Summary
Энтомопатогенные грибы приобрели значение в качестве агентов биологического контроля сельскохозяйственных насекомых-вредителей. В данном исследовании было успешно проведено массовое производство достаточного количества устойчивых инфекционных пропагул южноафриканских изолятов как Metarhizium robertsii , так и M. pinghaense для коммерческого применения против насекомых-вредителей с использованием сельскохозяйственных зерновых продуктов.
Abstract
Энтомопатогенные грибы видового комплекса Metarhizium anisopliae приобрели значение в качестве агентов биологического контроля сельскохозяйственных насекомых-вредителей. Повышение устойчивости вредителей к химическим инсектицидам, растущая обеспокоенность по поводу негативного воздействия инсектицидов на здоровье человека и загрязнение окружающей среды пестицидами привели к глобальному стремлению найти новые устойчивые стратегии защиты растений и борьбы с вредителями. Ранее предпринимались попытки массовой культивации таких энтомопатогенных видов грибов (EPF), как Beauveria bassiana . Однако были предприняты лишь ограниченные попытки массового культивирования Metarhizium robertsii и M. pinghaense для использования против насекомых-вредителей. Это исследование было направлено на массовое получение достаточного количества устойчивых инфекционных пропагул южноафриканских изолятов M. robertsii и M. pinghaense для коммерческого применения. Три сельскохозяйственных зерновых продукта, слоеный овес, шелушащийся ячмень и рис, были использованы в качестве твердых ферментационных субстратов EPF. Для инокуляции твердых субстратов использовали два метода инокуляции, конидиальные суспензии и жидкую грибковую культуру бластоспор. Было отмечено, что инокуляция с использованием конидиальных суспензий была относительно менее эффективной, поскольку на твердых субстратах наблюдались повышенные уровни загрязнения по сравнению с использованием метода инокуляции бластоспор. Было обнаружено, что шелушащийся овес не является подходящим субстратом для роста как для M. robertsii , так и для M. pinghaense, поскольку с субстрата не собирали сухих конидий. Было обнаружено, что шелушеный ячмень благоприятствует производству M. robertsii conidia по сравнению с M. pinghaense, и в среднем из субстрата было собрано 1,83 г ± 1,47 г сухой M. robertsii conidia и ноль граммов M. pinghaense conidia. Было обнаружено, что рисовые зерна благоприятствуют конидиальному массовому производству изолятов M. pinghaense и M. robertsii , в среднем 8,2 г ± 4,38 г и 6 г ± 2 г, собранных из субстрата, соответственно.
Introduction
Энтомопатогенные грибы (EPF) приобрели важное значение в качестве средств защиты растений в биологической борьбе с важными сельскохозяйственными насекомыми-вредителями 1,2. Энтомопатогены, встречающиеся естественным образом в почве, вызывают эпизоотии в популяциях различных видов вредителей3. Виды EPF специфичны для хозяина и представляют относительно небольшой риск с точки зрения нападения на нецелевые виды, и они нетоксичны для окружающей среды4. EPF имеют уникальный механизм для вторжения в своего хозяина, а также для распространения и сохранения в их ближайшем окружении1. Они атакуют хозяина в основном через бесполые споры, которые прикрепляются и проникают в кутикулу хозяина, чтобы вторгнуться и размножаться в гемокоэле хозяина. Хозяин в конечном итоге умирает из-за истощения питательных веществ гемолимфы или в результате токсикоза, вызванного токсичными метаболитами, выделяемыми грибком. После смерти, в идеальных условиях окружающей среды, грибок появляется на внешней поверхности (явный микоз) трупа хозяина 5,6.
Растущая обеспокоенность по поводу негативного воздействия химических остатков на здоровье человека, загрязнения окружающей среды и развития устойчивости к вредителям привела к глобальному стремлению сократить потребление инсектицидов на химической основе и найти альтернативные, новые и устойчивые стратегии защиты растений и борьбы с вредителями 6,7,8 . Это предоставило возможности для разработки инсектицидов на основе микробов для использования в программах комплексной борьбы с вредителями (IPM), которые являются более экологически благоприятными стратегиями, чем обычный химический контроль 3,8.
Чтобы разработать успешный микробный агент борьбы с сельскохозяйственным вредителем, подходящий организм должен быть сначала выделен, охарактеризован, идентифицирован и подтверждена его патогенность для целевого вредителя. Однако для получения жизнеспособного продукта для использования в программах биологического контроля 9,10,11,12,13 требуется простой и экономически эффективный метод крупномасштабного производства микробного агента. Массовое производство значительных количеств высококачественных энтомопатогенов зависит от микробного штамма, окружающей среды, целевого вредителя, состава, рынка, стратегии применения и желаемого конечного продукта 14,15,16. EPF может быть массово произведен с использованием ферментации жидкого субстрата для получения бластоспор или процесса ферментации твердого субстрата для получения воздушных конидий 6,17,18. Однако процесс массового производства и рецептуры энтомопатогенов напрямую влияет на вирулентность, стоимость, срок годности и полевую эффективность конечного продукта. Для успешного использования в IPM процесс производства энтомопатогенов должен быть простым в эксплуатации, требовать минимальной рабочей силы, производить высокую концентрацию вирулентных, жизнеспособных и стойких пропагул и быть недорогим 4,13,14,16.
Понимание потребностей в питании энтомопатогенов важно для массового выращивания всеми методами культивирования 4,12. Питательные компоненты производственной среды оказывают значительное влияние на характеристики полученных пропагул, включая эффективность биоконтроля, выход, устойчивость к высыханию и стойкость 8,19,20,21. Оптимизация производственных процедур предназначена для устранения таких факторов22. Для EPF основными требованиями для хорошего роста, споруляции и массового производства грибковых конидий являются достаточная влажность, оптимальная температура роста, рН, газообмен CO2 и O2 и питание, включая хорошие источники фосфора, углеводов, углерода и азота18.
Jaronski и Jackson18 описывают метод ферментации твердого субстрата как наиболее эффективный и наиболее близкий метод приближения к естественному процессу производства EPF по сравнению с методом ферментации жидкого субстрата, поскольку в естественных условиях грибковый конидиум переносится на твердые прямостоячие структуры, такие как поверхность трупов насекомых. Сельскохозяйственные продукты и побочные продукты, содержащие крахмал, в основном используются для массового производства гипокреальных грибов, поскольку грибы легко разлагают крахмал путем секреции высококонцентрированных гидролитических ферментов из своих гифальных кончиков, проникают в твердое вещество и получают доступ к питательным веществам, присутствующим в веществе 11,17,18,23 . Зерновые продукты также обеспечивают требования для здорового производства биомассы, потому что, когда они гидратируются и стерилизуются, субстраты могут поглощать дополнительные питательные вещества из любой жидкой среды 16,18,24.
Ранее в нескольких исследованиях предпринимались попытки массового культивирования видов EPF, таких как Beauveria bassiana (Bals.) Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Виегас и некоторые из Metarhizium anisopliae (Metschn.) Сорокинский видовой комплекс изолирует на различных субстратах 16,23,24. К таким массово производимым и коммерчески разработанным изолятам относятся Green Muscle® (штамм IMI 330189), разработанный из M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner) J.F. Bisch, Rehner & Humber, Metarhizium 69 (Meta 69 штамм ICIPE69), и Real Metarhizium 69 (L9281), разработанный из M. anisopliae, и Broadband® (штамм PPRI 5339) и Eco-Bb®, разработанный из B. bassiana25,26 . Однако были предприняты ограниченные попытки массовой культуры Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner & Humber и Metarhizium pinghaense Chen & Guo. Эти два изолята были выбраны в предыдущем исследовании как наиболее эффективные для борьбы с мучнистым червецом, Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)27. Поэтому настоящее исследование направлено на формулирование и массовое производство достаточного количества устойчивых инфекционных пропагул местных изолятов M. robertsii и M. pinghaense для коммерческого применения против насекомых-вредителей. Метод ферментации твердого субстрата был использован для массового получения грибковых конидий для обоих изолятов EPF. Два метода инокуляции EPF, с использованием конидиальных суспензий и жидкой грибковой культуры бластоспор, были использованы для инокуляции твердых субстратов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Источник грибковых штаммов
- Используйте южноафриканские изолированные грибковые штаммы как M. pinghaense 5 HEID (номер присоединения GenBank: MT367414/MT895630), так и M. robertsii 6EIKEN (MT378171/MT380849), собранные из яблоневых садов в Западно-Капской провинции, Южная Африка.
- Выращивать культуры каждого изолята EPF на 60 г агаровой среды декстрозы Сабуро, дополненной 1 г дрожжевого экстракта (SDAY) и 10 мкл стрептомицина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубировать культуры EPF при контролируемой температуре ± 25 °C в темноте.
2. Metarhizium pinghaense и M. robertsii конидиальная суспензионная прививка
- Подготовка твердых подложек
- Используйте два сельскохозяйственных продукта, а именно слоеный овес и шелушащийся ячмень, в качестве питательных сред для двух изолятов EPF и автоклавных мешков (305 мм × 660 мм) в качестве ферментационных мешков.
- Используйте небольшую поливинилхлоридную сточную трубу (1000 мм × 50 мм) для создания горлышка для ферментационного мешка на открытом конце автоклавного мешка и используйте автоклавную ленту для крепления трубы к мешку.
- Закройте трубу стерильной ватный пробкой, чтобы обеспечить достаточный газообмен во время ферментации.
- Взвесьте сухие зерна (200 г) как слоеного овса, так и слоеного ячменя и поместите их в ферментационные мешки, а в каждый пакет добавьте 100 мл дистиллированной воды и тщательно перемешайте содержимое пакетов.
- Оставьте влажные зерна отдыхать на 15-30 мин, чтобы впитать влагу перед автоклавированием и стерилизацией. Подготовьте шесть пакетиков для каждого типа зерна и, чтобы предотвратить загрязнение, поместите мешки в другие автоклавные мешки и автоклавируйте субстраты при 121 ° C в течение 55 мин.
- Приготовление конидиальной суспензии инокулята
- Собирают 2-3-недельные грибковые конидии из грибковых культур как M. pinghaense , так и M. robertsii путем выскабливания, используя стерильную хирургическую лопатку.
- Суспендировать собранные грибковые конидии в 20 мл стерильной дистиллированной воды, дополненной 0,05% Tween 20, и вихрево-смешать конидиальные суспензии в течение 2 мин.
- Готовят 20 мл конидиальных суспензий с концентрацией 1 × 107 конидий/мл и инокулируют отслаивающийся овсяный и шелушащийся твердые субстраты ячменя соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте гемоцитометр для определения конидиальных концентраций.
- Инокуляция твердых подложек
- Откройте каждый мешок, сняв горловину из ваты, и добавьте подготовленную конидиальную суспензию объемом 20 мл в охлажденную автоклавную подложку.
- Снова закройте мешочки, используя шейные пробки, и массируйте содержимое пакета, чтобы грибковый инокулятор равномерно смешался с зерновым субстратом.
- Инкубируйте ферментационные мешки при контролируемой температуре ± 25 °C и обеспечьте достаточный газообмен между культурой и окружающей средой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура должна проводиться под ламинарным шкафом.
- Фаза ферментации
- Вручную массируйте зерновые субстраты в ферментационных мешочках через 2 дня после посева и инкубации, когда происходит видимый рост мицелиальных субстратов и субстрат начинает слипаться растущим грибком.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это делается для смешивания привитых гранул, чтобы обеспечить ветвление мицелия на первых ранних стадиях вегетативного роста грибов. - Используйте кухонную скалку для манипулирования слоем субстрата, чтобы избежать физической неоднородности слоев зернового субстрата и толщины слоя массы субстрата.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс способствует грибковому метаболизму, что оптимизирует производство спор грибов и максимизирует площадь поверхности, способствуя конидному выходу18. - Оставьте процесс ферментации продолжаться до 4-5 недель и проверяйте ферментационные мешки каждые 2 дня на наличие любого белого вегетативного разрастания, которое может развиться во время процесса ферментации, что может сильно повлиять на выход грибковых конидий.
ПРИМЕЧАНИЕ: Немедленно прекратить ферментацию в ферментационных пакетах, содержащих любой белый вегетативный разрастание, и высушить грибковые культуры18.
- Вручную массируйте зерновые субстраты в ферментационных мешочках через 2 дня после посева и инкубации, когда происходит видимый рост мицелиальных субстратов и субстрат начинает слипаться растущим грибком.
3. Бластоспоровая прививка
- Производство и инокуляция бластоспор
- Приготовьте жидкую питательную среду, содержащую 1 л дистиллированной воды, 30 г глюкозы, 20 г дрожжевого экстракта, 4 г диабосновного фосфата калия (K2HPO4), 15 мл кукурузного крутого ликера и 10 мкг/мл антибиотика Стрептомицина, как для M. pinghaense , так и для M. robertsii.
- Сначала нагрейте дистиллированную воду, выключите до достижения точки кипения и добавьте каждый из ингредиентов, кроме стрептомицина, в горячую воду в кастрюле. Доведите среду до мягкого кипения в течение 3-4 минут и постоянно помешивайте среду, чтобы обеспечить правильное смешивание ингредиентов и предотвратить оседание некоторых ингредиентов на дне кастрюли.
- Вылейте в общей сложности 100 мл среды в девять различных колб по 250 мл и поместите на каждую колбу ватный штекер и накройте вату алюминиевой фольгой в качестве пробки (рисунок 1А).
- Автоклав среды в колбах в течение 55 мин при 121 °C. После автоклавирования дайте среде в колбах остыть и добавьте 10 мг/мл стрептомицина к среде в каждой колбе (рисунок 1B).
- Соберите две-три бактериальные петли грибковых конидий из 2-3-недельных пластин грибковой культуры для обоих изолятов EPF, M. pinghaense и M. robertsii, и переложите в каждую 100 мл жидкую среду в колбах по 250 мл в стерильных условиях и запечатайте колбы.
- Инкубируют колбы с жидкими культурами при ± 25 °C, на орбитальном шейкере при 140 об/мин в течение 3 дней и прекращают инкубацию, как только культуры проявляют признаки высокой мутности с ростом грибковых бластоспор (рисунок 1C).
- Чтобы обнаружить любое возможное бактериальное загрязнение от культур, возьмите образец 100 мкл из каждой жидкой колбы культуры через 24 ч во время инкубации и пластину на трех пластинах SDA на изолят. Инкубировать пластины в течение 48 ч при контролируемой температуре ± 25 °C.
- Подготовка твердой подложки
- Используйте пропаренный длиннозернистый белый рис в качестве твердой субстратной среды для бластоспор как M. pinghaense , так и M. robertsii (адаптировано из Jaronski and Jackson18).
- Подготовьте ферментационные мешки, как описано выше, на этапах 2.1.1-2.1.3, и к каждому пакетику добавить 1 кг риса и 300 мл стерильной дистиллированной воды.
- Аккуратно перемешайте содержимое ферментационных пакетов и поместите во внешние автоклавные мешки в вертикальном положении, а автоклав при 121 °C в течение 55 мин. После автоклавирования дайте субстратам остыть в течение ± 45 мин в стерильных условиях.
- Инокуляция и ферментация
- Снимите закрытие каждой из фляг с жидкими культуральными культурами как M. pinghaense , так и M. robertsii под ламинарной струей и воспламените ободок каждой колбы в течение 10 с.
- Вылейте жидкие культуры объемом 100 мл в ферментационные мешки, удалив пробки из ваты с их шейк (рисунок 2). Поместите ватные пробки обратно и покройте верхнюю часть шеи сумки хирургической бумагой, закрепленной резинкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Определите концентрацию бластоспор для каждой колбы с помощью гемоцитометра и используйте концентрации бластоспор 1 × 107 - 5 × 108 бластоспор/мл для иннокуляции субстратов28. - Скрутите верхнюю часть мешка и перемешайте содержимое мешка путем встряхивания и легких манипуляций с субстратом путем массажа, и высиживайте мешки при ± 25 °C, расплющивая субстрат в мешках, чтобы предотвратить образование толстых слоев18.
- Разбейте субстрат в ферментационных мешках, массируя содержимое мешков, через 2-3 дня после посева и инкубации, когда произошел видимый рост мицелиала и связывание субстрата грибком (адаптировано из техники Яронски и Джексона18).
ПРИМЕЧАНИЕ: Дайте ферментации продолжаться в течение 4 недель.
Рисунок 1: Жидкая культуральная среда в колбах по 250 мл. (А) Перед автоклавированием. (B) После автоклавирования и инокуляции спорами EPF. (C) Мутная среда с грибковыми бластоспорами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Подготовленная бластоспоровая жидкая культуральная среда. (A) Metarhizium robertsii и (B) Metarhizium pinghaense до посева риса в качестве твердого субстрата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
4. Сушка грибковых культур
- Высушите грибковые культуры в течение 10-12 дней после ферментации, перед их использованием в испытаниях, путем переноса спорулированных культур в коричневые бумажные пакеты по 26-30 кг (30 х 43 х 15250см3).
- Чтобы улучшить прочность бумажных пакетов на растяжение, горизонтально отрежьте одну треть верхней части каждого пакета и выровняйте нижнюю часть пакета (рисунок 3A, B).
Рисунок 3: Подготовка бумажных пакетов, процедура сушки культур и упаковка. (А,Б) Подготовка коричневых бумажных пакетов. Процедура сушки культур видов Metarhizium, выращенных на (C,E) пропаренном рисе и (D,F) шелушащемся ячмене. (G) Бумажные пакеты, закрытые скобами для создания треугольной структуры палатки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
- Аккуратно рассыпьте субстрат в каждом ферментационном пакете, отрежьте угол каждого пакета и перенесите всю культуру в бумажные пакеты через пространство, оставленное отрезанным углом (рисунок 3C-F). Чтобы избежать чрезмерного выхода грибковых спор в воздух, выполняйте этот процесс медленно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите этот процесс в стерильных условиях, используя ламинарный поток, чтобы избежать загрязнения. - Нанесите этикетку на каждый бумажный пакет и сложите верхний конец каждого пакета дважды и закройте скобами, чтобы создать треугольную структуру палатки, и поместите мешки на сушильные полки для проволоки, чтобы обеспечить правильную, равномерную сушку, при контролируемой температуре ± 25 ° C и низкой влажности 30-40%.
- Переворачивайте мешки ежедневно, чтобы обеспечить равномерное высыхание культур и избежать любого вегетативного роста, который может произойти, что снизит урожайность грибковых спор.
- Взвешивайте каждый сушильный мешок через каждые 2 дня в процессе сушки и продолжайте процесс сушки для каждого пакета до тех пор, пока в массе пакетов между последующими днями практически не будет наблюдаться никаких изменений.
5. Заготовка грибковых конидий
- Собирают грибковые конидии механически из культур с помощью трех вложенных сит, тестового сита (ETS) сетки No 35 (с диафрагмой 500 мкм), вложенной на тестовое сито (с диафрагмой 212 мкм), вложенной в сетку ETS No 100 (с диафрагмой 150 мкм), установленной на поддоне для сбора.
- Медленно загрузите образец сухой культуры на сито сетки ETS No 35 и поместите крышку на сито, чтобы предотвратить выброс грибковых конидий в воздух.
- Добавьте 10-12 стеклянных шариков в сита, чтобы облегчить прохождение грибковых конидий через сетчатые экраны и избежать удержания конидий в сите, что может привести к снижению восстановления спор.
- Заклейте и заклейте ситовые соединения с помощью электрической ленты, чтобы предотвратить выход конидиальной пыли.
- Поместите сита на вибрационный шейкер, оснащенный липкой прокладкой, чтобы закрепить сборный поддон и сита, на 20-25 мин, при движении 560-640 колебаний в минуту (рисунок 4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Техника адаптирована из Jaronski и Jackson18.
Рисунок 4: Сбор спор грибов из сушеных культур Metarhizium robertsii на рисе и шелушащемся ячмене. (A) 10-12 стеклянных шариков, добавленных к ситам, чтобы облегчить прохождение грибковых конидий через сетчатые экраны. M. robertsii conidia собирали из культур на (B) рисе, и (C) с трудом шелушились. (D) Сита на вибрационном шейкере. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
- Извлеките тестовые сита из поддона для сбора, соберите конидии и храните собранные конидии в герметичных и водонепроницаемых пакетах-молниях для длительного хранения (3-6 месяцев).
6. Количественная оценка полученных грибковых конидий
- Измерьте и запишите массу каждого зернового субстрата до сбора грибковых конидий с каждого субстрата.
- Измерьте общий вес собранных конидий, вычитая массу собранных спор из массы твердого субстрата.
ПРИМЕЧАНИЕ: Общий урожай конидий включает в себя не только собранные конидии, но и грибковые конидии, оставшиеся на твердом субстрате. - Взвесьте подложку и извлеките 10 г из взвешенной подложки. Суспендировать 10 г субстрата в 0,05% Tween 20 и разбавить в 10 мл стерильной дистиллированной воды.
- Вихрево -смешайте суспензию в течение 2 мин, и используйте гемоцитометр, чтобы сделать подсчет спор, чтобы определить количество конидий, вымываемых с субстрата.
- Проводят дальнейшие разбавления путем переноса 1000 мкл промытой конидиальной суспензии 10 мл в 9 мл стерильной дистиллированной воды, чтобы составить 10 мл суспензий разбавления.
- Вихрь - смешайте конидиальные суспензии в течение 2 мин и определите конидиальные концентрации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте процедуре и формуле, описанным в Inglis, Enkerli и Goettel30 , чтобы определить конидиальную концентрацию суспензий. - Собирают и суспендируют в общей сложности 0,1 г собранного конидиального порошка из каждой культуры в 10 мл стерильной дистиллированной воды, дополненной 0,05% Tween 20, и вихрево-смешивают конидиальную суспензию в течение 2 мин и определяют конидиальную концентрацию с помощью гемоцитометра.
- Проводят дальнейшие разбавления путем переноса 1000 мкл конидиальной суспензии 10 мл в 9 мл стерильной дистиллированной воды для получения 10 мл суспензионных разбавлений.
- Вихрево -смешивают конидиальные суспензии в течение 2 мин, рассчитывают конидиальные концентрации и определяют количество конидий на грамм.
- Умножьте количество конидий на грамм собранного порошка на начальную массу собранного конидиального порошка. Умножьте количество конидий, вымытых из субстрата, на общий вес отработанного субстрата, являющегося субстратом, из которого были собраны конидии.
- Сложите два заданных значения вместе и разделите на начальный сухой вес субстрата, чтобы рассчитать количество конидий на кг или г субстрата18.
ПРИМЕЧАНИЕ: Расчеты производились в основном для рисового субстрата. Тест на прорастание или конидиальную жизнеспособность был проведен как для изолятов M. pinghaense , так и для Изолятов M. robertsii для определения жизнеспособности полученных конидий.
7. Анализ данных
- Используйте соответствующее компьютерное программное обеспечение для проведения статистического анализа полученных результатов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Статистический анализ данных проводился с использованием STATISTICA версии 13.5.0.17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Снижение массы содержания культур на рисе как для M. pinghaense , так и для M. robertsii наблюдалось с течением времени во время стадии сушки грибковых культур, при этом никаких или незначительных изменений в массе наблюдалось после того, как культуры были сухими (рисунок 5). Собранный сухой грибковый конидийный порошок как M. pinghaense, так и M. robertsii показан на рисунке 6.
Рисунок 5: Изменение массы содержимого мешков в культурах Metarhizium robertsii и M. pinghaense на рисе (95% доверительный интервал) в течение 10 дней (ANOVA; F5,35 = 2,21; p = 0,08). Разные буквы над полосами указывают на значительную разницу (р < 0,05), полученную в массе содержимого мешка за сутки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Собранные конидии. (А) Собранные конидии в сборной кастрюле. (B) Metarhizium robertsii. (C) M. pinghaense. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Не наблюдалось существенной разницы в среднем конидиальном порошке, который собирали из каждого типа зерна как для M. pinghaense, так и для M. robertsii. Собранные сухие конидии для обоих имели в среднем >90% конидиальной жизнеспособности как для M. pinghaense, так и для M. robertsii. На рисовом субстрате M. pinghaense производили в среднем 8,2 г ± 4,38 г конидиального порошка, что несколько превышало количество, которое было получено для M. robertsii (6 г ± 2 г). В среднем 1,83 г ± 1,47 г сухого M. robertsii conidia было собрано из слоистого ячменного субстрата, тогда как ноль M. pinghaense был собран из субстрата. Из шелушащегося овсяного субстрата ни для M. pinghaense, ни для M. robertsii (рисунок 7) не было собрано сухих грибковых конидий (рисунок 7).
Рисунок 7: Среднее количество порошка конидий. Среднее количество порошка конидий Metarhizium pinghaense и M. robertsii, измеренное в граммах (95% доверительный интервал), собранных из трех твердых субстратов: пропаренного риса, шелушащегося ячменя и шелушащегося овса (ANOVA: F2,27 = 2,82; p = 0,08). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Существенная разница в расчетных средних конидиях на грамм, собранных из рисовых зерен, наблюдалась между M. pinghaense (3,51 x 107/г ± 0,43 x 107/г) и M. robertsii (4,31 x 107/г ± 0,38 x 107/г). M. robertsii имел несколько более высокое среднее количество конидий на грамм, чем M. pinghaense (рисунок 8).
Рисунок 8: Средняя конидия на грамм. Расчетный средний конидий на грамм для Metarhizium pinghaense и M. robertsii (95% доверительный интервал) из рисовых культур (ANOVA: F 1,7 = 8,47; p = 0,02). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Не наблюдалось существенной разницы в оценочном количестве конидий, присутствующих на отработанном рисовом субстрате, между M. pinghaense (5,02 x 107/мл ± 1,47 x 107/мл) и M. robertsii (3,70 x 107/мл ± 0,91 x 107/мл) (рисунок 9). Тем не менее, M. pinghaense имел несколько большее количество конидий, присутствующих на рисовом субстрате, чем M. robertsii.
Рисунок 9: Средняя грибковая конидия. Расчетные средние грибковые конидии Metarhizium pinghaense и M robertsii (95% доверительный интервал) из культур (F1,7 = 2,45; p = 0,16), присутствующие на отработанных субстратах рисовой культуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Существенной разницы в расчетной общей урожайности конидий не наблюдалось между M. pinghaense (5,09 x 107/г ± 1,35 x 107/г) и M. robertsii (3,55 x 107/г ± 0,85 x 107/г), полученными из культур рисового субстрата. Тем не менее, M. pinghaense дал несколько более высокий конидиальный выход , чем M. robertsii, который дал более низкий конидиальный выход (рисунок 10).
Рисунок 10: Общий выход конидий. Расчетный общий выход конидий Metarhizium pinghaense и M. robertsii (95% доверительный интервал) из культур на рисе (F1,7 = 3,91; p = 0,09). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Успешная интеграция микробных агентов для биологической борьбы с важными сельскохозяйственными насекомыми-вредителями в агроэкосистему зависит как от успеха, так и от простоты массового производства энтомопатогенов в качестве первого шага в лабораторных условиях. Массовое производство EPF важно для широкомасштабного применения и доступности продуктов EPF для программ IPM с использованием биологического контроля 9,10,11,12,13. На успех массового производства различных изолятов EPF влияют питательные компоненты производственного субстрата или среды, которые существенно влияют на характеристики полученных конидий, включая их эффективность, устойчивость к высыханию, стойкость поля и конидиальный выход 8,19,20,21 . Поэтому важно развивать знания о пищевых потребностях массового производства энтомопатогенов в процессе выращивания и ферментации29.
В текущем исследовании массовое производство как M. robertsii , так и M. pinghaense проводилось с использованием трех различных сельскохозяйственных продуктов в качестве ферментационных субстратов: пропаренного риса, шелушащегося ячменя и шелушащегося овса. Было обнаружено, что три различных зерновых субстрата значительно влияют на конидиальный выход грибковых изолятов. Пропаренный рис был очень благоприятен для массового производства обоих изолятов, в то время как шелушащиеся зерна ячменя благоприятствовали производству только M. robertsii . Наблюдения проводились на основе выхода сухого грибкового порошка конидий после ферментации. Мало или нет, конидии собирали из шелушащегося овса после ферментации. Было обнаружено, что шелушащийся овес сохраняет более высокие уровни влаги в ферментационных мешках во время процесса ферментации, что могло привести к наблюдаемым плохим характеристикам зерна в качестве субстрата для производства M. pinghaense и M. robertsii. Шелушащийся овсяный субстрат в некоторых случаях был склонен к белому вегетативному мицелиальному разрастанию грибковых изолятов, что сильно влияло на конидиальный выход, поскольку споруляция не происходила в ферментационных мешках, содержащих чрезмерный рост. Было также отмечено, что ферментационные мешки с отслаивающимся овсяным субстратом имеют высокие уровни бактериального загрязнения по сравнению с ферментационными пакетами, содержащими отслаивающиеся ячменные субстраты.
Высокие уровни сапрофитных грибов или дрожжевого загрязнения наблюдались в отношении массового производства M. pinghaense с использованием шелушащегося ячменя в качестве субстрата. Сапрофитное грибковое загрязнение наблюдалось на более поздней стадии процесса ферментации через рост и конидиогенез грибка, отличного от того, который используется для инокуляции субстрата. Диагностика загрязнения субстрата на начальном этапе ферментации, до конидиальной споруляции, была затруднена. Считается, что бактериальное и дрожжевое загрязнение во время процесса ферментации проявляется влажными пятнами в субстрате, и как шелушащийся овес, так и зерна ячменя, как правило, поглощают и удерживают влагу дольше, чем рисовые зерна. Это было ограничением для использования этих двух субстратов в качестве ферментационных субстратов для массового производства двух изолятов Metarhizium .
Наблюдения, сделанные в ходе текущего исследования, показали, что тип метода инокуляции, используемого для инокуляции каждого зернового субстрата, влияет на конидиальное производство. Метод конидиальной суспензионной инокуляции оказался относительно менее эффективным, поскольку инокулированный шелушащийся овес и шелушащийся ячмень показали повышенный уровень загрязнения по сравнению с тем, когда на рисовых зернах использовался метод посева бластоспора в жидкой культуре. В отличие от метода инокуляции бластоспор с жидкой культурой, метод конидиальной суспензии не позволяет обнаружить возможные загрязняющие вещества в суспензиях до инокуляции субстратов, что приводит к высоким уровням загрязнения, которые наблюдались в ферментационных мешках. Яронски и Джексон18 описали несколько факторов, которые могут привести к возможному загрязнению используемых субстратов, таких как отсутствие полной стерилизации субстрата, нестерильная прививка и неправильное обращение с ферментационным субстратом в мешках. Наблюдаемое загрязнение в ферментационных пакетах, содержащих шелушащийся ячмень и шелушащийся овес, также могло быть результатом отсутствия полной стерилизации субстрата, что могло произойти в процессе автоклавирования. Яронски и Джексон18 также описали использование конидиальных суспензий в качестве инокулянтов как невыгодное, поскольку это приводит к увеличению вероятности загрязнения во время конидиального сбора из агаровой среды.
В полевых условиях, во время заражения подходящих хозяев, гриб сначала накапливает биомассу в гемокоэли насекомых путем пролиферации, до ее появления и спорообразования на внешней твердой поверхности насекомых30. Такой процесс имитировали при использовании метода жидкостно-бластоспоровой ферментации. Соответственно, бульон представлял собой гемокоэль насекомого, прививка бульона грибковыми конидиями представляла собой первоначальный контакт и заражение насекомого, а образование бластоспор в бульоне представляло собой пролиферацию бластоспорового процесса, который происходит внутри гемокоэля зараженного насекомого. Окончательная прививка рисовых зерен и спорирование грибка на зернах с течением времени представляли собой то, что происходит на кутикуле насекомого, когда грибок начинает появляться изнутри трупа насекомого. Это может объяснить, почему метод ферментации жидких бластоспор работал лучше, чем метод конидиальной суспензионной инокуляции.
Яронски и Джексон18 описали шелушащийся овес и шелушащиеся зерна ячменя как предпочтительные сельскохозяйственные зерна для массовой культуры видов Metarhizium по сравнению с рисовыми зернами, поскольку было обнаружено, что два типа зерен сохраняют содержание влаги во время процесса ферментации. Тем не менее, текущее исследование противоречит наблюдениям и выводам вышеупомянутых исследователей, поскольку как шелушащийся овес, так и шелушащийся ячмень не были признаны хорошими твердыми ферментационными субстратами ни для M. pinghaense , ни для M. robertsii. Было обнаружено, что рис является хорошим зерновым субстратом для обоих изолятов, поскольку он не разлагается на мелкие частицы, которые могут смешиваться с конечным продуктом, как предполагалось в предыдущих исследованиях.
Текущее исследование показало, что изоляты видов Metarhizium могут быть успешно культивированы и массово произведены с использованием рисовых зерен и что различные зерна, как правило, по-разному влияют на конидиальную споруляцию и урожайность. Это может быть связано с тем, что различные зерна различаются с точки зрения такого состава питательных веществ, например, соотношение углерода: азота и концентрации углерода. Известно, что концентрация углерода и соотношение углерода и азота питательной среды влияют на выход конидий, а также на ее качество с точки зрения жизнеспособности и вирулентности22. Было также показано, что методы инокуляции, используемые для инокуляции субстратов, влияют на степень успеха, достигнутого в массовом производстве изолятов EPF на конкретных сельскохозяйственных зерновых субстратах. Поэтому метод ферментации жидких бластоспор, описанный в настоящем исследовании, рекомендуется как лучший метод инокуляции для сельскохозяйственных зерновых субстратов для массового производства изолятов M. pinghaense и M. robertsii . Использование такого метода позволяет обеспечить возможное обнаружение загрязнения до использования инокулянтов, что может препятствовать массовому производству желаемого изолята EPF относительно использования метода конидиальной суспензионной прививки. Также рекомендуется использовать рисовые зерна в качестве твердых субстратов для массового производства конидий как M. pinghaense , так и M. robertsii, а не шелушащегося ячменя и шелушащегося овса. Описанный метод важен для будущего массового производства и коммерческого применения конидий в полевых условиях против важных насекомых-вредителей в агроэкосистемах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Хорта Поме, Хорта Стоуна и Программу технологий и человеческих ресурсов для промышленности (THRIP: TP14062571871) за финансирование проекта.
ORCID:
Летоди Л. Матулве http://orcid.org/0000-0002-5118-3578
Антуанетта. Малан http://orcid.org/0000-0002-9257-0312
Номахолва Ф. Стокве http://orcid.org/0000-0003-2869-5652
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Tween 20 | Lasec | Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water | |
| 20 mL McCartney bottles | Lasec | Used to make conidial suspensions | |
| Aluminium foil | Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask | ||
| Autoclave | Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process | ||
| Autoclave bags | Lasec | Fermentation bags or solid substrate containers | |
| Autoclave tape | Lasec | To secure PVC pipes on the fermentation bags | |
| Brown Kraft paper bags | Used to dry conidia cultures on agricultural grains | ||
| Bunsen burnner | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks) | |
| Clear edge test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
| Corn steep liquor | SIGMA | 66071-94-1 | Ingredient of the blastospore liquid medium |
| Cotton Wool | Lasec | Used as plug of the neck for fermentation bags | |
| Duran laboratory bottles | Neolab | Used to autoclave SDA medium and distilled water | |
| Electrical tape | Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust | ||
| ENDECOTTS test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
| Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask | Lasec | Carrier of the blastospore liquid medium | |
| Ethanol (99%) | Lasec | Used to sterilize surgical blades and inoculating loops | |
| Flaked barley | Health Connection Wholefoods | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Flaked oats | Tiger brands | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Glucose | Merck | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
| Growth Chamber/ incubators | For growing fungal conidia culture | ||
| Haemocytometer | Used to determine conidial concentrations | ||
| Inoculating loops | Lasec | For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth | |
| Kitchen rolling pin | Used to manipulate the solid grain substrate bed | ||
| Laminar flow Cabinet | ESCO Laminar Flow Cabinet | Provide as sterile environment during substrate inoculation | |
| Metarhizium pinghaense conidia | Stellenbosch University | 5HEID | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense |
| Metarhizium robertsii conidia | Stellenbosch University | 6EIKEN | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii |
| Microscope | ZEIZZ (Scope. A1) | Used to determine conidial concentrations and conidial viability | |
| Orbital shaker | IncoShake- LABOTEC | Used for the blastospore production process | |
| Parboiled rice | Spekko | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Penicillin-Streptomycin | SIGMA | Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination | |
| Petri-dishes | Lasec | Containers for the SDA medium | |
| Pipettes and pipette tips | Labnet (BioPette PLUS) | Used to measure liquids ingredients | |
| Polyvinylchloride Marley waste pipe | Used to create a neck for the fermentation bag | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
| Rubber band | Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks | ||
| Sabaroud dextrose agar (SDA) | NEOGEN Culture Media | Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii | |
| Sterile distilled water | To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions | ||
| Sticky pad | Used to secure the seives on the vibratory shaker | ||
| Surgical blade | Lasec | Used to scrape off spores from fungal cultures | |
| Surgical paper | Lasec | Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag | |
| Vibratory shaker | Used to shake conidia off the agricultural grain substrates | ||
| Vortex mixer | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles | |
| Yeast extract | Biolab | Added to the SDA medium to improve spore germination and growth | |
| Zipper-lock bags | GLAD | Used to to store harvested fungal conidia |
References
- Shah, P. A., Pell, J. K. Entomopathogenic fungi as biological control agents. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5), 413-423 (2003).
- Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. A review of the biology and control of the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae), with special reference to biological control using entomopathogenic fungi and nematodes. African Entomology. 29 (1), 1-16 (2020).
- Ibrahim, L., Laham, L., Touma, A., Ibrahim, S. Mass production, yield, quality, formulation and efficacy of entomopathogenic Metarhizium anisopliae conidia. Current Journal of Applied Science and Technology. 9 (5), 427-440 (2015).
- Banu, J. G., Rajalakshmi, S. Standardisation of media for mass multiplication of entomopathogenic fungi. Indian Journal of Plant Protection. 42 (1), 91-93 (2014).
- Roberts, D. W., Humber, R. A. Entomogenous fungi. Biology of Conidial Fungi. Cole, G. T., Kendrick, W. B. , Academic Press. New York. 201-236 (1981).
- Feng, M. G., Poprawski, T. J., Khachatourians, G. G. Production, formulation and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for insect control. Current status. Biocontrol Science and Technology. 4 (1), 3-34 (1994).
- Karanja, L. W., Phiri, N. A., Oduor, G. I. Effect of different solid substrates on mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae entomopathogens. The Proceedings of the12th KARI Biennial Scientific Conference. , Nairobi, Kenya. 8-12 (2010).
- Prasad, C. S., Pal, R. Mass production and economics of entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae and Verticillium lecanii on agricultural and industrial waste. Scholars Journal of Agriculture and Veterinary Sciences. 1 (1), 28-32 (2014).
- Ehlers, R. U. Mass production of entomopathogenic nematodes for plant protection. Applied Microbiology and Biotechnology. 56 (5), 623-633 (2001).
- Pham, T. A., Kim, J. J., Kim, S. G., Kim, K. Production of blastospore of entomopathogenic Beauveria bassiana in a submerged batch culture. Mycobiology. 37 (3), 218-224 (2009).
- Bhadauria, B. P., Puri, S., Singh, P. K. Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products. The Bioscan. 7 (2), 229-232 (2012).
- Latifian, M., Rad, B., Amani, M. Mass production of entomopathogenic fungi Metarhizium anisopliae by using agricultural products based on liquid-solid diphasic method for date palm pest control. International Journal of Farming and Allied Sciences. 3 (4), 368-372 (2014).
- Agale, S. V., Gopalakrishnan, S., Ambhure, K. G., Chandravanshi, H., Gupta, R., Wani, S. P. Mass production of entomopathogenic fungi (Metarhizium anisopliae) using different grains as a substrate. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7 (1), 2227-2232 (2018).
- Jackson, M. A. Optimizing nutritional conditions for the liquid culture production of effective fungal biological control agents. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 19 (3), 180-187 (1997).
- Deshpande, M. V. Mycopesticides production by fermentation. Potential and challenges. Critical Reviews in Microbiology. 25 (3), 229-243 (1999).
- Sahayaraj, K., Namasivayam, S. K. R. Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products and by products. African Journal of Biotechnology. 7 (12), 1907-1910 (2008).
- Feng, K. C., Liu, L. B., Tzeng, Y. M. Verticillium lecanii spore production in solid-state and liquid-state fermentations. Bioprocess Engineering. 23 (1), 25-29 (2000).
- Jaronski, S. T., Jackson, M. A. Mass production of entomopathogenic Hypocreales. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology 2nd edition. Lacey, L. A. , Academic Press. London. 255-284 (2012).
- Vega, F. E., Jackson, M. A., Mercandier, G., Poprawski, T. J. The impact of nutrition on spore yields for various fungal entomopathogens in liquid culture. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 19 (4), 363-368 (2003).
- El Damir, M. Effect of growing media and water volume on conidial production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Journal of Biological Sciences. 6 (2), 269-274 (2006).
- Pandey, A. K., Kanaujia, K. R. Effect of different grains as solid substrates on sporulation, viability and pathogenicity of Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin. Journal of Biological Control. 22 (2), 369-374 (2008).
- Kassa, A., et al. Whey for mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Mycological Research. 112 (5), 583-591 (2008).
- Sharma, S., Gupta, R. B. L., Yadavam, C. P. S. Selection of a suitable medium for mass multiplication of entomofungal pathogens. Indian Journal of Entomology. 64 (3), 254-261 (2002).
- Bich, G. A., Castrillo, M. L., Villalba, L. L., Zapata, P. D. Evaluation of rice by-products, incubation time, and photoperiod for solid state mass multiplication of the biocontrol agents Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Agronomy Research. 16 (5), 1921-1930 (2018).
- Price, R. E., Müller, E. J., Brown, H. D., D'Uamba, P., Jone, A. A. The first trial of a Metarhizium anisopliae var. acridum mycoinsecticide for the control of the red locust in a recognised outbreak area. International Journal of Tropical Insect Science. 19 (4), 323-331 (1999).
- Hatting, J. L., Moore, S. D., Malan, A. P. Microbial control of phytophagous invertebrate pests in South Africa. Current status and future prospects. Journal of Invertebrate Pathology. 165, 54-66 (2019).
- Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. Laboratory screening of entomopathogenic fungi and nematodes for pathogenicity against the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae). Biocontrol Science and Technology. , (2021).
- Inglis, G. D., Enkerli, J., Goettel, M. S. Laboratory techniques used for entomopathogenic fungi: Hypocreales. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , Academic Press, Elsevier. Chapter 7 189-253 (2012).
- Mehta, J., et al. Impact of carbon & nitrogen sources on the Trichoderma viride (Biofungicide) and Beauveria bassiana (entomopathogenic fungi). European Journal of Experimental Biology. 2 (6), 2061-2067 (2012).
- Burges, H. D. Formulation of mycoinsecticides. Formulation of Microbial Biopesticides. , Springer. Dordrecht. 131-185 (1998).
