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Biology

कीट कीटों के खिलाफ वाणिज्यिक अनुप्रयोग के लिए एंटोमोपैथोजेनिक कवक, मेटारिज़ियम रॉबर्टसी और मेटारिज़ियम पिनघेन्से का बड़े पैमाने पर उत्पादन

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/63246
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Conservation Ecology and Entomology, Faculty of AgriSciences, Private Bag X1

Summary

एंटोमोपैथोजेनिक कवक ने कृषि कीटों के जैविक नियंत्रण एजेंटों के रूप में महत्व प्राप्त किया है। इस अध्ययन में, कीट कीटों के खिलाफ वाणिज्यिक अनुप्रयोग के लिए Metarhizium robertsii और M. pinghense दोनों के दक्षिण अफ्रीकी आइसोलेट्स के लचीले संक्रामक प्रोपेगुल्स की पर्याप्त संख्या का बड़े पैमाने पर उत्पादन सफलतापूर्वक कृषि अनाज उत्पादों का उपयोग करके आयोजित किया गया था।

Abstract

मेटारिज़ियम एनिसोप्लिया प्रजाति परिसर के एंटोमोपैथोजेनिक कवक ने कृषि कीटों के जैविक नियंत्रण एजेंटों के रूप में महत्व प्राप्त किया है। रासायनिक कीटनाशकों के लिए कीट प्रतिरोध में वृद्धि, मानव स्वास्थ्य पर कीटनाशकों के नकारात्मक प्रभावों के बारे में बढ़ती चिंताओं, और कीटनाशकों से पर्यावरण प्रदूषण ने फसल संरक्षण और कीट नियंत्रण के लिए उपन्यास स्थायी रणनीतियों को खोजने के लिए एक वैश्विक अभियान का नेतृत्व किया है। इससे पहले, इस तरह के entomopathogenic कवक (ईपीएफ) प्रजातियों के रूप में Beauveria bassian के रूप में बड़े पैमाने पर संस्कृति के प्रयास आयोजित किए गए हैं। हालांकि, कीट कीटों के खिलाफ उपयोग के लिए बड़े पैमाने पर संस्कृति Metarhizium robertsii और M. pinghaense के लिए केवल सीमित प्रयास किए गए हैं। इस अध्ययन का उद्देश्य वाणिज्यिक अनुप्रयोग के लिए एम रॉबर्टसी और एम. पिनघेन्स के दक्षिण अफ्रीकी आइसोलेट्स के लचीले संक्रामक प्रोपागुल्स की पर्याप्त संख्या का बड़े पैमाने पर उत्पादन करना था। तीन कृषि अनाज उत्पादों, गुच्छेदार जई, गुच्छेदार जौ, और चावल, ईपीएफ ठोस किण्वन सब्सट्रेट के रूप में इस्तेमाल किया गया था। ठोस सब्सट्रेट्स को टीका लगाने के लिए दो इनोक्यूलेशन विधियों, कोनिडियाल सस्पेंशन और ब्लास्टोस्पोर्स की तरल कवक संस्कृति का उपयोग किया गया था। कोनिडियाल निलंबन का उपयोग करके टीकाकरण अपेक्षाकृत कम प्रभावी पाया गया था, क्योंकि ब्लास्टोस्पोर इनोक्यूलेशन विधि का उपयोग करते समय ठोस सब्सट्रेट पर संदूषण के बढ़े हुए स्तर को देखा गया था। गुच्छेदार जई को एम रॉबर्टसी और एम पिनघेन्से दोनों के लिए एक उपयुक्त विकास सब्सट्रेट नहीं पाया गया था, क्योंकि सब्सट्रेट से कोई सूखा कोनिडिया नहीं काटा गया था। गुच्छेदार जौ को एम. पिन्गेनसे के उत्पादन पर एम. रॉबर्टसी कोनिडिया के उत्पादन का पक्ष लेने के लिए पाया गया था, और 1.83 ग्राम ± 1.47 ग्राम सूखे एम. रॉबर्टसी कोनिडिया के औसत और एम. पिन्गेनसे कोनिडिया के शून्य ग्राम सब्सट्रेट से काटा गया था। चावल के अनाज को एम. पिन्गेन्स और एम. रॉबर्टसी आइसोलेट्स दोनों के कोनिडियल बड़े पैमाने पर उत्पादन के पक्ष में पाया गया था, जिसमें क्रमशः सब्सट्रेट से काटे गए 8.2 ग्राम ± 4.38 ग्राम और 6 ग्राम ± 2 ग्राम का औसत था।

Introduction

एंटोमोपैथोजेनिक कवक (ईपीएफ) ने महत्वपूर्ण कृषि कीटों के जैविक नियंत्रण में फसल संरक्षण एजेंटों के रूप में महत्व प्राप्त कियाहै 1,2। एंटोमोपैथोजेन, जो मिट्टी में स्वाभाविक रूप से होते हैं, विभिन्न कीट प्रजातियों की आबादी में एपिज़ोटिक्स का कारण बनतेहैं। ईपीएफ की प्रजातियां मेजबान-विशिष्ट हैं और गैर-लक्षित प्रजातियों पर हमला करने के मामले में अपेक्षाकृत कम जोखिम पैदा करती हैं, और वे पर्यावरणके लिए गैर-विषैले हैं। ईपीएफ के पास अपने मेजबान पर हमला करने के लिए एक अद्वितीय तंत्र है, साथ ही साथ उनके तत्काल वातावरण में प्रचार और जारी रखनेके लिए भी। वे मुख्य रूप से अलैंगिक बीजाणुओं के माध्यम से मेजबान पर हमला करते हैं जो मेजबान हेमोकोइल में आक्रमण करने और फैलने के लिए मेजबान छल्ली को संलग्न और प्रवेश करते हैं। मेजबान अंततः हेमोलिम्फ पोषक तत्वों की कमी के कारण या कवक द्वारा जारी विषाक्त चयापचयों के कारण होने वाले टॉक्सेमिया के परिणामस्वरूप मर जाता है। मृत्यु के बाद, आदर्श पर्यावरणीय परिस्थितियों के तहत, कवक मेजबान शव 5,6 की बाहरी सतह (ओवरट माइकोसिस) पर उभरता है।

मानव स्वास्थ्य, पर्यावरण प्रदूषण, और कीट प्रतिरोध के विकास पर रासायनिक अवशेषों के नकारात्मक प्रभावों के बारे में बढ़ती चिंताओं ने रासायनिक-आधारित कीटनाशकों के आदानों को कम करने और फसल संरक्षण और कीट नियंत्रण के लिए वैकल्पिक, उपन्यास और टिकाऊ रणनीतियों को खोजने के लिए वैश्विक अभियान का नेतृत्व कियाहै 6,7,8 . इसने एकीकृत कीट प्रबंधन (आईपीएम) कार्यक्रमों में उपयोग के लिए माइक्रोबियल-आधारित कीटनाशकों को विकसित करने के अवसर प्रदान किए हैं, जो पारंपरिक रासायनिक नियंत्रण 3,8 की तुलना में अधिक पारिस्थितिक रूप से अनुकूल रणनीतियां हैं।

एक कृषि कीट के लिए एक सफल माइक्रोबियल नियंत्रण एजेंट विकसित करने के लिए, एक उपयुक्त जीव को पहले अलग किया जाना चाहिए, विशेषता, पहचाना जाना चाहिए और लक्ष्य कीट के लिए इसकी रोगजनकता की पुष्टि की जानी चाहिए। हालांकि, जैविक नियंत्रण कार्यक्रमों 9,10,11,12,13 में उपयोग के लिए एक व्यवहार्य उत्पाद का उत्पादन करने के लिए माइक्रोबियल एजेंट के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक आसान, लागत प्रभावी विधि की आवश्यकता होती है। अच्छी गुणवत्ता वाले एंटोमोपैथोजेन की पर्याप्त मात्रा का बड़े पैमाने पर उत्पादन माइक्रोबियल तनाव, पर्यावरण, लक्ष्य कीट, सूत्रीकरण, बाजार, आवेदन रणनीति और वांछित अंत उत्पाद 14,15,16 पर निर्भर करता है। ईपीएफ को बड़े पैमाने पर उत्पादित किया जा सकता है तरल सब्सट्रेट किण्वन का उपयोग करके ब्लास्टोस्पोर्स या ठोस सब्सट्रेट किण्वन प्रक्रिया का उत्पादन करने के लिए हवाई कोनिडिया 6,17,18 का उत्पादन करने के लिए। हालांकि, एंटोमोपैथोजेन्स के बड़े पैमाने पर उत्पादन और निर्माण प्रक्रिया सीधे वायरस, लागत, शेल्फ जीवन और अंतिम उत्पाद की क्षेत्र प्रभावकारिता को प्रभावित करती है। आईपीएम में सफल उपयोग के लिए, एंटोमोपैथोजेन की उत्पादन प्रक्रिया को चलाने में आसान होना चाहिए, न्यूनतम श्रम की आवश्यकता होती है, विषैले, व्यवहार्य और लगातार प्रोपागुल्स की उच्च उपज एकाग्रता का उत्पादन करना चाहिए, औरलागत में कम होना चाहिए 4,13,14,16।

एंटोमोपैथोजेन की पोषण संबंधी आवश्यकताओं को समझना सभी खेती विधियों के साथ बड़े पैमाने पर खेती के लिए महत्वपूर्ण है 4,12। उत्पादन माध्यम के पोषण घटकों का परिणामस्वरूप प्रोपेगुल्स की विशेषताओं पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है, जिसमें बायोकंट्रोल प्रभावकारिता, उपज, निर्जलीकरण सहिष्णुता और दृढ़ता 8,19,20,21 शामिल हैं। उत्पादन प्रक्रियाओं का अनुकूलन ऐसे कारकों को संबोधित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है22। ईपीएफ के लिए, कवक कोनिडिया के अच्छे विकास, स्पोरुलेशन और बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए मुख्य आवश्यकताएं पर्याप्त नमी, इष्टतम विकास तापमान, पीएच, सीओ 2 और ओ2 के गैस एक्सचेंज, और पोषण, जिसमें अच्छे फॉस्फोरस, कार्बोहाइड्रेट, कार्बन और नाइट्रोजन स्रोतशामिल हैं।

Jaronski और जैक्सन18 ठोस सब्सट्रेट किण्वन विधि को तरल सब्सट्रेट किण्वन विधि के सापेक्ष ईपीएफ उत्पादन के लिए प्राकृतिक प्रक्रिया के लिए सबसे कुशल और निकटतम सन्निकटन विधि के रूप में वर्णित करते हैं क्योंकि, प्राकृतिक परिस्थितियों में, कवक कोनिडियम ठोस खड़ी संरचनाओं पर उत्पन्न होता है, जैसे कि कीट शवों की सतह। स्टार्च युक्त कृषि उत्पादों और उप-उत्पादों का उपयोग ज्यादातर हाइपोक्रीलियन कवक के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए किया जाता है, क्योंकि कवक अपने हाइफल युक्तियों से अत्यधिक केंद्रित हाइड्रोलाइटिक एंजाइमों के स्राव के माध्यम से स्टार्च को आसानी से विघटित करता है, ठोस पदार्थ में प्रवेश करने के लिए, और पदार्थ में मौजूद पोषक तत्वों तक पहुंचने के लिए 11,17,18,23 . अनाज उत्पाद स्वस्थ बायोमास उत्पादन के लिए आवश्यकताएं भी प्रदान करते हैं क्योंकि, जब वे हाइड्रेटेड और निष्फल होते हैं, तो सब्सट्रेट किसी भी तरल माध्यमसे आगे के पोषक तत्वों को अवशोषित कर सकते हैं 16,18,24।

इससे पहले, कई अध्ययनों ने बीओवेरिया बेसियाना (बाल्स) जैसी ईपीएफ प्रजातियों को बड़े पैमाने पर संस्कृति करने का प्रयास किया। Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. श्रेष्ठ और Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas और Metarhizium anisopliae के कुछ (Metschn.) सोरोकिन प्रजाति परिसर विभिन्न substrates 16,23,24 पर अलग हो जाता है। इस तरह के बड़े पैमाने पर उत्पादित और व्यावसायिक रूप से विकसित आइसोलेट्स में ग्रीन मसल® (स्ट्रेन आईएमआई 330189) शामिल हैं, जो एम. एनिसोपलिया वार मेटारिज़ियम एक्रिडम (ड्राइवर और मिलनर) जे.एफ. बिश, रेहनर एंड हंबर, मेटारिज़ियम 69 (मेटा 69 स्ट्रेन ICIPE69), और रियल मेटारिज़ियम 69 (L9281) से विकसित किया गया है, जिसे M. anisopliae, और ब्रॉडबैंड® (स्ट्रेन PPRI 5339) और इको-बीबी® से विकसित किया गया है। . हालांकि, बड़े पैमाने पर संस्कृति के लिए सीमित प्रयास किए गए हैं Metarhizium robertsii J.F. Bisch., Sa. Rehner & Humber और Metarhizium pinghaense Chen & Guo। इन दो आइसोलेट्स को पिछले अध्ययन में मीलीबग के नियंत्रण के लिए सबसे प्रभावी के रूप में चुना गया था, स्यूडोकोकस विबर्नी सिग्नोरेट (हेमिप्टेरा: स्यूडोकोकिडे)27। इसलिए, वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य कीट कीटों के खिलाफ वाणिज्यिक अनुप्रयोग के लिए एम रॉबर्टसी और एम पिनघेन्से के स्थानीय आइसोलेट्स के लचीले संक्रामक प्रोपेगुल्स की पर्याप्त संख्या को तैयार करना और बड़े पैमाने पर उत्पादन करना है। ठोस सब्सट्रेट किण्वन विधि का उपयोग बड़े पैमाने पर दोनों ईपीएफ आइसोलेट्स के लिए फंगल कोनिडिया का उत्पादन करने के लिए किया गया था। दो ईपीएफ इनोक्यूलेशन विधियों, कोनिडियल निलंबन और ब्लास्टोस्पोर्स की तरल कवक संस्कृति का उपयोग करके, ठोस सब्सट्रेट को टीका लगाने के लिए उपयोग किया गया था।

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Protocol

1. कवक उपभेदों का स्रोत

  1. दोनों M. pinghense 5 HEID (GenBank Accession number: MT367414/MT895630) और M. robertsii 6EIKEN (MT378171/MT380849) दोनों के दक्षिण अफ्रीकी पृथक कवक उपभेदों का उपयोग करें, जो पश्चिमी केप प्रांत, दक्षिण अफ्रीका में सेब के बगीचों से एकत्र किए गए हैं।
  2. प्रत्येक ईपीएफ की संस्कृतियों को 60 ग्राम सबौरौड डेक्सट्रोज आगर माध्यम पर अलग करें, खमीर निकालने (SDAY) के 1 ग्राम और स्ट्रेप्टोमाइसिन के 10 μL के साथ पूरक।
    नोट: अंधेरे में ± 25 डिग्री सेल्सियस के नियंत्रित तापमान पर ईपीएफ संस्कृतियों को इनक्यूबेट करें।

2. Metarhizium pinghense  और एम रॉबर्टसी कोनिडियाल निलंबन टीकाकरण

  1. ठोस substrates की तैयारी
    1. दो कृषि उत्पादों का उपयोग करें, अर्थात् गुच्छेदार जई और गुच्छेदार जौ, किण्वन बैग के रूप में दो ईपीएफ आइसोलेट्स और आटोक्लेव बैग (305 मिमी × 660 मिमी) के लिए विकास माध्यमों के रूप में।
    2. आटोक्लेव बैग के खुले छोर पर किण्वन बैग के लिए एक गर्दन बनाने के लिए एक छोटे पॉलीविनाइलक्लोराइड अपशिष्ट पाइप (1000 मिमी × 50 मिमी) का उपयोग करें और बैग में पाइप को सुरक्षित करने के लिए आटोक्लेव टेप का उपयोग करें।
    3. किण्वन के दौरान पर्याप्त गैस विनिमय की अनुमति देने के लिए एक बाँझ कपास ऊन प्लग के साथ पाइप को बंद करें।
    4. गुच्छेदार जई और गुच्छेदार जौ दोनों के सूखे अनाज (200 ग्राम) का वजन करें और उन्हें किण्वन बैग में रखें, और प्रत्येक बैग में, 100 मिलीलीटर आसुत पानी जोड़ें और बैग की सामग्री को अच्छी तरह से मिलाएं।
    5. गीले अनाज को ऑटोक्लेविंग और नसबंदी से पहले नमी को अवशोषित करने के लिए 15-30 मिनट के लिए आराम करने के लिए छोड़ दें। प्रत्येक अनाज प्रकार के लिए छह बैग तैयार करें, और संदूषण को रोकने के लिए, बैग को अन्य आटोक्लेव बैग में रखें, और 55 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर सब्सट्रेट को आटोक्लेव करें।
  2. कोनिडियाल निलंबन इनोकुलम की तैयारी
    1. एक बाँझ सर्जिकल ब्लेड का उपयोग करके स्क्रैपिंग द्वारा एम. पिन्गेन्से और एम. रॉबर्टसी दोनों की फंगल संस्कृतियों से 2-3-सप्ताह के फंगल कोनिडिया की कटाई करें।
    2. बाँझ आसुत पानी के 20 मिलीलीटर में एकत्रित कवक कोनिडिया को निलंबित करें, 0.05% ट्वीन 20 के साथ पूरक, और भंवर-2 मिनट के लिए कोनिडियल निलंबन को मिलाएं।
    3. 1 × 107 कोनिडिया / एमएल की एकाग्रता के साथ 20 एमएल कोनिडियल सस्पेंशन तैयार करें, और क्रमशः गुच्छेदार जई और गुच्छेदार जौ ठोस सब्सट्रेट को टीका लगाएं।
      नोट: conidial सांद्रता निर्धारित करने के लिए एक hemocytometer का उपयोग करें।
  3. ठोस सब्सट्रेट्स का इनोक्यूलेशन
    1. कपास ऊन गर्दन प्लग को हटाने के द्वारा प्रत्येक बैग खोलें, और ठंडा autoclaved सब्सट्रेट के लिए तैयार 20 mL conidial निलंबन जोड़ें।
    2. गर्दन के प्लग का उपयोग करके बैग को फिर से बंद करें, और फंगल इनोकुलम को अनाज सब्सट्रेट के साथ समान रूप से मिश्रित होने की अनुमति देने के लिए बैग की सामग्री की मालिश करें।
    3. ± 25 डिग्री सेल्सियस के नियंत्रित तापमान पर किण्वन बैग को इनक्यूबेट करें, और संस्कृति और पर्यावरण के बीच पर्याप्त गैसीय विनिमय सुनिश्चित करें।
      नोट:: इस प्रक्रिया को एक लैमिनर प्रवाह कैबिनेट के अंतर्गत आयोजित किया जाना चाहिए।
  4. किण्वन चरण
    1. मैन्युअल रूप से किण्वन बैग में अनाज substrates मालिश 2 दिन के बाद टीका लगाने और इनक्यूबेशन, जब दिखाई mycelial विकास होता है और सब्सट्रेट बढ़ते कवक से clumped किया जा करने के लिए शुरू कर दिया है।
      नोट: यह कवक के वनस्पति विकास के पहले शुरुआती चरणों के दौरान होने वाली माइसेलियल ब्रांचिंग के लिए अनुमति देने के लिए संक्रमित दानों को मिलाने के लिए किया जाता है।
    2. अनाज सब्सट्रेट बेड की भौतिक विषमता और सब्सट्रेट द्रव्यमान की बिस्तर की मोटाई से बचने के लिए सब्सट्रेट बिस्तर में हेरफेर करने के लिए एक रसोई रोलिंग पिन का उपयोग करें।
      नोट: यह प्रक्रिया फंगल चयापचय को बढ़ावा देती है, जो कवक बीजाणु उत्पादन को अनुकूलित करती है, और सतह क्षेत्र को अधिकतम करती है, कोनिडियल उपज को बढ़ावा देतीहै 18।
    3. किण्वन प्रक्रिया को 4-5 सप्ताह तक जारी रखने के लिए छोड़ दें, और किसी भी सफेद वनस्पति अतिवृद्धि की उपस्थिति के लिए हर 2 दिनों में किण्वन बैग की जांच करें जो किण्वन प्रक्रिया के दौरान विकसित हो सकता है, जो कवक कोनिडिया उपज को बहुत प्रभावित कर सकता है।
      नोट: तुरंत किण्वन बैग में किण्वन को समाप्त करें जिसमें कोई भी सफेद वनस्पति अतिवृद्धि होती है, और फंगल संस्कृतियोंको सूखा देता है।

3. ब्लास्टोस्पोर इनोक्यूलेशन

  1. ब्लास्टोस्पोर उत्पादन और टीकाकरण
    1. एक तरल संस्कृति माध्यम तैयार करें, जिसमें आसुत पानी के 1 एल, ग्लूकोज के 30 ग्राम, खमीर निकालने के 20 ग्राम, पोटेशियम फॉस्फेट डायबेसिक (के2एचपीओ 4) के4 ग्राम, मकई खड़ी शराब के 15 मिलीलीटर, और एंटीबायोटिक स्ट्रेप्टोमाइसिन के 10 μg / mL, दोनों के लिए M. pinghaense और M. robertsii शामिल हैं।
    2. सबसे पहले, आसुत पानी को गर्म करें, क्वथनांक तक पहुंचने से पहले स्विच ऑफ करें, और स्ट्रेप्टोमाइसिन को छोड़कर प्रत्येक सामग्री को पॉट में गर्म पानी में जोड़ें। माध्यम को 3-4 मिनट के लिए एक कोमल उबाल पर लाएं, और सामग्री के उचित मिश्रण के लिए अनुमति देने के लिए माध्यम को लगातार हिलाएं और बर्तन के नीचे कुछ सामग्रियों के निपटान को रोकें।
    3. नौ अलग-अलग 250-एमएल फ्लास्क में माध्यम के कुल 100 मिलीलीटर डालें और प्रत्येक फ्लास्क पर एक कपास ऊन प्लग रखें, और कपास ऊन को एल्यूमीनियम पन्नी के साथ स्टॉपर के रूप में कवर करें (चित्रा 1 ए)।
    4. फ्लास्क में माध्यम को 121 डिग्री सेल्सियस पर 55 मिनट के लिए आटोक्लेव करें। ऑटोक्लेविंग के बाद, फ्लास्क में माध्यम को ठंडा करने की अनुमति दें और प्रत्येक फ्लास्क (चित्रा 1 बी) में माध्यम में स्ट्रेप्टोमाइसिन के 10 मिलीग्राम / एमएल जोड़ें।
    5. दोनों ईपीएफ आइसोलेट्स, एम. पिनघेन्स और एम. रॉबर्टसीई के लिए 2-3-सप्ताह पुरानी फंगल कल्चर प्लेटों से फंगल कोनिडिया के दो से तीन बैक्टीरियल लूप एकत्र करें, और बाँझ परिस्थितियों में 250-एमएल फ्लास्क में प्रत्येक 100 एमएल तरल मीडिया में स्थानांतरित करें, और फ्लास्क को सील करें।
    6. 3 दिनों के लिए 140 आरपीएम पर एक कक्षीय शेकर पर ± 25 डिग्री सेल्सियस पर तरल संस्कृति फ्लास्क को इनक्यूबेट करें, और एक बार जब संस्कृतियां फंगल ब्लास्टोस्पोर विकास (चित्रा 1 सी) के साथ उच्च टर्बिडिटी के संकेत दिखाती हैं तो इनक्यूबेशन को बंद कर दें।
    7. संस्कृतियों से किसी भी संभावित जीवाणु संदूषण का पता लगाने के लिए, इनक्यूबेशन के दौरान 24 घंटे के बाद प्रत्येक तरल संस्कृति फ्लास्क से 100 μL नमूना खींचें और प्रति आइसोलेट तीन एसडीए प्लेटों पर प्लेट। प्लेटों को 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें, ± 25 डिग्री सेल्सियस के नियंत्रित तापमान पर।
  2. ठोस सब्सट्रेट की तैयारी
    1. दोनों एम pinghense और एम robertsii (Jaronski और जैक्सन18 से अनुकूलित) के blastospores के लिए एक ठोस सब्सट्रेट माध्यम के रूप में उबले हुए लंबे अनाज सफेद चावल का उपयोग करें।
    2. ऊपर दिए गए विवरण के अनुसार किण्वन बैग तैयार करें, चरण 2.1.1-2.1.3 में, और प्रत्येक बैग के लिए, 1 किलो चावल और 300 मिलीलीटर बाँझ आसुत पानी जोड़ें।
    3. धीरे से किण्वन बैग की सामग्री को मिलाएं और बाहरी आटोक्लेव बैग में एक ईमानदार स्थिति में रखें, और 55 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव करें। ऑटोक्लेविंग के बाद, सब्सट्रेट्स को बाँझ परिस्थितियों में 45 मिनट ± के लिए ठंडा करने की अनुमति दें।
  3. इनोक्यूलेशन और किण्वन
    1. एक लैमिनर प्रवाह के तहत एम pinghense और M. robertsii दोनों के तरल संस्कृति फ्लास्क में से प्रत्येक के बंद होने को हटा दें और 10 s के लिए प्रत्येक फ्लास्क के रिम को लौ दें।
    2. उनकी गर्दन से कपास ऊन प्लग को हटाकर किण्वन बैग में 100-एमएल तरल संस्कृतियों को डालें (चित्रा 2)। कपास प्लग पर वापस जगह और एक रबर बैंड के साथ सुरक्षित सर्जिकल कागज के साथ बैग की गर्दन के शीर्ष को कवर.
      नोट: एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके प्रत्येक फ्लास्क के लिए ब्लास्टोस्पोर एकाग्रता निर्धारित करें, और 1 × 107 - 5 × 108 ब्लास्टोस्पोर / एमएल के ब्लास्टोस्पोर सांद्रता का उपयोग करें ताकि सब्सट्रेट्स 28 को इनोकुलेट किया जा सके।
    3. बैग के शीर्ष भाग को मोड़ें और मालिश द्वारा सब्सट्रेट के हल्के हेरफेर को हिलाकर और हल्का हेरफेर करके बैग की सामग्री को मिलाएं, औरमोटे बिस्तरों के गठन को रोकने के लिए बैग में सब्सट्रेट को समतल करके 25 डिग्री सेल्सियस ± पर बैग को इनक्यूबेट करें।
    4. बैग की सामग्री की मालिश करके किण्वन बैग में सब्सट्रेट को तोड़दें, टीकाकरण और इनक्यूबेशन के 2-3 दिन बाद, जब दिखाई देने वाले माइसेलियल विकास और कवक द्वारा सब्सट्रेट का बंधन हुआ था (जारोन्स्की और जैक्सन18 की तकनीक से अनुकूलित)।
      नोट: किण्वन को 4 सप्ताह तक जारी रखने की अनुमति दें।

Figure 1
चित्रा 1: 250-एमएल फ्लास्क में तरल संस्कृति माध्यम। (ए) ऑटोक्लेविंग से पहले। (बी) ईपीएफ बीजाणुओं के साथ ऑटोक्लेविंग और टीकाकरण के बाद। (c) कवक ब्लास्टोस्पोर्स के साथ टर्बिड माध्यम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: तैयार ब्लास्टोस्पोर तरल संस्कृति माध्यम। (ए) मेटारिज़ियम रॉबर्टसी और (बी) एक ठोस सब्सट्रेट के रूप में चावल के टीकाकरण से पहले मेटारिज़ियम पिन्गेनसे । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

4. कवक संस्कृतियों के सुखाने

  1. किण्वन के बाद 10-12 दिनों के लिए कवक संस्कृतियों को सूखाएं, परीक्षणों में उनके उपयोग से पहले, स्पोरुलेटेड संस्कृतियों को 26-30 किलोग्राम (30 x 43 x 15250 सेमी3) भूरे रंग के पेपर बैग में स्थानांतरित करके।
  2. पेपर बैग की तन्यता शक्ति में सुधार करने के लिए, क्षैतिज रूप से प्रत्येक बैग के शीर्ष भाग के एक तिहाई हिस्से को काट दें, और बैग के नीचे की रेखा (चित्रा 3 ए, बी)।

Figure 3
चित्र 3: पेपर बैग की तैयारी, संस्कृतियों की सुखाने की प्रक्रिया, और पैकेजिंग। (ए, बी) भूरे रंग के पेपर बैग की तैयारी। मेटारिज़ियम प्रजातियों की संस्कृतियों की सुखाने की प्रक्रिया (सी, ई) उबले हुए चावल और (डी, एफ) गुच्छेदार जौ पर उगाई जाती है। (जी) एक त्रिकोणीय तम्बू संरचना बनाने के लिए स्टेपल के साथ बंद कागज बैग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. धीरे से प्रत्येक किण्वन बैग में सब्सट्रेट को उखड़जाएं, प्रत्येक बैग के कोने को काट दें और कट-ऑफ कोने (चित्रा 3 सी-एफ) द्वारा छोड़े गए स्थान के माध्यम से पेपर बैग में पूरी संस्कृति को स्थानांतरित करें। कवक बीजाणुओं के हवा में अत्यधिक पलायन से बचने के लिए, इस प्रक्रिया को धीरे-धीरे करें।
    नोट: संदूषण से बचने के लिए, लैमिनर प्रवाह का उपयोग करके बाँझ परिस्थितियों में इस प्रक्रिया का संचालन करें।
  2. प्रत्येक पेपर बैग को लेबल करें और प्रत्येक बैग के शीर्ष छोर पर दो बार गुना करें और त्रिकोणीय तम्बू संरचना बनाने के लिए स्टेपल के साथ बंद करें, और 25 डिग्री सेल्सियस ± के नियंत्रित तापमान और 30-40% की कम आर्द्रता पर उचित, यहां तक कि सुखाने की अनुमति देने के लिए तार सुखाने वाले रैक पर बैग रखें।
  3. संस्कृतियों के सूखने की भी अनुमति देने के लिए और किसी भी वनस्पति regrowth से बचने के लिए बैग को दैनिक रूप से चालू करें जो जगह ले सकता है, जो कटाई योग्य कवक बीजाणुओं की उपज को कम करेगा।
  4. सुखाने की प्रक्रिया के दौरान हर 2 दिनों के बाद प्रत्येक सुखाने वाले बैग का वजन करें, और प्रत्येक बैग के लिए सुखाने की प्रक्रिया को जारी रखें जब तक कि लगातार दिनों के बीच बैग के द्रव्यमान में थोड़ा से कोई बदलाव नहीं देखा जाता है।

5. कवक conidia की फसल

  1. तीन नेस्टेड छलनी का उपयोग करके संस्कृतियों से यांत्रिक रूप से फंगल कोनिडिया की कटाई करें, एक परीक्षण छलनी (ईटीएस) जाल संख्या 35 (500-μm एपर्चर के साथ), एक परीक्षण छलनी (212-μm एपर्चर के साथ) पर नेस्टेड, ईटीएस जाल नंबर 100 (150-μm एपर्चर के साथ) पर नेस्टेड, एक संग्रह पैन पर घुड़सवार।
  2. ईटीएस जाल नंबर 35 छलनी पर सूखी संस्कृति के नमूने को धीरे-धीरे लोड करें और हवा में फंगल कोनिडिया की रिहाई को रोकने के लिए छलनी पर एक ढक्कन रखें।
  3. जाल स्क्रीन के माध्यम से कवक conidia के पारित होने में सहायता करने के लिए छलनी के लिए 10-12 ग्लास मार्बल्स जोड़ें और छलनी में conidia के प्रतिधारण से बचने के लिए, जिसके परिणामस्वरूप बीजाणु वसूली कम हो सकती है।
  4. टेप और कोनिडियल धूल के भागने को रोकने के लिए विद्युत टेप का उपयोग कर छलनी जोड़ों को सील.
  5. एक थरथानेवाला शेकर पर छलनी रखें, एक चिपचिपा पैड के साथ फिट, संग्रह पैन और छलनी को सुरक्षित करने के लिए, 20-25 मिनट के लिए, प्रति मिनट 560-640 कंपन की गति पर (चित्रा 4)।
    नोट: तकनीक Jaronski और जैक्सन18 से अनुकूलित.

Figure 4
चित्रा 4: चावल और गुच्छेदार जौ पर सूखे मेटाराइज़ियम रॉबर्टसी संस्कृतियों से कवक बीजाणुओं की कटाई। (ए) 10-12 कांच के संगमरमर को छलनी में जोड़ा जाता है ताकि जाल स्क्रीन के माध्यम से कवक कोनिडिया के पारित होने में सहायता मिल सके। M. robertsii conidia (बी) चावल पर संस्कृतियों से काटा, और (सी) मुश्किल से flaked. (डी) एक थरथानेवाला शेकर पर छलनी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. संग्रह पैन से परीक्षण छलनी को हटा दें, कोनिडिया एकत्र करें और लंबी अवधि के भंडारण (3-6 महीने) के लिए एयरटाइट और पानी-अपारगम्य जिपर-लॉक बैग में एकत्र कोनिडिया को स्टोर करें।

6. कवक conidia का परिमाणीकरण उत्पादित

  1. मापने और प्रत्येक सब्सट्रेट से कवक conidia की कटाई से पहले प्रत्येक अनाज सब्सट्रेट के द्रव्यमान रिकॉर्ड.
  2. ठोस सब्सट्रेट के द्रव्यमान से एकत्रित बीजाणुओं के द्रव्यमान को घटाकर एकत्र किए गए कोनिडिया के समग्र वजन को मापें।
    नोट: कुल conidia उपज न केवल काटा conidia बल्कि यह भी कवक conidia ठोस सब्सट्रेट पर छोड़ दिया शामिल है.
  3. सब्सट्रेट का वजन करें और वजन वाले सब्सट्रेट से 10 ग्राम निकालें। 0.05% Tween 20 में सब्सट्रेट के 10 ग्राम को निलंबित करें और बाँझ आसुत पानी के 10 मिलीलीटर में पतला करें।
  4. भंवर-2 मिनट के लिए निलंबन मिश्रण, और एक hemocytometer का उपयोग करने के लिए बीजाणु गिनती करने के लिए सब्सट्रेट से धोया conidia की संख्या निर्धारित करने के लिए.
  5. 10 mL धोया conidial निलंबन के 1000 μL को बाँझ आसुत पानी के 9 mL करने के लिए 10 mL कमजोर पड़ने निलंबन बनाने के लिए स्थानांतरित करके आगे dilutions आचरण.
  6. भंवर-2 मिनट के लिए conidial निलंबन मिश्रण, और conidial सांद्रता निर्धारित करते हैं।
    नोट:: प्रक्रिया और Inglis, Enkerli, और Goettel30 द्वारा वर्णित सूत्र का पालन करें निलंबन की conidial एकाग्रता निर्धारित करने के लिए।
  7. 0.05% Tween 20 के साथ पूरक बाँझ आसुत पानी के 10 मिलीलीटर में प्रत्येक संस्कृति से एकत्र कोनिडियल पाउडर के कुल 0.1 ग्राम को इकट्ठा और निलंबित करें, और भंवर-2 मिनट के लिए कोनिडियल निलंबन को मिलाएं, और हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोनिडियल एकाग्रता निर्धारित करें।
  8. 10 mL निलंबन dilutions बनाने के लिए बाँझ आसुत पानी के 9 mL करने के लिए 10 mL conidial निलंबन के 1000 μL स्थानांतरित करके आगे dilutions आचरण।
  9. भंवर-2 मिनट के लिए कोनिडियाल निलंबन मिश्रण, conidial सांद्रता की गणना और प्रति ग्राम conidia की संख्या निर्धारित.
  10. काटे गए पाउडर के प्रति ग्राम कोनिडिया की संख्या को काटे गए कोनिडियल पाउडर के प्रारंभिक द्रव्यमान से गुणा करें। खर्च किए गए सब्सट्रेट के कुल वजन से सब्सट्रेट से धोए गए कोनिडिया की संख्या को गुणा करें, सब्सट्रेट होने के नाते जिसमें से कोनिडिया काटा गया था।
  11. दिए गए दो मानों को एक साथ जोड़ें और सब्सट्रेट के प्रारंभिक सूखे वजन से विभाजित करें ताकि सब्सट्रेट18 के प्रति किलोग्राम या जी कोनिडिया की संख्या की गणना की जा सके।
    नोट: गणना मुख्य रूप से चावल सब्सट्रेट के लिए किया गया था। अंकुरण या कोनिडियल व्यवहार्यता परीक्षण दोनों के लिए आयोजित किया गया था एम. पिन्गेन्स और एम. रॉबर्टसी आइसोलेट्स उत्पादित कोनिडिया की व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए।

7. डेटा विश्लेषण

  1. प्राप्त परिणामों के सांख्यिकीय विश्लेषण का संचालन करने के लिए एक उपयुक्त कंप्यूटर सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग करें।
    नोट:: डेटा का सांख्यिकीय विश्लेषण STATISTICA संस्करण 13.5.0.17 का उपयोग कर किया गया था।

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Representative Results

एम pinghense और M. robertsii दोनों के लिए चावल पर संस्कृतियों की सामग्री द्रव्यमान में गिरावट कवक संस्कृतियों के सुखाने के चरण के दौरान समय के साथ मनाया गया था, कोई, या थोड़ा, परिवर्तन के साथ एक बार संस्कृतियों के सूखने के बाद द्रव्यमान में देखा जा रहा है (चित्रा 5). M. pinghense और M. robertsii दोनों के काटे गए सूखे कवक कोनिडिया पाउडर को चित्र 6 में दिखाया गया है।

Figure 5
चित्रा 5: मेटारिज़ियम रॉबर्ट्सी और चावल पर एम. पिनघेन्से संस्कृतियों के बैग सामग्री द्रव्यमान में परिवर्तन (95% आत्मविश्वास अंतराल) 10 दिनों (एनोवा) में; F5,35 = 2.21; पी = 0.08)। सलाखों के ऊपर विभिन्न अक्षर दिनों में बैग सामग्री द्रव्यमान में प्राप्त महत्वपूर्ण अंतर (पी < 0.05) को इंगित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: काटा गया कोनिडिया. (ए) संग्रह पैन में काटा गया कोनिडिया। (B) Metarhizium robertsii. (C) M. pinghense कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

औसत कोनिडियल पाउडर में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया था जो प्रत्येक अनाज के प्रकार से एम. पिनघेन्से और एम. रॉबर्टसीई दोनों के लिए काटा गया था। दोनों के लिए काटे गए सूखे कोनिडिया में एम. पिन्गेन्स और एम. रॉबर्टसी दोनों के लिए >90% कोनिडियाल व्यवहार्यता का औसत था। चावल सब्सट्रेट पर, एम. पिन्गेन्से ने 8.2 ग्राम ± 4.38 ग्राम कोनिडियाल पाउडर का औसत उत्पादन किया, जो एम रॉबर्टसी (6 ग्राम ± 2 ग्राम) के लिए प्राप्त की गई राशि से थोड़ा अधिक था। 1.83 ग्राम ± 1.47 ग्राम सूखे एम रॉबर्टसी कोनिडिया का औसत गुच्छेदार जौ सब्सट्रेट से काटा गया था, जबकि शून्य एम। कोई सूखी कवक conidia या तो M. pinghaense या M. robertsii (चित्रा 7) के लिए गुच्छेदार जई सब्सट्रेट से काटा गया था।

Figure 7
चित्रा 7: कोनिडिया पाउडर की औसत मात्रा। Metarhizium pinghense और M. robertsii के कोनिडिया पाउडर की औसत मात्रा, तीन ठोस सब्सट्रेट्स से काटे गए ग्राम (95% आत्मविश्वास अंतराल) में मापा जाता है: उबले हुए चावल, गुच्छेदार जौ, और गुच्छेदार जई (एनोवा: एफ2,27 = 2.82; पी = 0.08)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चावल के अनाज से काटे गए प्रति ग्राम अनुमानित औसत कोनिडिया में एक महत्वपूर्ण अंतर, एम. पिनघेन्से (3.51 x 107/g ± 0.43 x 107/g) और एम. रॉबर्टसी (4.31 x 107/g ± 0.38 x 107/g) के बीच देखा गया था। M. robertsii में M. pinghaense (चित्रा 8) की तुलना में प्रति ग्राम थोड़ा अधिक औसत कोनिडिया गिनती थी।

Figure 8
चित्रा 8: प्रति ग्राम औसत कोनिडिया। चावल संस्कृतियों से मेटारिज़ियम पिनघेन्से और एम रॉबर्टसी (95% आत्मविश्वास अंतराल) के लिए प्रति ग्राम अनुमानित औसत कोनिडिया (एनोवा: एफ 1,7 = 8.47; पी = 0.02)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

खर्च किए गए चावल सब्सट्रेट पर मौजूद कोनिडिया की अनुमानित संख्या में कोई महत्वपूर्ण अंतर एम. पिन्गेन्से (5.02 x 107/mL ± 1.47 x 107/mL) और M. robertsii (3.70 x 107/mL ± 0.91 x 107/mL) (चित्रा 9) के बीच नहीं देखा गया था। हालांकि, एम pinghense एम robertsii की तुलना में चावल सब्सट्रेट पर मौजूद conidia की एक छोटी सी संख्या थी।

Figure 9
चित्रा 9: औसत कवक conidia. मेटारिज़ियम पिनघेन्से और एम रॉबर्टसी (95% आत्मविश्वास अंतराल) के अनुमानित औसत कवक कोनिडिया संस्कृतियों से (एफ1,7 = 2.45; पी = 0.16) खर्च किए गए चावल संस्कृति सब्सट्रेट पर मौजूद हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुमानित समग्र कोनिडिया उपज में कोई महत्वपूर्ण अंतर एम . पिन्गेन्स (5.09 x 107/g ± 1.35 x 107/g) और एम. रॉबर्टसी (3.55 x 107/g ± 0.85 x 107/g) के बीच चावल सब्सट्रेट संस्कृतियों से प्राप्त किया गया था। हालांकि, एम pinghense ने M. robertsii की तुलना में थोड़ा अधिक कोनिडियल उपज का उत्पादन किया, जिसने कम कोनिडियाल उपज का उत्पादन किया (चित्रा 10)।

Figure 10
चित्रा 10: कुल कोनिडिया उपज. चावल पर संस्कृतियों से मेटारिज़ियम पिन्गेन्से और एम रॉबर्टसी (95% आत्मविश्वास अंतराल) की अनुमानित कुल कोनिडिया उपज (एफ1,7 = 3.91; पी = 0.09)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

एक agroecosystem में महत्वपूर्ण कृषि कीट कीटों के जैविक नियंत्रण के लिए माइक्रोबियल एजेंटों का सफल एकीकरण प्रयोगशाला परिस्थितियों के तहत पहले कदम के रूप में entomopathogens के बड़े पैमाने पर उत्पादन की सफलता और आसानी दोनों पर निर्भर करता है। ईपीएफ का बड़े पैमाने पर उत्पादन जैविक नियंत्रण 9,10,11,12,13 का उपयोग करके आईपीएम कार्यक्रमों के लिए ईपीएफ उत्पादों के बड़े पैमाने पर आवेदन और उपलब्धता के लिए महत्वपूर्ण है। विभिन्न ईपीएफ आइसोलेट्स के बड़े पैमाने पर उत्पादन की सफलता उत्पादन सब्सट्रेट या माध्यम के पोषण घटकों से प्रभावित होती है, जो परिणामी कोनिडिया की विशेषताओं को काफी प्रभावित करती है, जिसमें उनकी प्रभावकारिता, निर्जलीकरण सहिष्णुता, क्षेत्र दृढ़ता और कोनिडियल उपज 8,19,20,21 शामिल है। . इसलिए, खेती और किण्वन प्रक्रिया के दौरान बड़े पैमाने पर उत्पादित एंटोमोपैथोजेन की पोषण संबंधी आवश्यकताओं का ज्ञान विकसितकरना महत्वपूर्ण है।

वर्तमान अध्ययन में, M. robertsii और M. pinghense दोनों का बड़े पैमाने पर उत्पादन किण्वन सब्सट्रेट के रूप में तीन अलग-अलग कृषि उत्पादों का उपयोग करके आयोजित किया गया था: उबले हुए चावल, गुच्छेदार जौ, और गुच्छेदार जई। तीन अलग-अलग अनाज substrates कवक आइसोलेट्स की conidial उपज को प्रभावित करने के लिए देखा गया था काफी. उबले हुए चावल दोनों आइसोलेट्स के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए अत्यधिक अनुकूल थे, जबकि गुच्छेदार जौ के अनाज ने केवल एम रॉबर्टसी के उत्पादन का पक्ष लिया। ये टिप्पणियां किण्वन के बाद सूखे कवक कोनिडिया पाउडर की उपज के आधार पर की गई थीं। बहुत कम या नहीं, कोनिडिया किण्वन के बाद गुच्छेदार जई से काटा गया था। गुच्छेदार जई को किण्वन प्रक्रिया के दौरान किण्वन बैग में नमी के उच्च स्तर को बनाए रखने के लिए पाया गया था, जिसके परिणामस्वरूप एम. पिनघेन्से और एम. रॉबर्टसी के उत्पादन के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में अनाज के खराब प्रदर्शन को देखा जा सकता था। गुच्छेदार जई सब्सट्रेट कुछ उदाहरणों में कवक आइसोलेट्स के एक सफेद वनस्पति मायसेलियल अतिवृद्धि के लिए प्रवण था, जिसने कोनिडियल उपज को बहुत प्रभावित किया, क्योंकि अतिवृद्धि वाले किण्वन बैग में स्पोरुलेशन नहीं हुआ था। गुच्छेदार जई सब्सट्रेट के साथ किण्वन बैग को भी किण्वन बैग के सापेक्ष जीवाणु संदूषण के उच्च स्तर के लिए देखा गया था जिसमें गुच्छेदार जौ सब्सट्रेट होते हैं।

सैप्रोफाइटिक कवक या खमीर संदूषण के उच्च स्तर को सब्सट्रेट के रूप में गुच्छेदार जौ का उपयोग करके एम. पिनगेंस के बड़े पैमाने पर उत्पादन के बारे में देखा गया था। सैप्रोफाइटिक कवक संदूषण किण्वन प्रक्रिया के बाद के चरण में सब्सट्रेट को टीका लगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले एक के अलावा एक कवक के विकास और कोनिडियोजेनेसिस के माध्यम से देखा गया था। किण्वन के प्रारंभिक चरण में सब्सट्रेट संदूषण का निदान, कोनिडियल स्पोरुलेशन से पहले, मुश्किल था। किण्वन प्रक्रिया के दौरान जीवाणु और खमीर संदूषण को सब्सट्रेट में गीले पैच द्वारा प्रकट माना जाता है, और दोनों गुच्छेदार जई और जौ के अनाज चावल के अनाज की तुलना में लंबे समय तक नमी को अवशोषित और बनाए रखते हैं। यह दो मेटारिज़ियम आइसोलेट्स के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए किण्वन सब्सट्रेट के रूप में इन दो सब्सट्रेट्स का उपयोग करने की एक सीमा थी।

वर्तमान अध्ययन के दौरान की गई टिप्पणियों से पता चला है कि प्रत्येक अनाज सब्सट्रेट को टीका लगाने के लिए उपयोग की जाने वाली इनोक्यूलेशन विधि के प्रकार ने कोनिडियल उत्पादन को प्रभावित किया। कोनिडियल निलंबन टीकाकरण विधि को अपेक्षाकृत कम प्रभावी पाया गया था, क्योंकि संक्रमित गुच्छेदार जई और गुच्छेदार जौ ने संदूषण के स्तर में वृद्धि देखी थी, जब तरल-सुसंस्कृत ब्लास्टोस्पोर इनोक्यूलेशन विधि का उपयोग चावल के अनाज पर किया गया था। तरल-सुसंस्कृत ब्लास्टोस्पोर इनोक्यूलेशन विधि के विपरीत, कोनिडियल निलंबन विधि सब्सट्रेट्स के टीकाकरण से पहले निलंबन में संभावित संदूषकों का पता लगाने की अनुमति नहीं देती है, जिसके परिणामस्वरूप संदूषण के उच्च स्तर होते हैं जो किण्वन बैग में देखे गए थे। जारोन्स्की और जैक्सन18 ने कई कारकों का वर्णन किया जो उपयोग किए जाने वाले सब्सट्रेट के संभावित संदूषण का कारण बन सकते हैं, जैसे कि सब्सट्रेट की पूर्ण नसबंदी की कमी, नॉनस्टेराइल इनोक्यूलेशन, और बैग में किण्वन सब्सट्रेट की अनुचित हैंडलिंग। गुच्छेदार जौ और गुच्छेदार जई युक्त किण्वन बैग में मनाया संदूषण भी सब्सट्रेट की पूर्ण नसबंदी की कमी के परिणामस्वरूप हो सकता है, जो ऑटोक्लेविंग प्रक्रिया के दौरान हो सकता था। Jaronski और जैक्सन18 भी inoculants के रूप में conidial निलंबन के उपयोग का वर्णन किया नुकसानदायक होने के रूप में, के रूप में यह एक आगर माध्यम से conidial फसल के दौरान संदूषण की संभावना में वृद्धि हुई है.

क्षेत्र में, उपयुक्त मेजबानों के संक्रमण के दौरान, कवक पहले प्रसार के माध्यम से कीड़ों के हेमोकोएल में बायोमास का निर्माण करता है, इसके उद्भव से पहले और कीड़े की बाहरी ठोस सतह परस्पोरुलेशन 30। तरल-ब्लास्टोस्पोर किण्वन विधि का उपयोग करते समय इस तरह की प्रक्रिया की नकल की गई थी। तदनुसार, शोरबा ने कीट के हेमोकोइल का प्रतिनिधित्व किया, फंगल कोनिडिया के साथ शोरबा के टीकाकरण ने कीट के प्रारंभिक संपर्क और संक्रमण का प्रतिनिधित्व किया, और शोरबा में ब्लास्टोस्पोर के गठन ने ब्लास्टोस्पोर प्रक्रिया के प्रसार का प्रतिनिधित्व किया जो संक्रमित कीट के हेमोकोल के अंदर होता है। चावल के अनाज का अंतिम टीका और समय के साथ अनाज पर कवक के स्पोरुलेशन ने प्रतिनिधित्व किया कि कीट के छल्ली पर क्या होता है जब कवक कीट के शव के अंदर से उभरना शुरू हो जाता है। यह संभवतः समझा सकता है कि तरल ब्लास्टोस्पोर किण्वन विधि ने कोनिडियाल निलंबन टीकाकरण विधि की तुलना में बेहतर काम क्यों किया।

जारोन्स्की और जैक्सन18 ने चावल के अनाज की तुलना में मेटारिज़ियम प्रजातियों की बड़े पैमाने पर संस्कृति के लिए पसंदीदा कृषि अनाज के रूप में गुच्छेदार जई और गुच्छेदार जौ के अनाज का वर्णन किया, क्योंकि दो अनाज प्रकार किण्वन प्रक्रिया के दौरान अपनी नमी सामग्री को बनाए रखने के लिए पाए गए थे। हालांकि, वर्तमान अध्ययन उपर्युक्त शोधकर्ताओं की टिप्पणियों और निष्कर्षों के विपरीत है, क्योंकि गुच्छेदार जई और गुच्छेदार जौ दोनों को या तो एम. पिनघेन्स या एम रॉबर्टसी के लिए अच्छा ठोस किण्वन सब्सट्रेट नहीं पाया गया था। चावल को दोनों आइसोलेट्स के लिए एक अच्छा अनाज सब्सट्रेट पाया गया था, क्योंकि यह छोटे कणों में विघटित नहीं हुआ था जो अंतिम उत्पाद के साथ मिश्रण कर सकते थे, जैसा कि पिछले अध्ययनों में सुझाव दिया गया था।

वर्तमान अध्ययन से पता चला है कि मेटारिज़ियम प्रजातियों के आइसोलेट्स को चावल के अनाज का उपयोग करके सफलतापूर्वक सुसंस्कृत और बड़े पैमाने पर उत्पादित किया जा सकता है और यह कि विभिन्न अनाज कोनिडियाल स्पोरुलेशन को प्रभावित करते हैं और अलग-अलग उपज करते हैं। यह संभवतः इस तथ्य के कारण हो सकता है कि विभिन्न अनाज इस तरह के पोषण संरचना के संदर्भ में भिन्न होते हैं, उदाहरण के लिए, कार्बन: नाइट्रोजन अनुपात और कार्बन एकाग्रता। कार्बन एकाग्रता और कार्बन: एक विकास माध्यम के नाइट्रोजन अनुपात को कोनिडिया की उपज को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है, साथ ही साथ व्यवहार्यता और विषाणु22 के संदर्भ में इसकी गुणवत्ता भी है। सब्सट्रेट्स को टीका लगाने के लिए उपयोग की जाने वाली इनोक्यूलेशन तकनीकों को विशिष्ट कृषि अनाज सब्सट्रेट्स पर ईपीएफ आइसोलेट्स के बड़े पैमाने पर उत्पादन में प्राप्त सफलता की डिग्री को प्रभावित करने के लिए भी दिखाया गया है। इसलिए, वर्तमान अध्ययन में वर्णित तरल ब्लास्टोस्पोर किण्वन तकनीक को एम. पिनगेंस और एम. रॉबर्टसी आइसोलेट्स दोनों के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए कृषि अनाज सब्सट्रेट के लिए सबसे अच्छी इनोक्यूलेशन विधि के रूप में अनुशंसित किया गया है। इस तरह की विधि का उपयोग करने से इनोकुलेंट के उपयोग से पहले संदूषण का संभावित पता लगाने की अनुमति मिलती है, जो कोनिडियाल निलंबन टीकाकरण तकनीक के उपयोग के सापेक्ष वांछित ईपीएफ आइसोलेट के बड़े पैमाने पर उत्पादन में बाधा डाल सकती है। यह भी सिफारिश की जाती है कि चावल के अनाज का उपयोग एम. पिन्गेन्से और एम. रॉबर्टसी दोनों के कोनिडिया के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए ठोस सब्सट्रेट के रूप में किया जाए, बजाय गुच्छेदार जौ और गुच्छेदार जई के। वर्णित तकनीक भविष्य के बड़े पैमाने पर उत्पादन और कृषि पारिस्थितिकी प्रणालियों में महत्वपूर्ण कीट कीटों के खिलाफ क्षेत्र की स्थितियों के तहत कोनिडिया के वाणिज्यिक अनुप्रयोग के लिए महत्वपूर्ण है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकहोर्ट पोम, होर्ट स्टोन, और उद्योग कार्यक्रम के लिए प्रौद्योगिकी और मानव संसाधन (THRIP: TP14062571871) को परियोजना के वित्तपोषण के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं।

ORCID:
Letodi L. Mathulwe http://orcid.org/0000-0002-5118-3578

एंटोनेट पी. मलान http://orcid.org/0000-0002-9257-0312

Nomakholwa एफ Stokwe http://orcid.org/0000-0003-2869-5652

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Tween 20 Lasec Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water
20 mL McCartney bottles Lasec Used to make conidial suspensions
Aluminium foil Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask
Autoclave Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process
Autoclave bags Lasec Fermentation bags or solid substrate containers
Autoclave tape Lasec To secure PVC pipes on the fermentation bags
Brown Kraft paper bags Used to dry conidia cultures on agricultural grains
Bunsen burnner Labnet (Labnet International, Inc.) Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks)
Clear edge test sieve Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates
Corn steep liquor SIGMA 66071-94-1 Ingredient of the blastospore liquid medium
Cotton Wool Lasec Used as plug of the neck for fermentation bags
Duran laboratory bottles Neolab Used to autoclave SDA medium and distilled water
Electrical tape Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust
ENDECOTTS test sieve Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates
Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask Lasec Carrier of the blastospore liquid medium
Ethanol (99%) Lasec Used to sterilize surgical blades and inoculating loops
Flaked barley Health Connection Wholefoods Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Flaked oats Tiger brands Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Glucose Merck Ingredient of the blastospore liquid medium
Growth Chamber/ incubators For growing fungal conidia culture
Haemocytometer Used to determine conidial concentrations
Inoculating loops Lasec For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth
Kitchen rolling pin Used to manipulate the solid grain substrate bed
Laminar flow Cabinet ESCO Laminar Flow Cabinet Provide as sterile environment during substrate inoculation
Metarhizium pinghaense conidia Stellenbosch University 5HEID Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense
Metarhizium robertsii conidia Stellenbosch University 6EIKEN Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii
Microscope ZEIZZ (Scope. A1) Used to determine conidial concentrations and conidial viability
Orbital shaker IncoShake- LABOTEC Used for the blastospore production process
Parboiled rice Spekko Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Penicillin-Streptomycin SIGMA Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination
Petri-dishes Lasec Containers for the SDA medium
Pipettes and pipette tips Labnet (BioPette PLUS) Used to measure liquids ingredients
Polyvinylchloride Marley waste pipe Used to create a neck for the fermentation bag
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) SIGMA-ALDRICH Ingredient of the blastospore liquid medium
Rubber band Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks
Sabaroud dextrose agar (SDA) NEOGEN Culture Media Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii
Sterile distilled water To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions
Sticky pad Used to secure the seives on the vibratory shaker
Surgical blade Lasec Used to scrape off spores from fungal cultures
Surgical paper Lasec Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag
Vibratory shaker Used to shake conidia off the agricultural grain substrates
Vortex mixer Labnet (Labnet International, Inc.) Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles
Yeast extract Biolab Added to the SDA medium to improve spore germination and growth
Zipper-lock bags GLAD Used to to store harvested fungal conidia

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References

  1. Shah, P. A., Pell, J. K. Entomopathogenic fungi as biological control agents. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5), 413-423 (2003).
  2. Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. A review of the biology and control of the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae), with special reference to biological control using entomopathogenic fungi and nematodes. African Entomology. 29 (1), 1-16 (2020).
  3. Ibrahim, L., Laham, L., Touma, A., Ibrahim, S. Mass production, yield, quality, formulation and efficacy of entomopathogenic Metarhizium anisopliae conidia. Current Journal of Applied Science and Technology. 9 (5), 427-440 (2015).
  4. Banu, J. G., Rajalakshmi, S. Standardisation of media for mass multiplication of entomopathogenic fungi. Indian Journal of Plant Protection. 42 (1), 91-93 (2014).
  5. Roberts, D. W., Humber, R. A. Entomogenous fungi. Biology of Conidial Fungi. Cole, G. T., Kendrick, W. B. , Academic Press. New York. 201-236 (1981).
  6. Feng, M. G., Poprawski, T. J., Khachatourians, G. G. Production, formulation and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for insect control. Current status. Biocontrol Science and Technology. 4 (1), 3-34 (1994).
  7. Karanja, L. W., Phiri, N. A., Oduor, G. I. Effect of different solid substrates on mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae entomopathogens. The Proceedings of the12th KARI Biennial Scientific Conference. , Nairobi, Kenya. 8-12 (2010).
  8. Prasad, C. S., Pal, R. Mass production and economics of entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae and Verticillium lecanii on agricultural and industrial waste. Scholars Journal of Agriculture and Veterinary Sciences. 1 (1), 28-32 (2014).
  9. Ehlers, R. U. Mass production of entomopathogenic nematodes for plant protection. Applied Microbiology and Biotechnology. 56 (5), 623-633 (2001).
  10. Pham, T. A., Kim, J. J., Kim, S. G., Kim, K. Production of blastospore of entomopathogenic Beauveria bassiana in a submerged batch culture. Mycobiology. 37 (3), 218-224 (2009).
  11. Bhadauria, B. P., Puri, S., Singh, P. K. Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products. The Bioscan. 7 (2), 229-232 (2012).
  12. Latifian, M., Rad, B., Amani, M. Mass production of entomopathogenic fungi Metarhizium anisopliae by using agricultural products based on liquid-solid diphasic method for date palm pest control. International Journal of Farming and Allied Sciences. 3 (4), 368-372 (2014).
  13. Agale, S. V., Gopalakrishnan, S., Ambhure, K. G., Chandravanshi, H., Gupta, R., Wani, S. P. Mass production of entomopathogenic fungi (Metarhizium anisopliae) using different grains as a substrate. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7 (1), 2227-2232 (2018).
  14. Jackson, M. A. Optimizing nutritional conditions for the liquid culture production of effective fungal biological control agents. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 19 (3), 180-187 (1997).
  15. Deshpande, M. V. Mycopesticides production by fermentation. Potential and challenges. Critical Reviews in Microbiology. 25 (3), 229-243 (1999).
  16. Sahayaraj, K., Namasivayam, S. K. R. Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products and by products. African Journal of Biotechnology. 7 (12), 1907-1910 (2008).
  17. Feng, K. C., Liu, L. B., Tzeng, Y. M. Verticillium lecanii spore production in solid-state and liquid-state fermentations. Bioprocess Engineering. 23 (1), 25-29 (2000).
  18. Jaronski, S. T., Jackson, M. A. Mass production of entomopathogenic Hypocreales. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology 2nd edition. Lacey, L. A. , Academic Press. London. 255-284 (2012).
  19. Vega, F. E., Jackson, M. A., Mercandier, G., Poprawski, T. J. The impact of nutrition on spore yields for various fungal entomopathogens in liquid culture. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 19 (4), 363-368 (2003).
  20. El Damir, M. Effect of growing media and water volume on conidial production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Journal of Biological Sciences. 6 (2), 269-274 (2006).
  21. Pandey, A. K., Kanaujia, K. R. Effect of different grains as solid substrates on sporulation, viability and pathogenicity of Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin. Journal of Biological Control. 22 (2), 369-374 (2008).
  22. Kassa, A., et al. Whey for mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Mycological Research. 112 (5), 583-591 (2008).
  23. Sharma, S., Gupta, R. B. L., Yadavam, C. P. S. Selection of a suitable medium for mass multiplication of entomofungal pathogens. Indian Journal of Entomology. 64 (3), 254-261 (2002).
  24. Bich, G. A., Castrillo, M. L., Villalba, L. L., Zapata, P. D. Evaluation of rice by-products, incubation time, and photoperiod for solid state mass multiplication of the biocontrol agents Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Agronomy Research. 16 (5), 1921-1930 (2018).
  25. Price, R. E., Müller, E. J., Brown, H. D., D'Uamba, P., Jone, A. A. The first trial of a Metarhizium anisopliae var. acridum mycoinsecticide for the control of the red locust in a recognised outbreak area. International Journal of Tropical Insect Science. 19 (4), 323-331 (1999).
  26. Hatting, J. L., Moore, S. D., Malan, A. P. Microbial control of phytophagous invertebrate pests in South Africa. Current status and future prospects. Journal of Invertebrate Pathology. 165, 54-66 (2019).
  27. Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. Laboratory screening of entomopathogenic fungi and nematodes for pathogenicity against the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae). Biocontrol Science and Technology. , (2021).
  28. Inglis, G. D., Enkerli, J., Goettel, M. S. Laboratory techniques used for entomopathogenic fungi: Hypocreales. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , Academic Press, Elsevier. Chapter 7 189-253 (2012).
  29. Mehta, J., et al. Impact of carbon & nitrogen sources on the Trichoderma viride (Biofungicide) and Beauveria bassiana (entomopathogenic fungi). European Journal of Experimental Biology. 2 (6), 2061-2067 (2012).
  30. Burges, H. D. Formulation of mycoinsecticides. Formulation of Microbial Biopesticides. , Springer. Dordrecht. 131-185 (1998).

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जीव विज्ञान अंक 181 ब्लास्टोस्पोर फसल संरक्षण सूत्रीकरण कीटनाशकों बड़े पैमाने पर संस्कृति Metarhizium robertsii Metarhizium pinghaense
कीट कीटों के खिलाफ वाणिज्यिक अनुप्रयोग के लिए एंटोमोपैथोजेनिक कवक, <em>मेटारिज़ियम रॉबर्टसी</em> और <em>मेटारिज़ियम पिनघेन्से</em> का बड़े पैमाने पर उत्पादन
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Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests. J. Vis. Exp. (181), e63246, doi:10.3791/63246 (2022).

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