Summary
Entomopathogene schimmels hebben aan belang gewonnen als de biologische bestrijders van landbouwinsectenplagen. In deze studie werd de massaproductie van een voldoende aantal veerkrachtige infectieuze propagules van Zuid-Afrikaanse isolaten van zowel Metarhizium robertsii als M. pinghaense voor commerciële toepassing tegen insectenplagen met succes uitgevoerd met behulp van landbouwproducten.
Abstract
Entomopathogene schimmels van het Metarhizium anisopliae soortencomplex hebben aan belang gewonnen als de biologische bestrijders van landbouwinsectenplagen. De toename van de resistentie tegen plagen tegen chemische insecticiden, de groeiende bezorgdheid over de negatieve effecten van insecticiden op de menselijke gezondheid en de milieuvervuiling door pesticiden hebben geleid tot een wereldwijde drive om nieuwe duurzame strategieën voor gewasbescherming en ongediertebestrijding te vinden. Eerder zijn pogingen gedaan om dergelijke entomopathogene schimmels (EPF) -soorten zoals Beauveria bassiana massaal te kweken. Er zijn echter slechts beperkte pogingen ondernomen om Metarhizium robertsii en M. pinghaense massaal te kweken voor gebruik tegen insectenplagen. Deze studie was gericht op het massaal produceren van een voldoende aantal veerkrachtige infectieuze propagules van Zuid-Afrikaanse isolaten van M. robertsii en M. pinghaense voor commerciële toepassing. Drie landbouwproducten, haver in vlokken, gerst in vlokken en rijst, werden gebruikt als de EPF vaste gistingssubstraten. Twee inentingsmethoden, conidiale suspensies en de vloeibare schimmelcultuur van blastospores werden gebruikt om de vaste substraten te enten. Inenting met behulp van conidiale suspensies bleek relatief minder effectief te zijn, omdat verhoogde niveaus van verontreiniging werden waargenomen op de vaste substraten ten opzichte van bij gebruik van de blastospore-inentingsmethode. Vlokken haver bleken geen geschikt groeisubstraat te zijn voor zowel M. robertsii als M. pinghaense, omdat er geen droge conidia uit het substraat werden geoogst. Vlokken gerst bleek de productie van M. robertsii conidia te bevoordelen boven die van M. pinghaense, en een gemiddelde van 1,83 g ± 1,47 g droge M. robertsii conidia en nul gram M. pinghaense conidia werd geoogst van het substraat. Rijstkorrels bleken de conidiale massaproductie van zowel M. pinghaense - als M. robertsii-isolaten te bevorderen, met een gemiddelde van respectievelijk 8,2 g ± 4,38 g en 6 g ± 2 g geoogst van het substraat.
Introduction
Entomopathogene schimmels (EPF) hebben aan belang gewonnen als gewasbeschermingsmiddelen in de biologische bestrijding van belangrijke landbouwinsectenplagen 1,2. De entomopathogenen, die van nature in de bodem voorkomen, veroorzaken epizoötie in de populaties van verschillende plaagsoorten3. De soorten EPF zijn gastheerspecifiek en vormen relatief weinig risico's in termen van het aanvallen van niet-doelsoorten, en ze zijn niet giftig voor het milieu4. EPF heeft een uniek mechanisme voor het binnendringen van hun gastheer, evenals voor het verspreiden en volharden in hun directe omgeving1. Ze vallen de gastheer voornamelijk aan via aseksuele sporen die zich hechten aan en doordringen in de nagelriem van de gastheer om binnen te dringen en zich te vermenigvuldigen in de gastheerhemocoel. De gastheer sterft uiteindelijk als gevolg van uitputting van de hemolymfe voedingsstoffen of als gevolg van de toxemie veroorzaakt door de toxische metabolieten die door de schimmel worden vrijgegeven. Na de dood, onder ideale omgevingsomstandigheden, komt de schimmel tevoorschijn op het buitenoppervlak (openlijke mycose) van het gastheerkadaver 5,6.
Groeiende bezorgdheid over de negatieve effecten van chemische residuen op de menselijke gezondheid, milieuvervuiling en de ontwikkeling van resistentie tegen plagen hebben geleid tot de wereldwijde drang om de input van insecticiden op chemische basis te verminderen en alternatieve, nieuwe en duurzame strategieën voor gewasbescherming en ongediertebestrijding te vinden 6,7,8 . Dit heeft mogelijkheden geboden om microbiële insecticiden te ontwikkelen voor gebruik in Integrated Pest Management (IPM) -programma's, die ecologisch gunstiger strategieën zijn dan conventionele chemische bestrijding 3,8.
Om een succesvol microbieel bestrijdingsmiddel voor een landbouwplaag te ontwikkelen, moet eerst een geschikt organisme worden geïsoleerd, gekarakteriseerd, geïdentificeerd en de pathogeniciteit ervan voor het doelorganisme worden bevestigd. Een eenvoudige, kosteneffectieve methode voor grootschalige productie van het microbiële agens is echter vereist om een levensvatbaar product te produceren voor gebruik in biologische bestrijdingsprogramma's 9,10,11,12,13. Massaproductie van aanzienlijke hoeveelheden entomopathogenen van goede kwaliteit is afhankelijk van de microbiële stam, het milieu, de doelplaag, de formulering, de markt, de toepassingsstrategie en het gewenste eindproduct 14,15,16. EPF kan in massa worden geproduceerd met behulp van vloeibare substraatfermentatie om blastospores te produceren of het fermentatieproces van vaste substraten om luchtconidia 6,17,18 te produceren. Het massaproductie- en formuleringsproces van entomopathogenen heeft echter een directe invloed op de virulentie, de kosten, de houdbaarheid en de veldeffectiviteit van het eindproduct. Voor succesvol gebruik in IPM moet het productieproces van de entomopathogenen gemakkelijk te uitvoeren zijn, minimale arbeid vereisen, een hoge opbrengstconcentratie van virulente, levensvatbare en persistente propagules produceren en goedkoop zijn 4,13,14,16.
Het begrijpen van de voedingsbehoeften van entomopathogenen is belangrijk voor massateelt met alle kweekmethoden 4,12. De voedingscomponenten van het productiemedium hebben een aanzienlijke invloed op de eigenschappen van de resulterende propagules, waaronder biocontrole-werkzaamheid, opbrengst, uitdrogingstolerantie en persistentie 8,19,20,21. De optimalisatie van productieprocedures is ontworpen om dergelijke factoren aan te pakken22. Voor EPF zijn de belangrijkste vereisten voor goede groei, sporulatie en massaproductie van schimmelconidia voldoende vocht, optimale groeitemperatuur, pH, gasuitwisseling van CO2 en O2 en voeding, waaronder goede fosfor-, koolhydraat-, koolstof- en stikstofbronnen18.
Jaronski en Jackson18 beschrijven de vaste substraatfermentatiemethode als de meest efficiënte en de dichtstbijzijnde benaderingsmethode voor het natuurlijke proces voor EPF-productie ten opzichte van de vloeibare substraatfermentatiemethode, omdat onder natuurlijke omstandigheden het schimmelconidium wordt gedragen op vaste rechtopstaande structuren, zoals het oppervlak van insectenkadavers. Landbouwproducten en bijproducten die zetmeel bevatten, worden meestal gebruikt voor de massaproductie van hypocrealean schimmels, omdat de schimmels zetmeel gemakkelijk ontbinden door afscheiding van sterk geconcentreerde hydrolytische enzymen uit hun hyphale uiteinden, om de vaste stof binnen te dringen en om toegang te krijgen tot de voedingsstoffen die aanwezig zijn in de stof 11,17,18,23 . De graanproducten bieden ook de vereisten voor een gezonde biomassaproductie, omdat, wanneer ze worden gehydrateerd en gesteriliseerd, de substraten verdere voedingsstoffen uit elk vloeibaar medium kunnen opnemen 16,18,24.
Eerder probeerden verschillende studies EPF-soorten zoals Beauveria bassiana (Bals. Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas en enkele van de Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin soortencomplex isoleert op verschillende substraten 16,23,24. Dergelijke in massa geproduceerde en commercieel ontwikkelde isolaten omvatten Green Muscle® (stam IMI 330189), ontwikkeld uit M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner) J.F. Bisch, Rehner & Humber, Metarhizium 69 (Meta 69 stam ICIPE69), en Real Metarhizium 69 (L9281), ontwikkeld uit M. anisopliae, en Breedband® (stam PPRI 5339) en Eco-Bb®, ontwikkeld uit B. bassiana25.26 . Er zijn echter beperkte pogingen gedaan om Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner & Humber en Metarhizium pinghaense Chen & Guo te masseren. Deze twee isolaten werden in een eerdere studie geselecteerd als de meest effectieve voor de bestrijding van de wolluis, Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)27. Daarom was de huidige studie gericht op het formuleren en massaal produceren van een voldoende aantal veerkrachtige infectieuze propagules van de lokale isolaten van M. robertsii en M. pinghaense voor commerciële toepassing tegen insectenplagen. De vaste substraatfermentatiemethode werd gebruikt om de schimmelconidia voor beide EPF-isolaten massaal te produceren. Twee EPF-inentingsmethoden, met behulp van conidiale suspensies en de vloeibare schimmelcultuur van blastospores, werden gebruikt om de vaste substraten te enten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bron van schimmelstammen
- Gebruik Zuid-Afrikaanse geïsoleerde schimmelstammen van zowel M. pinghaense 5 HEID (GenBank Toetredingsnummer: MT367414/MT895630) als M. robertsii 6EIKEN (MT378171/MT380849), verzameld uit appelboomgaarden in de provincie West-Kaap, Zuid-Afrika.
- Kweekculturen van elk EPF-isolaat op 60 g Sabouraud dextrose-agarmedium, aangevuld met 1 g gistextract (SDAY) en 10 μL streptomycine.
OPMERKING: Incubeer EPF-culturen bij een gecontroleerde temperatuur van ± 25 °C in het donker.
2. Metarhizium pinghaense en M. robertsii conidiale suspensie-inenting
- Voorbereiding van de vaste substraten
- Gebruik twee landbouwproducten, namelijk haver in vlokken en gerst in vlokken, als groeimedium voor de twee EPF-isolaten en autoclaafzakken (305 mm × 660 mm) als fermentatiezakken.
- Gebruik een kleine polyvinylchloride-afvoerpijp (1000 mm × 50 mm) om een hals te maken voor de fermentatiezak aan het open uiteinde van de autoclaafzak en gebruik autoclaaftape om de pijp aan de zak te bevestigen.
- Sluit de buis met een steriele wattenplug om voldoende gasuitwisseling tijdens de gisting mogelijk te maken.
- Weeg droge granen (200 g) van zowel de vlokken haver als de gerst in vlokken en plaats ze in de gistingszakken en voeg aan elke zak 100 ml gedestilleerd water toe en meng de inhoud van de zakken grondig.
- Laat de natte korrels 15-30 minuten rusten om vocht te absorberen voordat ze worden geautoclaveerd en gesteriliseerd. Bereid zes zakken voor elk graantype en om besmetting te voorkomen, plaatst u de zakken in andere autoclaafzakken en autoclaaft u de substraten gedurende 55 minuten bij 121 °C.
- Bereiding van conidiale suspensie-entmateriaal
- Oogst 2-3 weken oude schimmel conidia uit schimmelculturen van zowel M. pinghaense als M. robertsii door te schrapen, met behulp van een steriel chirurgisch mes.
- Suspensie de verzamelde schimmelconidia in 20 ml steriel gedestilleerd water, aangevuld met 0,05% Tween 20, en vortex-meng de conidiale suspensies gedurende 2 minuten.
- Bereid 20 ml conidiale suspensies, met een concentratie van 1 × 107 conidia / ml, en en ent respectievelijk de afgebladderde haver en afgebladderde gerst vaste substraten.
OPMERKING: Gebruik een hemocytometer om conidiale concentraties te bepalen.
- Inenting van de vaste substraten
- Open elke zak door de wattenhalspluggen te verwijderen en voeg de voorbereide conidiale suspensie van 20 ml toe aan het gekoelde geautoclaveerde substraat.
- Sluit de zakken opnieuw, gebruik de nekpluggen en masseer de inhoud van de zak om het schimmel-entmateriaal gelijkmatig te mengen met het graansubstraat.
- Incubeer de fermentatiezakken bij een gecontroleerde temperatuur van ± 25 °C en zorg voor voldoende gasvormige uitwisseling tussen de cultuur en de omgeving.
OPMERKING: Deze procedure moet worden uitgevoerd onder een laminaire stroomkast.
- Fermentatiefase
- Masseer de graansubstraten handmatig in de fermentatiezakken 2 dagen na de inenting en incubatie, wanneer zichtbare myceliale groei optreedt en het substraat is begonnen te klonteren door de groeiende schimmel.
OPMERKING: Dit wordt gedaan om de geënte korrels te mengen om myceliale vertakkingen mogelijk te maken tijdens de eerste vroege stadia van de vegetatieve groei van de schimmels. - Gebruik een keuken deegroller om het substraatbed te manipuleren om de fysieke heterogeniteit van de graansubstraatbedden en de beddikte van de substraatmassa te voorkomen.
OPMERKING: Het proces bevordert het schimmelmetabolisme, dat de productie van schimmelsporen optimaliseert en het oppervlak maximaliseert, waardoor de conidiale opbrengstwordt bevorderd 18. - Laat het fermentatieproces tot 4-5 weken doorgaan en controleer de fermentatiezakken elke 2 dagen op de aanwezigheid van witte vegetatieve overgroei die zich tijdens het fermentatieproces kan ontwikkelen, wat de opbrengst van schimmelconidia sterk kan beïnvloeden.
OPMERKING: Beëindig onmiddellijk de fermentatie in de fermentatiezakken met witte vegetatieve overgroei en droog de schimmelculturen18.
- Masseer de graansubstraten handmatig in de fermentatiezakken 2 dagen na de inenting en incubatie, wanneer zichtbare myceliale groei optreedt en het substraat is begonnen te klonteren door de groeiende schimmel.
3. Blastospore inenting
- Blastospore productie en inenting
- Bereid een vloeibaar kweekmedium voor, met 1 l gedestilleerd water, 30 g glucose, 20 g gistextract, 4 g kaliumfosfaat diabasisch (K2HPO4), 15 ml maïs steile vloeistof en 10 μg / ml van het antibioticum Streptomycine, voor zowel de M. pinghaense als de M. robertsii.
- Verwarm eerst het gedestilleerde water, schakel uit voordat u het kookpunt bereikt en voeg elk van de ingrediënten, behalve Streptomycine, toe aan het hete water in de pot. Breng het medium gedurende 3-4 minuten zachtjes aan de kook en roer het medium constant om de ingrediënten goed te mengen en te voorkomen dat sommige ingrediënten op de bodem van de pot bezinken.
- Giet in totaal 100 ml van het medium in negen verschillende kolven van 250 ml en plaats een wattenplug op elke kolf en bedek de watten met aluminiumfolie als stop (figuur 1A).
- Autoclaaf het medium in de kolven gedurende 55 minuten bij 121 °C. Laat na de autoclavering het medium in de kolven afkoelen en voeg 10 mg/ml streptomycine toe aan het medium in elke kolf (figuur 1B).
- Verzamel twee tot drie bacteriële lussen van schimmelconidia van 2-3 weken oude schimmelcultuurplaten voor zowel de EPF-isolaten, M. pinghaense en M. robertsii, en breng over naar elk vloeibaar medium van 100 ml in de kolven van 250 ml, onder steriele omstandigheden, en sluit de kolven af.
- Incubeer de vloeibare kweekkolven bij ± 25 °C, op een orbitale shaker bij 140 tpm gedurende 3 dagen, en stop de incubatie zodra de culturen tekenen van hoge troebelheid vertonen met schimmelblastosporegroei (figuur 1C).
- Om eventuele bacteriële besmetting uit de culturen te detecteren, trekt u na 24 uur tijdens de incubatie een monster van 100 μL uit elke vloeibare kweekkolf en plaat op drie SDA-platen per isolaat. Incubeer de platen gedurende 48 uur, bij een gecontroleerde temperatuur van ± 25 °C.
- Voorbereiding van het vaste substraat
- Gebruik voorgekookte langkorrelige witte rijst als een vast substraatmedium voor de blastospores van zowel M. pinghaense als M. robertsii (aangepast van Jaronski en Jackson18).
- Bereid de fermentatiezakken zoals hierboven beschreven, in stappen 2.1.1-2.1.3, en voeg voor elke zak 1 kg rijst en 300 ml steriel gedestilleerd water toe.
- Meng de inhoud van de gistingszakken voorzichtig en plaats in de buitenste autoclaafzakken rechtop en autoclaaf bij 121 °C gedurende 55 minuten. Laat na de autoclavering de substraten ± 45 minuten afkoelen onder steriele omstandigheden.
- Inenting en fermentatie
- Verwijder de sluiting van elk van de vloeibare kweekkolven van zowel M. pinghaense als M. robertsii onder een laminaire stroom en vlam de rand van elke kolf gedurende 10 s.
- Giet de vloeibare culturen van 100 ml in de gistingszakken door de wattenpluggen uit hun nek te verwijderen (figuur 2). Plaats de katoenen pluggen terug en bedek de bovenkant van de hals van de tas met chirurgisch papier dat is vastgezet met een elastiekje.
OPMERKING: Bepaal de blastosporeconcentratie voor elke kolf met behulp van een hemocytometer en gebruik blastosporeconcentraties van 1 × 107 - 5 × 108 blastospores/ml om de substraten te innomeren28. - Draai het bovenste deel van de zak en meng de inhoud van de zak door schudden en lichte manipulatie van het substraat door massage, en incubeer de zakken bij ± 25 °C, door het substraat in de zakken plat te maken om de vorming van dikke bedden te voorkomen18.
- Breek het substraat in de fermentatiezakken door de inhoud van de zakken te masseren, 2-3 dagen na de inenting en de incubatie, wanneer zichtbare myceliale groei en de binding van het substraat door de schimmel was opgetreden (aangepast van de techniek van Jaronski en Jackson18).
OPMERKING: Laat de gisting 4 weken doorgaan.
Figuur 1: Vloeibaar kweekmedium in kolven van 250 ml. (A) Vóór het autoclaveren. (B) Na autoclaveren en inenten met EPF-sporen. (C) Troebel medium met schimmelblastospores. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Bereid blastospore vloeibaar kweekmedium. (A) Metarhizium robertsii en (B) Metarhizium pinghaense voorafgaand aan de inenting van rijst als vast substraat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Drogen van schimmelculturen
- Droog de schimmelculturen gedurende 10-12 dagen na de fermentatie, voorafgaand aan hun gebruik in proeven, door de gesporuleerde culturen over te brengen in bruine papieren zakken van 26-30 kg (30 x 43 x 15250 cm3).
- Om de treksterkte van de papieren zakken te verbeteren, snijdt u horizontaal een derde van het bovenste deel van elke zak af en bekleedt u de onderkant van de zak (figuur 3A, B).
Figuur 3: Bereiding van papieren zakken, droogproces van culturen en verpakking. (A,B) De bereiding van bruine papieren zakken. De droogprocedure van metarhizium-soortenculturen geteeld op (C,E) voorgekookte rijst en (D,F) gerst met schilfers. (G) Papieren zakken gesloten met nietjes om een driehoekige tentstructuur te creëren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Verkruimel voorzichtig het substraat in elke fermentatiezak, snijd de hoek van elke zak af en breng de hele cultuur over in de papieren zakken door de ruimte die overblijft door de afsnijhoek (figuur 3C-F). Om het overmatige ontsnappen van schimmelsporen in de lucht te voorkomen, voert u dit proces langzaam uit.
OPMERKING: Voer dit proces uit onder steriele omstandigheden, met behulp van laminaire stroming, om besmetting te voorkomen. - Label elke papieren zak en vouw twee keer over het bovenste uiteinde van elke zak en sluit met nietjes om een driehoekige tentstructuur te creëren, en plaats de zakken op draaddroogrekken om goed, gelijkmatig drogen, mogelijk te maken, bij een gecontroleerde temperatuur van ± 25 ° C en een lage luchtvochtigheid van 30-40%.
- Draai de zakken dagelijks om gelijkmatig drogen van de culturen mogelijk te maken en om vegetatieve hergroei te voorkomen, wat de opbrengst van oogstbare schimmelsporen zou verlagen.
- Weeg elke droogzak na elke 2 dagen tijdens het droogproces en ga door met het droogproces voor elke zak totdat er tussen de opeenvolgende dagen weinig tot geen verandering in de massa van de zakken wordt waargenomen.
5. Oogst van schimmel conidia
- Oogst schimmelconidia mechanisch uit de culturen met behulp van drie geneste zeven, een testzeef (ETS) gaas nr. 35 (met 500-μm diafragma), genest op een testzeef (met 212-μm diafragma), genest op ETS mesh nr. 100 (met 150-μm diafragma), gemonteerd op een verzamelpan.
- Laad het droge cultuurmonster langzaam op de zeef met ETS-gaas nr. 35 en plaats een deksel op de zeef om te voorkomen dat schimmelconidia in de lucht vrijkomen.
- Voeg 10-12 glazen knikkers toe aan de zeven om de passage van de schimmel conidia door de gaasschermen te helpen en het vasthouden van de conidia in de zeef te voorkomen, wat kan resulteren in verminderd sporenherstel.
- Tape en sluit de zeefverbindingen af met behulp van elektrische tape om het ontsnappen van conidiaal stof te voorkomen.
- Plaats de zeven op een trilschudder, voorzien van een kleverig kussen, om de opvangpan en zeven gedurende 20-25 minuten vast te zetten met een beweging van 560-640 trillingen per minuut (figuur 4).
OPMERKING: Techniek aangepast van Jaronski en Jackson18.
Figuur 4: Oogsten van schimmelsporen uit gedroogde Metarhizium robertsii culturen op rijst en gerst in vlokken. (A) 10-12 glazen knikkers toegevoegd aan de zeven om de doorgang van de schimmel conidia door de gaasschermen te vergemakkelijken. M. robertsii conidia geoogst uit culturen op (B) rijst, en (C) vlokken nauwelijks. (D) Zeven op een trilschudder. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Haal de testzeven uit de verzamelpan, verzamel conidia en bewaar de verzamelde conidia in luchtdichte en waterdoordringbare zakken met ritssluiting voor langdurige opslag (3-6 maanden).
6. Kwantificering van geproduceerde schimmelconidia
- Meet en registreer de massa van elk graansubstraat voorafgaand aan het oogsten van de schimmelconidia van elk substraat.
- Meet het totale gewicht van de verzamelde conidia door de massa van de verzamelde sporen af te trekken van de massa van het vaste substraat.
OPMERKING: De totale conidia-opbrengst omvat niet alleen de geoogste conidia, maar ook de schimmel conidia die op het vaste substraat is achtergelaten. - Weeg het substraat en verwijder 10 g van het gewogen substraat. Suspensie van de 10 g van het substraat in 0,05% Tween 20 en verdun in 10 ml steriel gedestilleerd water.
- Vortex-meng de suspensie gedurende 2 minuten en gebruik een hemocytometer om het sporenaantal te doen om het aantal conidia te bepalen dat van het substraat wordt gewassen.
- Voer verdere verdunningen uit door 1000 μL van de 10 ml gewassen conidiale suspensie over te brengen naar 9 ml steriel gedestilleerd water om 10 ml verdunningssuspensies te vormen.
- Vortex-meng de conidiale suspensies gedurende 2 minuten en bepaal de conidiale concentraties.
OPMERKING: Volg de procedure en formule beschreven door Inglis, Enkerli en Goettel30 om de conidiale concentratie van de suspensies te bepalen. - Verzamel en suspenseer in totaal 0,1 g van het verzamelde conidiale poeder uit elke cultuur in 10 ml steriel gedestilleerd water aangevuld met 0,05% Tween 20, en vortex-meng de conidiale suspensie gedurende 2 minuten en bepaal de conidiale concentratie met behulp van een hemocytometer.
- Voer verdere verdunningen uit door 1000 μL van de 10 ml conidiale suspensie over te brengen naar 9 ml steriel gedestilleerd water om de 10 ml suspensieverdunningen te vormen.
- Vortex-mix de conidiale suspensies gedurende 2 minuten, bereken de conidiale concentraties en bepaal het aantal conidia per gram.
- Vermenigvuldig het aantal conidia per gram geoogst poeder met de beginmassa van het geoogste conidiale poeder. Vermenigvuldig het aantal conidia dat uit het substraat wordt gewassen met het totale gewicht van het gebruikte substraat, zijnde het substraat waaruit de conidia zijn geoogst.
- Tel de twee gegeven waarden bij elkaar op en deel door het initiële drooggewicht van het substraat om het aantal conidia per kg of g van het substraat18 te berekenen.
OPMERKING: De berekeningen werden voornamelijk gedaan voor het rijstsubstraat. De kiemings- of conidiale levensvatbaarheidstest werd uitgevoerd voor zowel de M. pinghaense - als de M. robertsii-isolaten om de levensvatbaarheid van de geproduceerde conidia te bepalen.
7. Data-analyse
- Gebruik een geschikt computersoftwareprogramma om de statistische analyse van de verkregen resultaten uit te voeren.
OPMERKING: Statistische analyse van de gegevens werd uitgevoerd met STATISTICA versie 13.5.0.17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een afname van de inhoudsmassa van de culturen op rijst voor zowel de M. pinghaense als de M. robertsii werd in de loop van de tijd waargenomen tijdens het droogstadium van de schimmelculturen, waarbij geen of weinig verandering werd waargenomen in de massa zodra de culturen droog waren (figuur 5). Het geoogste droge schimmel conidia poeder van zowel de M. pinghaense als de M. robertsii is weergegeven in figuur 6.
Figuur 5: De verandering in de zakinhoudsmassa van de Metarhizium robertsii - en de M. pinghaense-culturen op rijst (95% betrouwbaarheidsinterval) gedurende 10 dagen (ANOVA; F5,35 = 2,21; p = 0,08). Verschillende letters boven de balken geven het significante verschil aan (p < 0,05) verkregen in de massa van het zakgehalte gedurende de dagen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Geoogste conidia. (A) Geoogste conidia in de verzamelpan. (B) Metarhizium robertsii. (C) M. pinghaense. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Er werd geen significant verschil waargenomen in het gemiddelde conidiale poeder dat werd geoogst van elk graantype voor zowel M. pinghaense als M. robertsii. Geoogste droge conidia voor beide hadden een gemiddelde van >90% conidiale levensvatbaarheid voor zowel M. pinghaense als M. robertsii. Op het rijstsubstraat produceerde M. pinghaense gemiddeld 8,2 g ± 4,38 g conidiaal poeder, wat iets hoger was dan de hoeveelheid die werd verkregen voor M. robertsii (6 g ± 2 g). Gemiddeld 1,83 g ± 1,47 g droge M. robertsii conidia werd geoogst uit het gevlokte gerstsubstraat, terwijl nul M. pinghaense uit het substraat werd geoogst. Er werden geen droge schimmelconidia geoogst uit het gevlokte haverssubstraat voor M. pinghaense of M. robertsii (figuur 7).
Figuur 7: Gemiddelde hoeveelheid conidia poeder. De gemiddelde hoeveelheid conidiapoeder van Metarhizium pinghaense en M. robertsii, gemeten in grammen (95% betrouwbaarheidsinterval) geoogst uit de drie vaste substraten: voorgekookte rijst, gerst in vlokken en havermout (ANOVA: F2,27 = 2,82; p = 0,08). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Een significant verschil in de geschatte gemiddelde conidia per gram, geoogst uit de rijstkorrels, werd waargenomen tussen M. pinghaense (3,51 x 107/g ± 0,43 x 107/g) en M. robertsii (4,31 x 107/g ± 0,38 x 107/g). M. robertsii had een iets hoger gemiddeld aantal conidia per gram dan M. pinghaense (figuur 8).
Figuur 8: Gemiddelde conidia per gram. De geschatte gemiddelde conidia per gram voor Metarhizium pinghaense en M. robertsii (95% betrouwbaarheidsinterval) van de rijstculturen (ANOVA: F 1,7 = 8,47; p = 0,02). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Er werd geen significant verschil waargenomen in het geschatte aantal conidia op het afgewerkte rijstsubstraat tussen M. pinghaense (5,02 x 107/ml ± 1,47 x 107/ml) en M. robertsii (3,70 x 107/ml ± 0,91 x 107/ml) (figuur 9). M. pinghaense had echter een iets hoger aantal conidia op het rijstsubstraat dan M. robertsii.
Figuur 9: Gemiddelde schimmel conidia. De geschatte gemiddelde schimmelconidia van Metarhizium pinghaense en M robertsii (95% betrouwbaarheidsinterval) van de culturen (F1,7 = 2,45; p = 0,16) aanwezig op de gebruikte rijstcultuursubstraten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Er werd geen significant verschil in de geschatte totale conidia-opbrengst waargenomen tussen de M. pinghaense (5,09 x 107/g ± 1,35 x 107/g) en de M. robertsii (3,55 x 107/g ± 0,85 x 107/g) verkregen uit de rijstsubstraatculturen. M. pinghaense produceerde echter een iets hogere conidiale opbrengst dan M. robertsii, wat een lagere conidiale opbrengst opleverde (figuur 10).
Figuur 10: Totale conidia-opbrengst. De geschatte totale conidia-opbrengst van Metarhizium pinghaense en M. robertsii (95% betrouwbaarheidsinterval) uit de culturen op rijst (F1,7 = 3,91; p = 0,09). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De succesvolle integratie van microbiële agentia voor de biologische bestrijding van belangrijke landbouwinsectenplagen in een agro-ecosysteem hangt af van zowel succes als gemak van massaproductie van de entomopathogenen als eerste stap onder laboratoriumomstandigheden. De massaproductie van EPF is belangrijk voor de grootschalige toepassing en beschikbaarheid van EPF-producten voor IPM-programma's met behulp van biologische bestrijding 9,10,11,12,13. Het succes van massaproductie van verschillende EPF-isolaten wordt beïnvloed door de voedingscomponenten van het productiesubstraat of -medium, die een aanzienlijke invloed hebben op de kenmerken van de resulterende conidia, waaronder hun werkzaamheid, uitdrogingstolerantie, veldpersistentie en conidiale opbrengst 8,19,20,21 . Daarom is het belangrijk om kennis te ontwikkelen over de voedingsbehoeften van in massa geproduceerde entomopathogenen tijdens het teelt- en fermentatieproces29.
In de huidige studie werd de massaproductie van zowel M. robertsii als M. pinghaense uitgevoerd met behulp van drie verschillende landbouwproducten als fermentatiesubstraten: voorgekookte rijst, gevlokken gerst en vlokken haver. De drie verschillende graansubstraten werden waargenomen om de conidiale opbrengst van de schimmelisolaten aanzienlijk te beïnvloeden. De voorgekookte rijst was zeer gunstig voor massaproductie van beide isolaten, terwijl de vlokken gerstkorrels alleen de productie van M. robertsii begunstigden. De waarnemingen werden gedaan op basis van de opbrengst van droog schimmelconidiapoeder na fermentatie. Weinig of niet, conidia werden geoogst van de vlokken haver na fermentatie. De vlokken haver bleken tijdens het fermentatieproces hogere niveaus van vocht in de fermentatiezakken vast te houden, wat mogelijk resulteerde in de waargenomen slechte prestaties van het graan als substraat voor de productie van M. pinghaense en M. robertsii. Het afgebladderde haverssubstraat was in sommige gevallen gevoelig voor een witte vegetatieve myceliale overgroei van de schimmelisolaten, wat de conidiale opbrengst sterk beïnvloedde, omdat sporulatie niet optrad in de fermentatiezakken met de overgroei. De fermentatiezakken met het afgevlokken haverssubstraat bleken ook hoge niveaus van bacteriële besmetting te hebben ten opzichte van de fermentatiezakken met afgebladderde gerstsubstraten.
Hoge niveaus van saprofytische schimmels of gistbesmetting werden waargenomen met betrekking tot de massaproductie van M. pinghaense met afgebladderde gerst als substraat. De saprofytische schimmelbesmetting werd waargenomen in een later stadium van het fermentatieproces door de groei en conidiogenese van een andere schimmel dan degene die wordt gebruikt om het substraat te enten. Het diagnosticeren van substraatverontreiniging in een beginstadium van fermentatie, voorafgaand aan conidiale sporulatie, was moeilijk. Bacteriële en gistbesmetting tijdens het fermentatieproces wordt verondersteld zich te manifesteren door natte plekken in het substraat, en zowel vlokken haver als gerstkorrels hebben de neiging om vocht langer te absorberen en vast te houden dan rijstkorrels. Dit was een beperking tot het gebruik van deze twee substraten als fermentatiesubstraten voor de massaproductie van de twee Metarhizium-isolaten .
De observaties die tijdens de huidige studie werden gedaan, toonden aan dat het type inentingsmethode dat werd gebruikt om elk graansubstraat te enten, de conidiale productie beïnvloedde. De conidiale suspensie-inentingsmethode bleek relatief minder effectief te zijn, omdat de ingeënte havermout en afgevlokken gerst een verhoogd niveau van verontreiniging vertoonden ten opzichte van wanneer de vloeistofgekweekte blastospore-inentingsmethode werd gebruikt op rijstkorrels. In tegenstelling tot de vloeistofgekweekte blastospore-inentingsmethode, maakt de conidiale suspensiemethode het niet mogelijk om mogelijke verontreinigingen in de suspensies te detecteren voorafgaand aan de inenting van de substraten, wat resulteert in de hoge niveaus van verontreiniging die werden waargenomen in de fermentatiezakken. Jaronski en Jackson18 beschreven verschillende factoren die kunnen leiden tot de mogelijke verontreiniging van de gebruikte substraten, zoals het ontbreken van volledige sterilisatie van het substraat, niet-steriele inenting en onjuiste behandeling van het fermentatiesubstraat in de zakken. De waargenomen verontreiniging in de gistingszakken met afgebladderde gerst en haver in vlokken kan ook het gevolg zijn geweest van een gebrek aan volledige sterilisatie van het substraat, wat tijdens het autoclaveringsproces had kunnen optreden. Jaronski en Jackson18 beschreven ook het gebruik van conidiale suspensies als inoculantia als nadelig, omdat het resulteert in een verhoogde kans op besmetting tijdens de conidiale oogst van een agarmedium.
In het veld, tijdens de infectie van geschikte gastheren, bouwt de schimmel eerst biomassa op in de hemocoel van de insecten door proliferatie, voorafgaand aan de opkomst en sporulatie op het buitenste vaste oppervlak van de insecten30. Een dergelijk proces werd nagebootst bij het gebruik van de vloeistof-blastospore fermentatiemethode. Dienovereenkomstig vertegenwoordigde de bouillon de hemocoel van het insect, de inenting van de bouillon met schimmel conidia vertegenwoordigde het eerste contact en de infectie van het insect, en de vorming van blastospores in de bouillon vertegenwoordigde de proliferatie van het blastosporeproces dat optreedt in de hemocoel van het geïnfecteerde insect. De laatste inenting van de rijstkorrels en sporulatie van de schimmel op de korrels in de loop van de tijd vertegenwoordigden wat er gebeurt op de cuticula van het insect zodra de schimmel uit het kadaver van het insect begint te komen. Dit kan mogelijk verklaren waarom de vloeibare blastosporefermentatiemethode beter werkte dan de conidiale suspensie-inentingsmethode.
Jaronski en Jackson18 beschreven vlokken haver en vlokken gerstkorrels als de voorkeurslandbouwkorrels voor massacultuur van Metarhizium-soorten , vergeleken met rijstkorrels, omdat de twee graansoorten hun vochtgehalte tijdens het fermentatieproces bleken te behouden. De huidige studie is echter in tegenspraak met de observaties en conclusies van de bovengenoemde onderzoekers, omdat zowel de vlokken haver als de vlokken gerst geen goede vaste fermentatiesubstraten bleken te zijn voor M. pinghaense of M. robertsii. De rijst bleek een goed graansubstraat te zijn voor beide isolaten, omdat het niet uiteenviel in kleine deeltjes die zich konden mengen met het eindproduct, zoals in eerdere studies werd gesuggereerd.
De huidige studie heeft aangetoond dat isolaten van de Metarhizium-soorten met succes kunnen worden gekweekt en massaal geproduceerd met behulp van rijstkorrels en dat de verschillende granen de neiging hebben om de conidiale sporulatie te beïnvloeden en anders op te leveren. Dit kan mogelijk te wijten zijn aan het feit dat verschillende granen verschillen in termen van dergelijke voedingssamenstelling, bijvoorbeeld koolstof: stikstofverhoudingen en koolstofconcentratie. Het is bekend dat de koolstofconcentratie en koolstof: stikstofverhouding van een groeimedium de opbrengst van conidia beïnvloeden, evenals de kwaliteit ervan in termen van levensvatbaarheid en virulentie22. Het is ook aangetoond dat de inentingstechnieken die worden gebruikt om de substraten te enten, van invloed zijn op de mate van succes die wordt bereikt bij de massaproductie van EPF-isolaten op specifieke landbouwgrasensubstraten. Daarom wordt de vloeibare blastosporefermentatietechniek die in de huidige studie wordt beschreven, aanbevolen als de beste inentingsmethode voor landbouwgraansubstraten voor de massaproductie van zowel M. pinghaense - als M. robertsii-isolaten . Het gebruik van een dergelijke methode maakt de mogelijke detectie van verontreiniging voorafgaand aan het gebruik van de inoculantia mogelijk, wat de massaproductie van het gewenste EPF-isolaat kan belemmeren ten opzichte van het gebruik van de conidiale suspensie-inentingstechniek. Het wordt ook aanbevolen om rijstkorrels te gebruiken als de vaste substraten voor massaproductie van conidia van zowel M. pinghaense als M. robertsii, in plaats van vlokken gerst en vlokken haver. De beschreven techniek is belangrijk voor toekomstige massaproductie en commerciële toepassing van de conidia onder veldomstandigheden tegen belangrijke insectenplagen in de agro-ecosystemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen Hort Pome, Hort Stone en het Technology and Human Resources for Industry Programme (THRIP: TP14062571871) bedanken voor de financiering van het project.
ORCID:
http://orcid.org/0000-0002-5118-3578 Letodi L. Mathulwe
Antoinette P. Malan http://orcid.org/0000-0002-9257-0312
Nomakholwa F. Stokwe http://orcid.org/0000-0003-2869-5652
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Tween 20 | Lasec | Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water | |
| 20 mL McCartney bottles | Lasec | Used to make conidial suspensions | |
| Aluminium foil | Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask | ||
| Autoclave | Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process | ||
| Autoclave bags | Lasec | Fermentation bags or solid substrate containers | |
| Autoclave tape | Lasec | To secure PVC pipes on the fermentation bags | |
| Brown Kraft paper bags | Used to dry conidia cultures on agricultural grains | ||
| Bunsen burnner | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks) | |
| Clear edge test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
| Corn steep liquor | SIGMA | 66071-94-1 | Ingredient of the blastospore liquid medium |
| Cotton Wool | Lasec | Used as plug of the neck for fermentation bags | |
| Duran laboratory bottles | Neolab | Used to autoclave SDA medium and distilled water | |
| Electrical tape | Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust | ||
| ENDECOTTS test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
| Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask | Lasec | Carrier of the blastospore liquid medium | |
| Ethanol (99%) | Lasec | Used to sterilize surgical blades and inoculating loops | |
| Flaked barley | Health Connection Wholefoods | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Flaked oats | Tiger brands | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Glucose | Merck | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
| Growth Chamber/ incubators | For growing fungal conidia culture | ||
| Haemocytometer | Used to determine conidial concentrations | ||
| Inoculating loops | Lasec | For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth | |
| Kitchen rolling pin | Used to manipulate the solid grain substrate bed | ||
| Laminar flow Cabinet | ESCO Laminar Flow Cabinet | Provide as sterile environment during substrate inoculation | |
| Metarhizium pinghaense conidia | Stellenbosch University | 5HEID | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense |
| Metarhizium robertsii conidia | Stellenbosch University | 6EIKEN | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii |
| Microscope | ZEIZZ (Scope. A1) | Used to determine conidial concentrations and conidial viability | |
| Orbital shaker | IncoShake- LABOTEC | Used for the blastospore production process | |
| Parboiled rice | Spekko | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Penicillin-Streptomycin | SIGMA | Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination | |
| Petri-dishes | Lasec | Containers for the SDA medium | |
| Pipettes and pipette tips | Labnet (BioPette PLUS) | Used to measure liquids ingredients | |
| Polyvinylchloride Marley waste pipe | Used to create a neck for the fermentation bag | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
| Rubber band | Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks | ||
| Sabaroud dextrose agar (SDA) | NEOGEN Culture Media | Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii | |
| Sterile distilled water | To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions | ||
| Sticky pad | Used to secure the seives on the vibratory shaker | ||
| Surgical blade | Lasec | Used to scrape off spores from fungal cultures | |
| Surgical paper | Lasec | Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag | |
| Vibratory shaker | Used to shake conidia off the agricultural grain substrates | ||
| Vortex mixer | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles | |
| Yeast extract | Biolab | Added to the SDA medium to improve spore germination and growth | |
| Zipper-lock bags | GLAD | Used to to store harvested fungal conidia |
References
- Shah, P. A., Pell, J. K. Entomopathogenic fungi as biological control agents. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5), 413-423 (2003).
- Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. A review of the biology and control of the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae), with special reference to biological control using entomopathogenic fungi and nematodes. African Entomology. 29 (1), 1-16 (2020).
- Ibrahim, L., Laham, L., Touma, A., Ibrahim, S. Mass production, yield, quality, formulation and efficacy of entomopathogenic Metarhizium anisopliae conidia. Current Journal of Applied Science and Technology. 9 (5), 427-440 (2015).
- Banu, J. G., Rajalakshmi, S. Standardisation of media for mass multiplication of entomopathogenic fungi. Indian Journal of Plant Protection. 42 (1), 91-93 (2014).
- Roberts, D. W., Humber, R. A. Entomogenous fungi. Biology of Conidial Fungi. Cole, G. T., Kendrick, W. B. , Academic Press. New York. 201-236 (1981).
- Feng, M. G., Poprawski, T. J., Khachatourians, G. G. Production, formulation and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for insect control. Current status. Biocontrol Science and Technology. 4 (1), 3-34 (1994).
- Karanja, L. W., Phiri, N. A., Oduor, G. I. Effect of different solid substrates on mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae entomopathogens. The Proceedings of the12th KARI Biennial Scientific Conference. , Nairobi, Kenya. 8-12 (2010).
- Prasad, C. S., Pal, R. Mass production and economics of entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae and Verticillium lecanii on agricultural and industrial waste. Scholars Journal of Agriculture and Veterinary Sciences. 1 (1), 28-32 (2014).
- Ehlers, R. U. Mass production of entomopathogenic nematodes for plant protection. Applied Microbiology and Biotechnology. 56 (5), 623-633 (2001).
- Pham, T. A., Kim, J. J., Kim, S. G., Kim, K. Production of blastospore of entomopathogenic Beauveria bassiana in a submerged batch culture. Mycobiology. 37 (3), 218-224 (2009).
- Bhadauria, B. P., Puri, S., Singh, P. K. Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products. The Bioscan. 7 (2), 229-232 (2012).
- Latifian, M., Rad, B., Amani, M. Mass production of entomopathogenic fungi Metarhizium anisopliae by using agricultural products based on liquid-solid diphasic method for date palm pest control. International Journal of Farming and Allied Sciences. 3 (4), 368-372 (2014).
- Agale, S. V., Gopalakrishnan, S., Ambhure, K. G., Chandravanshi, H., Gupta, R., Wani, S. P. Mass production of entomopathogenic fungi (Metarhizium anisopliae) using different grains as a substrate. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7 (1), 2227-2232 (2018).
- Jackson, M. A. Optimizing nutritional conditions for the liquid culture production of effective fungal biological control agents. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 19 (3), 180-187 (1997).
- Deshpande, M. V. Mycopesticides production by fermentation. Potential and challenges. Critical Reviews in Microbiology. 25 (3), 229-243 (1999).
- Sahayaraj, K., Namasivayam, S. K. R. Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products and by products. African Journal of Biotechnology. 7 (12), 1907-1910 (2008).
- Feng, K. C., Liu, L. B., Tzeng, Y. M. Verticillium lecanii spore production in solid-state and liquid-state fermentations. Bioprocess Engineering. 23 (1), 25-29 (2000).
- Jaronski, S. T., Jackson, M. A. Mass production of entomopathogenic Hypocreales. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology 2nd edition. Lacey, L. A. , Academic Press. London. 255-284 (2012).
- Vega, F. E., Jackson, M. A., Mercandier, G., Poprawski, T. J. The impact of nutrition on spore yields for various fungal entomopathogens in liquid culture. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 19 (4), 363-368 (2003).
- El Damir, M. Effect of growing media and water volume on conidial production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Journal of Biological Sciences. 6 (2), 269-274 (2006).
- Pandey, A. K., Kanaujia, K. R. Effect of different grains as solid substrates on sporulation, viability and pathogenicity of Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin. Journal of Biological Control. 22 (2), 369-374 (2008).
- Kassa, A., et al. Whey for mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Mycological Research. 112 (5), 583-591 (2008).
- Sharma, S., Gupta, R. B. L., Yadavam, C. P. S. Selection of a suitable medium for mass multiplication of entomofungal pathogens. Indian Journal of Entomology. 64 (3), 254-261 (2002).
- Bich, G. A., Castrillo, M. L., Villalba, L. L., Zapata, P. D. Evaluation of rice by-products, incubation time, and photoperiod for solid state mass multiplication of the biocontrol agents Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Agronomy Research. 16 (5), 1921-1930 (2018).
- Price, R. E., Müller, E. J., Brown, H. D., D'Uamba, P., Jone, A. A. The first trial of a Metarhizium anisopliae var. acridum mycoinsecticide for the control of the red locust in a recognised outbreak area. International Journal of Tropical Insect Science. 19 (4), 323-331 (1999).
- Hatting, J. L., Moore, S. D., Malan, A. P. Microbial control of phytophagous invertebrate pests in South Africa. Current status and future prospects. Journal of Invertebrate Pathology. 165, 54-66 (2019).
- Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. Laboratory screening of entomopathogenic fungi and nematodes for pathogenicity against the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae). Biocontrol Science and Technology. , (2021).
- Inglis, G. D., Enkerli, J., Goettel, M. S. Laboratory techniques used for entomopathogenic fungi: Hypocreales. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , Academic Press, Elsevier. Chapter 7 189-253 (2012).
- Mehta, J., et al. Impact of carbon & nitrogen sources on the Trichoderma viride (Biofungicide) and Beauveria bassiana (entomopathogenic fungi). European Journal of Experimental Biology. 2 (6), 2061-2067 (2012).
- Burges, H. D. Formulation of mycoinsecticides. Formulation of Microbial Biopesticides. , Springer. Dordrecht. 131-185 (1998).
