødvendigt at udføre trin 3.2 og 3.3 to gange for at adskille cellerne. Sørg for, at hver inkubationstid med trypsin-EDTA (0,25%) ikke overstiger 5 minutter.

  1. Aspirer medierne fra fuldt differentierede makrofager på 10 cm tallerkener og vask cellemonolaget med varmt serumfrit RPMI-1640 medium. Sørg for at fjerne mediet helt.
  2. Høst cellerne ved at tilsætte 2 ml varm trypsin-EDTA (0,25%) opløsning pr. 10 cm skål og inkuber i en befugtet vævskulturinkubator (37 ° C, 5% CO2) i 5 minutter.
  3. Fuldfør celleløsningen ved forsigtigt at pipettere trypsin-EDTA (0,25%) opløsningen op og ned over hele skålområdet ved hjælp af en p1000 mikropipette. Overfør cellesuspensionen til et 15 ml konisk rør indeholdende 5 ml varmt komplet dyrkningsmedium fra trin 1.1.2.
  4. Tag skålen til et lyst feltmikroskop og kontroller for celleløsning i forskellige synsfelter. Hvis der stadig er en betydelig mængde celler fastgjort, skal du gentage trin 3.2-3.3.
  5. Centrifugering af cellesuspensionen ved 250 x g i 5 minutter ved RT.
  6. Aspirere mediet og resuspend cellerne i 10 ml 1x steril PBS forvarmet til 37 °C. Tag en 20 μL aliquot for at bestemme cellenummeret ved hjælp af et hæmocytometer.
  7. Tag 1-2 x 105 celler pr. Tilsigtet transfektion og læg i et 15 ml rør. Bring til et endeligt volumen på 15 ml med forvarmet 1x steril PBS. Centrifuge ved 250 x g i 5 min ved RT.
  8. Aspirer PBS og centrifuge endnu en gang i 1 min ved 250 x g. Fjern eventuel resterende PBS fra cellepillen ved hjælp af en p200-mikropipette.

4. Nukleofektion af caspase BiFC-komponenter i humane monocytafledte makrofager

BEMÆRK: Dette afsnit af protokollen udføres ved hjælp af Neon Transfection System (Table of Materials). Denne protokol skitserer trinnene til transfekt 1-2 x 105 celler ved hjælp af en 10 μL neonspids (Table of Materials). Hvis du bruger en 100 μL Neon-spids, skal du skalere op i overensstemmelse hermed. Undgå at udsætte celler for resuspension buffer R i mere end 15 minutter, da dette kan reducere cellernes levedygtighed og transfektionseffektivitet.

  1. Fortynd reporterplasmidet (dvs. mCherry eller dsRedmito ved 100 ng / μL) i nukleasefrit vand eller 0,5x TE-buffer for at visualisere de transfekterede celler.
  2. Caspase BiFC-plasmiderne fortyndes til en passende koncentration i nukleasefrit vand eller 0,5x TE-buffer, således at det samlede volumen af plasmider ikke overstiger 30 % af det samlede transfektionsvolumen på 10 μL (dvs. 300 ng/μL C1 Pro-VC og 300 ng/μL C1 Pro-VN).
  3. Der fremstilles et sterilt mikrorør på 1,5 ml pr. påtænkt transfektion, og der tilsættes en passende mængde reporterplasmid (dvs. 50 ng eller 0,5 μL) og caspase BiFC-plasmider (dvs. 300 ng eller 1 μL C1 Pro-VC og 300 ng eller 1 μL C1 Pro-VN-fragment). Hold altid mikrorørene i emhætten.
  4. Anbring pipettestationen, enheden, spidserne, elektroporationsrørene og pipetten i en steril laminær strømningshætte.
    BEMÆRK: Pipettestationen, enheden, spidserne, elektroporationsrørene og pipetten er inkluderet i Neon Transfection System.
  5. Tilslut højspændings- og sensorstikket på pipettestationen til de bageste porte på enheden i henhold til producentens anvisninger. Hold pipettestationen tæt på enheden.
  6. Tilslut netledningen til det bageste vekselstrømsudløb, og fortsæt med at slutte enheden til stikkontakten. Tryk på afbryderen for at tænde enheden.
  7. Indtast transfektionsparametrene på startskærmen, der vises, når enheden er tændt og korrekt tilsluttet. Tryk på Spænding, indtast 1000, og tryk på Udført for at indstille spændingen til 1000 V. Tryk på Bredde, indtast 40, og tryk på Udført for at indstille pulsvarigheden til 40 ms. Til sidst skal du trykke på # Pulser, indtaste 2 og trykke på Udført for at indstille antallet af elektriske impulser til 2.
  8. Tag et af elektroporationsrørene (medfølger i sættet) og fyld det med 3 ml elektrolytisk buffer E (til 10 μL spidser og medfølger i sættet) ved RT. Indsæt elektroporationsrøret i pipetteholderen på pipettestationen. Sørg for, at elektroden på siden af røret vender indad, og at der høres en kliklyd, når røret indsættes.
  9. Tag cellepillen fra trin 3.8 og tilsæt 10 μL forvarmet resuspension R-buffer (leveret i sættet) for hver 1-2 x 105 celler. Bland forsigtigt med en p20 mikropipette. Tilsæt 10 μL af cellesuspensionen til hvert rør, der er oprettet i trin 4.3, og bland forsigtigt med en p20-mikropipette.
  10. Tag pipetten, og indsæt en spids ved at trykke på trykknappen til det andet stop. Sørg for, at klemmen helt opfanger stemplets monteringsstamme i spidsen, og at der ikke observeres noget mellemrum i pipettens øverste hoved.
  11. For at aspirere prøven skal du trykke på trykknappen på pipetten til det første stop og dyppe ned i det første rør, der indeholder celle/plasmid DNA-blanding. Aspirer langsomt blandingen ind i pipettespidsen.
    BEMÆRK: Undgå luftbobler, da de kan forårsage lysbue under elektroporation, og hvis de registreres af enheden, kan de forhindre levering af den elektriske puls. Hvis der observeres luftbobler, skal du frigive indholdet i røret og prøve at aspirere igen.
  12. Indsæt pipetten med prøven meget forsigtigt i pipetteholderen. Sørg for, at pipetten klikker, og at den er korrekt placeret.
  13. Tryk på Start på berøringsskærmen, og vent, indtil de elektriske impulser er leveret. En meddelelse på skærmen angiver færdiggørelsen.
  14. Fjern langsomt pipetten fra stationen, og tilsæt straks den transfekterede cellesuspension i den tilsvarende brønd med forvarmet antibiotikafrit medium fra trin 2.4 ved langsomt at trykke på trykknappen til første stop.
    BEMÆRK: Dette tip kan genbruges op til tre gange for det samme plasmid; Ellers skal du kassere det i en biohazard affaldsbeholder ved at trykke på trykknappen til det andet stop.
  15. Gentag trin 4.10-4.14 for hvert rør, der indeholder en celle/plasmid DNA-blanding.
  16. Rock forsigtigt pladen med transfekterede celler og inkuber i 1-3 timer i en befugtet vævskulturinkubator (37 ° C, 5% CO2).
  17. Til hver brønd tilsættes 200 μL forvarmet dyrkningsmedium (komplet medium) fra trin 1.1.2. Anbring fadet i inkubatoren for befugtet vævskultur (37 °C, 5 % CO2) igen. Tillad mindst 24 timer til genekspression.
  18. Den næste dag skal du inspicere cellens levedygtighed og transfektionseffektivitet ved hjælp af et epifluorescensmikroskop.
    1. Tænd epifluorescensmikroskopet og fluorescerende lyskildeboks i henhold til producentens anvisninger, og læg kulturskålen på mikroskopstadiet.
    2. Vælg 10x eller 20x målet og 568 nm (RFP) filteret.
    3. For at estimere cellens levedygtighed skal du trykke på knappen Transmitteret lys LED (TL) for at visualisere alle celler i det valgte felt. Mens du kigger ind i mikroskopets okular, skal du dreje fokusknappen, indtil cellerne observeres, og kontrollere, om der er cellefastgørelse i det valgte felt.
      BEMÆRK: Fuldt vedhæftede celler repræsenterer de levedygtige celler, mens flydende celler repræsenterer ikke-levedygtige celler. Hvis brøndens sammenløb er høj, kan tilstedeværelsen af ikke-sluttede celler være resultatet af en overvurdering af celleantal og ikke resultatet af lav levedygtighed. Imidlertid betyder lav sammenløb ledsaget af et højt indhold af flydende celler lav levedygtighed, der kan skyldes lysbue under elektroporation, plasmidtoksicitet eller overeksponering for resuspension R-buffer. Brug ikke brønde, der viser sidstnævnte adfærd.
    4. For at estimere transfektionseffektiviteten skal du fokusere på celler i det valgte felt under transmitteret lys som beskrevet ovenfor. Tæl det samlede antal celler i det valgte felt. Når LED'en for transmitteret lys (TL) er slukket, skal du trykke på LED-knappen (Reflected Light LED) (RL) for at tænde.
    5. Fint fokus på reportergenet fluorescens (røde blodlegemer) og tæl det samlede antal røde fluorescerende celler. Gentag disse trin (4.18.4-4.18.5) for mindst to felter mere pr. brønd.

5. Behandling af transfekteret MDM og caspase BiFC dataindsamling

BEMÆRK: Hvis du planlægger at afbilde cellerne ved hjælp af et epifluorescens- eller konfokalmikroskop, anbefales behandling med qVD-OPh (20 μM) i 1 time før behandling med den valgte stimulus for at forhindre caspaseafhængig celledød (overvejende apoptose). Dette bruges til billeddannelse for at forhindre celler i at løfte sig på grund af apoptose, hvilket gør dem meget vanskelige at afbilde, når de bevæger sig ud af brændplanet. Bemærk, at caspaserekruttering til aktiveringsplatformen og den tilhørende caspase BiFC ikke er afhængig af caspasens katalytiske aktivitet, og derfor vil caspasehæmning ikke påvirke dette trin.

  1. Behandl med valgt stimulus ca. 24 timer efter transfektion og inkuber så længe som nødvendigt for hvert lægemiddel.
    1. Forbered billeddannelsesmedium ved at supplere kulturmediet fra trin 1.1.2 med Hepes (20 mM, pH 7,2-7,5) og 2-mercaptoethanol (55 μM).
    2. Tilsæt den ønskede koncentration af stimulus til det forvarmede billedmedium og bland forsigtigt.
    3. Fjern medierne forsigtigt fra cellerne med en p1000-mikropipette, og tilsæt 500 μL af stimulusopløsningen fra trin 5.1.2 ned ad siden af brønden.
    4. For at køre ubehandlede kontrolbrønde skal du tilføje billedmedium uden stimulans.
    5. Inkuber cellerne i en inkubator for befugtet vævskultur (37 °C, 5 % CO2), så længe det er angivet for hver behandling.
  2. Visualiser cellerne ved hjælp af et epifluorescens eller konfokalmikroskop.
    1. Tænd mikroskopet og den fluorescerende lyskilde efter producentens anvisninger.
    2. Vælg 10x eller 20x målet, og placer kulturskålen på mikroskopscenen.
    3. Ved hjælp af mikroskopets okular skal du finde celler under 568 nm-filteret og fokusere på cellerne, der udtrykker dsRedmito / mCherry-reporteren (røde celler).
    4. Tæl alle de røde celler i synsfeltet, og registrer nummeret.
    5. Mens du er i det samme synsfelt, skal du skifte til 488- eller 512-filteret (GFP eller YFP), fortsæt med at tælle antallet af røde celler, der også er grønne (Venus-positive eller BiFC-positive) og registrere antallet.
    6. Tæl mindst 100 dsRedmito/mCherry-positive celler fra mindst tre individuelle synsfelter.
    7. Beregn procentdelen af Venus-positive transfekterede celler pr. Synsfelt og gennemsnit de resulterende procentdele for hver behandling (brønd) for at få standardafvigelsen.
  3. Forestil dig cellerne ved hjælp af en epifluorescens eller et konfokalt mikroskop
    BEMÆRK: For at erhverve konfokale billeder ved hjælp af et 20x mål eller en større forstørrelse skal celler belægges på glasskåle, medmindre mikroskopet er udstyret med et langt pasningsmål.
    1. Følg trin 5.2.1-5.2.3. Hvis du bruger et konfokalmikroskop med 40x, 60x eller 63x oliemål, skal du placere en dråbe olie på målet.
    2. Visualiser det levende billede af cellerne på computerskærmen som erhvervet af kameraet. Brug epifluorescenslyskilden til fluorescerende billeder, eller skift lyskilden til laserne til konfokale billeder.
    3. Finjuster fokus og placering af cellerne ved hjælp af joystickets kontrol- og fokushjul.
    4. Indstil den procentvise lasereffekt og eksponeringstid for laserne 512 nm eller 488 nm (YFP eller GFP) og 568 nm (RFP), så signalet i billedet ser godt ud og ikke når mætning.
    5. Tænd for liveoptagelsen, og undersøg det resulterende billede. Sørg for, at der ses en tydelig top for hver fluor i displayhistogrammet for begge kanaler.
    6. Juster lasereffekten og eksponeringstiden efter behov. Hold disse værdier så lave som muligt, mens du stadig er i stand til at registrere begge fluorescerende signaler (RFP og GFP / YFP).
    7. Mens du visualiserer det levende billede af cellerne, skal du tage flere repræsentative billeder af et felt, der indeholder en eller flere celler, der udtrykker mCherry/dsRedmito-reporteren for hver brønd på pladen, og gemme dataene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Skemaet vist i figur 2 giver et overblik over, hvordan man opnår, transfekterer og afbilder human MDM. Efter inkubation af de valgte CD14+ monocytter med GM-CSF i 7 dage ændres cellemorfologien i løbet af differentieringsperioden (figur 3A), der går fra sfæriske suspensionsceller til spindly og fuldt fastgjort (dag 3 og 4), og endelig til mere spredte celler, når de er fuldt differentierede (dag 7). Fuldt differentierede celler løsnes derefter fra pladen og transfekteres med caspase BiFC-parrene (VC og VN) sammen med reporterplasmidet (f.eks. dsRedmito, et plasmid, der koder for et rødt fluorescerende protein målrettet mod mitokondrierne), som bruges til at mærke de transfekterede celler (figur 3B) og anvendes til at vurdere effektiviteten af transfektionen efter 24 timer. Figur 3B-D vise et eksempel på BiFC-resultater ved hjælp af caspase-1 pro BiFC transfekterede celler behandlet i 20 timer med nigericin (5 μM), en kendt proinflammatorisk stimulus, der udløser samlingen af NLRP3-inflammasomet30,31. Ubehandlede celler viser ingen Venusfluorescens (figur 3B), og i nigericinbehandlede celler fremstår caspase-1 BiFC som et enkelt punktum med den typiske form af ASC-pletter 32,33,25 (figur 3C). Figur 3D viser et eksempel på kvantation af Venus-positiv MDM. Den højeste procentdel af caspase-1 BiFC ses i LPS + nigericin behandlingsgruppen (figur 3D). Dette resultat er i overensstemmelse med aktivering af et kanonisk inflammasom, hvor både et primingsignal (LPS) og et intracellulært signal (nigericin) er påkrævet for aktivering af capase-1.

Figure 3
Figur 3: Differentiering af CD14-monocytter og transfektion af human MDM. (A) Repræsentative lysfeltbilleder af CD14+ monocytter fra perifert blod eksponeret for GM-CSF på dag 1, 3, 4 og 7 af differentiering (Skalabjælke, 100 μm). (B-C) Human MDM blev transfekteret med caspase-1 pro BiFC-par og transfektionsreporteren dsRedmito (50 ng, rød). 24 timer senere blev cellerne primet med og uden LPS (100 ng/ml) i 3 timer og behandlet med nigericin (5 μM) i billeddannende medium i 20 timer. Repræsentative konfokale billeder af ubehandlede og nigericinbehandlede celler vises (Skalabjælke, 10 μm). BiFC er vist med grønt. (D) Celler fra (C) blev vurderet for procentdelen af dsRedmito-positive celler (røde, transfekterede celler), der var Venus-positive (grønt, caspase-1 BiFC-kompleks) ved 20 timer. Fejllinjer repræsenterer SD for mindst to uafhængige optællinger pr. brønd. Klik her for at se en større version af denne figur.

Et eksempel på plasmititrering er vist i figur 4, hvor stigende mængder af hvert BiFC-plasmid transfekterer. Dette giver mulighed for udvælgelse af den optimale dosis plasmid, hvilket resulterer i et specifikt signal og minimal baggrund. Figur 4A viser resultaterne af human MDM transfekteret med stigende koncentrationer af caspase-1, -4 og -5 pro BiFC-par (VC og VN) behandlet med hæm, et stærkt proinflammatorisk molekyle, der skyldes ødelæggelse af røde blodlegemer34. Den højeste procentdel af Venus-positive celler for caspase-1, -4 og -5 pro BiFC-par skyldes henholdsvis 400 ng, 500 ng og 1000 ng transfekteret plasmid. Brug af den højeste mængde plasmid risikerer imidlertid også at øge ikke-specifik baggrund (figur 4B). For eksempel resulterer transfektion af 1000 ng af caspase-5 pro BiFC-parret i næsten 40% uspecifik baggrund. Derfor betragtes anvendelse af den lavere 700 ng mængde som optimal for dette plasmidpar (figur 4B). I figur 4C vises repræsentative konfokale billeder opnået med et 20x mål for et felt af celler 24 timer efter transfektion. På dette billede kan man se, at de ubehandlede transfekterede celler er levedygtige baseret på mitokondriernes udseende (mitokondrier i døde celler er stærkt fragmenterede) og cellernes morfologi (apoptotiske celler krympes). Efter behandling med hæm fremstår caspase-1-komplekset som et enkelt grønt punktumctum svarende til det, der induceres af nigericin i figur 3C, og dets udseende blev ledsaget af cellekrympning.

Figure 4
Figur 4: Human MDM transfekteret med forskellige mængder inflammatorisk caspase pro BiFC par. (A) Titrering af caspase-1 pro; caspase-4 pro; eller caspase-5 pro BiFC par. Human MDM blev transfekteret med de angivne mængder af caspase pro BiFC-parrene med dsRedmito som transfektionsreporter (50 ng) og inkuberet natten over. Den næste dag blev kulturmediet fjernet fra alle brønde, og celler blev behandlet med og uden hæm (50 μM) i 0,1% FBS-medium. Efter 1 time blev der tilsat en lige stor mængde komplet medium til alle brønde for at rekonstituere FBS-koncentrationen til 5% og forhindre hæm i at dræbe cellerne. Efter en samlet behandling på 20 timer blev cellerne vurderet for procentdelen af dsRedmito-positive transfekterede celler, der var Venus-positive, bestemt ud fra mindst 300 celler pr. brønd. Fejllinjer repræsenterer SD for mindst tre uafhængige tællinger pr. Brønd. B) Human MDM blev transfekteret med udvalgte mængder caspase-1 pro; caspase-4 pro; eller caspase-5 pro BiFC-par sammen med dsRedmito (50 ng) som reporter til transfektion. 24 timer efter transfektion blev celler behandlet med eller uden hæm (50 μM) i 0,1% FBS. Efter 1 time blev FBS rekonstitueret til 5% for at hæmme ekstracellulær hæm. Celler blev vurderet for procentdelen af dsRedmito-positive celler (røde, transfekterede celler), der var Venus-positive (grønt, caspase BiFC-kompleks) ved 20 timer bestemt ud fra mindst 300 celler pr. Brønd. Resultaterne er repræsenteret som procentdel Venus-positive celler. Fejllinjer repræsenterer SD for mindst tre uafhængige tællinger pr. Brønd. (C) Repræsentative konfokale billeder opnået med et 20x mål for et cellefelt 24 timer efter transfektion og behandlet med og uden hæm som beskrevet i (B). Rød: dsRedmito-positive celler; Grøn: Venus-positive celler; Skalabjælke, 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver arbejdsgangen for at opnå makrofager fra monocytter isoleret fra humane blodprøver og en metode til effektivt at introducere de inflammatoriske caspase BiFC-reportere i human MDM uden at gå på kompromis med cellelevedygtighed og adfærd.

Denne protokol udnytter BiFC-teknikken35 til at mærke de inflammatoriske caspaser på caspaserekrutteringsdomænet (CARD) med ikke-fluorescerende fragmenter af det splittede fluorescerende protein Venus. Inflammatoriske caspaser koder for et katalytisk domæne sammensat af en stor (p20) og en lille (p10) underenhed og et konserveret protein-protein-interaktionsmotiv betegnet et CARD ved deres N-terminus eller prodomæne36 (figur 1B). Rekruttering af inflammatoriske caspaser til deres aktiveringsplatforme er afhængig af et intakt CARD. Til denne fremgangsmåde genereres to caspase prodomænekonstruktioner (kodning af CARD-motivet), der hver især er knyttet til de ikke-fluorescerende fragmenter af det fotostable gule protein Venus (Venus-C [VC]) og Venus-N [VN]) sammen med en fluorescerende transfektionsreporter for at muliggøre visualisering af cellerne før eller i mangel af aktivering af caspase BiFC-reporteren. Fluorescens observeres kun, når interagerende proteiner kommer i nærheden af hinanden, til at det ville muliggøre dimerisering og aktivering (se figur 1A). Effektiviteten af denne proces kan kvantificeres ved hjælp af en standard epifluorescens eller et konfokalmikroskop. I kombination med enkeltcellebilleddannelse tillader denne protokol visualisering af asynkrone begivenheder, der kan være uopnåelige i bulkpopulationer, og afhængigt af billedernes opløsning kan den bruges til at bestemme størrelsen og lokaliseringen af BiFC-komplekset, der er forbundet med hver caspase.

Denne protokol kan tilpasses en række proteiner, der aktiveres ved oligomerisering, og dens anvendelighed er ikke begrænset til mikroskopimetoder. Denne tilgang giver også mulighed for undersøgelse af differentielle krav til inflammatorisk caspases samling. For eksempel kan siRNA bruges til at identificere opstrøms komponenter / krav til specifik inflammatorisk caspaseaktivering. Caspase-BiFC-sonderne og siRNA-oligoen (bruges til at dæmpe et målprotein) kan transfekteres samtidigt til MDM. Dette kan identificere potentielle proteinpartnere eller væsentlige komponenter i hver aktiveringsplatform. For eksempel blev en siRNA-oligo, der er målrettet mod ASC-adaptormolekylet, som kræves til samling af NLRP1-, NLRP3- og AIM2-inflammasomerne, brugt til at vise, at hæminduceret aktivering af caspase-1 krævede disse kanoniske inflammasomer, mens caspase-4 og -5 ikkegjorde 21. Denne metode kan også tilpasses til time-lapse-mikroskopi, så kinetikken af den inflammatoriske caspaseaktivering kan bestemmes i enkeltceller. Ved hjælp af en sådan tilgang kan man vurdere, hvornår caspasedimerisering sker ved præcist at detektere tidspunktet for udseendet af BiFC-debuten i forhold til det tidspunkt, hvor cellen gennemgår døden ved at overvåge tab af fluorescens af transfektionsreporteren (mCherry) som en indikation af cellelyse. Der er flere måder at erhverve og analysere caspase BiFC-data på; valget afhænger af det spørgsmål, der skal besvares, og den tilgængelige type mikroskop og software. For eksempel kan enkelttidspunktsdata, der bruges til at bestemme effektiviteten af aktivering samt time-lapse-analyse, være særligt effektive, hvis en automatisk erhvervelsesfunktion, der leveres af nogle mikroskopsoftware, er tilgængelig. Dette muliggør objektiv billeddannelse, da forudbestemte positioner arrays erhverves fra hver brønd i en multi-well plade. Billeder kan kvantificeres både ved visuel inspektion og ved hjælp af automatiseret billedbehandlingssoftware som CellProfiler, ImageJ eller MATLAB for at øge nøjagtigheden og objektiviteten.

Undersøgelse af caspaseveje i primære celler er afgørende for fuldt ud at forstå disse proteiners fysiologiske roller. Derudover, fordi caspase-4 og caspase-5 erstattes af en enkelt caspase-11 hos mus, er det vigtigt at kunne vurdere humane celler. På grund af lav transfektionseffektivitet og toksicitet forbundet med mange leveringssystemer i primære celler kan det imidlertid være vanskeligt at maksimere brugen af tilgængelige plasmidbaserede indberettere. Den inflammatoriske caspase BiFC-protokol beskriver en simpel metode til at transfektere MDM fra perifert blod fra enten patienter eller raske forsøgspersoner, hvilket reducerer antallet af celler, der kræves pr. Transfektion. Dette gør det muligt for forskere at udføre mere komplekse eksperimenter med dyrebare celler som makrofager uden at gå på kompromis med cellelevedygtighed og cellulære egenskaber. Evnen til at bruge patientprøver giver en stor fordel ved at kunne vurdere inflammatorisk caspaseaktivering i specifikke sygdomstilstande. Faktisk, med nogle mindre optimeringer, kunne denne protokol let tilpasses til andre murine eller humane primære celler.

Denne protokol bruger en elektroporationsbaseret tilgang til transfekt MDM. Neon-systemet er særligt fordelagtigt, da det ikke inducerer et IFN-γ respons i MDM, hvilket kan forstyrre cellernes specifikke immunrespons37. Dette er et lille elektroporationssystem, der bruger et 10 μL transfektionsvolumen med en høj celletæthed for at muliggøre effektiv overførsel af eksogent DNA til et stort antal celler. Det skaber midlertidige porer i cellemembranen, så plasmider kan passere hurtigt og undgå den sene endocytose, der opstår under kemisk transfektion, og som kan udløse plasmidnedbrydning. Denne protokol anvender en organisk syrebaseret bufferformulering (buffer R), der indfører minimal celletoksicitet sammenlignet med andre buffere med chloridioner38. Det lille volumen og designet af pipettespidskammeret hjælper med at generere et ensartet elektrisk felt for at opretholde fysiologiske forhold, hvilket resulterer i høje overlevelsesrater. Transfektionseffektivitet og celleoverlevelse er stærkt afhængige af bufferens kemiske sammensætning, celletætheden, pulsens styrke og plasmidkoncentrationen39. Derfor er det vigtigt at optimere disse betingelser for hver celletype og plasmid, der introduceres. I MDM leverede lavere spændinger med længere pulsvarighed plasmider mere effektivt, samtidig med at cellerne blev levedygtige og sunde. Følgelig var de indstillinger, der blev anvendt til denne protokol, 1000 V og 2 impulser på 40 ms, hvilket resulterede i transfektionseffektivitet mellem 40-60% med cellelevedygtighed højere end 90% baseret på cellernes evne til at binde sig til pladen igen efter transfektion. Mens denne protokol er optimeret til human MDM, varierer spændingsindstillingerne fra 500 V til 1700 V, øger antallet af impulser fra 1 til 3 og tester længden af impulser fra 10 til 40 ms kan afbalancere transfektionseffektivitet og cellelevedygtighed i yderligere celletyper og eksperimentelle indstillinger.

Der er flere vigtige overvejelser for optimal anvendelse af BiFC-teknikken. 1) Det er vigtigt, at brugeren bestemmer den optimale mængde af hvert caspaseplasmid, der skal indføres, da dette kan variere for forskellige proteiner og celletyper. Dette er nødvendigt for at sikre maksimal følsomhed og specificitet af assayet. Det anbefales at køre en pilottitrering af caspase BiFC-plasmiderne (VC- og VN-fragmenter) mellem 200 ng og 1000 ng som vist i figur 4A-B. Det optimale interval af plasmid, der indføres, adskiller sig for hver enkelt caspase, og derfor skal de vurderes individuelt. Vælg en plasmidmængde, der giver det højeste specifikke signal med minimal baggrund. Ideelt set bør baggrundsniveauet være mindre end 10%, men op til 20% kan bruges, hvis det specifikke signal er højt. Det er også vigtigt at undgå barske tilstande og overdreven manipulation af disse celler under differentiering, transfektion og behandling. Dette kan også resultere i spontan aktivering og høje baggrundsniveauer af caspaseaktivering, der kan skjule de specifikke resultater, da aktivering af immunceller som monocyt eller makrofager er en naturlig proces, hvor de kan erhverve proinflammatoriske funktioner40. Hvis du bruger patientceller, kan det være svært at kontrollere for en iboende variation i niveauer af inflammasomaktivering og genetisk baggrund, der kan sensibilisere eller desensibilisere dem til stimuli og ændringer i deres lokale mikromiljø. For eksempel kan makrofagfunktion påvirkes hos immunkompromitterede individer eller personer, der bekæmper en infektion, da denne type celle spiller vigtige homeostatiske funktioner og er involveret i kontrol af betændelse, blandt andre funktioner. Disse genetiske og miljømæssige faktorer skal tages i betragtning, når det skal afgøres, om en høj baggrund er uspecifik eller en biologisk virkning. Brug af nøje matchede sunde kontroller (f.eks. Matchet for køn og alder) kan hjælpe med at vurdere den biologiske betydning af et højt baggrundsniveau af caspase BiFC. 2) Det er afgørende, at VC- og VN-fragmenterne introduceres i lige store mængder, da ulige ekspression af et Venus-fragment kan resultere i rekruttering til platformen ved højere frekvenser og maskere det fulde fluorescerende signal og producere et falsk negativt resultat. Derfor bør integriteten og koncentrationen af hvert enkelt plasmid valideres før hver transfektion for at undgå at indføre forskellige mængder af VC- og VN-fragmenterne. 3) Da denne tilgang er baseret på caspase-indberetternes eksogene ekspression, bør der medtages yderligere kontrol for specificitet. Caspase-BiFC-konstruktioner indeholdende enkeltpunktsmutationer, der forstyrrer bindingen mellem caspasen og dens aktiveringsplatform eller dæmpning af en af komponenterne i aktiveringsplatformen ved hjælp af siRNA, kan bruges til at bekræfte, at det fluorescerende signal skyldes specifik binding af caspasen til inflammasomet. Dette kontroleksperiment skulle resultere i nedsatte niveauer af Venus-positive celler. 4) Ekspression af caspase BiFC-konstruktionerne kan udløse eller påvirke nedstrømshændelser såsom celledød. For at omgå dette anbefales ikke-enzymatiske versioner af caspasen til BiFC-indberetterne, såsom caspaseprodomænet eller caspasen i fuld længde, hvor den katalytiske cysteinrest muteres og inaktiveres. For yderligere kontrol for dette bør kontrol af ikke-transfekterede behandlede og ubehandlede brønde indgå i forsøget og bør vise lignende adfærd som for de transfekterede brønde. 5) Endogen caspaseaktivitet kan muligvis påvirke BiFC-udlæsningen. For at kontrollere for dette kan man udtrykke caspase-reporteren i celler, der mangler for caspasen under undersøgelse, med forventning om, at BiFC-effektiviteten ville være den samme.

En af de største ulemper ved denne tilgang er, at den ikke måler caspaseaktivering i sig selv, men det inducerede nærhedstrin, der kræves for at aktivering kan forekomme. Dette er en subtil, men vigtig sondring. Ved design indeholder prodomænet ikke de katalytiske domæner af caspasen, der faktisk dimeriserer. Derfor fungerer venusfragmenternes omfoldning og fluorescens som en proxy for caspasedimerisering, da de kun kan foldes igen, hvis caspaserne er tætte nok til at dimerisere. Således måler BiFC specifikt induceret nærhed. Det er muligt, at posttranslationelle modifikationer i de katalytiske domæner kan hindre dimerisering uden at påvirke BiFC-signalet. For eksempel fosforyleres caspase-2 på sit katalytiske domæne, og dette hindrer dimerisering uden at forhindre rekruttering af caspase-2 til dets aktiveringsplatform41. Derfor skal observationer, der anvender BiFC-metoden, suppleres med funktionelle undersøgelser for at bekræfte, at den observerede fluorescens er repræsentativ for caspaseaktivering. På trods af denne ulempe, hvis de kontroller, der diskuteres her, er inkluderet, kan måling af induceret nærhed af caspase BiFC give en nøjagtig repræsentation af specifik caspaseaktivering.

Afslutningsvis er caspase BiFC et kraftfuldt værktøj til analyse af dynamiske caspaseinteraktioner på inflammasomniveau. Denne protokol giver mulighed for forhør af de inflammatoriske caspase-signalkaskader i levende immunceller. Denne tilgang giver ikke kun en teknik til specifikt og præcist at måle det første trin i caspaseaktivering, men ved at blive anvendt på primære immunceller har potentialet til at afsløre egenskaber ved inflammatoriske caspaser, der ikke kunne identificeres ved hjælp af konventionelle metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi takker medlemmerne af LBH's laboratorium før og nu, som har bidraget til udviklingen af denne teknik. Dette laboratorium understøttes af NIH/NIDDK T32DK060445 (BEB), NIH/NIDDK F32DK121479 (BEB), NIH/NIGMS R01GM121389 (LBH). Figur 2 blev tegnet ved hjælp af Biorender-software.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
48 well tissue culture2:34 plates Genesee Scientific 25-108
10 cm Tissue Culture Dishes VWR 25382-166
2 Mercaptoethanol 1000x Thermo Fisher Scientific 21985023
8 well chambered coverglass with 1.5 HP coverglass Cellvis c8-1.5H-N
AutoMACS columns Miltenyi (Biotec) 130-021-101 For automated separation using AutoMACS Pro Separator only
AutoMACS Pro Separator Miltenyi (Biotec) 130-092-545 For automated separation using AutoMACS Pro Separator only
AutoMACS Pro Washing Solution Miltenyi (Biotec) 130-092-987 For automated separation using AutoMACS Pro Separator only
AutoMACS Rinsing Solution Miltenyi (Biotec) 130-091-222 For automated separation using AutoMACS Pro Separator only
AutoMacs running buffer Miltenyi (Biotec) 130-091-221 For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator
Axio Observer Z1 motorized inverted microscope equipped with a CSU-X1A 5000 spinning disk unit Zeiss Any confocal microscope equipped with a laser module fitted with laser lines of 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used
AxioObserver A1, Research Grade Inverted Microscope Zeiss Any epifluorescence microscope with fluorescence filters capable of exciting 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used
CD14+ MICROBEADS Miltenyi (Biotec) 130-050-201 For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator
DPBS without calcium chloride and magnesium chloride Sigma D8537-6x500ML
DsRed mito plasmid Clontech 632421 Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 10437028
Ficoll-Paque PLUS 6 x 100 mL Sigma GE17-1440-02
GlutaMAX Supplement (100x) Thermo Fisher Scientific 35050079
GM-CSF Thermo Fisher Scientific PHC2011
Hemin BioXtra, from Porcine, ≥96.0% (HPLC) Sigma 51280-1G
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630106
Inflammatory caspase BiFC plasmids Available by request from LBH lab
LPS-EB Ultrapure Invivogen TLRL-3PELPS
LS Columns Miltenyi (Biotec) 130-042-401 For manual separation using QuadroMACS Separator only
MACS 15 mL Tube Rack Miltenyi (Biotec) 130-091-052 For manual separation using QuadroMACS Separator only
MACS MultiStand Miltenyi (Biotec) 130-042-303 For manual separation using QuadroMACS Separator only
mCherry plasmid Yungpeng Wang Lab Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene
Neon Transfection System Thermo Fisher Scientific MPK5000 Includes Neon electroporation device, pipette and pipette station
Neon Transfection System 10 µL Kit Thermo Fisher Scientific MPK1096 Includes resuspension buffer R, resuspension buffer T, electrolytic buffer E, 96 x 10 µL Neon tips and Neon electroporation tubes
Nigericin sodium salt, ready made solution Sigma SML1779-1ML
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122
Poly-D-Lysine Hydrobromide Sigma P7280-5mg
QuadroMACS Separator Miltenyi (Biotec) 130-090-976 For manual separation using QuadroMACS Separator only
qVD-OPh Fisher (ApexBio) 50-101-3172
RPMI 1640 Medium Thermo Fisher Scientific 11875119
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Fisher Scientific 25200072
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific 15575020
Zeiss Zen 2.6 (blue edition) software Zeiss Any software used to operate the confocal microscope of choice

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Molecular Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
  2. Pop, C., Salvesen, G. S. Human caspases: activation, specificity, and regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).
  3. Boice, A., Bouchier-Hayes, L. Targeting apoptotic caspases in cancer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1867 (6), 118688 (2020).
  4. Bolívar, B. E., Vogel, T. P., Bouchier-Hayes, L. Inflammatory caspase regulation: maintaining balance between inflammation and cell death in health and disease. The FEBS Journal. 286 (14), 2628-2644 (2019).
  5. Martinon, F., Tschopp, J. Inflammatory caspases: linking an intracellular innate immune system to autoinflammatory diseases. Cell. 117 (5), 561-574 (2004).
  6. Lamkanfi, M., Vishva, M. D. Mechanisms and functions of inflammasomes. Cell. 157 (5), 1013-1022 (2014).
  7. Viganò, E., et al. Human caspase-4 and caspase-5 regulate the one-step noncanonical inflammasome activation in monocytes. Nature Communications. 6, 8761 (2015).
  8. Cerretti, D. P., et al. Molecular cloning of the interleukin-1 beta converting enzyme. Science. 256 (5053), 97 (1992).
  9. van de Veerdonk, F. L., Netea, M. G., Dinarello, C. A., Joosten, L. A. Inflammasome activation and IL-1β and IL-18 processing during infection. Trends in Immunology. 32 (3), 110-116 (2011).
  10. Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Molecular Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
  11. Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation targets caspase-11. Nature. 479 (7371), 117-121 (2011).
  12. Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4. Science. 341 (6151), 1246-1249 (2013).
  13. Masumoto, J., et al. ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. The Journal of Biological Chemistry. 274 (48), 33835-33838 (1999).
  14. Bertin, J., DiStefano, P. S. The PYRIN domain: a novel motif found in apoptosis and inflammation proteins. Cell Death and Differentiation. 7 (12), 1273-1274 (2000).
  15. Agostini, L., et al. NALP3 forms an IL-1beta-processing inflammasome with increased activity in Muckle-Wells autoinflammatory disorder. Immunity. 20 (3), 319-325 (2004).
  16. Bürckstümmer, T., et al. An orthogonal proteomic-genomic screen identifies AIM2 as a cytoplasmic DNA sensor for the inflammasome. Nature Immunology. 10 (3), 266-272 (2009).
  17. Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A. Activation and regulation of the inflammasomes. Nature Reviews Immunology. 13 (6), 397-411 (2013).
  18. Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves gasdermin D for noncanonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
  19. Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
  20. Shi, J., et al. Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS. Nature. 514 (7521), 187-192 (2014).
  21. Bolívar, B. E., et al. Noncanonical Roles of Caspase-4 and Caspase-5 in Heme-Driven IL-1β Release and Cell Death. The Journal of Immunology. 206 (8), 1878-1889 (2021).
  22. Schmid-Burgk, J. L., et al. Caspase-4 mediates noncanonical activation of the NLRP3 inflammasome in human myeloid cells. European Journal of Immunology. 45 (10), 2911-2917 (2015).
  23. Baker, P. J., et al. NLRP3 inflammasome activation downstream of cytoplasmic LPS recognition by both caspase-4 and caspase-5. European Journal of Immunology. 45 (10), 2918-2926 (2015).
  24. Cullen, S. P., Kearney, C. J., Clancy, D. M., Martin, S. J. Diverse activators of the NLRP3 inflammasome promote IL-1β secretion by triggering necrosis. Cell Reports. 11 (10), 1535-1548 (2015).
  25. Sanders, M. G., et al. Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes. Cell Death & Disease. 6, 1813 (2015).
  26. Charendoff, C. I., Bouchier-Hayes, L. Lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), e57316 (2018).
  27. Bouchier-Hayes, L., et al. Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity. Molecular Cell. 35 (6), 830-840 (2009).
  28. Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Peripheral blood mononuclear cells: Isolation, Freezing, thawing, and culture. Methods in Molecular Biology. 1304, 53-61 (2016).
  29. Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Current Pathobiology Reports. 7 (2), 17-27 (2019).
  30. Perregaux, D., et al. IL-1 beta maturation: evidence that mature cytokine formation can be induced specifically by nigericin. The Journal of Immunology. 149 (4), 1294-1303 (1992).
  31. Cheneval, D., et al. Increased mature interleukin-1β (IL-1β) secretion from THP-1 cells induced by nigericin is a result of activation of p45 IL-1β-converting enzyme processing. Journal of Biological Chemistry. 273 (28), 17846-17851 (1998).
  32. Fernandes-Alnemri, T., et al. The pyroptosome: a supramolecular assembly of ASC dimers mediating inflammatory cell death via caspase-1 activation. Cell Death and Differentiation. 14 (9), 1590-1604 (2007).
  33. Lu, A., et al. Unified polymerization mechanism for the assembly of ASC-dependent inflammasomes. Cell. 156 (6), 1193-1206 (2014).
  34. Muller-Eberhard, U., Javid, J., Liem, H. H., Hanstein, A., Hanna, M. Brief report: Plasma concentrations of hemopexin, haptoglobin and heme in patients with various hemolytic diseases. Blood. 32 (5), 811-815 (1968).
  35. Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).
  36. Thornberry, N. A., et al. A novel heterodimeric cysteine protease is required for interleukin-1βprocessing in monocytes. Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).
  37. Jensen, K., Anderson, J. A., Glass, E. J. Comparison of small interfering RNA (siRNA) delivery into bovine monocyte-derived macrophages by transfection and electroporation. Veterinary Immunology and Immunopathology. 158 (3-4), 224-232 (2014).
  38. Tada, Y., Sakamoto, M., Fujimura, T. Efficient gene introduction into rice by electroporation and analysis of transgenic plants: use of electroporation buffer lacking chloride ions. Theoretical and Applied Genetics. 80 (4), 475-480 (1990).
  39. Bhowmik, P., et al. Targeted mutagenesis in wheat microspores using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 8 (1), 6502 (2018).
  40. Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. What's the difference between CD80 and CD86. Trends in Immunology. 24 (6), 314-319 (2003).
  41. Kurokawa, M., Kornbluth, S. Caspases and kinases in a death grip. Cell. 138 (5), 838-854 (2009).

Tags

Immunologi og infektion udgave 182
Visualisering af inflammatorisk caspases induceret nærhed i humane monocytafledte makrofager
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bolívar, B. E., Bouchier-Hayes, … More

Bolívar, B. E., Bouchier-Hayes, L. Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (182), e63162, doi:10.3791/63162 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter