Summary
昆虫病原性真菌は、農業害虫の生物防除剤として重要性を増している。この研究では、害虫に対する商業利用のために、 Metarhizium robertsii および M. pinghaense の両方の南アフリカの分離株の十分な数の弾力性感染性プロパグルの大量生産が、農業穀物製品を使用して首尾よく行われた。
Abstract
メタリジウム・アニソプリアエ種複合体の昆虫病原性真菌は、農業害虫の生物防除剤として重要性を増している。化学殺虫剤に対する害虫抵抗性の増加、殺虫剤の人間の健康への悪影響に関する懸念の高まり、および農薬による環境汚染は、作物保護と害虫駆除のための新しい持続可能な戦略を見出す世界的な推進力をもたらしました。これまで、ボーベリア・バッシアナのような昆虫病原性真菌(EPF)種を大量培養する試みが行われている。しかしながら、昆虫害虫に対する使用のためにメタリジウム・ロベルツィイおよびM. pinghaenseを大量培養する試みは限定的にしか行われていない。この研究は、M. robertsiiおよびM. pinghaenseの南アフリカの分離株の十分な数の弾力性感染性伝播剤を商業用途のために大量生産することを目的としていた。3つの農業穀物製品、フレークドオート麦、フレーク大麦、および米をEPF固体発酵基質として使用した。2つの接種方法、分生子懸濁液および胚芽胞子の液体真菌培養物を固体基質に接種するために使用した。分生子懸濁液を用いた接種は、ブラストスポア接種法を使用した場合と比較して固体基質上に増加したレベルの汚染が観察されたため、比較的効果が低いことが観察された。フレーク状のオート麦は、M. robertsiiとM. pinghaenseの両方にとって適切な成長基質ではないことが判明し、基質から乾燥分生子が採取されなかった。フレーク状の大麦は、M. pinghaenseのそれよりもM. robertsii conidiaの生産に有利であることが見出され、平均1.83g±1.47gの乾燥M. robertsii分生子および0グラムのM. pinghaense分生子が基質から収穫された。 米粒は、M. pinghaense分離株とM. robertsii分離株の両方の分生子大量生産に有利に働くことが見出され、基質から収穫された±平均8.2g±4.38gおよび6gである。
Introduction
昆虫病原性真菌(EPF)は、重要な農業害虫の生物学的防除における作物保護剤として重要性を増している1、2。土壌中に自然に発生する昆虫病原体は、様々な害虫種の集団に流行を引き起こす3。EPFの種は宿主特異的であり、非標的種を攻撃するという点で比較的リスクが少なく、環境に対して毒性がない4。EPF には、ホストに侵入するための独自のメカニズムと、その直接の環境での伝播と永続化のための独自のメカニズムがあります 1。彼らは主に宿主のキューティクルに付着して浸透する無性胞子を介して宿主を攻撃し、宿主のヘモコエルに侵入して増殖する。宿主は、最終的に血リンパ栄養素の枯渇のために、または真菌によって放出される毒性代謝産物によって引き起こされる毒素血症の結果として死亡する。死後、理想的な環境条件下で、真菌は宿主死体5,6の外表面(明白な真菌症)に出現する。
残留化学物質が人間の健康、環境汚染、および害虫抵抗性の開発に及ぼす悪影響に関する懸念の高まりは、化学ベースの殺虫剤の投入を減らし、作物保護と害虫駆除のための代替的で斬新で持続可能な戦略を見つける世界的な推進力をもたらしました6,7,8 .これは、従来の化学防除よりも生態学的に有利な戦略である統合害虫管理(IPM)プログラムで使用するための微生物ベースの殺虫剤を開発する機会を提供しました3,8。
農業害虫のための微生物防除剤の開発を成功させるためには、まず適切な生物を単離し、特徴付け、同定し、標的害虫に対するその病原性を確認しなければならない。しかしながら、微生物剤の大規模生産のための容易で費用対効果の高い方法は、生物学的制御プログラム9、10、11、12、13において使用するための生存可能な生成物を製造するために必要とされる。相当量の良質の昆虫病原体の大量生産は、微生物株、環境、標的害虫、製剤、市場、施用戦略、および所望の最終製品に依存する14、15、16。EPFは、胚芽胞子を生成するための液体基質発酵または空中分生子6、17、18を生成する固体基質発酵プロセスを使用して大量生産することができる。しかし、昆虫病原体の大量生産および製剤化プロセスは、最終製品の病原性、コスト、貯蔵寿命、および現場有効性に直接影響する。IPMでの使用を成功させるためには、昆虫病原体の生産プロセスは、実行が容易で、最小限の労力を必要とし、毒性、生存可能、および持続性の高収量濃度のプロパグルを生産し、低コストでなければならない4,13,14,16。
昆虫病原体の栄養要件を理解することは、すべての培養方法による大量培養にとって重要である4,12。生産培地の栄養成分は、生物防除有効性、収量、乾燥耐性、および持続性を含む、結果として生じるプロパグルの属性に重大な影響を及ぼす8、19、20、21。生産手順の最適化は、このような要因に対処するように設計されています 22.EPFにとって、真菌分生子の良好な成長、胞子形成、および大量生産のための主な要件は、適切な水分、最適な成長温度、pH、CO2およびO2のガス交換、ならびに良好なリン、炭水化物、炭素、および窒素源を含む栄養である18。
JaronskiとJackson18は、自然条件下では、真菌の分生子が昆虫の死体の表面のような固体直立構造に担がれるため、固体基質発酵法を液体基質発酵法と比較してEPF生産のための自然プロセスに最も効率的かつ最も近い近似法として記述している。デンプンを含む農産物および副産物は、真菌が菌糸先端からの高濃度加水分解酵素の分泌を介してデンプンを容易に分解し、固体物質に浸透し、物質中に存在する栄養素にアクセスするため、主に低クレアリア菌の大量生産に使用されている11、17、18、23.穀物製品はまた、それらが水和および滅菌されると、基質が任意の液体媒体16、18、24からさらなる栄養素を吸収することができるので、健康なバイオマス生産のための要件を提供する。
以前は、いくつかの研究がボーベリア・バッシアナ(Bals)のようなEPF種を大量培養しようと試みた。Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.)ViegasとMetarhizium anisopliae(Metschn)の一部。ソロキン種複合体は、種々の基質16、23、24上に単離する。このような大量生産され商業的に開発された分離株には、M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner) J.F. Bisch, Rehner & Humberから開発されたGreen Muscle®(株IMI 330189)、Metarhizium 69(Meta 69株ICIPE69)、およびM. anisopliaeから開発されたReal Metarhizium 69(L9281)、およびB. bassiana25,26から開発されたBroadband® (株PPRI 5339)およびEco-Bb®が含まれる。.しかし、Metarhizium robertsii J.F. Bisch、S.A. Rehner & Humber、Metarhizium pinghaense Chen & Guoを大量培養する試みは限定的である。これら2つの分離株は、以前の研究で、ミツバチ、Pseudococcus viburni Signoret(半翅目:Pseudococcidae)の防除に最も効果的であるものとして選択されました27。したがって、現在の研究は、害虫に対する商業的適用のために、M. robertsiiおよびM. pinghaenseの局所分離株の十分な数の弾力性のある感染性プロパグルを処方し、大量生産することを目的としていた。固体基質発酵法を用いて、両方のEPF分離株について真菌分生子を大量生産した。2つのEPF接種法は、分生子懸濁液および胚芽胞子の液体真菌培養物を使用して、固体基質を接種するために使用した。
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Protocol
1.真菌株の供給源
- 南アフリカの西ケープ州のリンゴ果樹園から採取したM. pinghaense 5 HEID(GenBankアクセッション番号:MT367414/MT895630)とM. robertsii 6EIKEN(MT378171/MT380849)の両方の南アフリカの単離真菌株を使用してください。
- 各EPF分離株の培養物を、1gの酵母エキス(SDAY)および10μLのストレプトマイシンを添加した60gのサブローデキストロース寒天培地上で増殖させる。
注:EPF培養物を暗所で±25°Cの制御された温度でインキュベートする。
2. メタリシウム・ピンヘーンセ および M.ロベルツィイ 分生子懸濁液接種
- 固体基質の調製
- 発酵バッグとして、2つのEPF分離株およびオートクレーブバッグ(305mm×660mm)の成長培地として、2つの農産物、すなわちフレークドオート麦およびフレークドオオムギを使用する。
- 小さなポリ塩化ビニル廃液パイプ(1000mm×50mm)を使用して、オートクレーブバッグの開放端に発酵バッグ用のネックを作成し、オートクレーブテープを使用してパイプをバッグに固定します。
- 発酵中に十分なガス交換を可能にするために、滅菌コットンウールプラグでパイプを閉じます。
- フレークドオート麦とフレーク大麦の両方の乾燥穀物(200g)を計量して発酵バッグに入れ、各バッグに100mLの蒸留水を加え、バッグの内容物を十分に混合する。
- 濡れた穀物を15〜30分間休ませて、オートクレーブと滅菌の前に水分を吸収します。粒種ごとに6袋を用意し、汚染を防ぐため、他のオートクレーブ袋に袋を入れ、基材を121°Cで55分間オートクレーブした。
- 分生子懸濁液接種の調製
- M. pinghaenseおよびM. robertsiiの両方の真菌培養物から2〜3週齢の真菌分生子を掻き取り、滅菌手術ブレードを使用して収穫する。
- 回収した真菌分生子を20mLの滅菌蒸留水に懸濁し、0.05%Tween 20を補充し、分生子懸濁液を2分間ボルテックスミックスする。
- 1 ~107 分生子/mLの濃度で20 mLの分生子懸濁液を調製し、それぞれフレークドオート麦×フレーク大麦固体基質を接種する。
注:分生子濃度を決定するために血球計数器を使用してください。
- 固体基質の接種
- コットンウールネックプラグを取り外して各袋を開き、調製した20mL分生子懸濁液を冷却したオートクレーブ処理基材に加える。
- 首栓を使用して袋をもう一度閉じ、袋の内容物をマッサージして、真菌の接種物が穀物基質と均一に混合されるようにします。
- 発酵バッグを±25°Cの制御された温度でインキュベートし、培養物と環境との間の十分なガス交換を確実にする。
メモ: この手順は、層流キャビネットの下で行う必要があります。
- 発酵段階
- 接種およびインキュベーションの2日後に発酵バッグ内の穀物基質を手動でマッサージし、目に見える菌糸成長が起こり、基質が増殖する真菌によって凝集し始めたとき。
注:これは、菌類の栄養成長の最初の初期段階で菌糸枝分かれが起こることを可能にするために、接種された顆粒を混合するために行われる。 - キッチンの麺棒を使用して基板ベッドを操作し、粒子基板ベッドの物理的な不均一性および基板質量のベッド厚さを回避します。
注:このプロセスは、真菌の胞子産生を最適化し、表面積を最大化し、分生子収量を促進する真菌代謝を促進する18。 - 発酵プロセスを最大4〜5週間継続させ、発酵プロセス中に発生する可能性のある白い栄養過成長の存在について発酵バッグをチェックし、真菌の分生子収量に大きく影響する可能性があります。
注:任意の白色栄養過剰増殖を含む発酵バッグ内の発酵を直ちに終了し、真菌培養物18を乾燥させる。
- 接種およびインキュベーションの2日後に発酵バッグ内の穀物基質を手動でマッサージし、目に見える菌糸成長が起こり、基質が増殖する真菌によって凝集し始めたとき。
3. 芽球胞子接種
- 芽胞子の産生と接種
- M. pinghaenseとM. robertsiiの両方について、1Lの蒸留水、30gのグルコース、20gの酵母エキス、4gのリン酸亜塩基性カリウム(K2HPO4)、15mLのコーンスティープリカー、および10μg/mLの抗生物質ストレプトマイシンを含む液体培地を調製する。
- まず、蒸留水を加熱し、沸点に達する前にスイッチを切って、ストレプトマイシンを除く各成分を鍋の中のお湯に加えます。培地を3〜4分間穏やかに沸騰させ、成分の適切な混合を可能にし、ポットの底にいくつかの成分が沈降するのを防ぐために培地を絶えず攪拌する。
- 合計100mLの培地を9つの異なる250mLフラスコに注ぎ、各フラスコにコットンウールプラグを置き、ストッパーとしてコットンウールをアルミホイルで覆った(図1A)。
- フラスコ内の培地を121°Cで55分間オートクレーブする。 オートクレーブ処理に続いて、フラスコ内の培地を冷却し、各フラスコ内の培地に10mg/mLのストレプトマイシンを加えます(図1B)。
- EPF分離株M. pinghaenseおよびM. robertsiiの両方について、2〜3週齢の真菌培養プレートから真菌分生子の2〜3細菌ループを収集し、滅菌条件下で、250mLフラスコ内の各100mL液体培地に移し、フラスコを密封する。
- 液体培養フラスコを±25°Cでインキュベートし、140rpmでオービタルシェーカー上で3日間、培養物が真菌芽胞子増殖を伴う高い濁度の徴候を示したらインキュベーションを停止した(図1C)。
- 培養物からの細菌汚染の可能性を検出するには、インキュベーション中に24時間後に各液体培養フラスコから100μLのサンプルを引き出し、単離物ごとに3つのSDAプレート上にプレートします。プレートを±25°Cの制御温度で48時間インキュベートする。
- 固体基板の作製
- M. pinghaenseとM. robertsiiの両方の芽胞子の固体基質培地として、パーボイルした長粒白米を使用する(JaronskiとJackson18から適応)。
- 上記のように発酵バッグをステップ2.1.1〜2.1.3で準備し、各バッグに1kgの米と300mLの滅菌蒸留水を加える。
- 発酵バッグの内容物を穏やかに混合し、外側のオートクレーブバッグに直立姿勢で入れ、オートクレーブを121°Cで55分間行った。オートクレーブ処理に続いて、滅菌条件下で基板を± 45分間冷却します。
- 接種と発酵
- 層流下で M. pinghaense および M. robertsii の両方の液体培養フラスコの各々の閉鎖を解除し、各フラスコの縁を10秒間炎上させる。
- 100mLの液体培養物を発酵バッグに注ぎ、コットンウールプラグを首から取り外します(図2)。綿のプラグを元に戻し、バッグの首の上部を輪ゴムで固定された手術用紙で覆います。
注:血球計数器を使用して各フラスコの胚盤胞子濃度を決定し、1 ×107 - 5 × 108 胚芽胞子/mLの胚芽胞子濃度を使用して基質28を無菌化する。 - 袋の上部をひねり、マッサージによる基板の振とうと軽い操作により袋の内容物を混ぜ合わせ、±25°Cで袋をインキュベートし、袋内の基板を平らにすることにより、厚いベッド18の形成を防止する。
- 袋の内容物をマッサージすることによって発酵バッグ内の基質を破り、接種およびインキュベーションの2〜3日後に、真菌による基質の目に見える菌糸成長および結合が生じていた(JaronskiおよびJackson18の技術から適合)。
注:発酵を4週間継続させる。
図1:250mLフラスコ内の液体培養液。(b)オートクレーブ処理後、EPF胞子を接種する。(c)真菌芽球胞子を有する濁質培地。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:胚盤胞子液体培地を調製した。 (A)メタリシウム・ロベルツィイ及び(B)メタリシウム・ピンヘンセは、固体基質としてのイネの接種前。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
4. 真菌培養物の乾燥
- 真菌培養物を発酵後10〜12日間乾燥させ、試験に使用する前に、胞子状培養物を26〜30kg(30 x 43 x 15250 cm3)の茶色の紙袋に移す。
- 紙袋の引張強度を向上させるために、各袋の上部の3分の1を水平に切り落とし、袋の底部を線で引いた(図3A、B)。
図3:紙袋の調製、培養物の乾燥手順、および包装。(C,E)パーボイルド米および(D,F)フレーク大麦上で栽培したメタリジウム種培養物の乾燥手順。(G)紙袋をステープルで閉じて三角形のテント構造を作る。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- 各発酵袋内の基質を穏やかに崩壊させ、各袋の角を切り取り、切り取られた角が残した空間を通して培養物全体を紙袋に移す(図3C-F)。真菌胞子の空気中への過度の逃避を避けるために、このプロセスをゆっくりと実行してください。
注:汚染を避けるために、層流を使用して滅菌条件下でこのプロセスを実施してください。 - 各紙袋にラベルを付け、各袋の上端を2回折り、ステープルで閉じて三角形のテント構造を作成し、ワイヤー乾燥ラックに袋を置き、±25°Cの制御された温度と30〜40%の低湿度で適切で乾燥させる。
- 培養物の乾燥を均一にし、収穫可能な真菌胞子の収量を低下させる可能性のある栄養再成長を避けるために、毎日袋を回してください。
- 乾燥工程中に2日毎に各乾燥袋を秤量し、連続する日の間に袋の質量にほとんどまたは全く変化が認められなくなるまで各袋について乾燥処理を継続する。
5.真菌分生子の収穫
- 3つの入れ子付きふるいを用いて培養物から機械的に真菌分生子を採取し、試験篩(ETS)メッシュ番号35(500μm開口付き)、試験篩(212μm開口付き)、ETSメッシュ100号(150μm開口付き)に入れ子にし、収集パンに取り付けた。
- 乾式培養サンプルをETSメッシュ35号篩にゆっくりと装填し、真菌分生子が空気中に放出されないようにふたをふるいにかける。
- 10〜12個のガラス大理石をふるいに追加して、メッシュスクリーンを通る真菌分生子の通過を支援し、篩内の分生子の保持を回避し、胞子の回復を減少させる可能性がある。
- 電気テープを使用してふるいの目地をテープで留めて密封し、分生子のほこりが逃げないようにします。
- 粘着性パッドを取り付けた振動シェーカーの上にふるいを置き、収集パンとふるいを毎分560〜640振動の動きで20〜25分間固定します(図4)。
注:ヤロンスキーとジャクソン18から適応したテクニック。
図4:イネおよびフレーク化オオムギ上の乾燥 メタリジウム・ロベルツィイ 培養物からの真菌胞子の収穫。 (A)メッシュスクリーンを通る真菌分生子の通過を助けるためにふるいに10〜12個のガラス大理石を加える。 M. robertsii conidiaは、(B)米の培養物から収穫され、(C)かろうじてフレークされた。(D)振動シェーカーでふるいにかける。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- 試験ふるいを収集パンから取り出し、分生子を収集し、収集した分生子を気密で水不透過性のジッパーロックバッグに保管し、長期保存(3〜6ヶ月)します。
6. 生産される真菌分生子の定量化
- 各基質から真菌分生子を採取する前に、各粒子基質の質量を測定し、記録する。
- 固体基質の質量から収集された胞子の質量を差し引くことによって、収集された分生子の全体重量を測定する。
注:総分生子収量は、収穫された分生子だけでなく、固体基質上に残された真菌分生子も含む。 - 基板を秤量し、秤量した基板から10gを取り出す。10 gの基質を0.05%Tween 20に懸濁し、10 mLの滅菌蒸留水で希釈する。
- 懸濁液を2分間ボルテックスミックスし、血球計数器を使用して胞子数を行い、基質から洗浄した分生子の数を求めた。
- 10 mL洗浄した分生子懸濁液1000 μLを9 mLの滅菌蒸留水に移してさらに希釈を行い、10 mLの希釈懸濁液を作ります。
- 分生子懸濁液を2分間渦混合し、分生子濃度を決定する。
注:Inglis、Enkerli、およびGoettel30 によって説明されている手順および式に従って、懸濁液の分生子濃度を決定する。 - 各培養物から回収した分生子粉末の合計0.1gを0.05%Tween 20を添加した滅菌蒸留水10mLに回収・懸濁し、分生子懸濁液を2分間ボルテックスミックスし、血球計数器を用いて分生子濃度を求めた。
- 10 mLの分生子懸濁液1000 μLを9 mLの滅菌蒸留水に移してさらに希釈を行い、10 mLの懸濁液希釈液を作ります。
- 渦 - 分生子懸濁液を2分間混合し、分生子濃度を計算し、グラムあたりの分生子の数を決定する。
- 採取した粉末のグラム当たりの分生子の数に、採取した分生子粉末の初期質量を掛ける。基質から洗浄された分生子の数に、分生子が採取された基質である使用済み基質の総重量を掛ける。
- 2つの所与の値を一緒に加算し、基質の初期乾燥重量で除して、基質18のkgまたはg当たりの分生子の数を計算する。
注:計算は主に米基質について行われた。発芽または分生子生存率試験を 、M. pinghaense 分離株および M. robertsii 分離株の両方について実施し、産生された分生子の生存率を決定した。
7. データ解析
- 適切なコンピュータソフトウェアプログラムを使用して、得られた結果の統計分析を行います。
注: データの統計分析は、STATISTICA バージョン 13.5.0.17 を使用して行われました。
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Representative Results
M. pinghaenseとM. robertsiiの両方について、イネ上の培養物の含量質量の減少は、真菌培養物の乾燥段階で経時的に観察され、培養物が乾燥した後、質量に変化は見られなかったか、またはほとんど観察されなかった(図5)。M. pinghaenseとM. robertsiiの両方の回収された乾燥真菌分生子粉末を図6に示す。
図5:10日間にわたるイネ(95%信頼区間)上の メタリシウム・ロベルツィイ および M. pinghaense 培養物の袋内容物質量の変化( ANOVA;F5,35 = 2.21;p = 0.08)。バーの上の異なる文字は、数日間にわたって袋内容物質量で得られた有意差(p<0.05)を示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:収穫した分生子。 (A)収集鍋で収穫した分生子。(B) メタリシウム・ロバーツイ (C) M. ピンヘーンセこの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
M. pinghaenseおよびM. robertsiiの両方について、各穀物タイプから収穫された平均分生子粉末に有意差は認められなかった。両方のために収穫された乾燥分生子は、M. pinghaenseおよびM. robertsiiの両方について平均>90%の分生子生存率を有していた。イネ基質上で、M. pinghaenseは平均8.2g±4.38gの分生子粉末を生産し、これはM. robertsiiについて得られた量(6g±2g)をわずかに上回った。平均1.83g±1.47gの乾燥したM. robertsii conidiaがフレーク状の大麦基質から収穫されたが、基質から0個のM. pinghaenseが収穫された。乾燥した真菌の分生子は、M. pinghaenseまたはM. robertsiiのいずれについても、フレーク状のオート麦基質から採取されなかった(図7)。
図7:分生子粉末の平均量。メタリジウム・ピンヘーンセおよびM.ロバーツイの分生子粉末の平均量を、3つの固体基質から収穫したグラム(95%信頼区間)で測定した:パーボイルド米、フレーク大麦、およびフレークドオート麦(ANOVA:F2,27 = 2.82;p=0.08)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
米粒から収穫された1グラム当たりの推定平均分生子の有意差は、M. pinghaense(3.51 x 10 7/g ± 0.43 x 10 7/g)とM. robertsii(4.31 x 10 7/g±0.38 x 107/g)の間で観察された。M. robertsiiは、M. pinghaenseよりもグラムあたりの平均分生子数がわずかに高かった(図8)。
図8:グラムあたりの平均分生子。 イネ培養物からの メタリジウム・ピンヘーンセ および M. robertsii (95%信頼区間)のグラム当たりの推定平均分生子(ANOVA:F 1,7 = 8.47;p = 0.02)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
使用済みイネ基質上に存在する分生子の推定数に有意差は認められず、M. pinghaense(5.02 x 107/mL ± 1.47 x 107/mL)とM. robertsii(3.70 x107/mL ± 0.91 x107/mL)との間で観察されなかった(図9)。しかし、M. pinghaenseは、M. robertsiiよりもイネ基質上に存在する分生子の数がわずかに多かった。
図9:平均的な真菌分生子。使用済みイネ培養基質上に存在する培養物(F1,7=2.45;p=0.16)からのメタリジウム・ピンヘンセおよびM・ロベルツィイ(95%信頼区間)の推定平均真菌分生子。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
推定された全体的な分生子収量に有意差は認められなかった M. pinghaense (5.09 x 10 7/g ± 1.35 x 10 7/g) と M. robertsii (3.55 x 10 7/g ± 0.85 x 10 7/g) はイネ基質培養物から得られた。しかし、M. pinghaenseは、M. robertsiiよりもわずかに高い分生子収量を生み出し、より低い分生子収量を生み出した(図10)。
図10:全分生子収量。 イネ上の培養物からの メタリジウム・ピンヘーンセ および M. robertsii (95%信頼区間)の推定総分生子収量(F1,7 =3.91;p=0.09)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
農業生態系における重要な農業害虫の生物学的防除のための微生物剤の統合の成功は、実験室条件下での第一歩としての昆虫病原体の成功と大量生産の容易さの両方に依存する。EPFの大量生産は、生物学的制御9、10、11、12、13を用いたIPMプログラムのためのEPF製品の大規模な適用と入手可能性にとって重要である。異なるEPF分離株の大量生産の成功は、生産基質または培地の栄養成分によって影響され、これは、それらの有効性、乾燥耐性、圃場の持続性、および分生子収量を含む、結果として生じる分生子の属性に大きく影響する8、19、20、21.したがって、培養および発酵プロセス中に大量生産された昆虫病原体の栄養所要量に関する知識を開発することは重要である29。
今回の研究では、 M. robertsii と M. pinghaense の両社の大量生産を発酵基質として、パーボイルドライス、フレーク大麦、フレークオート麦の3種類の農産物を用いて行った。3つの異なる粒子基質は、真菌分離株の分生子収量に有意に影響を及ぼすことが観察された。パーボイルド米は両方の分離株の大量生産に非常に有利であったが、フレーク状の大麦粒は M. robertsii の生産のみを支持した。観察は、発酵後の乾燥真菌分生子粉末の収率に基づいて行われた。ほとんどまたはまったく、分生子は発酵後にフレーク状のオート麦から収穫された。フレーク状のオート麦は、発酵プロセス中に発酵バッグ内により高いレベルの水分を保持することが見出され、その結果、 M. pinghaense および M. robertsiiの生産のための基質としての穀物の観察された性能の低下をもたらした可能性がある。フレーク状のオート麦基質は、場合によっては真菌分離株の白色栄養菌糸体過増殖を起こしやすく、過増殖を含む発酵バッグでは胞子形成が起こらなかったため、分生子収量に大きく影響した。フレーク化オート麦基質を有する発酵バッグはまた、フレーク化大麦基質を含む発酵バッグと比較して高レベルの細菌汚染を有することが観察された。
フレーク化大麦を基質として用いた M. pinghaense の大量生産に関して、高レベルの腐生菌または酵母汚染が観察された。腐生性真菌汚染は、基質を接種するために使用されるもの以外の真菌の増殖および分生子形成を通して発酵プロセスの後期段階で観察された。分生子胞子形成前の発酵初期段階での基質汚染の診断は困難であった。発酵プロセス中の細菌および酵母の汚染は、基質中の湿ったパッチによって現れると考えられており、フレーク状のオート麦および大麦粒は、米粒よりも長く水分を吸収および保持する傾向がある。これは、2つの メタリジウム 分離株の大量生産のための発酵基質としてこれら2つの基質を使用することに対する制限であった。
現在の研究中に行われた観察は、各穀物基質を接種するために使用される接種方法の種類が分生子の生産に影響を与えることを示した。分生子懸濁接種法は、接種されたフレークドオート麦およびフレークドオオムギが、液体培養胚盤胞子接種法が米粒に使用された場合と比較して汚染レベルの増加を示したため、比較的効果が低いことが判明した。液体培養胚盤胞子接種法とは異なり、分生子懸濁法は、基質の接種前に懸濁液中の可能性のある汚染物質を検出することができず、発酵バッグ内で観察された高レベルの汚染をもたらす。JaronskiとJackson18 は、基質の完全な滅菌の欠如、非滅菌接種、およびバッグ内の発酵基質の不適切な取り扱いなど、使用される基質の汚染の可能性につながる可能性のあるいくつかの要因を説明した。フレーク大麦とフレークドオート麦を含む発酵バッグで観察された汚染は、オートクレーブプロセス中に発生した可能性のある基質の完全な滅菌の欠如からも生じた可能性があります。JaronskiとJackson18 はまた、寒天培地からの分生子収穫中に汚染の可能性が高まるため、接種剤として分生子懸濁液を使用することは不利であると説明した。
野外では、適切な宿主の感染の間、真菌は、昆虫30の外側の固体表面上でのその出現および胞子形成の前に、増殖を通して昆虫のヘモコエル中にバイオマスを最初に蓄積する。このようなプロセスは、液芽胞子発酵法を用いた場合に模倣された。したがって、ブロスは昆虫のヘモコエルを表し、真菌分生子によるブロスの接種は昆虫の初期接触および感染を表し、ブロス中の芽胞子の形成は感染した昆虫のヘモコエル内で起こる芽胞子プロセスの増殖を表した。米粒の最終的な接種と時間の経過に伴う穀物への真菌の胞子形成は、真菌が昆虫の死体の内側から出現し始めると、昆虫のキューティクルに起こることを表していました。これはおそらく、液体芽胞子発酵法が分生子懸濁液接種法よりもうまく機能した理由を説明することができる。
JaronskiとJackson18 は、2つの穀物タイプが発酵プロセス中に水分含有量を維持することが見出されたので、 メシウム 種の大量培養のための好ましい農業穀物として、フレークドオート麦およびフレークド大麦粒を、米粒と比較して説明した。しかし、現在の研究は、フレークドオート麦とフレークドオオムギの両方が M. pinghaense または M. robertsiiのいずれにとっても良好な固体発酵基質であることが見つからなかったため、前述の研究者の観察と結論と矛盾する。米は、以前の研究で示唆されたように、最終製品と混合する可能性のある小さな粒子に分解されないため、両方の分離株にとって良好な穀物基質であることが判明した。
現在の研究では、 Metarhizium 種の分離株は、米粒を使用してうまく培養および大量生産することができ、異なる穀物が分生子胞子形成および収量に異なる影響を与える傾向があることが示されている。これはおそらく、異なる穀物がそのような栄養組成、例えば炭素:窒素比および炭素濃度の点で異なるという事実に起因する可能性がある。生育培地の炭素濃度および炭素:窒素比は、分生子の収量、ならびに生存率および病原性の点でその品質に影響を与えることが知られている22。基質を接種するために使用される接種技術は、特定の農業穀物基質上のEPF分離株の大量生産において達成された成功の程度に影響を与えることも示されている。したがって、本研究で説明した液体芽胞子発酵技術は、 M. pinghaense 分離株および M. robertsii 分離株の大量生産のための農業穀物基質に対する最良の接種方法として推奨されている。このような方法を使用することで、接種剤の使用前に汚染の検出が可能となり、分生子懸濁液接種技術の使用に対して所望のEPF単離物の大量生産を妨げる可能性がある。また、米粒は、フレーク状の大麦やフレーク状のオート麦ではなく、 M. pinghaense と M. robertsiiの両方の分生子の大量生産のための固体基質として使用することも推奨されます。記載された技術は、農業生態系における重要な害虫に対する野外条件下での分生子の将来の大量生産および商業適用にとって重要である。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、このプロジェクトに資金を提供してくれたHort Pome、Hort Stone、およびTechnology and Human Resources for Industry Programme(THRIP:TP14062571871)に感謝したい。
オルシド:
レトディ・L・マトゥルウェ http://orcid.org/0000-0002-5118-3578
アントワネット・P・マラン・http://orcid.org/0000-0002-9257-0312
ノマコルワ・F・ストクウェ http://orcid.org/0000-0003-2869-5652
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Tween 20 | Lasec | Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water | |
| 20 mL McCartney bottles | Lasec | Used to make conidial suspensions | |
| Aluminium foil | Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask | ||
| Autoclave | Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process | ||
| Autoclave bags | Lasec | Fermentation bags or solid substrate containers | |
| Autoclave tape | Lasec | To secure PVC pipes on the fermentation bags | |
| Brown Kraft paper bags | Used to dry conidia cultures on agricultural grains | ||
| Bunsen burnner | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks) | |
| Clear edge test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
| Corn steep liquor | SIGMA | 66071-94-1 | Ingredient of the blastospore liquid medium |
| Cotton Wool | Lasec | Used as plug of the neck for fermentation bags | |
| Duran laboratory bottles | Neolab | Used to autoclave SDA medium and distilled water | |
| Electrical tape | Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust | ||
| ENDECOTTS test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
| Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask | Lasec | Carrier of the blastospore liquid medium | |
| Ethanol (99%) | Lasec | Used to sterilize surgical blades and inoculating loops | |
| Flaked barley | Health Connection Wholefoods | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Flaked oats | Tiger brands | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Glucose | Merck | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
| Growth Chamber/ incubators | For growing fungal conidia culture | ||
| Haemocytometer | Used to determine conidial concentrations | ||
| Inoculating loops | Lasec | For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth | |
| Kitchen rolling pin | Used to manipulate the solid grain substrate bed | ||
| Laminar flow Cabinet | ESCO Laminar Flow Cabinet | Provide as sterile environment during substrate inoculation | |
| Metarhizium pinghaense conidia | Stellenbosch University | 5HEID | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense |
| Metarhizium robertsii conidia | Stellenbosch University | 6EIKEN | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii |
| Microscope | ZEIZZ (Scope. A1) | Used to determine conidial concentrations and conidial viability | |
| Orbital shaker | IncoShake- LABOTEC | Used for the blastospore production process | |
| Parboiled rice | Spekko | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Penicillin-Streptomycin | SIGMA | Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination | |
| Petri-dishes | Lasec | Containers for the SDA medium | |
| Pipettes and pipette tips | Labnet (BioPette PLUS) | Used to measure liquids ingredients | |
| Polyvinylchloride Marley waste pipe | Used to create a neck for the fermentation bag | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
| Rubber band | Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks | ||
| Sabaroud dextrose agar (SDA) | NEOGEN Culture Media | Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii | |
| Sterile distilled water | To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions | ||
| Sticky pad | Used to secure the seives on the vibratory shaker | ||
| Surgical blade | Lasec | Used to scrape off spores from fungal cultures | |
| Surgical paper | Lasec | Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag | |
| Vibratory shaker | Used to shake conidia off the agricultural grain substrates | ||
| Vortex mixer | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles | |
| Yeast extract | Biolab | Added to the SDA medium to improve spore germination and growth | |
| Zipper-lock bags | GLAD | Used to to store harvested fungal conidia |
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