Summary
I funghi entomopatogeni hanno acquisito importanza come agenti di controllo biologico degli insetti nocivi agricoli. In questo studio, la produzione di massa di un numero sufficiente di propaguli infettivi resilienti di isolati sudafricani di Metarhizium robertsii e M. pinghaense per l'applicazione commerciale contro gli insetti nocivi è stata condotta con successo utilizzando prodotti a base di cereali agricoli.
Abstract
I funghi entomopatogeni del complesso di specie Metarhizium anisopliae hanno acquisito importanza come agenti di controllo biologico degli insetti nocivi agricoli. L'aumento della resistenza dei parassiti agli insetticidi chimici, le crescenti preoccupazioni per gli effetti negativi degli insetticidi sulla salute umana e l'inquinamento ambientale da pesticidi hanno portato a una spinta globale per trovare nuove strategie sostenibili per la protezione delle colture e il controllo dei parassiti. In precedenza, sono stati condotti tentativi di coltura di massa di tali specie di funghi entomopatogeni (EPF) come Beauveria bassiana . Tuttavia, sono stati condotti solo tentativi limitati di coltura di massa di Metarhizium robertsii e M. pinghaense per l'uso contro gli insetti nocivi. Questo studio mirava a produrre in serie un numero sufficiente di propaguli infettivi resilienti di isolati sudafricani di M. robertsii e M. pinghaense per applicazioni commerciali. Tre prodotti a base di cereali agricoli, avena in fiocchi, orzo in fiocchi e riso, sono stati utilizzati come substrati di fermentazione solida EPF. Due metodi di inoculazione, sospensioni conidiali e la coltura fungina liquida di blastospore sono stati utilizzati per inoculare i substrati solidi. L'inoculazione con sospensioni conidiali è stata osservata come relativamente meno efficace, poiché sono stati osservati livelli aumentati di contaminazione sui substrati solidi rispetto a quando si utilizza il metodo di inoculazione delle blastospore. L'avena in scaglie non è risultata essere un substrato di crescita adatto sia per M. robertsii che per M. pinghaense, poiché nessun conidi secco è stato raccolto dal substrato. L'orzo in scaglie è stato trovato per favorire la produzione di M. robertsii conidia rispetto a quella di M. pinghaense, e una media di 1,83 g ± 1,47 g di conidia secca di M. robertsii e zero grammi di conidia M. pinghaense è stata raccolta dal substrato. I chicchi di riso sono risultati favorire la produzione di massa conidiale di isolati di M. pinghaense e M. robertsii , con una media di 8,2 g ± 4,38 g e 6 g ± 2 g raccolti dal substrato, rispettivamente.
Introduction
I funghi entomopatogeni (EPF) hanno acquisito importanza come agenti di protezione delle colture nel controllo biologico di importanti insetti nocivi agricoli 1,2. Gli entomopatogeni, che si trovano naturalmente nel suolo, causano epizoozie nelle popolazioni di varie specie di parassiti3. Le specie di EPF sono specifiche dell'ospite e presentano relativamente pochi rischi in termini di attacco alle specie non bersaglio, e non sono tossiche per l'ambiente4. Gli EPF hanno un meccanismo unico per invadere il loro ospite, così come per propagarsi e persistere nel loro ambiente immediato1. Attaccano l'ospite principalmente attraverso spore asessuate che si attaccano e penetrano nella cuticola dell'ospite per invadere e proliferare nell'emocoel ospite. L'ospite alla fine muore a causa dell'esaurimento dei nutrienti dell'emolinfa o a causa della tossiemia causata dai metaboliti tossici rilasciati dal fungo. Dopo la morte, in condizioni ambientali ideali, il fungo emerge sulla superficie esterna (micosi conclamata) del cadavere ospite 5,6.
Le crescenti preoccupazioni per quanto riguarda gli effetti negativi dei residui chimici sulla salute umana, l'inquinamento ambientale e lo sviluppo della resistenza ai parassiti hanno portato alla spinta globale a ridurre gli input di insetticidi a base chimica e a trovare strategie alternative, nuove e sostenibili per la protezione delle colture e il controllo dei parassiti 6,7,8 . Ciò ha fornito l'opportunità di sviluppare insetticidi a base microbica da utilizzare nei programmi di gestione integrata dei parassiti (IPM), che sono strategie ecologicamente più favorevoli rispetto al controllo chimico convenzionale 3,8.
Per sviluppare un agente di controllo microbico di successo per un parassita agricolo, un organismo adatto deve prima essere isolato, caratterizzato, identificato e la sua patogenicità per l'organismo nocivo bersaglio confermato. Tuttavia, è necessario un metodo semplice ed economico per la produzione su larga scala dell'agente microbico per produrre un prodotto valido da utilizzare nei programmi di controllo biologico 9,10,11,12,13. La produzione di massa di quantità sostanziali di entomopatogeni di buona qualità dipende dal ceppo microbico, dall'ambiente, dal parassita bersaglio, dalla formulazione, dal mercato, dalla strategia di applicazione e dal prodotto finale desiderato 14,15,16. L'EPF può essere prodotto in serie utilizzando la fermentazione del substrato liquido per produrre blastospore o il processo di fermentazione del substrato solido per produrre conidiaerei 6,17,18. Tuttavia, il processo di produzione e formulazione di massa di entomopathogens influenza direttamente la virulenza, il costo, la durata di conservazione e l'efficacia sul campo del prodotto finale. Per un uso di successo nella difesa integrata, il processo di produzione degli entomopatogeni deve essere facile da eseguire, richiedere manodopera minima, produrre una concentrazione ad alto rendimento di propaguli virulenti, vitali e persistenti ed essere a basso costo 4,13,14,16.
Comprendere le esigenze nutrizionali degli entomopatogeni è importante per la coltivazione di massa con tutti i metodi dicoltivazione 4,12. I componenti nutrizionali del mezzo di produzione hanno un impatto significativo sugli attributi dei propaguli risultanti, tra cui l'efficacia del biocontrollo, la resa, la tolleranza all'essiccazione e la persistenza 8,19,20,21. L'ottimizzazione delle procedure di produzione è progettata per affrontare tali fattori22. Per l'EPF, i requisiti principali per una buona crescita, sporulazione e produzione di massa di conidi fungini sono l'umidità adeguata, la temperatura di crescita ottimale, il pH, lo scambio di gas di CO2 e O2 e la nutrizione, comprese buone fonti di fosforo, carboidrati, carbonio e azoto18.
Jaronski e Jackson18 descrivono il metodo di fermentazione del substrato solido come il metodo di approssimazione più efficiente e più vicino al processo naturale per la produzione di EPF rispetto al metodo di fermentazione del substrato liquido perché, in condizioni naturali, il conidio fungino è portato su solide strutture erette, come la superficie dei cadaveri di insetti. I prodotti agricoli e i sottoprodotti contenenti amido sono utilizzati principalmente per la produzione di massa di funghi ipocrealeani, poiché i funghi decompongono facilmente l'amido attraverso la secrezione di enzimi idrolitici altamente concentrati dalle loro punte ifali, per penetrare nella sostanza solida e per accedere ai nutrienti presenti nella sostanza 11,17,18,23 . I prodotti a base di cereali forniscono anche i requisiti per una produzione sana di biomassa perché, quando sono idratati e sterilizzati, i substrati possono assorbire ulteriori nutrienti da qualsiasi mezzo liquido 16,18,24.
In precedenza, diversi studi hanno tentato di coltivare in massa specie di EPF come Beauveria bassiana (Bals.) Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas e alcuni dei Metarhizium anisopliae (Metschn.) Il complesso di specie Sorokin si isola su vari substrati 16,23,24. Tali isolati prodotti in serie e sviluppati commercialmente includono Green Muscle® (ceppo IMI 330189), sviluppato da M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner) J.F. Bisch, Rehner & Humber, Metarhizium 69 (ceppo Meta 69 ICIPE69), e Real Metarhizium 69 (L9281), sviluppato da M. anisopliae, e Broadband® (ceppo PPRI 5339) ed Eco-Bb®, sviluppato da B. bassiana25,26 . Tuttavia, sono stati fatti tentativi limitati alla cultura di massa Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner & Humber e Metarhizium pinghaense Chen & Guo. Questi due isolati sono stati selezionati in uno studio precedente come i più efficaci per il controllo della cocciniglia, Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)27. Pertanto, l'attuale studio mirava a formulare e produrre in serie un numero sufficiente di propaguli infettivi resilienti degli isolati locali di M. robertsii e M. pinghaense per l'applicazione commerciale contro gli insetti nocivi. Il metodo di fermentazione del substrato solido è stato utilizzato per produrre in serie i conidi fungini per entrambi gli isolati di EPF. Due metodi di inoculazione EPF, utilizzando sospensioni conidiali e la coltura fungina liquida di blastospore, sono stati utilizzati per inoculare i substrati solidi.
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Protocol
1. Fonte di ceppi fungini
- Utilizzare ceppi fungini isolati sudafricani di M. pinghaense 5 HEID (GenBank Numero di adesione: MT367414/MT895630) e M. robertsii 6EIKEN (MT378171/MT380849), raccolti da meleti nella provincia del Capo Occidentale, in Sudafrica.
- Coltivare colture di ciascun isolato di EPF su 60 g di mezzo agar destrosio Sabouraud, integrato con 1 g di estratto di lievito (SDAY) e 10 μL di streptomicina.
NOTA: Incubare colture di EPF a temperatura controllata di ± 25 °C al buio.
2. Metarhizium pinghaense e M. robertsii inoculazione conidiale in sospensione
- Preparazione dei substrati solidi
- Utilizzare due prodotti agricoli, vale a dire l'avena in fiocchi e l'orzo in fiocchi, come mezzi di crescita per i due isolati EPF e i sacchetti di autoclave (305 mm × 660 mm) come sacchetti di fermentazione.
- Utilizzare un piccolo tubo di scarico in polivinilcloruro (1000 mm × 50 mm) per creare un collo per il sacchetto di fermentazione all'estremità aperta del sacchetto dell'autoclave e utilizzare il nastro adesivo per fissare il tubo al sacchetto.
- Chiudere il tubo con un tappo di cotone idrofilo sterile per consentire un sufficiente scambio di gas durante la fermentazione.
- Pesare i chicchi secchi (200 g) sia dell'avena in fiocchi che dell'orzo in fiocchi e metterli nei sacchetti di fermentazione, e ad ogni sacchetto, aggiungere 100 ml di acqua distillata e mescolare accuratamente il contenuto dei sacchetti.
- Lasciare riposare i grani bagnati per 15-30 minuti per assorbire l'umidità prima dell'autoclave e della sterilizzazione. Preparare sei sacchi per ogni tipo di grano e, per evitare contaminazioni, posizionare i sacchetti in altri sacchetti per autoclave e autoclave i substrati a 121 °C per 55 minuti.
- Preparazione dell'inoculo di sospensione conidiale
- Raccogli conidi fungini di 2-3 settimane da colture fungine di M. pinghaense e M. robertsii raschiando, usando una lama chirurgica sterile.
- Sospendere i conidi fungini raccolti in 20 ml di acqua distillata sterile, integrata con 0,05% Tween 20, e mescolare a vortice le sospensioni conidiali per 2 minuti.
- Preparare 20 ml di sospensioni conidiche, con una concentrazione di 1 × 107 conidi/ml, e inoculare rispettivamente i substrati solidi di avena in fiocchi e orzo in fiocchi.
NOTA: Utilizzare un emocitometro per determinare le concentrazioni conidiali.
- Inoculazione dei substrati solidi
- Aprire ogni sacchetto rimuovendo i tappi per il collo in cotone idrofilo e aggiungere la sospensione conidiale da 20 ml preparata al substrato autoclavato raffreddato.
- Chiudere nuovamente le borse, usando i tappi per il collo, e massaggiare il contenuto della borsa per consentire all'inoculo fungino di mescolarsi uniformemente con il substrato del grano.
- Incubare i sacchi di fermentazione a una temperatura controllata di ± 25 °C e garantire un sufficiente scambio gassoso tra la coltura e l'ambiente.
NOTA: questa procedura deve essere eseguita in un armadio a flusso laminare.
- Fase di fermentazione
- Massaggiare manualmente i substrati di grano nei sacchetti di fermentazione 2 giorni dopo l'inoculazione e l'incubazione, quando si verifica una crescita miceliale visibile e il substrato ha iniziato a essere raggruppato dal fungo in crescita.
NOTA: Questo viene fatto per mescolare i granuli inoculati per consentire la ramificazione miceliale durante le prime fasi iniziali della crescita vegetativa dei funghi. - Utilizzare un mattarello da cucina per manipolare il letto del substrato per evitare l'eterogeneità fisica dei letti del substrato del grano e lo spessore del letto della massa del substrato.
NOTA: Il processo promuove il metabolismo fungino, che ottimizza la produzione di spore fungine e massimizza la superficie, promuovendo la resa conidiale18. - Lasciare che il processo di fermentazione continui per un massimo di 4-5 settimane e controllare i sacchetti di fermentazione ogni 2 giorni per la presenza di qualsiasi crescita eccessiva vegetativa bianca che può svilupparsi durante il processo di fermentazione, che può influire notevolmente sulla resa dei conidi fungini.
NOTA: Terminare immediatamente la fermentazione nei sacchetti di fermentazione contenenti eventuali crescite vegetative bianche e asciugare le colture fungine18.
- Massaggiare manualmente i substrati di grano nei sacchetti di fermentazione 2 giorni dopo l'inoculazione e l'incubazione, quando si verifica una crescita miceliale visibile e il substrato ha iniziato a essere raggruppato dal fungo in crescita.
3. Inoculazione di blastospore
- Produzione e inoculazione di blastospore
- Preparare un terreno di coltura liquido, contenente 1 L di acqua distillata, 30 g di glucosio, 20 g di estratto di lievito, 4 g di fosfato di potassio diabasico (K2HPO4), 15 ml di liquore ripido di mais e 10 μg/mL dell'antibiotico Streptomicina, sia per il M. pinghaense che per il M. robertsii.
- Per prima cosa, riscaldare l'acqua distillata, spegnere prima di raggiungere il punto di ebollizione e aggiungere ciascuno degli ingredienti, ad eccezione della streptomicina, all'acqua calda nella pentola. Portare il mezzo a ebollizione delicata per 3-4 minuti e mescolare costantemente il mezzo per consentire la corretta miscelazione degli ingredienti e impedire l'assestamento di alcuni degli ingredienti sul fondo della pentola.
- Versare un totale di 100 ml del mezzo in nove diversi palloni da 250 ml e posizionare un tappo di cotone idrofilo su ciascun pallone e coprire il batuffolo di cotone con un foglio di alluminio come tappo (Figura 1A).
- Autoclave del mezzo nei palloni per 55 min a 121 °C. Dopo l'autoclave, lasciare raffreddare il mezzo nei palloni e aggiungere 10 mg/mL di streptomicina al mezzo in ciascun matraccio (figura 1B).
- Raccogliere da due a tre anelli batterici di conidi fungini da piastre di coltura fungina di 2-3 settimane per entrambi gli isolati di EPF, M. pinghaense e M. robertsii, e trasferire a ciascun mezzo liquido da 100 ml nei palloni da 250 ml, in condizioni sterili, e sigillare i palloni.
- Incubare i palloni di coltura liquida a ± 25 °C, su uno shaker orbitale a 140 giri/min per 3 giorni, e cessare l'incubazione una volta che le colture mostrano segni di elevata torbidità con la crescita di blastospore fungine (Figura 1C).
- Per rilevare qualsiasi possibile contaminazione batterica dalle colture, prelevare un campione da 100 μL da ciascun pallone di coltura liquida dopo 24 ore durante l'incubazione e piastrare su tre piastre SDA per isolato. Incubare le piastre per 48 ore, ad una temperatura controllata di ± 25 °C.
- Preparazione del substrato solido
- Usa il riso bianco parboiled a grani lunghi come substrato solido per le blastospore di M. pinghaense e M. robertsii (adattato da Jaronski e Jackson18).
- Preparare i sacchetti di fermentazione come descritto sopra, nei passaggi 2.1.1-2.1.3, e per ogni sacchetto, aggiungere 1 kg di riso e 300 ml di acqua distillata sterile.
- Mescolare delicatamente il contenuto dei sacchetti di fermentazione e metterli in sacchetti esterni in autoclave in posizione verticale e in autoclave a 121 °C per 55 min. Dopo l'autoclave, lasciare raffreddare i substrati per ± 45 minuti in condizioni sterili.
- Inoculazione e fermentazione
- Rimuovere la chiusura di ciascuno dei palloni di coltura liquida di M. pinghaense e M. robertsii sotto un flusso laminare e fiammare il bordo di ciascun matraccio per 10 s.
- Versare le colture liquide da 100 ml nei sacchetti di fermentazione rimuovendo i tappi di cotone idrofilo dal collo (Figura 2). Riposizionare i tappi di cotone e coprire la parte superiore del collo della borsa con carta chirurgica fissata con un elastico.
NOTA: Determinare la concentrazione di blastospore per ciascun pallone utilizzando un emocitometro e utilizzare concentrazioni di blastospore di 1 × 107 - 5 × 108 blastospore/mL per innoculare i substrati28. - Ruotare la parte superiore del sacchetto e mescolare il contenuto del sacchetto agitando e manipolando leggermente il substrato mediante massaggio, e incubare i sacchetti a ± 25 °C, appiattindo il substrato nei sacchetti per evitare la formazione di letti spessi18.
- Rompere il substrato nei sacchetti di fermentazione massaggiando il contenuto dei sacchetti, 2-3 giorni dopo l'inoculazione e l'incubazione, quando si era verificata la crescita miceliale visibile e il legame del substrato da parte del fungo (adattato dalla tecnica di Jaronski e Jackson18).
NOTA: Lasciare che la fermentazione continui per 4 settimane.
Figura 1: Terreno di coltura liquido in palloni da 250 mL. (A) Prima dell'autoclave. (B) Dopo autoclave e inoculazione con spore di EPF. (C) Mezzo torbido con blastospore fungine. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Terreno di coltura liquido di blastospore preparato. (A) Metarhizium robertsii e (B) Metarhizium pinghaense prima dell'inoculazione del riso come substrato solido. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
4. Essiccazione di colture fungine
- Asciugare le colture fungine per 10-12 giorni dopo la fermentazione, prima del loro utilizzo nelle prove, trasferendo le colture sporulate in sacchetti di carta marrone da 26-30 kg (30 x 43 x 15250 cm3).
- Per migliorare la resistenza alla trazione dei sacchetti di carta, tagliare orizzontalmente un terzo della parte superiore di ciascun sacchetto e allineare il fondo del sacchetto (Figura 3A, B).
Figura 3: Preparazione dei sacchetti di carta, procedura di essiccazione delle colture e imballaggio. (A,B) La preparazione dei sacchetti di carta marrone. La procedura di essiccazione delle colture di specie Metarhizium coltivate su riso parboiled (C,E) e (D,F) orzo in fiocchi. (G) Sacchetti di carta chiusi con graffette per creare una struttura triangolare della tenda. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Sbriciolare delicatamente il substrato in ogni sacchetto di fermentazione, tagliare l'angolo di ciascun sacchetto e trasferire l'intera coltura ai sacchetti di carta attraverso lo spazio lasciato dall'angolo di taglio (Figura 3C-F). Per evitare l'eccessiva fuoriuscita di spore fungine nell'aria, eseguire questo processo lentamente.
NOTA: Condurre questo processo in condizioni sterili, utilizzando il flusso laminare, per evitare la contaminazione. - Etichettare ogni sacchetto di carta e piegare due volte l'estremità superiore di ogni sacchetto e chiudere con graffette per creare una struttura triangolare a tenda, e posizionare i sacchetti su stendibiancheria per consentire un'asciugatura corretta, uniforme, a una temperatura controllata di ± 25 °C e bassa umidità del 30-40%.
- Girare i sacchetti ogni giorno per consentire anche l'essiccazione delle colture e per evitare qualsiasi ricrescita vegetativa che potrebbe avvenire, che ridurrebbe la resa delle spore fungine raccoglibili.
- Pesare ogni sacchetto di essiccazione dopo ogni 2 giorni durante il processo di essiccazione e continuare il processo di essiccazione per ogni sacchetto fino a quando non si osservano cambiamenti minimi o nulli nella massa dei sacchetti tra i giorni successivi.
5. Raccolta di conidi fungini
- Raccogliere meccanicamente i conidi fungini dalle colture utilizzando tre setacci nidificati, un setaccio di prova (ETS) mesh n. 35 (con apertura di 500 μm), nidificato su un setaccio di prova (con apertura di 212 μm), annidato su rete ETS n. 100 (con apertura di 150 μm), montato su una padella di raccolta.
- Caricare lentamente il campione di coltura a secco sulla rete ETS n. 35 e posizionare un coperchio sul setaccio per impedire il rilascio di conidi fungini nell'aria.
- Aggiungere 10-12 biglie di vetro ai setacci per favorire il passaggio dei conidi fungini attraverso gli schermi a rete ed evitare la ritenzione dei conidi nel setaccio, che può comportare un ridotto recupero delle spore.
- Nastro adesivo e sigillare i giunti del setaccio utilizzando nastro adesivo per impedire la fuoriuscita di polvere conidiale.
- Posizionare i setacci su uno shaker vibrante, dotato di un cuscinetto appiccicoso, per fissare la vaschetta di raccolta e i setacci, per 20-25 minuti, con un movimento di 560-640 vibrazioni al minuto (Figura 4).
NOTA: Tecnica adattata da Jaronski e Jackson18.
Figura 4: Raccolta di spore fungine da colture essiccate di Metarhizium robertsii su riso e orzo in fiocchi. (A) 10-12 biglie di vetro aggiunte ai setacci per favorire il passaggio dei conidi fungini attraverso i vagli a rete. M. robertsii conidia raccolta da colture su (B) riso e (C) in fiocchi a malapena. (D) Setacci su uno shaker vibrante. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Rimuovere i setacci di prova dalla vaschetta di raccolta, raccogliere i conidi e conservare i conidi raccolti in sacchetti ermetici e impermeabili con chiusura a cerniera per la conservazione a lungo termine (3-6 mesi).
6. Quantificazione dei conidi fungini prodotti
- Misurare e registrare la massa di ciascun substrato di grano prima della raccolta dei conidi fungini da ciascun substrato.
- Misurare il peso complessivo dei conidi raccolti sottraendo la massa delle spore raccolte dalla massa del substrato solido.
NOTA: La resa totale dei conidi coinvolge non solo i conidi raccolti ma anche i conidi fungini lasciati sul substrato solido. - Pesare il substrato e rimuovere 10 g dal substrato pesato. Sospendere i 10 g del substrato in 0,05% Tween 20 e diluire in 10 ml di acqua distillata sterile.
- Mescolare la sospensione per 2 minuti e utilizzare un emocitometro per eseguire il conteggio delle spore per determinare il numero di conidi lavati dal substrato.
- Condurre ulteriori diluizioni trasferendo 1000 μL della sospensione conidiale lavata da 10 mL a 9 mL di acqua distillata sterile per costituire 10 mL di sospensioni di diluizione.
- Vortex-mescolare le sospensioni conidiali per 2 min e determinare le concentrazioni conidiali.
NOTA: Seguire la procedura e la formula descritte da Inglis, Enkerli e Goettel30 per determinare la concentrazione conidiale delle sospensioni. - Raccogliere e sospendere un totale di 0,1 g della polvere conidiale raccolta da ciascuna coltura in 10 ml di acqua distillata sterile integrata con 0,05% Tween 20 e mescolare a vortice la sospensione conidiale per 2 minuti e determinare la concentrazione conidiale utilizzando un emocitometro.
- Condurre ulteriori diluizioni trasferendo 1000 μL della sospensione conidiale da 10 mL a 9 mL di acqua distillata sterile per comporre le diluizioni di sospensione da 10 mL.
- Vortex-mescolare le sospensioni conidiali per 2 min, calcolare le concentrazioni conidiali e determinare il numero di conidi per grammo.
- Moltiplicare il numero di conidi per grammo di polvere raccolta per la massa iniziale della polvere conidiale raccolta. Moltiplicare il numero di conidi lavati dal substrato per il peso totale del substrato esaurito, essendo il substrato da cui sono stati raccolti i conidi.
- Sommare i due valori indicati insieme e dividere per il peso secco iniziale del substrato per calcolare il numero di conidi per kg o g del substrato18.
NOTA: I calcoli sono stati fatti principalmente per il substrato di riso. Il test di germinazione o vitalità conidiale è stato condotto sia per gli isolati di M. pinghaense che per quelli di M. robertsii per determinare la vitalità dei conidi prodotti.
7. Analisi dei dati
- Utilizzare un programma software appropriato per computer per condurre l'analisi statistica dei risultati ottenuti.
NOTA: L'analisi statistica dei dati è stata effettuata utilizzando STATISTICA versione 13.5.0.17.
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Representative Results
Un declino della massa di contenuto delle colture sul riso sia per il M. pinghaense che per il M. robertsii è stato osservato nel tempo durante la fase di essiccazione delle colture fungine, con nessun o poco cambiamento osservato nella massa una volta che le colture erano secche (Figura 5). La polvere di conidi fungini secchi raccolti sia del M. pinghaense che del M. robertsii è mostrata nella Figura 6.
Figura 5: La variazione della massa del contenuto di sacchi delle colture metarhizium robertsii e M. pinghaense sul riso (intervallo di confidenza al 95%) nell'arco di 10 giorni (ANOVA; F5,35 = 2,21; p = 0,08). Lettere diverse sopra le barre indicano la differenza significativa (p < 0,05) ottenuta nella massa del contenuto del sacchetto nel corso dei giorni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Conidi raccolti. (A) Conidi raccolti nella padella di raccolta. (B) Metarhizium robertsii. (C) M. pinghaense. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nessuna differenza significativa è stata osservata nella polvere conidiale media che è stata raccolta da ciascun tipo di grano sia per M. pinghaense che per M. robertsii. I conidi secchi raccolti per entrambi avevano una media di vitalità conidiale del >90% sia per M. pinghaense che per M. robertsii. Sul substrato di riso, M. pinghaense ha prodotto una media di 8,2 g ± 4,38 g di polvere conidiale, che ha leggermente superato la quantità ottenuta per M. robertsii (6 g ± 2 g). Una media di 1,83 g ± 1,47 g di conidi secchi di M. robertsii sono stati raccolti dal substrato d'orzo in fiocchi, mentre zero M. pinghaense è stato raccolto dal substrato. Nessun conidi fungino secco è stato raccolto dal substrato di avena in scaglie per M. pinghaense o M. robertsii (Figura 7).
Figura 7: Quantità media di polvere di conidi. La quantità media di conidi in polvere di Metarhizium pinghaense e M. robertsii, misurata in grammi (intervallo di confidenza al 95%) raccolta dai tre substrati solidi: riso parboiled, orzo in fiocchi e avena in fiocchi (ANOVA: F2,27 = 2,82; p = 0,08). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Una differenza significativa nella conidia media stimata per grammo, raccolta dai chicchi di riso, è stata osservata tra M. pinghaense (3,51 x 107/g ± 0,43 x 107/g) e M. robertsii (4,31 x 107/g ± 0,38 x 107/g). M. robertsii aveva un numero medio di conidi per grammo leggermente superiore a quello di M. pinghaense (Figura 8).
Figura 8: Conidi medi per grammo. La media stimata dei conidi per grammo per Metarhizium pinghaense e M. robertsii (intervallo di confidenza al 95%) dalle colture di riso (ANOVA: F 1,7 = 8,47; p = 0,02). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Non è stata osservata alcuna differenza significativa nel numero stimato di conidi presenti sul substrato di riso esaurito tra M. pinghaense (5,02 x 107/mL ± 1,47 x 107/mL) e M. robertsii (3,70 x 107/mL ± 0,91 x 107/mL) (Figura 9). Tuttavia, M. pinghaense aveva un numero leggermente superiore di conidi presenti sul substrato del riso rispetto a M. robertsii.
Figura 9: Conidi fungini medi. I conidi fungini medi stimati di Metarhizium pinghaense e M robertsii (intervallo di confidenza al 95%) dalle colture (F1,7 = 2,45; p = 0,16) presenti sui substrati di coltura del riso esauriti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Non è stata osservata alcuna differenza significativa nella resa complessiva stimata dei conidi tra M. pinghaense (5,09 x 107/g ± 1,35 x 107/g) e M. robertsii (3,55 x 107/g ± 0,85 x 107/g) ottenuti dalle colture di substrato di riso. Tuttavia, M. pinghaense ha prodotto una resa conidiale leggermente superiore rispetto a M. robertsii, che ha prodotto una resa conidiale inferiore (Figura 10).
Figura 10: Resa totale dei conidi. La resa totale stimata di conidi di Metarhizium pinghaense e M. robertsii (intervallo di confidenza al 95%) dalle colture su riso (F1,7 = 3,91; p = 0,09). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il successo dell'integrazione di agenti microbici per il controllo biologico di importanti insetti nocivi agricoli in un agroecosistema dipende sia dal successo che dalla facilità di produzione di massa degli entomopatogeni come primo passo in condizioni di laboratorio. La produzione di massa di EPF è importante per l'applicazione su larga scala e la disponibilità di prodotti EPF per programmi IPM utilizzando il controllo biologico 9,10,11,12,13. Il successo della produzione di massa di diversi isolati di EPF è influenzato dai componenti nutrizionali del substrato o del mezzo di produzione, che influiscono in modo significativo sugli attributi dei conidi risultanti, tra cui la loro efficacia, tolleranza all'essiccazione, persistenza del campo e resa conidiale 8,19,20,21 . Pertanto, lo sviluppo della conoscenza delle esigenze nutrizionali degli entomopatogeni prodotti in serie durante il processo di coltivazione e fermentazione è importante29.
Nel presente studio, la produzione di massa di M. robertsii e M. pinghaense è stata condotta utilizzando tre diversi prodotti agricoli come substrati di fermentazione: riso parboiled, orzo in fiocchi e avena in fiocchi. I tre diversi substrati di grano sono stati osservati per influenzare significativamente la resa conidiale degli isolati fungini. Il riso parboiled era molto favorevole alla produzione di massa di entrambi gli isolati, mentre i chicchi d'orzo in fiocchi favorivano la sola produzione di M. robertsii . Le osservazioni sono state fatte sulla base della resa di polvere di conidi fungini secchi dopo la fermentazione. Poco o no, i conidi sono stati raccolti dall'avena in fiocchi dopo la fermentazione. Si è scoperto che l'avena in fiocchi tratteneva livelli più elevati di umidità nei sacchetti di fermentazione durante il processo di fermentazione, il che potrebbe aver portato alle scarse prestazioni osservate del grano come substrato per la produzione di M. pinghaense e M. robertsii. Il substrato di avena in scaglie era soggetto a una crescita eccessiva miceliale vegetativa bianca degli isolati fungini in alcuni casi, che ha notevolmente influenzato la resa conidiale, poiché la sporulazione non si è verificata nei sacchetti di fermentazione contenenti la crescita eccessiva. I sacchetti di fermentazione con il substrato di avena in fiocchi sono stati anche osservati per avere alti livelli di contaminazione batterica rispetto ai sacchetti di fermentazione contenenti substrati di orzo in fiocchi.
Sono stati osservati alti livelli di funghi saprofiti o contaminazione da lieviti per quanto riguarda la produzione di massa di M. pinghaense utilizzando l'orzo in fiocchi come substrato. La contaminazione fungina saprofita è stata osservata in una fase successiva del processo di fermentazione attraverso la crescita e la conidiogenesi di un fungo diverso da quello utilizzato per inoculare il substrato. Diagnosticare la contaminazione del substrato in una fase iniziale della fermentazione, prima della sporulazione conidiale, era difficile. Si ritiene che la contaminazione batterica e di lievito durante il processo di fermentazione si manifesti con macchie bagnate nel substrato e sia l'avena in fiocchi che i chicchi d'orzo tendono ad assorbire e trattenere l'umidità più a lungo dei chicchi di riso. Questa era una limitazione all'uso di questi due substrati come substrati di fermentazione per la produzione di massa dei due isolati di Metarhizium .
Le osservazioni fatte durante il presente studio hanno dimostrato che il tipo di metodo di inoculazione utilizzato per inoculare ciascun substrato di grano ha influenzato la produzione conidiale. Il metodo di inoculazione in sospensione conidiale è risultato relativamente meno efficace, poiché l'avena in scagliata inoculata e l'orzo in fiocco hanno mostrato un aumento del livello di contaminazione rispetto a quando il metodo di inoculazione di blastospore in coltura liquida è stato utilizzato sui chicchi di riso. A differenza del metodo di inoculazione delle blastospore in coltura liquida, il metodo della sospensione conidiale non consente il rilevamento di possibili contaminanti nelle sospensioni prima dell'inoculazione dei substrati, con conseguenti alti livelli di contaminazione osservati nei sacchi di fermentazione. Jaronski e Jackson18 hanno descritto diversi fattori che potrebbero portare alla possibile contaminazione dei substrati utilizzati, come la mancanza di una completa sterilizzazione del substrato, l'inoculazione non sterile e la manipolazione impropria del substrato di fermentazione nei sacchetti. La contaminazione osservata nei sacchetti di fermentazione contenenti orzo in fiocchi e avena in fiocchi potrebbe anche essere il risultato di una mancanza di completa sterilizzazione del substrato, che potrebbe essersi verificata durante il processo di autoclave. Jaronski e Jackson18 hanno anche descritto l'uso di sospensioni conidiali come inoculanti come svantaggioso, in quanto si traduce in maggiori possibilità di contaminazione durante la raccolta conidiale da un mezzo agar.
Sul campo, durante l'infezione di ospiti adatti, il fungo accumula prima biomassa nell'emocoel degli insetti attraverso la proliferazione, prima della sua comparsa e sporulazione sulla superficie solida esterna degli insetti30. Tale processo è stato imitato quando si utilizza il metodo di fermentazione liquido-blastospora. Di conseguenza, il brodo rappresentava l'emocoel dell'insetto, l'inoculazione del brodo con conidi fungini rappresentava il contatto iniziale e l'infezione dell'insetto e la formazione di blastospore nel brodo rappresentava la proliferazione del processo di blastospore che si verifica all'interno dell'emocele dell'insetto infetto. L'inoculazione finale dei chicchi di riso e la sporulazione del fungo sui chicchi nel tempo hanno rappresentato ciò che accade sulla cuticola dell'insetto una volta che il fungo inizia ad emergere dall'interno del cadavere dell'insetto. Questo può forse spiegare perché il metodo di fermentazione della blastospora liquida ha funzionato meglio del metodo di inoculazione della sospensione conidiale.
Jaronski e Jackson18 hanno descritto l'avena in fiocchi e i chicchi d'orzo in fiocchi come i cereali agricoli preferiti per la coltura di massa delle specie di Metarhizium , rispetto ai chicchi di riso, poiché i due tipi di cereali sono stati trovati per mantenere il loro contenuto di umidità durante il processo di fermentazione. Tuttavia, l'attuale studio contraddice le osservazioni e le conclusioni dei ricercatori di cui sopra, poiché sia l'avena in fiocchi che l'orzo in fiocchi non sono risultati buoni substrati di fermentazione solida per M. pinghaense o M. robertsii. Il riso è risultato essere un buon substrato di grano per entrambi gli isolati, in quanto non si è decomposto in piccole particelle che potrebbero mescolarsi con il prodotto finale, come suggerito in studi precedenti.
Il presente studio ha dimostrato che gli isolati della specie Metarhizium possono essere coltivati con successo e prodotti in serie utilizzando chicchi di riso e che i diversi grani tendono a influenzare la sporulazione conidiale e la resa in modo diverso. Ciò potrebbe essere dovuto al fatto che diversi grani differiscono in termini di tale composizione nutrizionale, ad esempio, rapporti carbonio:azoto e concentrazione di carbonio. La concentrazione di carbonio e il rapporto carbonio:azoto di un mezzo di crescita sono noti per influenzare la resa dei conidi, così come la sua qualità in termini di vitalità e virulenza22. Le tecniche di inoculazione utilizzate per inoculare i substrati hanno anche dimostrato di influenzare il grado di successo raggiunto nella produzione di massa di isolati di EPF su specifici substrati di cereali agricoli. Pertanto, la tecnica di fermentazione delle blastospore liquide descritta nel presente studio è raccomandata come il miglior metodo di inoculazione per substrati di cereali agricoli per la produzione di massa di isolati di M. pinghaense e M. robertsii . L'utilizzo di tale metodo consente la possibile rilevazione di contaminazioni prima dell'uso degli inoculanti, che possono ostacolare la produzione di massa dell'isolato di EPF desiderato rispetto all'uso della tecnica di inoculazione della sospensione conidiale. Si raccomanda inoltre di utilizzare i chicchi di riso come substrati solidi per la produzione di massa di conidi sia di M. pinghaense che di M. robertsii, piuttosto che di orzo in fiocchi e avena in fiocchi. La tecnica descritta è importante per la futura produzione di massa e l'applicazione commerciale dei conidi in condizioni di campo contro importanti insetti nocivi negli agroecosistemi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Hort Pome, Hort Stone e il programma Technology and Human Resources for Industry (THRIP: TP14062571871) per aver finanziato il progetto.
ORCID:
Letodi L. Mathulwe http://orcid.org/0000-0002-5118-3578
Antoinette P. Malan http://orcid.org/0000-0002-9257-0312
Nomakholwa F. Stokwe http://orcid.org/0000-0003-2869-5652
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Tween 20 | Lasec | Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water | |
| 20 mL McCartney bottles | Lasec | Used to make conidial suspensions | |
| Aluminium foil | Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask | ||
| Autoclave | Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process | ||
| Autoclave bags | Lasec | Fermentation bags or solid substrate containers | |
| Autoclave tape | Lasec | To secure PVC pipes on the fermentation bags | |
| Brown Kraft paper bags | Used to dry conidia cultures on agricultural grains | ||
| Bunsen burnner | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks) | |
| Clear edge test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
| Corn steep liquor | SIGMA | 66071-94-1 | Ingredient of the blastospore liquid medium |
| Cotton Wool | Lasec | Used as plug of the neck for fermentation bags | |
| Duran laboratory bottles | Neolab | Used to autoclave SDA medium and distilled water | |
| Electrical tape | Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust | ||
| ENDECOTTS test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
| Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask | Lasec | Carrier of the blastospore liquid medium | |
| Ethanol (99%) | Lasec | Used to sterilize surgical blades and inoculating loops | |
| Flaked barley | Health Connection Wholefoods | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Flaked oats | Tiger brands | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Glucose | Merck | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
| Growth Chamber/ incubators | For growing fungal conidia culture | ||
| Haemocytometer | Used to determine conidial concentrations | ||
| Inoculating loops | Lasec | For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth | |
| Kitchen rolling pin | Used to manipulate the solid grain substrate bed | ||
| Laminar flow Cabinet | ESCO Laminar Flow Cabinet | Provide as sterile environment during substrate inoculation | |
| Metarhizium pinghaense conidia | Stellenbosch University | 5HEID | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense |
| Metarhizium robertsii conidia | Stellenbosch University | 6EIKEN | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii |
| Microscope | ZEIZZ (Scope. A1) | Used to determine conidial concentrations and conidial viability | |
| Orbital shaker | IncoShake- LABOTEC | Used for the blastospore production process | |
| Parboiled rice | Spekko | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Penicillin-Streptomycin | SIGMA | Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination | |
| Petri-dishes | Lasec | Containers for the SDA medium | |
| Pipettes and pipette tips | Labnet (BioPette PLUS) | Used to measure liquids ingredients | |
| Polyvinylchloride Marley waste pipe | Used to create a neck for the fermentation bag | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
| Rubber band | Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks | ||
| Sabaroud dextrose agar (SDA) | NEOGEN Culture Media | Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii | |
| Sterile distilled water | To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions | ||
| Sticky pad | Used to secure the seives on the vibratory shaker | ||
| Surgical blade | Lasec | Used to scrape off spores from fungal cultures | |
| Surgical paper | Lasec | Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag | |
| Vibratory shaker | Used to shake conidia off the agricultural grain substrates | ||
| Vortex mixer | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles | |
| Yeast extract | Biolab | Added to the SDA medium to improve spore germination and growth | |
| Zipper-lock bags | GLAD | Used to to store harvested fungal conidia |
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