Summary
Entomopathogene Pilze haben als biologische Bekämpfungsmittel für landwirtschaftliche Insektenschädlinge an Bedeutung gewonnen. In dieser Studie wurde die Massenproduktion einer ausreichenden Anzahl widerstandsfähiger infektiöser Vermehrungen südafrikanischer Isolate von Metarhizium robertsii und M. pinghaense für die kommerzielle Anwendung gegen Insektenschädlinge erfolgreich unter Verwendung von landwirtschaftlichen Getreideprodukten durchgeführt.
Abstract
Entomopathogene Pilze des Artenkomplexes Metarhizium anisopliae haben als biologische Bekämpfungsmittel für landwirtschaftliche Insektenschädlinge an Bedeutung gewonnen. Die Zunahme der Schädlingsresistenz gegen chemische Insektizide, die wachsende Besorgnis über die negativen Auswirkungen von Insektiziden auf die menschliche Gesundheit und die Umweltverschmutzung durch Pestizide haben zu einem globalen Bestreben geführt, neuartige nachhaltige Strategien für den Pflanzenschutz und die Schädlingsbekämpfung zu finden. Zuvor wurden Versuche unternommen, solche entomopathogenen Pilze (EPF) -Arten wie Beauveria bassiana in Massen zu kultivieren. Es wurden jedoch nur begrenzte Versuche unternommen, Metarhizium robertsii und M. pinghaense zur Verwendung gegen Insektenschädlinge zu kultivieren. Diese Studie zielte darauf ab, eine ausreichende Anzahl widerstandsfähiger infektiöser Propagulationen südafrikanischer Isolate von M. robertsii und M. pinghaense für kommerzielle Anwendungen in Massenproduktion herzustellen. Drei landwirtschaftliche Getreideprodukte, Haferflocken, Gerstenflocken und Reis, wurden als feste EPF-Fermentationssubstrate verwendet. Zwei Impfmethoden, konidielle Suspensionen und die flüssige Pilzkultur von Blastosporen, wurden verwendet, um die festen Substrate zu impfen. Es wurde beobachtet, dass die Impfung mit konidiellen Suspensionen relativ weniger wirksam ist, da auf den festen Substraten im Vergleich zur Verwendung der Blastosporen-Impfmethode erhöhte Kontaminationsgrade beobachtet wurden. Haferflocken erwiesen sich sowohl für M. robertsii als auch für M. pinghaense als geeignetes Wachstumssubstrat, da keine trockenen Konidien aus dem Substrat geerntet wurden. Es wurde festgestellt, dass Gerstenflocken die Produktion von M. robertsii-Konidien gegenüber der von M. pinghaense begünstigten, und durchschnittlich 1,83 g ± 1,47 g trockene M. robertsii-Konidien und null Gramm M. pinghaense-Konidien wurden aus dem Substrat geerntet. Es wurde festgestellt, dass Reiskörner die konidielle Massenproduktion von M. pinghaense- und M. robertsii-Isolaten begünstigen, wobei durchschnittlich 8,2 g ± 4,38 g bzw. 6 g ± 2 g aus dem Substrat geerntet wurden.
Introduction
Entomopathogene Pilze (EPF) haben als Pflanzenschutzmittel bei der biologischen Bekämpfung wichtiger landwirtschaftlicher Insektenschädlinge an Bedeutung gewonnen 1,2. Die Entomopathogene, die natürlicherweise im Boden vorkommen, verursachen Tierseuchen in den Populationen verschiedener Schädlingsarten3. Die Arten von EPF sind wirtsspezifisch und stellen relativ wenige Risiken in Bezug auf den Angriff auf Nichtzielarten dar, und sie sind ungiftig für die Umwelt4. EPF haben einen einzigartigen Mechanismus für das Eindringen in ihren Wirt sowie für die Ausbreitung und Persistenz in ihrer unmittelbaren Umgebung1. Sie greifen den Wirt hauptsächlich durch asexuelle Sporen an, die sich an die Nagelhaut des Wirts anheften und diese durchdringen, um in den Hämocoel des Wirts einzudringen und sich zu vermehren. Der Wirt stirbt schließlich aufgrund der Erschöpfung der Hämolymph-Nährstoffe oder als Folge der Toxämie, die durch die toxischen Metaboliten verursacht wird, die vom Pilz freigesetzt werden. Nach dem Tod tritt der Pilz unter idealen Umweltbedingungen auf der äußeren Oberfläche (offene Mykose) des Wirtskadaversaus 5,6.
Wachsende Besorgnis über die negativen Auswirkungen chemischer Rückstände auf die menschliche Gesundheit, Umweltverschmutzung und die Entwicklung von Schädlingsresistenzen haben zu dem globalen Bestreben geführt, den Einsatz von Insektiziden auf chemischer Basis zu reduzieren und alternative, neuartige und nachhaltige Strategien für Pflanzenschutz und Schädlingsbekämpfungzu finden 6,7,8 . Dies hat Möglichkeiten geschaffen, mikrobielle Insektizide für den Einsatz in Programmen für den integrierten Pflanzenschutz (IPM) zu entwickeln, die ökologisch günstigere Strategien sind als die herkömmliche chemische Kontrolle 3,8.
Um ein erfolgreiches mikrobielles Bekämpfungsmittel für einen landwirtschaftlichen Schädling zu entwickeln, muss zunächst ein geeigneter Organismus isoliert, charakterisiert, identifiziert und seine Pathogenität für den Zielschädling bestätigt werden. Es ist jedoch eine einfache und kostengünstige Methode für die großtechnische Produktion des mikrobiellen Agens erforderlich, um ein lebensfähiges Produkt für die Verwendung in biologischen Bekämpfungsprogrammen 9,10,11,12,13 herzustellen. Die Massenproduktion erheblicher Mengen hochwertiger Entomopathogene hängt vom mikrobiellen Stamm, der Umwelt, dem Zielschädling, der Formulierung, dem Markt, der Anwendungsstrategie und dem gewünschten Endproduktab 14,15,16. EPF kann unter Verwendung von flüssiger Substratfermentation zur Herstellung von Blastosporen oder des festen Substratfermentationsprozesses zur Herstellung von Luftkonidien 6,17,18 in Massenproduktion hergestellt werden. Der Massenproduktions- und Formulierungsprozess von Entomopathogenen beeinflusst jedoch direkt die Virulenz, die Kosten, die Haltbarkeit und die Feldwirksamkeit des Endprodukts. Für eine erfolgreiche Verwendung in IPM muss der Produktionsprozess der Entomopathogene einfach zu bedienen sein, minimale Arbeit erfordern, eine hohe Ausbeute an virulenten, lebensfähigen und persistenten Vermehrungen erzeugen und kostengünstigsein 4,13,14,16.
Das Verständnis des Nährstoffbedarfs von Entomopathogenen ist wichtig für die Massenkultivierung mit allen Anbaumethoden 4,12. Die Nährstoffkomponenten des Produktionsmediums haben einen signifikanten Einfluss auf die Eigenschaften der resultierenden Vermehrungen, einschließlich der Wirksamkeit der Biokontrolle, des Ertrags, der Austrocknungstoleranz und der Persistenz 8,19,20,21. Die Optimierung von Produktionsabläufen ist darauf ausgerichtet, solche Faktoren anzugehen22. Für EPF sind die Hauptanforderungen für ein gutes Wachstum, Sporulation und Massenproduktion von Pilzkonidien ausreichende Feuchtigkeit, optimale Wachstumstemperatur, pH-Wert, Gasaustausch von CO2 undO2 und Ernährung, einschließlich guter Phosphor-, Kohlenhydrat-, Kohlenstoff- und Stickstoffquellen18.
Jaronski und Jackson18 beschreiben die feste Substratfermentationsmethode als die effizienteste und engste Annäherungsmethode an den natürlichen Prozess zur EPF-Produktion im Vergleich zur Fermentationsmethode für flüssige Substrate, da das Pilzkonidium unter natürlichen Bedingungen auf festen aufrechten Strukturen wie der Oberfläche von Insektenkadavern getragen wird. Landwirtschaftliche Produkte und Nebenprodukte, die Stärke enthalten, werden hauptsächlich für die Massenproduktion von hypokrealischen Pilzen verwendet, da die Pilze Stärke leicht durch Sekretion hochkonzentrierter hydrolytischer Enzyme aus ihren Hyphenspitzen zersetzen, um in die feste Substanz einzudringen und auf die in der Substanz vorhandenen Nährstoffe zuzugreifen11,17,18,23 . Die Getreideprodukte liefern auch die Voraussetzungen für eine gesunde Biomasseproduktion, denn wenn sie hydratisiert und sterilisiert sind, können die Substrate weitere Nährstoffe aus jedem flüssigen Medium aufnehmen16,18,24.
Zuvor wurde in mehreren Studien versucht, EPF-Arten wie Beauveria bassiana (Bals.) Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas und einige der Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin-Spezies-Komplex-Isolate auf verschiedenen Substraten 16,23,24. Zu diesen massenproduzierten und kommerziell entwickelten Isolaten gehören Green Muscle® (Stamm IMI 330189), entwickelt aus M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner), J.F. Bisch, Rehner & Humber, Metarhizium 69 (Meta 69 Stamm ICIPE69) und Real Metarhizium 69 (L9281), entwickelt aus M. anisopliae, und Broadband® (Stamm PPRI 5339) und Eco-Bb®, entwickelt aus B. bassiana 25,26 . Es wurden jedoch begrenzte Versuche unternommen, Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner & Humber und Metarhizium pinghaense Chen & Guo in Massenkultur zu bringen. Diese beiden Isolate wurden in einer früheren Studie als die wirksamsten für die Bekämpfung der Wollläuse ausgewählt, Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)27. Daher zielte die aktuelle Studie darauf ab, eine ausreichende Anzahl widerstandsfähiger infektiöser Vermehrungen der lokalen Isolate von M. robertsii und M. pinghaense für die kommerzielle Anwendung gegen Insektenschädlinge zu formulieren und in Massenproduktion zu produzieren. Die Festsubstratfermentationsmethode wurde verwendet, um die Pilzkonidien für beide EPF-Isolate in Massenproduktion herzustellen. Zwei EPF-Impfmethoden, bei denen konidielle Suspensionen und die flüssige Pilzkultur von Blastosporen verwendet wurden, wurden verwendet, um die festen Substrate zu impfen.
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Protocol
1. Quelle von Pilzstämmen
- Verwenden Sie südafrikanische isolierte Pilzstämme von M. pinghaense 5 HEID (GenBank Accession number: MT367414/MT895630) und M. robertsii 6EIKEN (MT378171/MT380849), die aus Apfelplantagen in der Provinz Westkap, Südafrika, gesammelt wurden.
- Züchten Sie Kulturen jedes EPF-Isolats auf 60 g Sabouraud-Dextrose-Agar-Medium, ergänzt mit 1 g Hefeextrakt (SDAY) und 10 μL Streptomycin.
HINWEIS: Inkubieren Sie EPF-Kulturen bei einer kontrollierten Temperatur von ± 25 °C im Dunkeln.
2. Metarhizium pinghaense und M. robertsii conidial suspension inokulation
- Aufbereitung der festen Substrate
- Verwenden Sie zwei landwirtschaftliche Produkte, nämlich Haferflocken und Gerstenflocken, als Wachstumsmedien für die beiden EPF-Isolate und Autoklavenbeutel (305 mm × 660 mm) als Gärbeutel.
- Verwenden Sie ein kleines Polyvinylchlorid-Abfallrohr (1000 mm × 50 mm), um einen Hals für den Gärbeutel am offenen Ende des Autoklavenbeutels zu erstellen, und verwenden Sie Autoklavband, um das Rohr am Beutel zu befestigen.
- Schließen Sie das Rohr mit einem sterilen Wattestopfen, um einen ausreichenden Gasaustausch während der Gärung zu ermöglichen.
- Wiegen Sie trockene Körner (200 g) von Haferflocken und Gerstenflocken und legen Sie sie in die Gärbeutel, und fügen Sie zu jedem Beutel 100 ml destilliertes Wasser hinzu und mischen Sie den Inhalt der Beutel gründlich.
- Lassen Sie die nassen Körner 15-30 Minuten ruhen, um Feuchtigkeit vor dem Autoklavieren und Sterilisieren aufzunehmen. Bereiten Sie sechs Beutel für jeden Getreidetyp vor, und um eine Kontamination zu vermeiden, legen Sie die Beutel in andere Autoklavbeutel und autoklavieren Sie die Substrate bei 121 ° C für 55 min.
- Herstellung von konidialem Suspensionsinokulum
- Ernten Sie 2-3 Wochen alte Pilzkonidien aus Pilzkulturen von M. pinghaense und M. robertsii durch Kratzen mit einer sterilen chirurgischen Klinge.
- Suspendieren Sie die gesammelten Pilzkonidien in 20 ml sterilem destilliertem Wasser, ergänzt mit 0,05% Tween 20, und mischen Sie die konidiellen Suspensionen für 2 min.
- Bereiten Sie 20 ml konidielle Suspensionen mit einer Konzentration von 1 × 107 Konidien / ml vor und impfen Sie die Substrate für Haferflocken bzw. gefüllte Gersten.
HINWEIS: Verwenden Sie ein Hämozytometer, um konidimale Konzentrationen zu bestimmen.
- Impfung der festen Substrate
- Öffnen Sie jeden Beutel, indem Sie die Nackenstöpsel aus Watte entfernen, und fügen Sie die vorbereitete 20 ml konidielle Suspension dem gekühlten autoklavierten Substrat hinzu.
- Schließen Sie die Beutel erneut mit den Nackenstöpseln und massieren Sie den Inhalt des Beutels ein, damit sich das Pilzinokulum gleichmäßig mit dem Getreidesubstrat vermischt.
- Inkubieren Sie die Gärbeutel bei einer kontrollierten Temperatur von ± 25 °C und sorgen Sie für einen ausreichenden Gasaustausch zwischen Kultur und Umwelt.
HINWEIS: Dieses Verfahren muss unter einem Laminar-Flow-Schrank durchgeführt werden.
- Fermentationsphase
- Massieren Sie die Getreidesubstrate in den Gärbeuteln 2 Tage nach der Impfung und Inkubation manuell, wenn sichtbares Myzelwachstum auftritt und das Substrat durch den wachsenden Pilz verklumpt ist.
HINWEIS: Dies geschieht, um das geimpfte Granulat zu mischen, damit in den ersten frühen Stadien des vegetativen Wachstums der Pilze eine myzelliche Verzweigung stattfinden kann. - Verwenden Sie ein Küchen-Nudelholz, um das Substratbett zu manipulieren, um die physikalische Heterogenität der Getreidesubstratbetten und die Bettdicke der Substratmasse zu vermeiden.
HINWEIS: Der Prozess fördert den Pilzstoffwechsel, der die Produktion von Pilzsporen optimiert und die Oberfläche maximiert, wodurch der konididale Ertrag gefördertwird 18. - Lassen Sie den Fermentationsprozess bis zu 4-5 Wochen andauern und überprüfen Sie die Fermentationsbeutel alle 2 Tage auf das Vorhandensein von weißem vegetativem Überwuchs, der sich während des Fermentationsprozesses entwickeln kann, was den Ertrag der Pilzkonidien stark beeinflussen kann.
HINWEIS: Beenden Sie sofort die Fermentation in den Gärbeuteln, die weißes vegetatives Überwuchern enthalten, und trocknen Sie die Pilzkulturen18.
- Massieren Sie die Getreidesubstrate in den Gärbeuteln 2 Tage nach der Impfung und Inkubation manuell, wenn sichtbares Myzelwachstum auftritt und das Substrat durch den wachsenden Pilz verklumpt ist.
3. Blastosporen-Impfung
- Blastosporenproduktion und -impfung
- Bereiten Sie ein flüssiges Kulturmedium vor, das 1 l destilliertes Wasser, 30 g Glukose, 20 g Hefeextrakt, 4 g Kaliumphosphat-Diabasis (K2HPO4), 15 ml Maissteillauge und 10 μg / ml Antibiotikum Streptomycin sowohl für M. pinghaense als auch für M . robertsii enthält.
- Erhitzen Sie zuerst das destillierte Wasser, schalten Sie es aus, bevor Sie den Siedepunkt erreichen, und fügen Sie jede der Zutaten, mit Ausnahme von Streptomycin, in das heiße Wasser im Topf hinzu. Bringen Sie das Medium 3-4 min lang sanft zum Kochen und rühren Sie das Medium ständig um, um das richtige Mischen der Zutaten zu ermöglichen und das Absetzen einiger Zutaten am Boden des Topfes zu verhindern.
- Gießen Sie insgesamt 100 ml des Mediums in neun verschiedene 250-ml-Kolben, legen Sie einen Wattestopfen auf jeden Kolben und bedecken Sie die Watte mit Aluminiumfolie als Stopfen (Abbildung 1A).
- Autoklavieren Sie das Medium in den Kolben für 55 min bei 121 °C. Lassen Sie nach der Autoklavierung das Medium in den Kolben abkühlen und fügen Sie dem Medium in jedem Kolben 10 mg/ml Streptomycin hinzu (Abbildung 1B).
- Sammeln Sie zwei bis drei bakterielle Schleifen von Pilzkonidien von 2-3 Wochen alten Pilzkulturplatten für die EPF-Isolate, M. pinghaense und M. robertsii, und übertragen Sie sie unter sterilen Bedingungen auf jedes 100 ml flüssige Medium in den 250-ml-Kolben und verschließen Sie die Kolben.
- Inkubieren Sie die flüssigen Kulturkolben bei ± 25 °C, auf einem Orbitalschüttler bei 140 U / min für 3 Tage und stoppen Sie die Inkubation, sobald die Kulturen Anzeichen einer hohen Trübung mit pilzlichem Blastosporenwachstum zeigen (Abbildung 1C).
- Um eine mögliche bakterielle Kontamination durch die Kulturen nachzuweisen, entnehmen Sie nach 24 Stunden während der Inkubation eine 100-μL-Probe aus jedem Flüssigkulturkolben und die Platte auf drei SDA-Platten pro Isolat. Inkubieren Sie die Platten für 48 h bei einer kontrollierten Temperatur von ± 25 °C.
- Vorbereitung des festen Substrats
- Verwenden Sie parboiled langkörnigen weißen Reis als festes Substratmedium für die Blastosporen von M. pinghaense und M. robertsii (adaptiert von Jaronski und Jackson18).
- Bereiten Sie die Gärbeutel wie oben beschrieben in den Schritten 2.1.1-2.1.3 vor und fügen Sie für jeden Beutel 1 kg Reis und 300 ml steriles destilliertes Wasser hinzu.
- Mischen Sie vorsichtig den Inhalt der Gärbeutel und legen Sie ihn in äußere Autoklavenbeutel in aufrechter Position und Autoklav bei 121 ° C für 55 min. Lassen Sie die Substrate nach dem Autoklavieren unter sterilen Bedingungen für ± 45 Minuten abkühlen.
- Impfung und Gärung
- Entfernen Sie den Verschluss jedes der flüssigen Kulturkolben von M. pinghaense und M. robertsii unter einer laminaren Strömung und brennen Sie den Rand jedes Kolbens für 10 s.
- Gießen Sie die 100-ml-Flüssigkulturen in die Fermentationsbeutel, indem Sie die Wattestopfen vom Hals nehmen (Abbildung 2). Setzen Sie die Baumwollstöpsel wieder auf und bedecken Sie die Oberseite des Halses der Tasche mit chirurgischem Papier, das mit einem Gummiband gesichert ist.
HINWEIS: Bestimmen Sie die Blastosporenkonzentration für jeden Kolben mit einem Hämozytometer und verwenden Sie Blastosporenkonzentrationen von 1 × 107 - 5 × 108 Blastosporen / ml, um die Substrate28 zu innokulieren. - Drehen Sie den oberen Teil des Beutels und mischen Sie den Inhalt des Beutels durch Schütteln und leichte Manipulation des Substrats durch Massage und inkubieren Sie die Beutel bei ± 25 ° C, indem Sie das Substrat in den Beuteln abflachen, um die Bildung dicker Bettenzu verhindern 18.
- Brechen Sie das Substrat in den Gärbeuteln durch Massieren des Inhalts der Beutel, 2-3 Tage nach der Impfung und der Inkubation, wenn sichtbares Myzelwachstum und die Bindung des Substrats durch den Pilz aufgetreten sind (angepasst an die Technik von Jaronski und Jackson18).
HINWEIS: Lassen Sie die Fermentation 4 Wochen lang fortsetzen.
Abbildung 1: Flüssiges Kulturmedium in 250-ml-Kolben. (A) Vor der Autoklavierung. (B) Nach Autoklavierung und Inokulation mit EPF-Sporen. (C) Trübes Medium mit pilzlichen Blastosporen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Zubereitetes Blastosporen-Flüssigkulturmedium. (A) Metarhizium robertsii und (B) Metarhizium pinghaense vor der Beimpfung von Reis als festem Substrat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
4. Trocknung von Pilzkulturen
- Trocknen Sie die Pilzkulturen für 10-12 Tage nach der Fermentation, bevor sie in Versuchen verwendet werden, indem Sie die sporulierten Kulturen in 26-30 kg (30 x 43 x15250 cm 3) braune Papiertüten umfüllen.
- Um die Zugfestigkeit der Papiertüten zu verbessern, schneiden Sie ein Drittel des oberen Teils jedes Beutels horizontal ab und kleiden Sie den Boden des Beutels aus (Abbildung 3A, B).
Abbildung 3: Vorbereitung von Papiertüten, Trocknungsverfahren von Kulturen und Verpackung. (A,B) Die Herstellung von braunen Papiertüten. Das Trocknungsverfahren von Metarhizium-Artenkulturen, die auf (C,E) Parboiled-Reis und (D,F)-Gerstenflocken angebaut werden. (G) Papiertüten, die mit Heftklammern verschlossen sind, um eine dreieckige Zeltstruktur zu schaffen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
- Zerbröckeln Sie vorsichtig das Substrat in jedem Gärbeutel, schneiden Sie die Ecke jedes Beutels ab und übertragen Sie die gesamte Kultur durch den durch die abgeschnittene Ecke verbleibenden Raum auf die Papiertüten (Abbildung 3C-F). Um das übermäßige Austreten von Pilzsporen in die Luft zu vermeiden, führen Sie diesen Prozess langsam durch.
HINWEIS: Führen Sie diesen Prozess unter sterilen Bedingungen unter laminaren Strömungen durch, um eine Kontamination zu vermeiden. - Beschriften Sie jede Papiertüte und falten Sie sie zweimal über das obere Ende jeder Tasche und schließen Sie sie mit Klammern, um eine dreieckige Zeltstruktur zu schaffen, und legen Sie die Taschen auf Drahttrocknungsgestelle, um eine ordnungsgemäße, gleichmäßige Trocknung bei einer kontrollierten Temperatur von ± 25 ° C und einer niedrigen Luftfeuchtigkeit von 30-40% zu ermöglichen.
- Drehen Sie die Beutel täglich, um eine gleichmäßige Trocknung der Kulturen zu ermöglichen und ein vegetatives Nachwachsen zu vermeiden, das den Ertrag an erntefähigen Pilzsporen verringern würde.
- Wiegen Sie jeden Trocknungsbeutel alle 2 Tage während des Trocknungsprozesses und setzen Sie den Trocknungsprozess für jeden Beutel fort, bis wenig bis keine Veränderung in der Masse der Beutel zwischen den aufeinanderfolgenden Tagen beobachtet wird.
5. Ernte von Pilzkonidien
- Pilzkonidien mechanisch aus den Kulturen mit drei verschachtelten Sieben ernten, einem Testsieb (ETS) Mesh Nr. 35 (mit 500-μm-Öffnung), verschachtelt auf einem Testsieb (mit 212-μm-Öffnung), verschachtelt auf ETS-Mesh Nr. 100 (mit 150-μm-Öffnung), montiert auf einer Auffangwanne.
- Legen Sie die Trockenkulturprobe langsam auf das ETS-Netz Nr. 35 und legen Sie einen Deckel auf das Sieb, um die Freisetzung von Pilzkonidien in die Luft zu verhindern.
- Fügen Sie 10-12 Glasmurmeln zu den Sieben hinzu, um den Durchgang der Pilzkonidien durch die Netzsiebe zu unterstützen und die Retention der Konidien im Sieb zu vermeiden, was zu einer verminderten Sporenausbeute führen kann.
- Kleben und versiegeln Sie die Siebverbindungen mit Elektroband, um das Entweichen von Staub zu verhindern.
- Legen Sie die Siebe auf einen Vibrationsschüttler, der mit einem klebrigen Pad ausgestattet ist, um die Auffangwanne und die Siebe für 20-25 min bei einer Bewegung von 560-640 Vibrationen pro Minute zu sichern (Abbildung 4).
HINWEIS: Technik angepasst von Jaronski und Jackson18.
Abbildung 4: Ernte von Pilzsporen aus getrockneten Metarhizium robertsii-Kulturen auf Reis und Gerstenflocken. (A) 10-12 Glasmurmeln, die den Sieben hinzugefügt wurden, um den Durchgang der Pilzkonidien durch die Netzsiebe zu erleichtern. M. robertsii conidia aus Kulturen auf (B) Reis geerntet und (C) kaum geflockt. (D) Siebt auf einem Vibrationsschüttler. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
- Entfernen Sie die Analysensiebe aus der Auffangwanne, sammeln Sie Konidien und lagern Sie die gesammelten Konidien in luftdichten und wasserundurchlässigen Reißverschlussbeuteln zur Langzeitlagerung (3-6 Monate).
6. Quantifizierung der produzierten Pilzkonidien
- Messen und erfassen Sie die Masse jedes Getreidesubstrats vor der Ernte der Pilzkonidien von jedem Substrat.
- Messen Sie das Gesamtgewicht der gesammelten Konidien, indem Sie die Masse der gesammelten Sporen von der Masse des festen Substrats abziehen.
HINWEIS: Der gesamte Konidienertrag umfasst nicht nur die geernteten Konidien, sondern auch die Pilzkonidien, die auf dem festen Substrat verbleiben. - Wiegen Sie das Substrat und entfernen Sie 10 g aus dem gewogenen Substrat. Die 10 g des Substrats in 0,05% Tween 20 suspendieren und in 10 ml sterilem destilliertem Wasser verdünnen.
- Mischen Sie die Suspension für 2 min und verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Sporenzählung durchzuführen, um die Anzahl der vom Substrat gewaschenen Konidien zu bestimmen.
- Führen Sie weitere Verdünnungen durch, indem Sie 1000 μL der 10 ml gewaschenen konidiellen Suspension auf 9 ml steriles destilliertes Wasser übertragen, um 10 ml Verdünnungssuspensionen zu bilden.
- Wirbelmischen Sie die konidiellen Suspensionen für 2 min und bestimmen Sie die konidiellen Konzentrationen.
HINWEIS: Befolgen Sie das von Inglis, Enkerli und Göttel30 beschriebene Verfahren und die Formel, um die konidielle Konzentration der Suspensionen zu bestimmen. - Sammeln und suspendieren Sie insgesamt 0,1 g des gesammelten konidiellen Pulvers aus jeder Kultur in 10 ml sterilem destilliertem Wasser, ergänzt mit 0,05% Tween 20, und mischen Sie die konidielle Suspension für 2 min und bestimmen Sie die konidielle Konzentration mit einem Hämozytometer.
- Führen Sie weitere Verdünnungen durch, indem Sie 1000 μL der 10 ml konidiellen Suspension auf 9 ml steriles destilliertes Wasser übertragen, um die 10 ml Suspensionsverdünnungen zu bilden.
- Mischen Sie die konidialen Suspensionen für 2 min, berechnen Sie die konidiellen Konzentrationen und bestimmen Sie die Anzahl der Konidien pro Gramm.
- Multiplizieren Sie die Anzahl der Konidien pro Gramm geerntetem Pulver mit der Anfangsmasse des geernteten Konidienpulvers. Multiplizieren Sie die Anzahl der aus dem Substrat gewaschenen Konidien mit dem Gesamtgewicht des verbrauchten Substrats, das das Substrat ist, von dem die Konidien geerntet wurden.
- Addieren Sie die beiden angegebenen Werte zusammen und dividieren Sie sie durch das anfängliche Trockengewicht des Substrats, um die Anzahl der Konidien pro kg oder g des Substrats18 zu berechnen.
HINWEIS: Die Berechnungen wurden hauptsächlich für das Reissubstrat durchgeführt. Der Keimungs- oder Konidiallebensfähigkeitstest wurde sowohl für die M. pinghaense - als auch für die M. robertsii-Isolate durchgeführt, um die Lebensfähigkeit der produzierten Konidien zu bestimmen.
7. Datenanalyse
- Verwenden Sie eine geeignete Computersoftware, um die statistische Analyse der erhaltenen Ergebnisse durchzuführen.
HINWEIS: Die statistische Analyse der Daten erfolgte mit STATISTICA Version 13.5.0.17.
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Representative Results
Ein Rückgang der Inhaltsmasse der Kulturen auf Reis sowohl für die M. pinghaense als auch für die M. robertsii wurde im Laufe der Zeit während der Trocknungsphase der Pilzkulturen beobachtet, wobei keine oder nur eine geringe Veränderung in der Masse beobachtet wurde, sobald die Kulturen trocken waren (Abbildung 5). Das geerntete trockene Pilzkonidienpulver sowohl der M. pinghaense als auch der M. robertsii ist in Abbildung 6 dargestellt.
Abbildung 5: Die Veränderung der Beutelinhaltsmasse der Metarhizium robertsii und der M. pinghaense-Kulturen auf Reis (95%-Konfidenzintervall) über 10 Tage ( ANOVA; F5,35 = 2,21; p = 0,08). Verschiedene Buchstaben über den Balken zeigen die signifikante Differenz (p < 0,05) an, die in der Beutelinhaltsmasse über die Tage erhalten wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Geerntete Konidien . (A) Geerntete Konidien in der Sammelpfanne. (B) Metarhizium robertsii . (C) M. pinghaense. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Es wurde kein signifikanter Unterschied im durchschnittlichen konidialen Pulver beobachtet, das von jedem Getreidetyp für M. pinghaense und M. robertsii geerntet wurde. Geerntete trockene Konidien für beide hatten eine durchschnittliche >90% konidielle Lebensfähigkeit für M. pinghaense und M. robertsii. Auf dem Reissubstrat produzierte M. pinghaense durchschnittlich 8,2 g ± 4,38 g Konidialpulver, was die Menge, die für M. robertsii erhalten wurde (6 g ± 2 g), leicht übertraf. Durchschnittlich 1,83 g ± 1,47 g trockene M. robertsii-Konidien wurden aus dem Flockgerstensubstrat geerntet, während aus dem Substrat keine M. pinghaense geerntet wurde. Aus dem Haferflockensubstrat wurden weder für M. pinghaense noch für M. robertsii trockene Pilzkonidien geerntet (Abbildung 7).
Abbildung 7: Durchschnittliche Menge an Konidienpulver. Die durchschnittliche Menge an Konidienpulver von Metarhizium pinghaense und M. robertsii, gemessen in Gramm (95% Konfidenzintervall), geerntet aus den drei festen Substraten: Parboiled-Reis, Gerstenflocken und Haferflocken (ANOVA: F2,27 = 2,82; p = 0,08). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ein signifikanter Unterschied in den geschätzten durchschnittlichen Konidien pro Gramm, die aus den Reiskörnern geerntet wurden, wurde zwischen M. pinghaense (3,51 x 10 7/g ± 0,43 x 10 7/g) und M. robertsii (4,31 x 10 7/g ± 0,38 x 10 7/g) beobachtet. M. robertsii hatte eine etwas höhere durchschnittliche Konidienzahl pro Gramm als M. pinghaense (Abbildung 8).
Abbildung 8: Durchschnittliche Konidien pro Gramm. Die geschätzten durchschnittlichen Konidien pro Gramm für Metarhizium pinghaense und M. robertsii (95% Konfidenzintervall) aus den Reiskulturen (ANOVA: F 1,7 = 8,47; p = 0,02). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Es wurde kein signifikanter Unterschied in der geschätzten Anzahl der auf dem verbrauchten Reissubstrat vorhandenen Konidien zwischen M. pinghaense (5,02 x 10 7/ml ± 1,47 x 10 7/ml) und M. robertsii (3,70 x 10 7/ml ± 0,91 x 10 7/ml) beobachtet (Abbildung 9). M. pinghaense hatte jedoch eine etwas höhere Anzahl von Konidien auf dem Reissubstrat als M. robertsii.
Abbildung 9: Durchschnittliche Pilzkonidien. Die geschätzten durchschnittlichen Pilzkonidien von Metarhizium pinghaense und M robertsii (95%-Konfidenzintervall) aus den Kulturen (F1,7 = 2,45; p = 0,16), die auf den verbrauchten Reiskultursubstraten vorhanden sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Es wurde kein signifikanter Unterschied in der geschätzten Gesamtkonidienausbeute zwischen der M. pinghaense (5,09 x 10 7/g ± 1,35 x 10 7/g) und der M. robertsii (3,55 x 10 7/g ± 0,85 x10 7/g) aus den Reissubstratkulturen beobachtet. M. pinghaense erzeugte jedoch eine etwas höhere konidielle Ausbeute als M. robertsii, die eine geringere konidielle Ausbeute erzeugte (Abbildung 10).
Abbildung 10: Gesamtkonidienertrag. Der geschätzte Gesamtkonidienertrag von Metarhizium pinghaense und M. robertsii (95%-Konfidenzintervall) aus den Kulturen auf Reis (F 1,7 = 3,91; p =0,09). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die erfolgreiche Integration mikrobieller Wirkstoffe zur biologischen Bekämpfung wichtiger landwirtschaftlicher Insektenschädlinge in ein Agrarökosystem hängt sowohl vom Erfolg als auch von der Leichtigkeit der Massenproduktion der Entomopathogene als erster Schritt unter Laborbedingungen ab. Die Massenproduktion von EPF ist wichtig für die großtechnische Anwendung und Verfügbarkeit von EPF-Produkten für IPM-Programme unter biologischer Kontrolle 9,10,11,12,13. Der Erfolg der Massenproduktion verschiedener EPF-Isolate wird durch die Nährstoffkomponenten des Produktionssubstrats oder -mediums beeinflusst, die die Eigenschaften der resultierenden Konidien erheblich beeinflussen, einschließlich ihrer Wirksamkeit, Austrocknungstoleranz, Feldpersistenz und konidiellen Ausbeute 8,19,20,21 . Daher ist es wichtig, während des Kultivierungs- und Fermentationsprozesses Kenntnisse über den Nährstoffbedarf von massenproduzierten Entomopathogenen zu entwickeln29.
In der aktuellen Studie wurde die Massenproduktion von M. robertsii und M. pinghaense mit drei verschiedenen landwirtschaftlichen Produkten als Fermentationssubstrate durchgeführt: Parboiled-Reis, Gerstenflocken und Haferflocken. Es wurde beobachtet, dass die drei verschiedenen Kornsubstrate die konidielle Ausbeute der Pilzisolate signifikant beeinflussen. Der Parboiled-Reis war sehr günstig für die Massenproduktion beider Isolate, während die Flockgerstenkörner nur die Produktion von M. robertsii begünstigten. Die Beobachtungen wurden auf der Grundlage der Ausbeute von trockenem Pilzkonidienpulver nach der Fermentation gemacht. Wenig oder gar nicht, Konidien wurden nach der Gärung aus den Haferflocken geerntet. Es wurde festgestellt, dass die Haferflocken während des Fermentationsprozesses einen höheren Feuchtigkeitsgehalt in den Fermentationsbeuteln zurückhalten, was zu der beobachteten schlechten Leistung des Getreides als Substrat für die Herstellung von M. pinghaense und M . robertsii geführt haben könnte. Das Haferflockensubstrat neigte in einigen Fällen zu einer weißen vegetativen Myzelüberwucherung der Pilzisolate, was die konidielle Ausbeute stark beeinflusste, da in den Gärbeuteln, die den Überwuchs enthielten, keine Sporulation auftrat. Es wurde auch beobachtet, dass die Gärbeutel mit dem Haferflockensubstrat im Vergleich zu den Gärbeuteln, die Gerstenflockensubstrate enthalten, einen hohen Grad an bakterieller Kontamination aufweisen.
Bei der Massenproduktion von M. pinghaense unter Verwendung von Gerstenflocken als Substrat wurden hohe Mengen an saprophytischen Pilzen oder Hefekontaminationen beobachtet. Die saprophytische Pilzkontamination wurde in einem späteren Stadium des Fermentationsprozesses durch das Wachstum und die Konidiogenese eines anderen Pilzes als dem, der zur Impfung des Substrats verwendet wird, beobachtet. Die Diagnose einer Substratkontamination in einem Anfangsstadium der Fermentation, vor der konidialen Sporulation, war schwierig. Es wird angenommen, dass sich die Kontamination von Bakterien und Hefen während des Fermentationsprozesses durch nasse Flecken im Substrat manifestiert, und sowohl Haferflocken als auch Gerstenkörner neigen dazu, Feuchtigkeit länger aufzunehmen und zu speichern als Reiskörner. Dies war eine Einschränkung bei der Verwendung dieser beiden Substrate als Fermentationssubstrate für die Massenproduktion der beiden Metarhizium-Isolate .
Die Beobachtungen während der aktuellen Studie zeigten, dass die Art der Impfmethode, die zur Impfung jedes Getreidesubstrats verwendet wurde, die konidielle Produktion beeinflusste. Die konidielle Suspensionsimpfmethode erwies sich als relativ weniger wirksam, da die geimpften Haferflocken und die Gerstenflocken einen erhöhten Kontaminationsgrad aufwiesen, verglichen mit der Anwendung der flüssig kultivierten Blastospore-Impfmethode auf Reiskörnern. Im Gegensatz zur flüssig kultivierten Blastosporen-Impfmethode erlaubt die konidielle Suspensionsmethode nicht den Nachweis möglicher Verunreinigungen in den Suspensionen vor der Beimpfung der Substrate, was zu den hohen Kontaminationsgraden führt, die in den Gärbeuteln beobachtet wurden. Jaronski und Jackson18 beschrieben mehrere Faktoren, die zu einer möglichen Kontamination der verwendeten Substrate führen könnten, wie das Fehlen einer vollständigen Sterilisation des Substrats, die unsterile Impfung und die unsachgemäße Handhabung des Fermentationssubstrats in den Beuteln. Die beobachtete Kontamination in den Gärbeuteln mit Gerstenflocken und Haferflocken könnte auch auf eine fehlende vollständige Sterilisation des Substrats zurückzuführen sein, die während des Autoklavierungsprozesses aufgetreten sein könnte. Jaronski und Jackson18 beschrieben auch die Verwendung von konidiellen Suspensionen als Impfmittel als nachteilig, da sie zu einer erhöhten Wahrscheinlichkeit einer Kontamination während der konidiellen Ernte aus einem Agarmedium führt.
Auf dem Feld baut der Pilz während der Infektion geeigneter Wirte zunächst Biomasse im Hämocoel der Insekten durch Proliferation auf, bevor er auf der äußeren festen Oberfläche der Insekten30 entsteht und sporuliert. Ein solcher Prozess wurde bei der Verwendung der Flüssig-Blastospore-Fermentationsmethode nachgeahmt. Dementsprechend stellte die Brühe das Hämocoel des Insekts dar, die Beimpfung der Brühe mit Pilzkonidien stellte den ersten Kontakt und die Infektion des Insekts dar, und die Bildung von Blastosporen in der Brühe stellte die Proliferation des Blastosporenprozesses dar, der im Hämocoel des infizierten Insekts auftritt. Die endgültige Impfung der Reiskörner und die Sporulation des Pilzes auf den Körnern im Laufe der Zeit repräsentierten, was auf der Kutikula des Insekts passiert, sobald der Pilz aus dem Inneren des Kadavers des Insekts auszutreten beginnt. Dies kann möglicherweise erklären, warum die Fermentationsmethode der flüssigen Blastospore besser funktionierte als die konidielle Suspensionsinokulationsmethode.
Jaronski und Jackson18 beschrieben Haferflocken und Gerstenflockenkörner als die bevorzugten landwirtschaftlichen Körner für die Massenkultur von Metarhizium-Arten im Vergleich zu Reiskörnern, da festgestellt wurde, dass die beiden Getreidesorten ihren Feuchtigkeitsgehalt während des Fermentationsprozesses beibehalten. Die aktuelle Studie widerspricht jedoch den Beobachtungen und Schlussfolgerungen der oben genannten Forscher, da sowohl die Haferflocken als auch die Gerstenflocken weder für M. pinghaense noch für M. robertsii gute feste Fermentationssubstrate waren. Es wurde festgestellt, dass der Reis ein gutes Getreidesubstrat für beide Isolate ist, da er sich nicht in kleine Partikel zersetzt, die sich mit dem Endprodukt vermischen könnten, wie in früheren Studien vorgeschlagen wurde.
Die aktuelle Studie hat gezeigt, dass Isolate der Metarhizium-Arten erfolgreich kultiviert und mit Reiskörnern in Massenproduktion hergestellt werden können und dass die verschiedenen Körner dazu neigen, die konididale Sporulation und den Ertrag unterschiedlich zu beeinflussen. Dies könnte möglicherweise daran liegen, dass sich verschiedene Körner in Bezug auf eine solche Nährstoffzusammensetzung unterscheiden, z. B. Kohlenstoff: Stickstoffverhältnisse und Kohlenstoffkonzentration. Es ist bekannt, dass die Kohlenstoffkonzentration und das Kohlenstoff-Stickstoff-Verhältnis eines Wachstumsmediums die Ausbeute an Konidien sowie deren Qualität in Bezug auf Lebensfähigkeit und Virulenz beeinflussen22. Es hat sich auch gezeigt, dass die Impftechniken, die zur Impfung der Substrate verwendet werden, den Grad des Erfolgs bei der Massenproduktion von EPF-Isolaten auf bestimmten landwirtschaftlichen Getreidesubstraten beeinflussen. Daher wird die in der aktuellen Studie beschriebene Fermentationstechnik für flüssige Blastosporen als die beste Impfmethode für landwirtschaftliche Getreidesubstrate für die Massenproduktion von M. pinghaense - und M. robertsii-Isolaten empfohlen. Die Verwendung einer solchen Methode ermöglicht die mögliche Erkennung von Kontaminationen vor der Verwendung der Impfmittel, die die Massenproduktion des gewünschten EPF-Isolats im Vergleich zur Verwendung der konidiellen Suspensionsimpftechnik behindern können. Es wird auch empfohlen, Reiskörner als feste Substrate für die Massenproduktion von Konidien von M. pinghaense und M . robertsii anstelle von Gerstenflocken und Haferflocken zu verwenden. Die beschriebene Technik ist wichtig für die zukünftige Massenproduktion und kommerzielle Anwendung der Konidien unter Feldbedingungen gegen wichtige Insektenschädlinge in den Agrarökosystemen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Die Autoren danken Hort Pome, Hort Stone und dem Technology and Human Resources for Industry Programme (THRIP: TP14062571871) für die Finanzierung des Projekts.
ORCID:
Letodi L. Mathulwe http://orcid.org/0000-0002-5118-3578
Antoinette P. Malan http://orcid.org/0000-0002-9257-0312
Nomakholwa F. Stokwe http://orcid.org/0000-0003-2869-5652
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Tween 20 | Lasec | Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water | |
| 20 mL McCartney bottles | Lasec | Used to make conidial suspensions | |
| Aluminium foil | Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask | ||
| Autoclave | Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process | ||
| Autoclave bags | Lasec | Fermentation bags or solid substrate containers | |
| Autoclave tape | Lasec | To secure PVC pipes on the fermentation bags | |
| Brown Kraft paper bags | Used to dry conidia cultures on agricultural grains | ||
| Bunsen burnner | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks) | |
| Clear edge test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
| Corn steep liquor | SIGMA | 66071-94-1 | Ingredient of the blastospore liquid medium |
| Cotton Wool | Lasec | Used as plug of the neck for fermentation bags | |
| Duran laboratory bottles | Neolab | Used to autoclave SDA medium and distilled water | |
| Electrical tape | Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust | ||
| ENDECOTTS test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
| Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask | Lasec | Carrier of the blastospore liquid medium | |
| Ethanol (99%) | Lasec | Used to sterilize surgical blades and inoculating loops | |
| Flaked barley | Health Connection Wholefoods | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Flaked oats | Tiger brands | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Glucose | Merck | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
| Growth Chamber/ incubators | For growing fungal conidia culture | ||
| Haemocytometer | Used to determine conidial concentrations | ||
| Inoculating loops | Lasec | For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth | |
| Kitchen rolling pin | Used to manipulate the solid grain substrate bed | ||
| Laminar flow Cabinet | ESCO Laminar Flow Cabinet | Provide as sterile environment during substrate inoculation | |
| Metarhizium pinghaense conidia | Stellenbosch University | 5HEID | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense |
| Metarhizium robertsii conidia | Stellenbosch University | 6EIKEN | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii |
| Microscope | ZEIZZ (Scope. A1) | Used to determine conidial concentrations and conidial viability | |
| Orbital shaker | IncoShake- LABOTEC | Used for the blastospore production process | |
| Parboiled rice | Spekko | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Penicillin-Streptomycin | SIGMA | Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination | |
| Petri-dishes | Lasec | Containers for the SDA medium | |
| Pipettes and pipette tips | Labnet (BioPette PLUS) | Used to measure liquids ingredients | |
| Polyvinylchloride Marley waste pipe | Used to create a neck for the fermentation bag | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
| Rubber band | Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks | ||
| Sabaroud dextrose agar (SDA) | NEOGEN Culture Media | Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii | |
| Sterile distilled water | To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions | ||
| Sticky pad | Used to secure the seives on the vibratory shaker | ||
| Surgical blade | Lasec | Used to scrape off spores from fungal cultures | |
| Surgical paper | Lasec | Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag | |
| Vibratory shaker | Used to shake conidia off the agricultural grain substrates | ||
| Vortex mixer | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles | |
| Yeast extract | Biolab | Added to the SDA medium to improve spore germination and growth | |
| Zipper-lock bags | GLAD | Used to to store harvested fungal conidia |
References
- Shah, P. A., Pell, J. K. Entomopathogenic fungi as biological control agents. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5), 413-423 (2003).
- Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. A review of the biology and control of the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae), with special reference to biological control using entomopathogenic fungi and nematodes. African Entomology. 29 (1), 1-16 (2020).
- Ibrahim, L., Laham, L., Touma, A., Ibrahim, S. Mass production, yield, quality, formulation and efficacy of entomopathogenic Metarhizium anisopliae conidia. Current Journal of Applied Science and Technology. 9 (5), 427-440 (2015).
- Banu, J. G., Rajalakshmi, S. Standardisation of media for mass multiplication of entomopathogenic fungi. Indian Journal of Plant Protection. 42 (1), 91-93 (2014).
- Roberts, D. W., Humber, R. A. Entomogenous fungi. Biology of Conidial Fungi. Cole, G. T., Kendrick, W. B. , Academic Press. New York. 201-236 (1981).
- Feng, M. G., Poprawski, T. J., Khachatourians, G. G. Production, formulation and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for insect control. Current status. Biocontrol Science and Technology. 4 (1), 3-34 (1994).
- Karanja, L. W., Phiri, N. A., Oduor, G. I. Effect of different solid substrates on mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae entomopathogens. The Proceedings of the12th KARI Biennial Scientific Conference. , Nairobi, Kenya. 8-12 (2010).
- Prasad, C. S., Pal, R. Mass production and economics of entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae and Verticillium lecanii on agricultural and industrial waste. Scholars Journal of Agriculture and Veterinary Sciences. 1 (1), 28-32 (2014).
- Ehlers, R. U. Mass production of entomopathogenic nematodes for plant protection. Applied Microbiology and Biotechnology. 56 (5), 623-633 (2001).
- Pham, T. A., Kim, J. J., Kim, S. G., Kim, K. Production of blastospore of entomopathogenic Beauveria bassiana in a submerged batch culture. Mycobiology. 37 (3), 218-224 (2009).
- Bhadauria, B. P., Puri, S., Singh, P. K. Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products. The Bioscan. 7 (2), 229-232 (2012).
- Latifian, M., Rad, B., Amani, M. Mass production of entomopathogenic fungi Metarhizium anisopliae by using agricultural products based on liquid-solid diphasic method for date palm pest control. International Journal of Farming and Allied Sciences. 3 (4), 368-372 (2014).
- Agale, S. V., Gopalakrishnan, S., Ambhure, K. G., Chandravanshi, H., Gupta, R., Wani, S. P. Mass production of entomopathogenic fungi (Metarhizium anisopliae) using different grains as a substrate. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7 (1), 2227-2232 (2018).
- Jackson, M. A. Optimizing nutritional conditions for the liquid culture production of effective fungal biological control agents. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 19 (3), 180-187 (1997).
- Deshpande, M. V. Mycopesticides production by fermentation. Potential and challenges. Critical Reviews in Microbiology. 25 (3), 229-243 (1999).
- Sahayaraj, K., Namasivayam, S. K. R. Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products and by products. African Journal of Biotechnology. 7 (12), 1907-1910 (2008).
- Feng, K. C., Liu, L. B., Tzeng, Y. M. Verticillium lecanii spore production in solid-state and liquid-state fermentations. Bioprocess Engineering. 23 (1), 25-29 (2000).
- Jaronski, S. T., Jackson, M. A. Mass production of entomopathogenic Hypocreales. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology 2nd edition. Lacey, L. A. , Academic Press. London. 255-284 (2012).
- Vega, F. E., Jackson, M. A., Mercandier, G., Poprawski, T. J. The impact of nutrition on spore yields for various fungal entomopathogens in liquid culture. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 19 (4), 363-368 (2003).
- El Damir, M. Effect of growing media and water volume on conidial production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Journal of Biological Sciences. 6 (2), 269-274 (2006).
- Pandey, A. K., Kanaujia, K. R. Effect of different grains as solid substrates on sporulation, viability and pathogenicity of Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin. Journal of Biological Control. 22 (2), 369-374 (2008).
- Kassa, A., et al. Whey for mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Mycological Research. 112 (5), 583-591 (2008).
- Sharma, S., Gupta, R. B. L., Yadavam, C. P. S. Selection of a suitable medium for mass multiplication of entomofungal pathogens. Indian Journal of Entomology. 64 (3), 254-261 (2002).
- Bich, G. A., Castrillo, M. L., Villalba, L. L., Zapata, P. D. Evaluation of rice by-products, incubation time, and photoperiod for solid state mass multiplication of the biocontrol agents Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Agronomy Research. 16 (5), 1921-1930 (2018).
- Price, R. E., Müller, E. J., Brown, H. D., D'Uamba, P., Jone, A. A. The first trial of a Metarhizium anisopliae var. acridum mycoinsecticide for the control of the red locust in a recognised outbreak area. International Journal of Tropical Insect Science. 19 (4), 323-331 (1999).
- Hatting, J. L., Moore, S. D., Malan, A. P. Microbial control of phytophagous invertebrate pests in South Africa. Current status and future prospects. Journal of Invertebrate Pathology. 165, 54-66 (2019).
- Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. Laboratory screening of entomopathogenic fungi and nematodes for pathogenicity against the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae). Biocontrol Science and Technology. , (2021).
- Inglis, G. D., Enkerli, J., Goettel, M. S. Laboratory techniques used for entomopathogenic fungi: Hypocreales. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , Academic Press, Elsevier. Chapter 7 189-253 (2012).
- Mehta, J., et al. Impact of carbon & nitrogen sources on the Trichoderma viride (Biofungicide) and Beauveria bassiana (entomopathogenic fungi). European Journal of Experimental Biology. 2 (6), 2061-2067 (2012).
- Burges, H. D. Formulation of mycoinsecticides. Formulation of Microbial Biopesticides. , Springer. Dordrecht. 131-185 (1998).
