Summary
Entomopathogenic 진균은 농업 곤충 해충의 생물학적 방제제로서 중요성을 얻고있다. 이 연구에서, 곤충 해충에 대한 상업적 적용을 위해 Metarhizium robertsii 및 M. pinghaense 둘 다의 남아프리카 단리물의 충분한 수의 탄력적 감염성 프로파굴레의 대량 생산은 농산물 곡물 제품을 사용하여 성공적으로 수행되었다.
Abstract
Metarhizium anisopliae 종 복합체의 Entomopathogenic 진균은 농업 곤충 해충의 생물학적 방제제로서 중요성을 얻고있다. 화학 살충제에 대한 해충 저항성의 증가, 살충제가 인체 건강에 미치는 부정적인 영향에 대한 우려가 커짐에 따라 농약으로 인한 환경 오염은 작물 보호 및 해충 방제를위한 새로운 지속 가능한 전략을 찾는 세계적인 추진력으로 이어졌습니다. 이전에, 보베리아 바시아나와 같은 엔토모병원성 진균(EPF) 종을 대량 배양하려는 시도가 수행되었다. 그러나 곤충 해충에 대한 사용을 위해 Metarhizium robertsii 및 M. pinghaense를 대량 배양하려는 시도는 제한적이었습니다. 이 연구는 상업적 적용을 위해 M. robertsii 및 M. pinghaense의 남아프리카 분리 물의 충분한 수의 탄력적 인 감염성 프로파굴레를 대량 생산하는 것을 목표로했습니다. 세 가지 농산물, 조각난 귀리, 조각난 보리, 쌀이 EPF 고체 발효 기질로 사용되었다. 두 가지 접종 방법, 원추형 현탁액 및 블라스토포자의 액체 진균 배양물을 고체 기질을 접종하기 위해 사용하였다. 원추형 현탁액을 사용한 접종은 블라스토포어 접종 방법을 사용할 때와 비교하여 고체 기질 상에서 증가된 오염 수준이 관찰되었기 때문에 상대적으로 덜 효과적인 것으로 관찰되었다. 플레이크된 귀리는 M. robertsii 및 M. pinghaense 둘 다에 적합한 성장 기질이 아닌 것으로 밝혀졌으며, 건조 코니디아가 기질로부터 수확되지 않았기 때문이다. 플랙 보리는 M. pinghaense보다 M. robertsii conidia의 생산을 선호하는 것으로 밝혀졌으며, 1.47g의 건조 M. robertsii conidia와 M. pinghaense conidia의 0 그램± 평균 1.83g을 기질로부터 수확하였다. 쌀알은 M. pinghaense와 M. robertsii 단리물 모두의 침엽수 대량 생산을 선호하는 것으로 밝혀졌으며, 기질로부터 수확 된 2g± 평균 8.2g 및 4.38g 및 6g ± 2g이 각각 발견되었습니다.
Introduction
엔토모병원성 진균(EPF)은 중요한 농작물 해충 1,2의 생물학적 방제에서 작물 보호제로서 중요성을 갖게 되었다. 토양에서 자연적으로 발생하는 엔토모 병원균은 다양한 해충 종의 개체군에서 epizootics를 일으킨다3. EPF의 종은 숙주 특이적이며 비 표적 종을 공격하는 측면에서 상대적으로 적은 위험을 제기하며 환경에 독성이없습니다 4. EPF는 호스트를 침범하는 것뿐만 아니라 즉각적인 환경에서 전파하고 지속하기위한 고유 한 메커니즘을 가지고 있습니다1. 그들은 주로 숙주 표피에 부착되고 침투하여 숙주 헤모코엘에서 침입하고 증식하는 무성 포자를 통해 숙주를 공격합니다. 숙주는 결국 혈림프 영양소의 고갈 또는 곰팡이에 의해 방출 된 독성 대사 산물에 의한 독혈증의 결과로 사망합니다. 사망 후, 이상적인 환경 조건 하에서, 곰팡이는 숙주 사체 5,6의 외부 표면 (명백한 진균증)에 나타납니다.
화학 잔류 물이 인체 건강, 환경 오염 및 해충 저항성의 발달에 미치는 부정적인 영향에 대한 우려가 커짐에 따라 화학 물질 기반 살충제의 투입을 줄이고 작물 보호 및 해충 방제를위한 대안적이고 참신하며 지속 가능한 전략을 모색하려는 세계적인 움직임이 생겨났습니다 6,7,8 . 이것은 기존의 화학 물질 방제 3,8보다 생태 학적으로 유리한 전략 인 통합 해충 관리 (IPM) 프로그램에 사용하기위한 미생물 기반 살충제를 개발할 수있는 기회를 제공했습니다.
농업 해충에 대한 성공적인 미생물 방제제를 개발하려면 먼저 적합한 유기체를 분리, 특성화, 확인 및 대상 해충에 대한 병원성을 확인해야합니다. 그러나, 생물학적 제어 프로그램(9,10,11,12,13)에 사용하기 위한 실행 가능한 생성물을 생산하기 위해서는 미생물 제제의 대규모 생산을 위한 용이하고 비용 효율적인 방법이 요구된다. 양질의 엔토모병원체의 상당한 양의 대량 생산은 미생물 균주, 환경, 표적 해충, 제형, 시장, 적용 전략 및 원하는 최종 생성물 14,15,16에 의존한다. EPF는 액체 기질 발효를 사용하여 배반포자를 생산하거나 공중 원추 6,17,18을 생산하기 위해 고체 기질 발효 공정을 사용하여 대량 생산할 수 있습니다. 그러나 엔토모병원체의 대량 생산 및 제형 공정은 최종 제품의 독성, 비용, 유통 기한 및 현장 효능에 직접적인 영향을 미칩니다. IPM에서 성공적으로 사용하기 위해서는 엔토모 병원균의 생산 공정이 작동하기 쉽고, 최소한의 노동력이 필요하며, 독성이 뛰어나고 실행 가능하며 지속적인 프로파굴레의 고수율 농도를 생산해야하며 비용4,13,14,16이 낮아야합니다.
엔토모병원균의 영양 요구량을 이해하는 것은 모든 배양 방법 4,12를 사용한 대량 재배에 중요하다. 생산 배지의 영양 성분은 생물방제 효능, 수율, 건조 내성 및 지속성 8,19,20,21을 포함하여 생성된 프로파귤류의 특성에 상당한 영향을 미친다. 생산 절차의 최적화는 이러한 인자들(22)을 다루도록 설계된다. EPF의 경우, 곰팡이 코니디아의 좋은 성장, 다공 및 대량 생산을위한 주요 요구 사항은 적절한 수분, 최적의 성장 온도, pH,CO2 및O2의 가스 교환 및 좋은 인, 탄수화물, 탄소 및 질소 공급원을 포함한 영양 (18)입니다.
Jaronski와 Jackson18은 고체 기질 발효 방법을 액체 기질 발효 방법에 비해 EPF 생산을위한 자연 공정에 가장 효율적이고 가장 가까운 근사 방법으로 설명하는데, 이는 자연 조건 하에서 곰팡이 코니듐이 곤충 사체의 표면과 같은 고체 직립 구조에서 부담되기 때문입니다. 전분을 함유 한 농산물 및 부산물은 곰팡이가 히팔 끝에서 고농축 가수 분해 효소의 분비를 통해 전분을 쉽게 분해하고 고체 물질에 침투하며 물질11,17,18,23에 존재하는 영양소에 접근하기 때문에 저실질 곰팡이의 대량 생산에 주로 사용됩니다. . 곡물 제품은 또한 건강한 바이오 매스 생산을위한 요구 사항을 제공하는데, 왜냐하면 그들이 수화되고 멸균 될 때, 기질은 모든 액체 배지16,18,24에서 더 많은 영양소를 흡수 할 수 있기 때문입니다.
이전에 여러 연구가 Beauveria bassiana (Bals)와 같은 EPF 종을 대량 배양하려고 시도했습니다. Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas와 Metarhizium anisopliae (Metschn) 중 일부. 소로킨 종 복합체는 다양한 기질16,23,24 상에서 분리된다. 이러한 대량 생산 및 상업적으로 개발된 단리물에는 M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner) J.F. Bisch, Rehner & Humber, Metarhizium 69 (Meta 69 strain ICIPE69), 및 M. anisopliae로부터 개발된 Real Metarhizium 69 (L9281) 및 B. bassiana25,26으로부터 개발된 Broadband® (균주 PPRI 5339) 및 Eco-Bb로부터 개발된 Green Muscle®® (균주 IMI 330189)이 포함된다. . 그러나 Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner & Humber 및 Metarhizium pinghaense Chen & Guo의 대량 문화에 대한 시도는 제한적이었습니다. 이들 두 단리물은 이전 연구에서 메뚜기벌레의 조절에 가장 효과적인 것으로서, 슈도코커스 비버니 시뇨레트(Hemiptera: Pseudococcidae)27로 선택되었다. 따라서 현재의 연구는 곤충 해충에 대한 상업적 적용을 위해 M. robertsii 및 M. pinghaense의 국소 분리 물의 충분한 수의 탄력적 인 감염성 프로파굴레를 공식화하고 대량 생산하는 것을 목표로했습니다. 고체 기질 발효 방법은 EPF 단리물 둘 다에 대한 진균성 코니디아를 대량 생산하기 위해 사용되었다. 침엽수 현탁액 및 블라스토포자의 액체 진균 배양을 사용하는 두 가지 EPF 접종 방법이 고체 기질을 접종하기 위해 사용되었다.
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Protocol
1. 곰팡이 균주의 공급원
- 남아프리카 공화국 서부 케이프 지방의 사과 과수원에서 채취한 M. pinghaense 5 HEID (GenBank 가입 번호: MT367414/MT895630) 및 M. robertsii 6EIKEN (MT378171/MT380849)의 남아프리카 분리된 곰팡이 균주를 사용하십시오.
- 각 EPF의 성장 배양물을 60 g의 사부라우드 덱스트로스 한천 배지 상에서 단리하고, 1 g의 효모 추출물 (SDAY) 및 10 μL의 스트렙토마이신으로 보충한다.
참고: EPF 배양물을 어둠 속에서 ± 25°C의 조절된 온도에서 배양한다.
2. 메타리지움 핑하엔세 와 M. 로베르트시이 침엽수 현탁 접종
- 고체 기질의 제조
- 두 개의 농산물, 즉 플레이크 귀리와 플레이크 보리를 두 EPF 분리 물의 성장 배지로 사용하고 오토클레이브 백 (305mm × 660mm)을 발효 백으로 사용하십시오.
- 작은 폴리 염화 비닐 폐기물 파이프 (1000mm × 50mm)를 사용하여 오토클레이브 백의 열린 끝에 발효 백을위한 목을 만들고 오토클레이브 테이프를 사용하여 파이프를 가방에 고정하십시오.
- 발효 중에 충분한 가스 교환을 허용하기 위해 멸균 된 면직물 플러그로 파이프를 닫으십시오.
- 조각난 귀리와 조각난 보리의 건조 곡물 (200g)을 계량하여 발효 백에 넣고 각 봉지에 증류수 100mL를 넣고 주머니의 내용물을 완전히 섞습니다.
- 오토클레이빙 및 살균 전에 수분을 흡수하기 위해 젖은 곡물을 15-30 분 동안 쉬게하십시오. 각 곡물 유형에 대해 여섯 개의 백을 준비하고 오염을 방지하기 위해 가방을 다른 오토클레이브 백에 넣고 기판을 121 °C에서 55 분 동안 오토클레이브하십시오.
- 침엽수 현탁액 접종물의 제조
- 멸균 수술 블레이드를 사용하여 긁어서 M. pinghaense 와 M. robertsii 의 곰팡이 배양물에서 2-3 주령의 곰팡이 코니디아를 수확하십시오.
- 수집된 진균 코니디아를 멸균 증류수 20 mL에 현탁시키고, 0.05% 트윈 20으로 보충하고, 볼텍스-침엽수 현탁액을 2분 동안 혼합한다.
- 1 × 107 코니디아 / mL의 농도로 침엽수 현탁액 20 mL를 준비하고 조각난 귀리와 조각난 보리 고체 기질을 각각 접종하십시오.
참고: 혈구세포계를 사용하여 침엽수 농도를 결정하십시오.
- 고체 기질의 접종
- 면직물 목마개를 제거하여 각 백을 열고, 준비된 20 mL 침엽수 현탁액을 냉각된 오토클레이브 기판에 첨가한다.
- 목 플러그를 사용하여 가방을 다시 닫고 곰팡이 접종물이 곡물 기질과 고르게 섞일 수 있도록 가방의 내용물을 마사지하십시오.
- 발효 백을 ± 25°C의 제어된 온도에서 인큐베이션하고, 배양과 환경 사이의 충분한 기체 교환을 보장한다.
참고: 이 절차는 층류 캐비닛에서 수행해야 합니다.
- 발효 단계
- 접종 및 배양 2 일 후에 발효 백에 곡물 기질을 수동으로 마사지하면 눈에 보이는 균사체 성장이 발생하고 기질이 성장하는 곰팡이에 의해 뭉치기 시작했습니다.
참고 : 이것은 균류의 식물 성장의 첫 번째 초기 단계에서 균사 분지화가 일어날 수 있도록 접종 된 과립을 혼합하기 위해 수행됩니다. - 주방 롤링 핀을 사용하여 기판 베드를 조작하여 그레인 기판 베드의 물리적 이질성과 기판 질량의 침대 두께를 피하십시오.
참고 :이 과정은 곰팡이 포자 생산을 최적화하고 표면적을 극대화하여 침엽수 수율18을 촉진하는 곰팡이 대사를 촉진합니다. - 발효 과정을 최대 4-5 주 동안 계속하고 발효 과정에서 발생할 수있는 흰 식물 과증식이 있는지 2 일마다 발효 백을 확인하여 곰팡이 코니디아 수확량에 큰 영향을 줄 수 있습니다.
참고 : 흰색 식물 과증식이 들어있는 발효 백에서 발효를 즉시 종료하고 곰팡이 배양물18을 건조시킵니다.
- 접종 및 배양 2 일 후에 발효 백에 곡물 기질을 수동으로 마사지하면 눈에 보이는 균사체 성장이 발생하고 기질이 성장하는 곰팡이에 의해 뭉치기 시작했습니다.
3. 블라스토포어 접종
- 블라스토포어 생산 및 접종
- M. pinghaense와 M. robertsii 모두에 대해 증류수 1L, 포도당 30g, 효모 추출물 20g, 인산이베이거칼륨4g(K2HPO4), 옥수수 침지액 15mL, 항생제 스트렙토마이신 10μg/mL를 포함하는 액체 배지를 준비한다.
- 먼저 증류수를 가열하고 끓는점에 도달하기 전에 전원을 끈 다음 스트렙토 마이신을 제외한 각 성분을 냄비의 뜨거운 물에 첨가하십시오. 배지를 3-4 분 동안 부드럽게 끓여서 재료를 적절하게 혼합하고 냄비 바닥에 일부 성분이 침전되는 것을 방지하기 위해 배지를 지속적으로 저어줍니다.
- 총 100mL의 배지를 아홉 개의 서로 다른 250mL 플라스크에 붓고 각 플라스크에 면모 플러그를 놓고 마개로 알루미늄 호일로 면봉을 덮습니다(그림 1A).
- 배지를 플라스크에서 121°C에서 55분 동안 오토클레이브한다. 오토클레이빙 후, 플라스크의 배지를 냉각시키고 10mg/mL의 스트렙토마이신을 각 플라스크의 배지에 첨가한다(그림 1B).
- EPF 단리물, M. pinghaense 및 M . robertsii 둘 다에 대해 2-3주령의 진균 배양 플레이트로부터 진균 코니디아의 2 내지 3개의 박테리아 루프를 수집하고, 멸균 조건 하에서 250-mL 플라스크 내의 각각의 100 mL 액체 배지로 옮기고, 플라스크를 밀봉한다.
- 액체 배양 플라스크를 ± 25°C에서, 140 rpm의 오비탈 진탕기 상에서 3일 동안 인큐베이션하고, 일단 배양물이 진균 블라스토포어 성장과 함께 높은 탁도의 징후를 보이면 배양을 중단한다(도 1C).
- 배양물로부터 임의의 가능한 박테리아 오염을 검출하기 위해, 인큐베이션 동안 24시간 후에 각 액체 배양 플라스크로부터 100 μL 샘플을 채취하고 단리물 당 세 개의 SDA 플레이트 상에 플레이트를 그린다. 플레이트를 ± 25°C의 조절된 온도에서 48시간 동안 인큐베이션한다.
- 고체 기질의 제조
- M. pinghaense와 M. robertsii (Jaronski와 Jackson18에서 채택 된)의 블라스토 포자를위한 단단한 기질 매개체로 파삶은 긴 곡물 흰 쌀을 사용하십시오.
- 2.1.1-2.1.3 단계에서 위에서 설명한 바와 같이 발효 백을 준비하고 각 봉지에 쌀 1kg과 멸균 증류수 300 mL를 첨가하십시오.
- 발효 백의 내용물을 부드럽게 혼합하고, 직립 위치에 외부 오토클레이브 백에 넣고, 121°C에서 55분 동안 오토클레이브한다. 오토클레이빙 후, 기판을 무균 조건 하에서 ± 45분 동안 식히십시오.
- 접종 및 발효
- 층류 하에서 M. pinghaense 및 M. robertsii 둘 다의 각각의 액체 배양 플라스크의 폐쇄를 제거하고 각 플라스크의 테두리를 10초 동안 화염시킨다.
- 100mL의 액체 배양물을 목에서 면봉 플러그를 제거하여 발효 백에 붓습니다(그림 2). 면 플러그를 다시 끼우고 고무 밴드로 고정된 수술용 종이로 가방의 목 꼭대기를 덮습니다.
참고: 혈구분석기를 사용하여 각 플라스크의 블라스토포어 농도를 결정하고, 기질28에 접종하기 위해 1 × 107 - 5 × 108 blastospore/mL의 블라스토포자 농도를 사용하십시오. - 백의 윗부분을 비틀고 마사지에 의해 기판의 흔들림 및 가벼운 조작에 의해 백의 내용물을 혼합하고, ± 25°C에서 백을 인큐베이션하고, 백내의 기판을 평탄화시켜 두꺼운 침대(18)의 형성을 방지한다.
- 백의 내용물을 마사지하여 발효 백에 기질을 부수고, 접종 및 배양 후 2-3일 후, 균사체의 성장을 볼 때 균류에 의한 기질의 결합이 발생하였다(Jaronski 및 Jackson18의 기술로부터 적응됨).
참고 : 발효가 4 주 동안 계속되도록 허용하십시오.
도 1: 250-mL 플라스크 중의 액체 배양 배지 . (A) 오토클레이빙 전. (B) EPF 포자로 오토클레이빙 및 접종 후. (C) 곰팡이 블라스토포자가있는 탁한 배지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 제조된 블라스토포어 액체 배양 배지. (A) Metarhizium robertsii 및 (B) 쌀을 고체 기질로 접종하기 전에 메타리지움 핑하엔스 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. 곰팡이 문화의 건조
- 발효 후 10-12 일 동안 곰팡이 배양물을 건조시키고, 시험에서 사용하기 전에, 다공질 배양물을 26-30 kg (30 x 43 x 15250cm3) 갈색 종이 봉지로 옮겼다.
- 종이 봉지의 인장 강도를 향상시키려면 각 봉지의 윗부분의 3분의 1을 수평으로 자르고 가방 바닥을 정렬합니다(그림 3A, B).
그림 3 : 종이 봉지의 제조, 배양의 건조 절차 및 포장. (A, B) 갈색 종이 봉지의 준비. (C,E) 끓인 쌀과 (D,F) 조각난 보리에서 자란 메타 리지움 종 배양물의 건조 과정. (G) 종이 봉지는 삼각형 텐트 구조를 만들기 위해 스테이플로 닫힙니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 각 발효 백의 기질을 부드럽게 무너뜨리고 각 봉지의 모서리를 잘라 내고 컷오프 모서리가 남긴 공간을 통해 전체 배양물을 종이 봉지로 옮깁니다 (그림 3C-F). 곰팡이 포자가 공기 중으로 과도하게 빠져 나가는 것을 피하려면이 과정을 천천히 수행하십시오.
참고: 오염을 피하기 위해 층류를 사용하여 멸균 조건에서 이 공정을 수행하십시오. - 각 종이 봉지에 라벨을 붙이고 각 가방의 상단 끝을 두 번 접고 스테이플로 닫아 삼각형 텐트 구조를 만들고 가방을 와이어 건조 랙에 올려 놓아 ± 25 ° C의 통제 된 온도와 30-40 %의 낮은 습도에서 적절하고 건조시킬 수 있도록하십시오.
- 매일 가방을 돌려 문화를 건조시키고 수확 가능한 곰팡이 포자의 수확량을 낮추는 식물 재성장을 피하십시오.
- 건조 과정 동안 매 2일마다 각 건조 백을 계량하고, 연속적인 일 사이에 백의 질량에서 거의 또는 전혀 변화가 관찰되지 않을 때까지 각 백에 대한 건조 과정을 계속한다.
5. 곰팡이 코니디아의 수확
- 세 개의 중첩 된 체, 테스트 체 (ETS) 메쉬 번호 35 (500-μm 조리개 포함), 시험 체 (212-μm 조리개 포함)에 중첩 된 ETS 메쉬 번호 100 (150-μm 조리개 포함)에 중첩 된 수집 팬에 장착 된 세 개의 중첩 된 체를 사용하여 배양물에서 기계적으로 곰팡이 코니디아를 수확하십시오.
- 건조 배양 샘플을 ETS 메쉬 35호 체에 천천히 적재하고 곰팡이 코니디아가 공기 중으로 방출되는 것을 방지하기 위해 체에 뚜껑을 놓습니다.
- 체에 10-12 개의 유리 대리석을 추가하여 메쉬 스크린을 통해 곰팡이 코니디아가 통과하도록 돕고 체에 코니디아가 유지되지 않도록하여 포자 회복을 줄일 수 있습니다.
- 전기 테이프를 사용하여 체 조인트를 테이프로 밀봉하여 침엽수 먼지의 탈출을 방지합니다.
- 끈적 끈적한 패드가 장착된 진동 셰이커에 체를 올려 놓고 수집 팬과 체를 분당 560-640회 진동의 움직임으로 20-25분 동안 고정합니다(그림 4).
참고 : Jaronski와 Jackson18에서 채택 된 기술.
그림 4: 쌀과 조각난 보리에서 건조된 메타리지움 로베르티시 배양물에서 곰팡이 포자를 수확함. (A) 메쉬 스크린을 통한 곰팡이 코니디아의 통과를 돕기 위해 체에 10-12 개의 유리 대리석을 첨가합니다. M. robertsii conidia는 (B) 쌀에 대한 문화에서 수확하고, (C) 간신히 조각났다. (D) 진동 쉐이커에 체질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 수집 팬에서 테스트 체를 제거하고 코니디아를 수집한 다음 수집된 코니디아를 밀폐 및 불투과성 지퍼 잠금 백에 보관하여 장기간 보관하십시오(3-6개월).
6. 생산 된 곰팡이 코니디아의 정량화
- 각 기질로부터 곰팡이 코니디아를 수확하기 전에 각 그레인 기질의 질량을 측정하고 기록하십시오.
- 수집된 코니디아의 전체 중량을 고체 기질의 질량으로부터 수집된 포자의 질량을 뺀 값으로 측정한다.
참고 : 총 conidia 수확량은 수확 된 conidia뿐만 아니라 고체 기질에 남아있는 곰팡이 코니디아도 포함합니다. - 기판을 계량하고 칭량된 기판으로부터 10 g을 제거하였다. 기질 10 g을 0.05% 트윈 20에 현탁시키고, 멸균 증류수 10 mL에 희석한다.
- 소용돌이-현탁액을 2분 동안 혼합하고, 혈구세포계를 사용하여 포자 계수를 수행하여 기질로부터 세척된 코니디아의 수를 결정한다.
- 세척된 침엽수 현탁액 10 mL 중 1000 μL를 멸균 증류수 9 mL로 옮겨 10 mL의 희석 현탁액을 구성함으로써 추가 희석을 실시한다.
- 소용돌이-침엽수 현탁액을 2분 동안 혼합하고, 침엽수 농도를 결정한다.
참고: Inglis, Enkerli 및 Goettel30 에 의해 설명된 절차와 공식에 따라 현탁액의 침엽수 농도를 결정하십시오. - 각 배양물로부터 수집된 침엽수 분말 총 0.1 g을 0.05% 트윈 20이 보충된 멸균 증류수 10 mL에 현탁하고, 와류-침엽수 현탁액을 2분 동안 혼합하고, 혈구분석기를 이용하여 침엽수 농도를 결정한다.
- 10 mL 침엽수 현탁액 1000 μL를 9 mL의 멸균 증류수로 옮겨 10 mL 현탁액 희석액을 구성함으로써 추가 희석을 수행한다.
- 소용돌이 - 2 분 동안 원추형 현탁액을 혼합하고, 원추 농도를 계산하고, 그램 당 conidia의 수를 결정하십시오.
- 수확 된 분말의 그램 당 conidia의 수를 수확 된 원추 분말의 초기 질량에 곱하십시오. 기판으로부터 세척된 코니디아의 수를 소비된 기판의 총 중량에 곱하면 코니디아가 수확된 기판이 된다.
- 주어진 두 값을 함께 첨가하고 기판의 초기 건조 중량으로 나누어 기판(18)의 kg 또는 g 당 코니디아의 수를 계산한다.
참고 : 계산은 주로 쌀 기질에 대해 수행되었습니다. 발아 또는 원추형 생존력 시험은 생성된 코니디아의 생존력을 결정하기 위해 M. pinghaense 및 M. robertsii 단리물 둘 다에 대해 수행되었다.
7. 데이터 분석
- 적절한 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 사용하여 얻은 결과의 통계 분석을 수행하십시오.
참고: 데이터의 통계 분석은 STATISTICA 버전 13.5.0.17을 사용하여 수행되었습니다.
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Representative Results
M. pinghaense 및 M. robertsii 둘 다에 대한 쌀 상의 배양물의 함량 질량의 감소는 진균 배양물의 건조 단계 동안 시간에 따라 관찰되었으며, 배양물이 건조되면 질량에서 관찰되는 변화가 없거나 거의 관찰되지 않았다(도 5). M. pinghaense 및 M. robertsii 둘 다의 수확된 건조 진균 코니디아 분말을 도 6에 나타내었다.
도 5: 10일에 걸친 쌀 상의 메타리지움 로베르트시 이 및 M. 핑하엔세 배양물의 봉지 함량 질량의 변화(95% 신뢰 구간) ( ANOVA; F5,35 = 2.21; p = 0.08). 막대 위의 다른 문자는 며칠 동안 가방 함량 질량에서 얻은 유의한 차이 (p < 0.05)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 수확된 원추종. (A) 수집 팬에서 수확된 코니디아. (B) 메타리지움 로베르츠이. (C) M. 핑하엔세. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
M. pinghaense 및 M. robertsii 둘 다에 대해 각 곡물 유형으로부터 수확된 평균 원추형 분말에서 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 둘 다에 대해 수확된 건조 코니디아는 M. pinghaense 및 M. robertsii 둘 다에 대해 평균 >90%의 원추형 생존력을 가졌다. 쌀 기질 상에서, M. pinghaense는 평균 8.2 g± 4.38 g의 원추형 분말을 생산했으며, 이는 M. robertsii (6 g ± 2 g)에 대해 수득 된 양을 약간 초과했다. 평균 1.83g± 1.47g의 건조 M. robertsii conidia가 플레이크된 보리 기질로부터 수확된 반면, 제로 M. 핑하엔세는 기질로부터 수확되었다. M. pinghaense 또는 M. robertsii에 대한 플레이크 된 귀리 기질에서 건조한 곰팡이 코니디아를 수확하지 않았습니다 (그림 7).
그림 7: 코니디아 분말의 평균 양. Metarhizium pinghaense 및 M. robertsii의 코니디아 분말의 평균 양은 세 가지 고체 기질로부터 수확 된 그램 (95 % 신뢰 구간)으로 측정됩니다 : 파삶은 쌀, 조각난 보리 및 플레이크 귀리 (ANOVA : F2,27 = 2.82; p = 0.08). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
쌀알에서 수확한 그램당 추정된 평균 코니디아의 유의한 차이는 M. pinghaense (3.51 x 10 7/g ± 0.43 x 10 7/g)와 M. robertsii (4.31 x 107/g ± 0.38 x 10 7/g) 사이에서 관찰되었다. M. robertsii는 M. pinghaense보다 그램 당 평균 코니디아 카운트가 약간 더 높았다 (그림 8).
그림 8: 그램당 평균 코니디아. 쌀 배양물로부터의 메타리지움 핑하엔스 및 M. robertsii (95% 신뢰 구간)에 대한 그램 당 추정된 평균 코니디아이다 (ANOVA: F 1,7 = 8.47; p = 0.02). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
소비된 쌀 기질 상에 존재하는 추정된 코니디아 수에 유의한 차이는 M. pinghaense (5.02 x 10 7/mL ± 1.47 x 10 7/mL)와 M. robertsii (3.70 x 107/mL ± 0.91 x 107/mL) 사이에서 관찰되지 않았다(도 9). 그러나, M. pinghaense는 M. robertsii보다 쌀 기질 상에 존재하는 코니디아의 수가 약간 더 많았다.
그림 9: 평균 곰팡이 코니디아. 추정된 평균 진균성 코니디아의 메타리지움 핑하엔스 및 M robertsii (95% 신뢰 구간)로부터의 배양물 (F1,7 = 2.45; p = 0.16)은 소비된 벼 배양 기질 상에 존재한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
추정된 전체 코니디아 수율에서 유의한 차이는 벼 기질 배양물로부터 얻은 M. pinghaense (5.09 x 10 7/g ± 1.35 x 10 7/g)와 M. robertsii (3.55 x 10 7/g ± 0.85 x 10 7/g) 사이에서 관찰되지 않았다. 그러나, M. pinghaense는 M. robertsii보다 약간 더 높은 원뿔 수율을 생성하였고, 이는 더 낮은 원뿔 수율을 생성하였다(그림 10).
그림 10: 총 코니디아 수율. 쌀 상의 배양물로부터의 메타리지움 핑하엔스 및 M. robertsii (95% 신뢰 구간)의 추정된 총 코니디아 수율 (F1,7 = 3.91; p = 0.09). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
농업 생태계에서 중요한 농업 곤충 해충의 생물학적 방제를위한 미생물 제제의 성공적인 통합은 실험실 조건 하에서 첫 번째 단계로서 엔토모 병원균의 대량 생산의 성공과 용이성에 달려 있습니다. EPF의 대량 생산은 생물학적 제어 9,10,11,12,13을 사용하는 IPM 프로그램을위한 EPF 제품의 대규모 적용 및 가용성에 중요합니다. 다른 EPF 분리 물의 대량 생산의 성공은 생산 기질 또는 배지의 영양 성분에 의해 영향을받으며, 이는 효능, 건조성 내성, 현장 지성 및 원추형 수율을 포함하여 결과 원추의 특성에 큰 영향을 미칩니다 8,19,20,21 . 따라서 재배 및 발효 과정에서 대량 생산되는 엔토모병원균의 영양 요건에 대한 지식을 개발하는 것이 중요합니다29.
현재 연구에서 M. robertsii와 M . pinghaense 의 대량 생산은 발효 기질로 세 가지 농산물을 사용하여 수행되었습니다 : 끓인 쌀, 조각난 보리 및 플레이크 귀리. 세 개의 상이한 그레인 기질이 진균 단리물의 침엽수 수율에 유의하게 영향을 미치는 것으로 관찰되었다. 끓인 쌀은 두 분리 물의 대량 생산에 매우 유리했으며, 조각난 보리 곡물은 M. robertsii 의 생산만을 선호했습니다. 관찰은 발효 후 건조 진균 코니디아 분말의 수율에 기초하여 이루어졌다. 거의 또는 전혀 없이, 코니디아는 발효 후 플레이크된 귀리로부터 수확되었다. 조각난 귀리는 발효 과정에서 발효 백에 더 높은 수준의 수분을 보유하는 것으로 밝혀졌으며, 이로 인해 M. pinghaense 및 M. robertsii의 생산을위한 기질로서 곡물의 성능이 저하되었을 수 있습니다. 플레이크 된 귀리 기질은 곰팡이 분리 물의 흰색 식물 균사 과잉 성장이 발생하기 쉬웠으며, 이는 과다 증식을 포함하는 발효 백에서 다공이 발생하지 않았기 때문에 침엽수 수확량에 큰 영향을 미쳤습니다. 플레이크 된 귀리 기질을 가진 발효 백은 또한 플레이크 보리 기질을 함유 한 발효 백에 비해 높은 수준의 박테리아 오염을 갖는 것으로 관찰되었다.
플라크된 보리를 기질로 사용하는 M. pinghaense 의 대량 생산과 관련하여 높은 수준의 saprophytic 진균 또는 효모 오염이 관찰되었다. 상기 saprophytic 진균 오염은 기질을 접종하는데 사용된 것 이외의 균류의 성장 및 conidiogenesis를 통해 발효 과정의 후기 단계에서 관찰되었다. 침엽수 다공 이전에 발효의 초기 단계에서 기질 오염을 진단하는 것은 어려웠습니다. 발효 과정에서 박테리아와 효모 오염은 기질의 젖은 패치에 의해 나타나는 것으로 생각되며, 조각난 귀리와 보리 곡물 모두 쌀알보다 오랫동안 수분을 흡수하고 유지하는 경향이 있습니다. 이는 두 개의 메타리지움 단리 물의 대량 생산을 위한 발효 기질로서 이들 두 기질을 사용하는 데 한계가 있었다.
현재 연구 기간 동안 이루어진 관찰은 각 곡물 기질을 접종하는 데 사용 된 접종 방법의 유형이 침엽수 생산에 영향을 미친다는 것을 보여주었습니다. 침엽수 현탁 접종 방법은 쌀알에 액체 배양된 블라스토포어 접종 방법을 사용한 경우에 비해 증가된 오염 수준을 보인 플레이크 귀리와 플레이크 보리가 상대적으로 덜 효과적인 것으로 밝혀졌다. 액체 배양 된 blastospore 접종 방법과는 달리, 원추형 현탁액 방법은 기질의 접종 전에 현탁액에서 가능한 오염 물질의 검출을 허용하지 않으며, 발효 백에서 관찰 된 높은 수준의 오염을 초래합니다. Jaronski와 Jackson18은 기질의 완전한 살균 부족, 비멸균 접종 및 백에서 발효 기질의 부적절한 취급과 같이 사용 된 기질의 오염 가능성을 유발할 수있는 몇 가지 요인을 설명했습니다. 플레이크 보리와 플레이크 된 귀리가 들어있는 발효 백에서 관찰 된 오염은 또한 오토 클레이빙 과정에서 발생할 수있는 기질의 완전한 살균 부족으로 인한 것일 수 있습니다. Jaronski와 Jackson18 은 또한 침엽수 현탁액을 접종제로 사용하는 것이 불리한 것으로 묘사했는데, 이는 한천 배지에서 침엽수 수확 중에 오염 가능성이 증가하기 때문입니다.
현장에서, 적합한 숙주의 감염 동안, 곰팡이는 먼저 곤충(30)의 외부 고체 표면에 출현하고 다공되기 전에 증식을 통해 곤충의 헤모코엘에 바이오 매스를 축적합니다. 이러한 과정은 액체-블라스토포어 발효 방법을 사용할 때 모방되었다. 따라서 국물은 곤충의 헤모코엘을 대표하고, 곰팡이 코니디아로 국물을 접종하는 것은 곤충의 초기 접촉과 감염을 나타내며, 국물에서 배반포자의 형성은 감염된 곤충의 헤모코엘 내부에서 발생하는 배반포자 과정의 증식을 나타냈다. 쌀알의 최종 접종과 시간이 지남에 따라 곡물에 곰팡이가 다공하는 것은 곰팡이가 곤충의 사체 내부에서 나오기 시작하면 곤충의 표피에서 일어나는 일을 나타냅니다. 이것은 아마도 액체 블라스토포어 발효 방법이 침엽수 현탁액 접종 방법보다 더 잘 작동하는 이유를 설명 할 수 있습니다.
Jaronski와 Jackson18 은 두 가지 곡물 유형이 발효 과정에서 수분 함량을 유지하는 것으로 밝혀 졌기 때문에 쌀 곡물에 비해 Metarhizium 종의 대량 배양에 선호되는 농업 곡물로 플레이크 귀리와 플랙 보리 곡물을 설명했습니다. 그러나 현재의 연구는 앞서 언급 한 연구원들의 관찰과 결론과 모순되며, 조각난 귀리와 조각난 보리는 M. pinghaense 또는 M. robertsii에 대한 좋은 고체 발효 기질로 발견되지 않았기 때문입니다. 쌀은 이전 연구에서 제안 된 것처럼 최종 제품과 혼합 할 수있는 작은 입자로 분해되지 않았기 때문에 두 분리 물 모두에 좋은 곡물 기질로 밝혀졌습니다.
현재의 연구에 따르면 메타 리지움 종의 분리 물은 쌀알을 사용하여 성공적으로 배양되고 대량 생산 될 수 있으며 다른 곡물은 침엽수 다공에 영향을 미치고 수확량이 다른 경향이 있음을 보여주었습니다. 이것은 아마도 다른 곡물이 그러한 영양 조성의 측면에서 다르다는 사실 때문일 수 있습니다 (예 : 탄소 : 질소 비율 및 탄소 농도). 성장 배지의 탄소 농도와 탄소 : 질소 비율은 코니디아의 수율뿐만 아니라 생존력과 독성 측면에서 품질에 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다22. 기질을 접종하는데 사용되는 접종 기술은 또한 특정 농업 곡물 기질 상의 EPF 단리물의 대량 생산에서 달성되는 성공 정도에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 따라서, 현재 연구에 기술된 액체 블라스토포어 발효 기술은 M. pinghaense 및 M . robertsii 단리물 둘 다의 대량 생산을 위한 농업용 곡물 기질을 위한 최상의 접종 방법인 것으로 추천된다. 이러한 방법을 사용하면 접종제의 사용 전에 오염의 가능한 검출이 가능하며, 이는 침엽수 현탁액 접종 기술의 사용에 비해 원하는 EPF 단리물의 대량 생산을 방해할 수 있다. 또한 쌀알은 플랙 보리와 조각난 귀리가 아닌 M. pinghaense 와 M. robertsii의 conidia의 대량 생산을위한 고체 기질로 사용하는 것이 좋습니다. 설명 된 기술은 농업 생태계에서 중요한 곤충 해충에 대한 현장 조건 하에서 코니디아의 향후 대량 생산 및 상업적 적용에 중요합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 Hort Pome, Hort Stone, 그리고 프로젝트 자금을 지원해 주신 산업 프로그램 기술 및 인적 자원 (THRIP : TP14062571871)에 감사드립니다.
오시드:
레토디 엘 마툴웨 http://orcid.org/0000-0002-5118-3578
앙투아네트 P. 말란 http://orcid.org/0000-0002-9257-0312
노막홀와 F. 스토크웨 http://orcid.org/0000-0003-2869-5652
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Tween 20 | Lasec | Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water | |
| 20 mL McCartney bottles | Lasec | Used to make conidial suspensions | |
| Aluminium foil | Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask | ||
| Autoclave | Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process | ||
| Autoclave bags | Lasec | Fermentation bags or solid substrate containers | |
| Autoclave tape | Lasec | To secure PVC pipes on the fermentation bags | |
| Brown Kraft paper bags | Used to dry conidia cultures on agricultural grains | ||
| Bunsen burnner | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks) | |
| Clear edge test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
| Corn steep liquor | SIGMA | 66071-94-1 | Ingredient of the blastospore liquid medium |
| Cotton Wool | Lasec | Used as plug of the neck for fermentation bags | |
| Duran laboratory bottles | Neolab | Used to autoclave SDA medium and distilled water | |
| Electrical tape | Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust | ||
| ENDECOTTS test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
| Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask | Lasec | Carrier of the blastospore liquid medium | |
| Ethanol (99%) | Lasec | Used to sterilize surgical blades and inoculating loops | |
| Flaked barley | Health Connection Wholefoods | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Flaked oats | Tiger brands | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Glucose | Merck | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
| Growth Chamber/ incubators | For growing fungal conidia culture | ||
| Haemocytometer | Used to determine conidial concentrations | ||
| Inoculating loops | Lasec | For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth | |
| Kitchen rolling pin | Used to manipulate the solid grain substrate bed | ||
| Laminar flow Cabinet | ESCO Laminar Flow Cabinet | Provide as sterile environment during substrate inoculation | |
| Metarhizium pinghaense conidia | Stellenbosch University | 5HEID | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense |
| Metarhizium robertsii conidia | Stellenbosch University | 6EIKEN | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii |
| Microscope | ZEIZZ (Scope. A1) | Used to determine conidial concentrations and conidial viability | |
| Orbital shaker | IncoShake- LABOTEC | Used for the blastospore production process | |
| Parboiled rice | Spekko | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Penicillin-Streptomycin | SIGMA | Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination | |
| Petri-dishes | Lasec | Containers for the SDA medium | |
| Pipettes and pipette tips | Labnet (BioPette PLUS) | Used to measure liquids ingredients | |
| Polyvinylchloride Marley waste pipe | Used to create a neck for the fermentation bag | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
| Rubber band | Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks | ||
| Sabaroud dextrose agar (SDA) | NEOGEN Culture Media | Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii | |
| Sterile distilled water | To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions | ||
| Sticky pad | Used to secure the seives on the vibratory shaker | ||
| Surgical blade | Lasec | Used to scrape off spores from fungal cultures | |
| Surgical paper | Lasec | Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag | |
| Vibratory shaker | Used to shake conidia off the agricultural grain substrates | ||
| Vortex mixer | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles | |
| Yeast extract | Biolab | Added to the SDA medium to improve spore germination and growth | |
| Zipper-lock bags | GLAD | Used to to store harvested fungal conidia |
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