Summary
اكتسبت الفطريات المسببة للأمراض الحشرية أهمية باعتبارها عوامل المكافحة البيولوجية للآفات الحشرية الزراعية. في هذه الدراسة ، تم بنجاح الإنتاج الضخم لعدد كاف من البروباغولات المعدية المرنة لعزلات جنوب أفريقيا لكل من Metarhizium robertsii و M. pinghaense للتطبيق التجاري ضد الآفات الحشرية باستخدام منتجات الحبوب الزراعية.
Abstract
اكتسبت الفطريات المسببة للأمراض الحشرية في مجمع أنواع Metarhizium anisopliae أهمية باعتبارها عوامل المكافحة البيولوجية للآفات الحشرية الزراعية. وقد أدت الزيادة في مقاومة الآفات للمبيدات الحشرية الكيميائية، والمخاوف المتزايدة بشأن الآثار السلبية للمبيدات الحشرية على صحة الإنسان، والتلوث البيئي الناجم عن مبيدات الآفات إلى حملة عالمية لإيجاد استراتيجيات مستدامة جديدة لحماية المحاصيل ومكافحة الآفات. في السابق ، أجريت محاولات لزراعة أنواع الفطريات المسببة للأمراض الحشرية (EPF) مثل Beauveria bassiana. ومع ذلك ، لم تجر سوى محاولات محدودة للاستزراع الجماعي Metarhizium robertsii و M. pinghaense لاستخدامها ضد الآفات الحشرية. هدفت هذه الدراسة إلى إنتاج عدد كاف من البروباغولات المعدية المرنة لعزلات جنوب أفريقيا من M. robertsii و M. pinghaense للتطبيق التجاري. تم استخدام ثلاثة منتجات من الحبوب الزراعية ، الشوفان المقشر ، والشعير المقشر ، والأرز ، كركائز تخمير صلبة EPF. تم استخدام طريقتين للتلقيح ، المعلقات المخروطية وثقافة الفطريات السائلة للأبواسير الأريمية لتلقيح الركائز الصلبة. ولوحظ أن التلقيح باستخدام المعلقات المخروطية أقل فعالية نسبيا، حيث لوحظت مستويات متزايدة من التلوث على الركائز الصلبة مقارنة باستخدامها عند استخدام طريقة تلقيح الأروميات. تم العثور على الشوفان المقشر ليس ركيزة نمو مناسبة لكل من M. robertsii و M. pinghaense ، حيث لم يتم حصاد أي كونيديا جافة من الركيزة. وجد أن الشعير المقشر يفضل إنتاج M. robertsii conidia على إنتاج M. pinghaense ، وتم حصاد ما معدله 1.83 جم ± 1.47 جم من M. robertsii conidia الجاف وصفر جرام من M. pinghaense conidia من الركيزة. وجد أن حبوب الأرز تفضل الإنتاج الضخم المخروطي لكل من عزلات M. pinghaense و M. robertsii ، بمتوسط 8.2 جم ± 4.38 جم و 6 جم ± 2 جم يتم حصادها من الركيزة ، على التوالي.
Introduction
اكتسبت الفطريات المسببة للأمراض الحشرية (EPF) أهمية كعوامل لحماية المحاصيل في المكافحة البيولوجية للآفات الحشرية الزراعية الهامة 1,2. مسببات الأمراض الحشرية ، التي تحدث بشكل طبيعي في التربة ، تسبب الأوبئة الحيوانية في مجموعات أنواع الآفات المختلفة3. أنواع EPF خاصة بالمضيف وتشكل مخاطر قليلة نسبيا من حيث مهاجمة الأنواع غير المستهدفة ، وهي غير سامة للبيئة4. لدى EPF آلية فريدة لغزو مضيفها ، وكذلك للانتشار والاستمرار في بيئتها المباشرة1. يهاجمون المضيف بشكل رئيسي من خلال الجراثيم اللاجنسية التي تلتصق ببشرة المضيف وتخترقها لغزو وتكاثر في الهيموكول المضيف. يموت المضيف في النهاية بسبب استنفاد العناصر الغذائية الليمفاوية أو نتيجة لتوكسيوم الدم الناجم عن المستقلبات السامة التي تطلقها الفطريات. بعد الموت ، في ظل ظروف بيئية مثالية ، تظهر الفطريات على السطح الخارجي (الفطار العلني) للجثة المضيفة 5,6.
أدت المخاوف المتزايدة بشأن الآثار السلبية للمخلفات الكيميائية على صحة الإنسان والتلوث البيئي وتطوير مقاومة الآفات إلى الحملة العالمية للحد من مدخلات المبيدات الحشرية القائمة على المواد الكيميائية وإيجاد استراتيجيات بديلة وجديدة ومستدامة لحماية المحاصيل ومكافحة الآفات 6,7,8 . وقد وفر ذلك فرصا لتطوير مبيدات حشرية قائمة على الميكروبات لاستخدامها في برامج الإدارة المتكاملة للآفات (IPM) ، والتي تعد استراتيجيات أكثر ملاءمة من الناحية البيئية من المكافحة الكيميائية التقليدية 3,8.
لتطوير عامل مكافحة ميكروبي ناجح لآفة زراعية ، يجب أولا عزل كائن حي مناسب وتوصيفه وتحديده وتأكيد إمراضه للآفة المستهدفة. ومع ذلك، يلزم وجود طريقة سهلة وفعالة من حيث التكلفة لإنتاج العامل الميكروبي على نطاق واسع لإنتاج منتج قابل للتطبيق للاستخدام في برامج المكافحة البيولوجية9،10،11،12،13. يعتمد الإنتاج الضخم لكميات كبيرة من مسببات الأمراض الحشرية ذات النوعية الجيدة على السلالة الميكروبية والبيئة والآفة المستهدفة والتركيبة والسوق واستراتيجية التطبيق والمنتج النهائي المطلوب 14،15،16. يمكن إنتاج EPF بكميات كبيرة باستخدام تخمير الركيزة السائلة لإنتاج الأروميات أو عملية تخمير الركيزة الصلبة لإنتاج كونيديا هوائية6،17،18. ومع ذلك ، فإن عملية الإنتاج الضخم وصياغة مسببات الأمراض الحشرية تؤثر بشكل مباشر على الضراوة والتكلفة والعمر الافتراضي والفعالية الميدانية للمنتج النهائي. من أجل الاستخدام الناجح في الإدارة المتكاملة للآفات ، يجب أن تكون عملية إنتاج مسببات الأمراض الحشرية سهلة التشغيل ، وتتطلب الحد الأدنى من العمالة ، وتنتج تركيزا عالي الغلة من البروباغولات الخبيثة والقابلة للحياة والمستمرة ، وأن تكون منخفضة التكلفة4،13،14،16.
فهم المتطلبات الغذائية لمسببات الأمراض الحشرية مهم للزراعة الجماعية مع جميع طرق الزراعة 4,12. المكونات الغذائية لوسط الإنتاج لها تأثير كبير على سمات البروباغولات الناتجة ، بما في ذلك فعالية المكافحة الحيوية ، والعائد ، وتحمل الجفاف ، والثبات8،19،20،21. تم تصميم تحسين إجراءات الإنتاج لمعالجة هذه العوامل22. بالنسبة ل EPF ، فإن المتطلبات الرئيسية للنمو الجيد ، والجراثيم ، والإنتاج الضخم للكونيديا الفطرية هي الرطوبة الكافية ، ودرجة حرارة النمو المثلى ، ودرجة الحموضة ، وتبادل الغازات من CO 2 و O2 ، والتغذية، بما في ذلك مصادر الفوسفور والكربوهيدرات والكربون والنيتروجين الجيدة18.
يصف جارونسكي وجاكسون18 طريقة تخمير الركيزة الصلبة بأنها الطريقة الأكثر كفاءة والأقرب للتقريب إلى العملية الطبيعية لإنتاج EPF بالنسبة لطريقة تخمير الركيزة السائلة لأنه ، في ظل الظروف الطبيعية ، يتم حمل الكونيديوم الفطري على هياكل منتصبة صلبة ، مثل سطح جثث الحشرات. تستخدم المنتجات الزراعية والمنتجات الثانوية التي تحتوي على النشا في الغالب للإنتاج الضخم للفطريات hypocrealean ، حيث أن الفطريات تتحلل بسهولة النشا من خلال إفراز إنزيمات هيدروليتية عالية التركيز من أطرافها الواصلة ، لاختراق المادة الصلبة ، والوصول إلى العناصر الغذائية الموجودة في المادة 11،17،18،23 . توفر منتجات الحبوب أيضا متطلبات إنتاج الكتلة الحيوية الصحية لأنه عندما يتم ترطيبها وتعقيمها ، يمكن للركائز امتصاص المزيد من العناصر الغذائية من أي وسط سائل16،18،24.
في السابق ، حاولت العديد من الدراسات زراعة أنواع EPF مثل Beauveria bassiana (Bals). Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas وبعض من Metarhizium anisopliae (Metschn.) أنواع السوروكين المعقدة تعزل على ركائز مختلفة16،23،24. وتشمل هذه العزلات المنتجة بكميات كبيرة والمطورة تجاريا العضلات® الخضراء (سلالة IMI 330189) ، التي تم تطويرها من M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner) J.F. Bisch و Rehner & Humber و Metarhizium 69 (سلالة Meta 69 ICIPE69) ، و Real Metarhizium 69 (L9281) ، التي تم تطويرها من M. anisopliae ، و Broadband® (سلالة PPRI 5339) و Eco-Bb® ، التي تم تطويرها من B. bassiana25,26 . ومع ذلك ، فقد بذلت محاولات محدودة للثقافة الجماعية Metarhizium robertsii J.F. Bisch. و S.A. Rehner & Humber و Metarhizium pinghaense Chen & Guo. تم اختيار هذين العزلين في دراسة سابقة كالأكثر فعالية للسيطرة على البق الدقيقي ، Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)27. ولذلك، تهدف الدراسة الحالية إلى صياغة وإنتاج عدد كاف من البروباغولات المعدية المرنة للعزلات المحلية ل M. robertsii و M. pinghaense للتطبيق التجاري ضد الآفات الحشرية. تم استخدام طريقة تخمير الركيزة الصلبة لإنتاج الكونيديا الفطرية بكميات كبيرة لكل من عزلات EPF. تم استخدام طريقتين لتلقيح EPF ، باستخدام المعلقات المخروطية والثقافة الفطرية السائلة للأبواسير الأريمية ، لتلقيح الركائز الصلبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. مصدر السلالات الفطرية
- استخدم سلالات فطرية معزولة من جنوب أفريقيا من كل من M. pinghaense 5 HEID (رقم انضمام بنك الجينات: MT367414/MT895630) و M. robertsii 6EIKEN (MT378171/MT380849) ، التي تم جمعها من بساتين التفاح في مقاطعة كيب الغربية ، جنوب أفريقيا.
- تنمو الثقافات من كل EPF معزولة على 60 غرام من سابورو سكر العنب أجار المتوسطة، مع استكمال 1 غرام من مستخلص الخميرة (SDAY) و 10 ميكرولتر من الستربتومايسين.
ملاحظة: احتضان مزارع EPF عند درجة حرارة يتم التحكم فيها ± 25 درجة مئوية في الظلام.
2. Metarhizium pinghaense و M. robertsii تلقيح التعليق المخروطي
- إعداد الركائز الصلبة
- استخدم منتجين زراعيين ، وهما الشوفان المقشر والشعير المقشر ، كوسيطين للنمو لعزلتي EPF وأكياس الأوتوكلاف (305 مم × 660 مم) كأكياس تخمير.
- استخدم أنبوب نفايات صغير من البولي فينيل كلوريد (1000 مم × 50 مم) لإنشاء عنق لكيس التخمير في الطرف المفتوح من كيس الأوتوكلاف واستخدم شريط الأوتوكلاف لتأمين الأنبوب إلى الحقيبة.
- أغلق الأنبوب بقابس من الصوف القطني المعقم للسماح بتبادل الغاز بشكل كاف أثناء التخمير.
- وزن الحبوب الجافة (200 غرام) من كل من الشوفان المقشر والشعير المقشر ووضعها في أكياس التخمير ، وإلى كل كيس ، أضف 100 مل من الماء المقطر واخلط محتويات الأكياس جيدا.
- اترك الحبوب الرطبة لترتاح لمدة 15-30 دقيقة لامتصاص الرطوبة قبل التعقيم والتعقيم. قم بإعداد ستة أكياس لكل نوع من أنواع الحبوب ، ولمنع التلوث ، ضع الأكياس في أكياس الأوتوكلاف الأخرى ، وأوتوكلاف الركائز عند 121 درجة مئوية لمدة 55 دقيقة.
- تحضير التلقيح المعلق المخروطي
- حصاد كونيديا فطرية عمرها 2-3 أسابيع من الثقافات الفطرية لكل من M. pinghaense و M . robertsii عن طريق الكشط ، باستخدام شفرة جراحية معقمة.
- الكونيديا الفطرية التي تم جمعها في 20 مل من الماء المقطر المعقم ، مع استكمالها بنسبة 0.05٪ Tween 20 ، وخلط الدوامة مع المعلقات المخروطية لمدة دقيقتين.
- تحضير 20 مل من المعلقات المخروطية ، بتركيز 1 × 107 conidia / mL ، وتلقيح الركائز الصلبة الشوفان المقشر والشعير المقشر ، على التوالي.
ملاحظة: استخدم مقياس الدم لتحديد التركيزات المخروطية.
- تلقيح الركائز الصلبة
- افتح كل كيس عن طريق إزالة سدادات الرقبة المصنوعة من الصوف القطني ، وأضف التعليق المخروطي المحضر سعة 20 مل إلى الركيزة المعقمة المبردة.
- أغلق الأكياس مرة أخرى ، باستخدام سدادات الرقبة ، وقم بتدليك محتويات الكيس للسماح للتلقيح الفطري بأن يختلط بالتساوي مع ركيزة الحبوب.
- احتضان أكياس التخمير عند درجة حرارة يتم التحكم فيها ± 25 درجة مئوية ، وضمان التبادل الغازي الكافي بين الثقافة والبيئة.
ملاحظة: يجب إجراء هذا الإجراء تحت خزانة تدفق صفائحية.
- مرحلة التخمير
- تدليك ركائز الحبوب يدويا في أكياس التخمير بعد 2 أيام من التلقيح والحضانة ، عندما يحدث نمو فطري مرئي وبدأت الركيزة في التكتل بواسطة الفطريات المتنامية.
ملاحظة: يتم ذلك لخلط الحبيبات الملقحة للسماح بحدوث التفرع الفطري خلال المراحل المبكرة الأولى من النمو الخضري للفطريات. - استخدم دبوس المطبخ المتداول للتلاعب بسرير الركيزة لتجنب عدم التجانس المادي لأسرة ركيزة الحبوب وسمك السرير لكتلة الركيزة.
ملاحظة: تعزز العملية عملية التمثيل الغذائي الفطري ، مما يحسن إنتاج بوغ الفطريات ، ويزيد من مساحة السطح ، مما يعزز العائد المخروطي18. - اترك عملية التخمير لتستمر لمدة تصل إلى 4-5 أسابيع ، وتحقق من أكياس التخمير كل يومين بحثا عن وجود أي فرط نمو نباتي أبيض يمكن أن يتطور أثناء عملية التخمير ، مما قد يؤثر بشكل كبير على محصول الكونيديا الفطرية.
ملاحظة: قم بإنهاء التخمير على الفور في أكياس التخمير التي تحتوي على أي نمو نباتي أبيض ، وجفف الثقافات الفطرية18.
- تدليك ركائز الحبوب يدويا في أكياس التخمير بعد 2 أيام من التلقيح والحضانة ، عندما يحدث نمو فطري مرئي وبدأت الركيزة في التكتل بواسطة الفطريات المتنامية.
3. تلقيح الأروميات
- إنتاج وتلقيح الأروميات
- قم بإعداد وسط استزراع سائل ، يحتوي على 1 لتر من الماء المقطر ، و 30 جم من الجلوكوز ، و 20 جم من مستخلص الخميرة ، و 4 جم من فوسفات البوتاسيوم دياباسيك (K2HPO4) ، و 15 مل من خمور الذرة شديدة الانحدار ، و 10 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين المضاد الحيوي ، لكل من M. pinghaense و M. robertsii.
- أولا ، قم بتسخين الماء المقطر ، وأطفئه قبل الوصول إلى نقطة الغليان ، وأضف كل مكون من المكونات ، باستثناء الستربتومايسين ، إلى الماء الساخن في الوعاء. يغلى الوسط بلطف لمدة 3-4 دقائق ، ويحرك الوسط باستمرار للسماح بالخلط السليم للمكونات ومنع استقرار بعض المكونات في قاع الوعاء.
- صب ما مجموعه 100 مل من الوسط في تسع قوارير مختلفة سعة 250 مل ووضع سدادة من الصوف القطني على كل قارورة ، وقم بتغطية الصوف القطني بورق الألومنيوم كسدادة (الشكل 1A).
- قم بتعقيم الوسط في القوارير لمدة 55 دقيقة عند 121 درجة مئوية. بعد التعقيم ، اترك الوسط الموجود في القوارير ليبرد وأضف 10 ملغ / مل من الستربتومايسين إلى الوسط في كل قارورة (الشكل 1B).
- جمع حلقتين إلى ثلاث حلقات بكتيرية من الكونيديا الفطرية من لوحات الثقافة الفطرية التي يبلغ عمرها 2-3 أسابيع لكل من عزلات EPF ، M. pinghaense و M . robertsii ، ونقلها إلى كل وسائط سائلة 100 مل في قوارير 250 مل ، في ظل ظروف معقمة ، وختم القوارير.
- احتضن قوارير الاستزراع السائل عند ± 25 درجة مئوية ، على شاكر مداري عند 140 دورة في الدقيقة لمدة 3 أيام ، وأوقف الحضانة بمجرد أن تظهر الثقافات علامات على التعكر العالي مع نمو الأروميات الفطرية (الشكل 1C).
- للكشف عن أي تلوث بكتيري محتمل من المستنبتات ، اسحب عينة 100 ميكرولتر من كل قارورة مستزرعة سائلة بعد 24 ساعة أثناء الحضانة وطبقها على ثلاث لوحات SDA لكل عزلة. احتضن الألواح لمدة 48 ساعة ، عند درجة حرارة يتم التحكم فيها تبلغ ± 25 درجة مئوية.
- إعداد الركيزة الصلبة
- استخدم الأرز الأبيض طويل الحبة المسلوق كوسيط ركيزة صلب للأبواسير الأرومية لكل من M. pinghaense و M. robertsii (مقتبس من Jaronski و Jackson18).
- قم بإعداد أكياس التخمير كما هو مفصل أعلاه ، في الخطوات 2.1.1-2.1.3 ، ولكل كيس ، أضف 1 كجم من الأرز و 300 مل من الماء المقطر المعقم.
- امزج محتويات أكياس التخمير برفق وضعها في أكياس الأوتوكلاف الخارجية في وضع مستقيم ، والأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 55 دقيقة. بعد التعقيم ، اسمح للركائز بالتبريد لمدة ± 45 دقيقة في ظل ظروف معقمة.
- التلقيح والتخمير
- قم بإزالة إغلاق كل من قوارير الثقافة السائلة لكل من M. pinghaense و M . robertsii تحت تدفق صفائحي وقم بلهب حافة كل قارورة لمدة 10 ثوان.
- صب الثقافات السائلة سعة 100 مل في أكياس التخمير عن طريق إزالة سدادات الصوف القطني من أعناقها (الشكل 2). ضع سدادات القطن مرة أخرى وقم بتغطية الجزء العلوي من عنق الحقيبة بورق جراحي مثبت بشريط مطاطي.
ملاحظة: حدد تركيز الأروميات لكل قارورة باستخدام مقياس دمية، واستخدم تركيزات الأروميات من 1 × 107 - 5 × 108 blastospores/mL لتطهير الركائز28. - قم بلف الجزء العلوي من الكيس واخلط محتويات الكيس عن طريق الاهتزاز والتلاعب الخفيف بالركيزة عن طريق التدليك ، واحتضن الأكياس في ± 25 درجة مئوية ، عن طريق تسطيح الركيزة في الأكياس لمنع تكوين أسرة سميكة18.
- كسر الركيزة في أكياس التخمير عن طريق تدليك محتويات الأكياس ، بعد 2-3 أيام من التلقيح والحضانة ، عندما حدث نمو فطري مرئي وربط الركيزة بواسطة الفطريات (مقتبس من تقنية Jaronski و Jackson18).
ملاحظة: اسمح للتخمير بالاستمرار لمدة 4 أسابيع.
الشكل 1: وسط الاستزراع السائل في قوارير سعة 250 مل . (أ) قبل التعقيم. (ب) بعد التعقيم والتلقيح باستخدام جراثيم EPF. (ج) وسط عكر مع أبواسير بلاموسية فطرية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: وسط مستنبتة سائلة محضرة من الأروميات. (أ) Metarhizium robertsii و (B) Metarhizium pinghaense قبل تلقيح الأرز كركيزة صلبة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
4. تجفيف الثقافات الفطرية
- جفف الثقافات الفطرية لمدة 10-12 يوما بعد التخمير ، قبل استخدامها في التجارب ، عن طريق نقل الثقافات البوغية إلى أكياس ورقية بنية اللون 26-30 كجم (30 × 43 × 15250 سم3).
- لتحسين قوة الشد للأكياس الورقية ، قم بقطع ثلث الجزء العلوي من كل كيس أفقيا ، وقم بخط الجزء السفلي من الكيس (الشكل 3A ، B).
الشكل 3: تحضير الأكياس الورقية، وإجراءات تجفيف الثقافات، والتعبئة والتغليف. (أ، ب) إعداد الأكياس الورقية البنية. إجراء تجفيف مزارع أنواع Metarhizium المزروعة على (C,E) الأرز المسلوق و (D,F) الشعير المقشر. (ز) أكياس ورقية مغلقة بالدبابيس لإنشاء هيكل خيمة مثلث. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- قم بتفتيت الركيزة بلطف في كل كيس تخمير ، واقطع زاوية كل كيس وانقل الثقافة بأكملها إلى الأكياس الورقية من خلال المساحة التي تتركها الزاوية المقطوعة (الشكل 3C-F). لتجنب الهروب المفرط من الجراثيم الفطرية في الهواء ، قم بإجراء هذه العملية ببطء.
ملاحظة: قم بإجراء هذه العملية في ظل ظروف معقمة ، باستخدام التدفق الرقائقي ، لتجنب التلوث. - قم بتسمية كل كيس ورقي وطيه على الطرف العلوي من كل كيس مرتين وإغلاقه باستخدام الدبابيس لإنشاء هيكل خيمة مثلث ، ووضع الأكياس على رفوف تجفيف سلكية للسماح بالتجفيف السليم ، حتى ، عند درجة حرارة يتم التحكم فيها ± 25 درجة مئوية ورطوبة منخفضة تتراوح بين 30-40٪.
- أدر الأكياس يوميا للسماح حتى بتجفيف الثقافات وتجنب أي إعادة نمو نباتي قد تحدث ، مما يقلل من غلة الجراثيم الفطرية القابلة للحصاد.
- وزن كل كيس تجفيف بعد كل 2 أيام أثناء عملية التجفيف ، واستمر في عملية التجفيف لكل كيس حتى يتم ملاحظة تغيير طفيف أو معدوم في كتلة الأكياس بين الأيام المتتالية.
5. حصاد كونيديا الفطرية
- حصاد كونيديا فطرية ميكانيكيا من الثقافات باستخدام ثلاثة غربال متداخلة ، وشبكة غربال اختبار (ETS) رقم 35 (مع فتحة 500 ميكرومتر) ، متداخلة على غربال اختبار (مع فتحة 212 ميكرومتر) ، متداخلة على شبكة ETS رقم 100 (مع فتحة 150 ميكرومتر) ، مثبتة على مقلاة تجميع.
- قم بتحميل عينة المستزرعة الجافة على شبكة ETS رقم 35 غربال ببطء ووضع غطاء على الغربال لمنع إطلاق الكونيديا الفطرية في الهواء.
- أضف 10-12 من الرخام الزجاجي إلى المناخل للمساعدة في مرور الكونيديا الفطرية عبر الشاشات الشبكية وتجنب الاحتفاظ بالكونيديا في الغربال ، مما قد يؤدي إلى تقليل استعادة الجراثيم.
- قم بشريط وختم مفاصل الغربال باستخدام شريط كهربائي لمنع هروب الغبار المخرطي.
- ضع المناخل على شاكر اهتزازي ، مزود بوسادة لاصقة ، لتأمين مقلاة التجميع والمناخل ، لمدة 20-25 دقيقة ، بحركة 560-640 اهتزازا في الدقيقة (الشكل 4).
ملاحظة: تقنية مقتبسة من جارونسكي وجاكسون18.
الشكل 4: حصاد الجراثيم الفطرية من ثقافات Metarhizium robertsii المجففة على الأرز والشعير المقشر. (أ) 10-12 من الرخام الزجاجي المضاف إلى المناخل للمساعدة في مرور الكونيديا الفطرية عبر الشاشات الشبكية. M. robertsii conidia تحصد من الثقافات على الأرز (B) ، و (C) تقشر بالكاد. (د) غربال على شاكر اهتزازي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- قم بإزالة غربال الاختبار من مقلاة التجميع ، وجمع conidia وتخزين conidia المجمعة في أكياس قفل سحاب محكمة الإغلاق وغير منفذة بالماء للتخزين على المدى الطويل (3-6 أشهر).
6. تحديد كمية الكونيديا الفطرية المنتجة
- قياس وتسجيل كتلة كل ركيزة الحبوب قبل حصاد الكونيديا الفطرية من كل ركيزة.
- قياس الوزن الكلي للكونيديا المجمعة عن طريق طرح كتلة الجراثيم المجمعة من كتلة الركيزة الصلبة.
ملاحظة: لا يشمل إجمالي محصول الكونيديا الكونيديا المحصودة فحسب ، بل يشمل أيضا الكونيديا الفطرية المتبقية على الركيزة الصلبة. - وزن الركيزة وإزالة 10 غرام من الركيزة وزنها. تعليق 10 غرام من الركيزة في 0.05 ٪ Tween 20 وتمييع في 10 مل من الماء المقطر المعقم.
- دوامة خلط التعليق لمدة 2 دقيقة ، واستخدام مقياس الدم للقيام بعدد بوغ لتحديد عدد conidia غسلها من الركيزة.
- قم بإجراء المزيد من التخفيفات عن طريق نقل 1000 ميكرولتر من التعليق المخروطي المغسول سعة 10 مل إلى 9 مل من الماء المقطر المعقم لتكوين 10 مل من معلقات التخفيف.
- دوامة خلط المعلقات المخروطية لمدة 2 دقيقة ، وتحديد تركيزات conidial.
ملاحظة: اتبع الإجراء والصيغة الموصوفة من قبل Inglis و Enkerli و Goettel30 لتحديد التركيز المخروطي للمعلقات. - جمع وتعليق ما مجموعه 0.1 غرام من مسحوق conidial الذي تم جمعه من كل مزرعة في 10 مل من الماء المقطر المعقم مع استكمال 0.05 ٪ Tween 20 ، ودوامة خلط التعليق conidial لمدة دقيقتين ، وتحديد التركيز المخروطي باستخدام مقياس الدم.
- قم بإجراء المزيد من التخفيفات عن طريق نقل 1000 ميكرولتر من التعليق المخروطي سعة 10 مل إلى 9 مل من الماء المقطر المعقم لتعويض تخفيفات التعليق 10 مل.
- دوامة خلط المعلقات المخروطية لمدة 2 دقيقة ، وحساب تركيزات conidial وتحديد عدد conidia لكل غرام.
- اضرب عدد الكونيديا لكل غرام من المسحوق المحصود في الكتلة الأولية للمسحوق المخروطي المحصود. اضرب عدد الكونيديا المغسولة من الركيزة في الوزن الإجمالي للركيزة المستهلكة ، كونها الركيزة التي تم حصاد الكونيديا منها.
- أضف القيمتين المعطاتين معا واقسمهما على الوزن الجاف الأولي للركيزة لحساب عدد الكونيديا لكل كيلوغرام أو غرام من الركيزة18.
ملاحظة: أجريت الحسابات بشكل رئيسي لركيزة الأرز. تم إجراء اختبار الإنبات أو الجدوى المخروطية لكل من عزلات M. pinghaense و M. robertsii لتحديد صلاحية الكونيديا المنتجة.
7. تحليل البيانات
- استخدام برنامج حاسوبي مناسب لإجراء التحليل الإحصائي للنتائج التي تم الحصول عليها.
ملاحظة: تم إجراء التحليل الإحصائي للبيانات باستخدام الإصدار 13.5.0.17 من STATISTICA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لوحظ انخفاض في كتلة محتوى الثقافات على الأرز لكل من M. pinghaense و M. robertsii بمرور الوقت خلال مرحلة تجفيف الثقافات الفطرية ، مع عدم ملاحظة أي تغيير أو القليل في الكتلة بمجرد أن تجف الثقافات (الشكل 5). يوضح الشكل 6 مسحوق الكونيديا الفطري الجاف الذي تم حصاده لكل من M. pinghaense و M. robertsii.
الشكل 5: التغير في كتلة محتوى الكيس في ثقافات Metarhizium robertsii و M. pinghaense على الأرز (فاصل ثقة 95٪) على مدى 10 أيام ( ANOVA; F5,35 = 2.21; p = 0.08). تشير الأحرف المختلفة فوق القضبان إلى الفرق الكبير (p < 0.05) الذي تم الحصول عليه في كتلة محتوى الحقيبة على مدار الأيام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: الكونيديا المحصودة (أ) الكونيديا المحصودة في مقلاة التجميع. (ب) ميتاريزيوم روبرتسي. (ج) م. بينغاينسي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ولم يلاحظ وجود فرق كبير في متوسط المسحوق المخروطي الذي تم حصاده من كل نوع من أنواع الحبوب لكل من M. pinghaense و M. robertsii. كان للكونيديا الجافة التي تم حصادها لكليهما قدرة مخروطية بنسبة >90٪ في المتوسط لكل من M. pinghaense و M . robertsii. على ركيزة الأرز ، أنتجت M. pinghaense ما معدله 8.2 جم ± 4.38 جم من مسحوق conidial ، وهو ما تجاوز قليلا الكمية التي تم الحصول عليها ل M. robertsii (6 جم ± 2 جم). تم حصاد ما معدله 1.83 جم ± 1.47 جم من M. robertsii conidia الجاف من ركيزة الشعير المقشر ، في حين تم حصاد صفر M. pinghaense من الركيزة. لم يتم حصاد أي كونيديا فطرية جافة من ركيزة الشوفان المقشر إما ل M. pinghaense أو M. robertsii (الشكل 7).
الشكل 7: متوسط كمية مسحوق كونيديا. متوسط كمية مسحوق كونيديا من Metarhizium pinghaense و M. robertsii ، مقاسة بالجرام (فاصل الثقة 95٪) التي تم حصادها من الركائز الصلبة الثلاث: الأرز المسلوق والشعير المقشر والشوفان المقشر (ANOVA: F2,27 = 2.82 ؛ p = 0.08). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ولوحظ وجود فرق كبير في المتوسط المقدر للكونيديا لكل غرام، الذي يتم حصاده من حبوب الأرز، بين M. pinghaense (3.51 × 10 7/g ± 0.43 × 10 7/g) و M. robertsii (4.31 × 10 7/g ± 0.38 x 10 7/g). كان لدى M. robertsii متوسط عدد كونيديا أعلى قليلا لكل غرام من M. pinghaense (الشكل 8).
الشكل 8: متوسط الكونيديا لكل غرام. متوسط الكونيديا المقدر لكل غرام ل Metarhizium pinghaense و M. robertsii (فاصل ثقة 95٪) من ثقافات الأرز (ANOVA: F 1,7 = 8.47 ؛ p = 0.02). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ولم يلاحظ أي فرق كبير في العدد التقديري للكونيديا الموجودة على ركيزة الأرز المستهلكة بين M. pinghaense (5.02 × 10 7/mL ± 1.47 × 10 7/mL) و M. robertsii (3.70 × 10 7/mL ± 0.91 x 10 7/mL) (الشكل 9). ومع ذلك ، كان لدى M. pinghaense عدد أكبر قليلا من الكونيديا الموجودة على ركيزة الأرز من M. robertsii.
الشكل 9: متوسط الكونيديا الفطرية. يقدر متوسط الكونيديا الفطرية ل Metarhizium pinghaense و M robertsii (فاصل ثقة 95٪) من الثقافات (F1,7 = 2.45 ؛ p = 0.16) الموجودة على ركائز زراعة الأرز المستهلكة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
لم يلاحظ أي فرق كبير في محصول الكونيديا الإجمالي المقدر بين M. pinghaense (5.09 × 10 7/g ± 1.35 x 10 7/g) و M. robertsii (3.55 x 10 7/g ± 0.85 x 10 7/g) التي تم الحصول عليها من مزارع ركيزة الأرز. ومع ذلك، أنتجت M. pinghaense محصولا مخروطيا أعلى قليلا من M. robertsii، الذي أنتج محصولا مخروطي أقل (الشكل 10).
الشكل 10: إجمالي عائد الكونيديا. المحصول الكلي المقدر للكونيديا من Metarhizium pinghaense و M. robertsii (فاصل الثقة بنسبة 95٪) من الثقافات على الأرز (F1,7 = 3.91 ؛ p = 0.09). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعتمد الدمج الناجح للعوامل الميكروبية للمكافحة البيولوجية للآفات الحشرية الزراعية الهامة في النظام الإيكولوجي الزراعي على نجاح وسهولة الإنتاج الضخم لمسببات الأمراض الحشرية كخطوة أولى في ظل الظروف المختبرية. الإنتاج الضخم ل EPF مهم للتطبيق على نطاق واسع وتوافر منتجات EPF لبرامج الإدارة المتكاملة للآفات باستخدام المكافحة البيولوجية9،10،11،12،13. يتأثر نجاح الإنتاج الضخم لمختلف عزلات EPF بالمكونات الغذائية لركيزة الإنتاج أو الوسط ، والتي تؤثر بشكل كبير على سمات الكونيديا الناتجة ، بما في ذلك فعاليتها ، وتحمل الجفاف ، وثبات الحقل ، والعائد المخروطي8،19،20،21 . لذلك ،من المهم تطوير المعرفة بالمتطلبات الغذائية لمسببات الأمراض الحشرية المنتجة بكميات كبيرة أثناء عملية الزراعة والتخمير.
في الدراسة الحالية ، تم إجراء الإنتاج الضخم لكل من M. robertsii و M . pinghaense باستخدام ثلاثة منتجات زراعية مختلفة كركائز تخمير: الأرز المسلوق والشعير المقشر والشوفان المقشر. وقد لوحظ أن ركائز الحبوب الثلاث المختلفة تؤثر على العائد المخروطي للعزلات الفطرية بشكل كبير. كان الأرز المسلوق مواتيا للغاية للإنتاج الضخم لكلا العزلين ، في حين فضلت حبوب الشعير المقشر إنتاج M. robertsii فقط. تم إجراء الملاحظات بناء على محصول مسحوق كونيديا الفطري الجاف بعد التخمير. قليلا أو لا ، تم حصاد conidia من الشوفان المقشر بعد التخمير. وجد أن الشوفان المقشر يحتفظ بمستويات أعلى من الرطوبة في أكياس التخمير أثناء عملية التخمير ، مما قد يؤدي إلى الأداء الضعيف الملحوظ للحبوب كركيزة لإنتاج M. pinghaense و M . robertsii. كانت ركيزة الشوفان المقشر عرضة لفرط نمو فطري نباتي أبيض للعزلات الفطرية في بعض الحالات ، مما أثر بشكل كبير على العائد المخروطي ، حيث لم يحدث الجراثيم في أكياس التخمير التي تحتوي على النمو الزائد. كما لوحظ أن أكياس التخمير مع ركيزة الشوفان المقشر تحتوي على مستويات عالية من التلوث البكتيري بالنسبة لأكياس التخمير التي تحتوي على ركائز الشعير المقشرة.
ولوحظت مستويات عالية من التلوث بالفطريات أو الخميرة الوقائية فيما يتعلق بالإنتاج الضخم للمتفطرة بينغهاينسي باستخدام الشعير المقشر كركيزة. وقد لوحظ التلوث الفطري الوقائي في مرحلة لاحقة من عملية التخمير من خلال نمو وتكوين فطر آخر غير الفطر المستخدم لتلقيح الركيزة. كان من الصعب تشخيص تلوث الركيزة في مرحلة أولية من التخمير ، قبل الجراثيم المخروطية. يعتقد أن التلوث البكتيري والخميرة أثناء عملية التخمير يتجلى في البقع الرطبة في الركيزة ، ويميل كل من الشوفان المقشر وحبوب الشعير إلى امتصاص الرطوبة والاحتفاظ بها لفترة أطول من حبوب الأرز. كان هذا قيدا على استخدام هاتين الركيزتين كركيزة تخمير للإنتاج الضخم لعزلتي Metarhizium .
أظهرت الملاحظات التي تم إجراؤها خلال الدراسة الحالية أن نوع طريقة التلقيح المستخدمة لتلقيح كل ركيزة من الحبوب يؤثر على الإنتاج المخروطي. وتبين أن طريقة التلقيح المعلق المخروطي أقل فعالية نسبيا، حيث أظهر الشوفان المقشر الملقح والشعير المقشر زيادة في مستوى التلوث مقارنة بالوقت الذي استخدمت فيه طريقة تلقيح الأروميات المستزرعة بالسائل على حبوب الأرز. على عكس طريقة تلقيح الأروميات المستزرعة بالسائل ، لا تسمح طريقة التعليق المخروطي بالكشف عن الملوثات المحتملة في المعلقات قبل تلقيح الركائز ، مما يؤدي إلى مستويات عالية من التلوث التي لوحظت في أكياس التخمير. وصف جارونسكي وجاكسون18 العديد من العوامل التي يمكن أن تؤدي إلى تلوث محتمل للركائز المستخدمة ، مثل عدم وجود تعقيم كامل للركيزة ، والتلقيح غير المعقم ، والتعامل غير السليم مع ركيزة التخمير في الأكياس. وقد يكون التلوث الملحوظ في أكياس التخمير التي تحتوي على الشعير المقشر والشوفان المقشر ناتجا أيضا عن عدم التعقيم الكامل للركيزة، وهو ما كان يمكن أن يحدث أثناء عملية التعقيم. كما وصف جارونسكي وجاكسون18 استخدام المعلقات المخروطية كلقاحات بأنها غير مؤاتية، لأنها تؤدي إلى زيادة فرص التلوث أثناء الحصاد المخروطي من وسط أجار.
في الميدان ، أثناء إصابة المضيفين المناسبين ، يبني الفطر أولا الكتلة الحيوية في هيموكول الحشرات من خلال الانتشار ، قبل ظهوره وتكاثره على السطح الصلب الخارجي للحشرات30. تم تقليد هذه العملية عند استخدام طريقة تخمير الأروميات السائلة. وبناء على ذلك ، مثل المرق هيموكول الحشرة ، ويمثل تلقيح المرق بالكونيديا الفطرية الاتصال الأولي والعدوى للحشرة ، ويمثل تكوين الأروميات في المرق انتشار عملية الأرومية التي تحدث داخل هيموكول الحشرة المصابة. يمثل التلقيح النهائي لحبوب الأرز وجراثيم الفطريات على الحبوب بمرور الوقت ما يحدث على بشرة الحشرة بمجرد أن تبدأ الفطريات في الظهور من داخل جثة الحشرة. هذا يمكن أن يفسر لماذا عملت طريقة تخمير الأروميات السائلة بشكل أفضل من طريقة التلقيح المعلق المخروطي.
وصف جارونسكي وجاكسون18 الشوفان المقشر وحبوب الشعير المقشر بأنها الحبوب الزراعية المفضلة للزراعة الجماعية لأنواع Metarhizium ، مقارنة بحبوب الأرز ، حيث وجد أن نوعي الحبوب يحافظان على محتواهما الرطوبي أثناء عملية التخمير. ومع ذلك ، فإن الدراسة الحالية تتناقض مع ملاحظات الباحثين المذكورين أعلاه واستنتاجاتهم ، حيث لم يتم العثور على كل من الشوفان المقشر والشعير المقشر على أنهما ركائز تخمير صلبة جيدة ل M. pinghaense أو M. robertsii. وجد أن الأرز هو ركيزة جيدة من الحبوب لكلا العزلتين ، لأنه لم يتحلل إلى جزيئات صغيرة يمكن أن تختلط مع المنتج النهائي ، كما اقترح في الدراسات السابقة.
وقد أظهرت الدراسة الحالية أن عزلات أنواع Metarhizium يمكن استزراعها بنجاح وإنتاجها بكميات كبيرة باستخدام حبوب الأرز وأن الحبوب المختلفة تميل إلى التأثير على الجراثيم المخروطية والعائد بشكل مختلف. قد يكون هذا بسبب حقيقة أن الحبوب المختلفة تختلف من حيث تكوين التغذية هذا ، على سبيل المثال ، الكربون: نسب النيتروجين وتركيز الكربون. تركيز الكربون والكربون: من المعروف أن نسبة النيتروجين في وسط النمو تؤثر على محصول الكونيديا ، وكذلك جودتها من حيث الجدوى والضراوة22. كما ثبت أن تقنيات التلقيح المستخدمة لتلقيح الركائز تؤثر على درجة النجاح التي تحققت في الإنتاج الضخم لعزلات EPF على ركائز محددة من الحبوب الزراعية. لذلك ، يوصى باستخدام تقنية تخمير الأروميات السائلة الموصوفة في الدراسة الحالية باعتبارها أفضل طريقة تلقيح لركائز الحبوب الزراعية للإنتاج الضخم لكل من عزلات M. pinghaense و M. robertsii. يسمح استخدام هذه الطريقة بالكشف المحتمل عن التلوث قبل استخدام اللقاحات ، مما قد يعوق الإنتاج الضخم لعزل EPF المطلوب بالنسبة لاستخدام تقنية التلقيح المعلق المخروطي. ويوصى أيضا باستخدام حبوب الأرز كركائز صلبة للإنتاج الضخم للكونيديا لكل من M. pinghaense و M . robertsii ، بدلا من الشعير المقشر والشوفان المقشر. التقنية الموصوفة مهمة للإنتاج الضخم المستقبلي والتطبيق التجاري للكونيديا في ظل الظروف الميدانية ضد الآفات الحشرية الهامة في النظم الإيكولوجية الزراعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يود المؤلفون أن يشكروا هورت بوم وهورت ستون وبرنامج التكنولوجيا والموارد البشرية للصناعة (THRIP: TP14062571871) على تمويل المشروع.
أوركيد:
http://orcid.org/0000-0002-5118-3578 ليتودي ل. ماثولوي
أنطوانيت ب. مالان http://orcid.org/0000-0002-9257-0312
نوماخولوا ف. ستوكوي http://orcid.org/0000-0003-2869-5652
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Tween 20 | Lasec | Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water | |
| 20 mL McCartney bottles | Lasec | Used to make conidial suspensions | |
| Aluminium foil | Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask | ||
| Autoclave | Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process | ||
| Autoclave bags | Lasec | Fermentation bags or solid substrate containers | |
| Autoclave tape | Lasec | To secure PVC pipes on the fermentation bags | |
| Brown Kraft paper bags | Used to dry conidia cultures on agricultural grains | ||
| Bunsen burnner | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks) | |
| Clear edge test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
| Corn steep liquor | SIGMA | 66071-94-1 | Ingredient of the blastospore liquid medium |
| Cotton Wool | Lasec | Used as plug of the neck for fermentation bags | |
| Duran laboratory bottles | Neolab | Used to autoclave SDA medium and distilled water | |
| Electrical tape | Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust | ||
| ENDECOTTS test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
| Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask | Lasec | Carrier of the blastospore liquid medium | |
| Ethanol (99%) | Lasec | Used to sterilize surgical blades and inoculating loops | |
| Flaked barley | Health Connection Wholefoods | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Flaked oats | Tiger brands | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Glucose | Merck | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
| Growth Chamber/ incubators | For growing fungal conidia culture | ||
| Haemocytometer | Used to determine conidial concentrations | ||
| Inoculating loops | Lasec | For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth | |
| Kitchen rolling pin | Used to manipulate the solid grain substrate bed | ||
| Laminar flow Cabinet | ESCO Laminar Flow Cabinet | Provide as sterile environment during substrate inoculation | |
| Metarhizium pinghaense conidia | Stellenbosch University | 5HEID | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense |
| Metarhizium robertsii conidia | Stellenbosch University | 6EIKEN | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii |
| Microscope | ZEIZZ (Scope. A1) | Used to determine conidial concentrations and conidial viability | |
| Orbital shaker | IncoShake- LABOTEC | Used for the blastospore production process | |
| Parboiled rice | Spekko | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Penicillin-Streptomycin | SIGMA | Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination | |
| Petri-dishes | Lasec | Containers for the SDA medium | |
| Pipettes and pipette tips | Labnet (BioPette PLUS) | Used to measure liquids ingredients | |
| Polyvinylchloride Marley waste pipe | Used to create a neck for the fermentation bag | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
| Rubber band | Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks | ||
| Sabaroud dextrose agar (SDA) | NEOGEN Culture Media | Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii | |
| Sterile distilled water | To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions | ||
| Sticky pad | Used to secure the seives on the vibratory shaker | ||
| Surgical blade | Lasec | Used to scrape off spores from fungal cultures | |
| Surgical paper | Lasec | Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag | |
| Vibratory shaker | Used to shake conidia off the agricultural grain substrates | ||
| Vortex mixer | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles | |
| Yeast extract | Biolab | Added to the SDA medium to improve spore germination and growth | |
| Zipper-lock bags | GLAD | Used to to store harvested fungal conidia |
References
- Shah, P. A., Pell, J. K. Entomopathogenic fungi as biological control agents. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5), 413-423 (2003).
- Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. A review of the biology and control of the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae), with special reference to biological control using entomopathogenic fungi and nematodes. African Entomology. 29 (1), 1-16 (2020).
- Ibrahim, L., Laham, L., Touma, A., Ibrahim, S. Mass production, yield, quality, formulation and efficacy of entomopathogenic Metarhizium anisopliae conidia. Current Journal of Applied Science and Technology. 9 (5), 427-440 (2015).
- Banu, J. G., Rajalakshmi, S. Standardisation of media for mass multiplication of entomopathogenic fungi. Indian Journal of Plant Protection. 42 (1), 91-93 (2014).
- Roberts, D. W., Humber, R. A. Entomogenous fungi. Biology of Conidial Fungi. Cole, G. T., Kendrick, W. B. , Academic Press. New York. 201-236 (1981).
- Feng, M. G., Poprawski, T. J., Khachatourians, G. G. Production, formulation and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for insect control. Current status. Biocontrol Science and Technology. 4 (1), 3-34 (1994).
- Karanja, L. W., Phiri, N. A., Oduor, G. I. Effect of different solid substrates on mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae entomopathogens. The Proceedings of the12th KARI Biennial Scientific Conference. , Nairobi, Kenya. 8-12 (2010).
- Prasad, C. S., Pal, R. Mass production and economics of entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae and Verticillium lecanii on agricultural and industrial waste. Scholars Journal of Agriculture and Veterinary Sciences. 1 (1), 28-32 (2014).
- Ehlers, R. U. Mass production of entomopathogenic nematodes for plant protection. Applied Microbiology and Biotechnology. 56 (5), 623-633 (2001).
- Pham, T. A., Kim, J. J., Kim, S. G., Kim, K. Production of blastospore of entomopathogenic Beauveria bassiana in a submerged batch culture. Mycobiology. 37 (3), 218-224 (2009).
- Bhadauria, B. P., Puri, S., Singh, P. K. Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products. The Bioscan. 7 (2), 229-232 (2012).
- Latifian, M., Rad, B., Amani, M. Mass production of entomopathogenic fungi Metarhizium anisopliae by using agricultural products based on liquid-solid diphasic method for date palm pest control. International Journal of Farming and Allied Sciences. 3 (4), 368-372 (2014).
- Agale, S. V., Gopalakrishnan, S., Ambhure, K. G., Chandravanshi, H., Gupta, R., Wani, S. P. Mass production of entomopathogenic fungi (Metarhizium anisopliae) using different grains as a substrate. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7 (1), 2227-2232 (2018).
- Jackson, M. A. Optimizing nutritional conditions for the liquid culture production of effective fungal biological control agents. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 19 (3), 180-187 (1997).
- Deshpande, M. V. Mycopesticides production by fermentation. Potential and challenges. Critical Reviews in Microbiology. 25 (3), 229-243 (1999).
- Sahayaraj, K., Namasivayam, S. K. R. Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products and by products. African Journal of Biotechnology. 7 (12), 1907-1910 (2008).
- Feng, K. C., Liu, L. B., Tzeng, Y. M. Verticillium lecanii spore production in solid-state and liquid-state fermentations. Bioprocess Engineering. 23 (1), 25-29 (2000).
- Jaronski, S. T., Jackson, M. A. Mass production of entomopathogenic Hypocreales. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology 2nd edition. Lacey, L. A. , Academic Press. London. 255-284 (2012).
- Vega, F. E., Jackson, M. A., Mercandier, G., Poprawski, T. J. The impact of nutrition on spore yields for various fungal entomopathogens in liquid culture. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 19 (4), 363-368 (2003).
- El Damir, M. Effect of growing media and water volume on conidial production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Journal of Biological Sciences. 6 (2), 269-274 (2006).
- Pandey, A. K., Kanaujia, K. R. Effect of different grains as solid substrates on sporulation, viability and pathogenicity of Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin. Journal of Biological Control. 22 (2), 369-374 (2008).
- Kassa, A., et al. Whey for mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Mycological Research. 112 (5), 583-591 (2008).
- Sharma, S., Gupta, R. B. L., Yadavam, C. P. S. Selection of a suitable medium for mass multiplication of entomofungal pathogens. Indian Journal of Entomology. 64 (3), 254-261 (2002).
- Bich, G. A., Castrillo, M. L., Villalba, L. L., Zapata, P. D. Evaluation of rice by-products, incubation time, and photoperiod for solid state mass multiplication of the biocontrol agents Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Agronomy Research. 16 (5), 1921-1930 (2018).
- Price, R. E., Müller, E. J., Brown, H. D., D'Uamba, P., Jone, A. A. The first trial of a Metarhizium anisopliae var. acridum mycoinsecticide for the control of the red locust in a recognised outbreak area. International Journal of Tropical Insect Science. 19 (4), 323-331 (1999).
- Hatting, J. L., Moore, S. D., Malan, A. P. Microbial control of phytophagous invertebrate pests in South Africa. Current status and future prospects. Journal of Invertebrate Pathology. 165, 54-66 (2019).
- Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. Laboratory screening of entomopathogenic fungi and nematodes for pathogenicity against the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae). Biocontrol Science and Technology. , (2021).
- Inglis, G. D., Enkerli, J., Goettel, M. S. Laboratory techniques used for entomopathogenic fungi: Hypocreales. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , Academic Press, Elsevier. Chapter 7 189-253 (2012).
- Mehta, J., et al. Impact of carbon & nitrogen sources on the Trichoderma viride (Biofungicide) and Beauveria bassiana (entomopathogenic fungi). European Journal of Experimental Biology. 2 (6), 2061-2067 (2012).
- Burges, H. D. Formulation of mycoinsecticides. Formulation of Microbial Biopesticides. , Springer. Dordrecht. 131-185 (1998).
