Summary
Entomopathogene sopp har fått betydning som de biologiske kontrollmidlene til landbruksinsekt. I denne studien ble masseproduksjonen av et tilstrekkelig antall elastiske infektive propaguler av sørafrikanske isolasjoner av både Metarhizium robertsii og M. pinghaense for kommersiell anvendelse mot vellykket utført ved hjelp av landbrukskornprodukter.
Abstract
Entomopathogene sopp av Metarhizium anisopliae artskomplekset har fått betydning som de biologiske kontrollmidlene til landbruksinsekt. Økningen i skadedyrsmotstand mot kjemiske insektmidler, de økende bekymringene for de negative effektene av insektmidler på menneskers helse, og miljøforurensningen fra plantevernmidler har ført til et globalt pådriv for å finne nye bærekraftige strategier for avlingsbeskyttelse og skadedyrsbekjempelse. Tidligere har forsøk på å massekulturere slike entomopathogene sopparter (EPF) som Beauveria bassiana blitt utført. Imidlertid er det bare utført begrensede forsøk på massekultur metarhizium robertsii og M. pinghaense for bruk mot. Denne studien hadde som mål å masseprodusere et tilstrekkelig antall elastiske infektive propaguler av sørafrikanske isolasjoner av M. robertsii og M. pinghaense for kommersiell anvendelse. Tre landbrukskornprodukter, flakede havre, flaket bygg og ris ble brukt som EPF solid gjæringssubstrater. To inokulasjonsmetoder, konidiale suspensjoner og den flytende soppkulturen av blastosporer ble brukt til å inokulere de faste substratene. Inokulering ved bruk av konidiale suspensjoner ble observert å være relativt mindre effektiv, da økte nivåer av forurensning ble observert på de faste substratene i forhold til ved bruk av blastosporinokuleringsmetoden. Flaked havre ble funnet ikke å være et passende vekstsubstrat for både M. robertsii og M. pinghaense, da ingen tørr conidia ble høstet fra substratet. Flaked bygg ble funnet å favorisere produksjonen av M. robertsii conidia over M. pinghaense, og i gjennomsnitt 1,83 g ± 1,47 g tørr M. robertsii conidia og null gram M. pinghaense conidia ble høstet fra substratet. Riskorn ble funnet å favorisere den konidiale masseproduksjonen av både M. pinghaense og M. robertsii isolerer, med et gjennomsnitt på henholdsvis 8,2 g ± 4,38 g og 6 g ± 2 g høstet fra substratet.
Introduction
Entomopathogene sopp (EPF) har fått betydning som avlingsbeskyttelsesmidler i den biologiske kontrollen av viktige landbruksinsekt 1,2. Entomopathogenene, som forekommer naturlig i jord, forårsaker epizootikk i befolkningen i ulike skadedyrsarter3. Arten av EPF er vertsspesifikk og utgjør relativt få risikoer når det gjelder å angripe ikke-målrettede arter, og de er ikke-giftige for miljøet4. EPF har en unik mekanisme for å invadere verten, samt for å forplante og vedvare i deres umiddelbare miljø1. De angriper verten hovedsakelig gjennom aseksuelle sporer som fester seg til og trenger inn i verts cuticle for å invadere og spre seg i verts hemocoel. Verten dør til slutt på grunn av uttømming av hemolymfe næringsstoffer eller som følge av toksemi forårsaket av giftige metabolitter frigjort av soppen. Etter døden, under ideelle miljøforhold, kommer soppen ut på den ytre overflaten (overt mykose) av vertskadaveren 5,6.
Økende bekymringer for de negative effektene av kjemiske rester på menneskers helse, miljøforurensning og utvikling av skadedyrsresistens har ført til den globale drivkraften for å redusere innganger av kjemisk baserte insektmidler og for å finne alternative, nye og bærekraftige strategier for avlingsbeskyttelse og skadedyrsbekjempelse 6,7,8 . Dette har gitt muligheter til å utvikle mikrobielle baserte insektmidler til bruk i Integrert Pest Management (IPM) programmer, som er mer økologisk gunstige strategier enn konvensjonell kjemisk kontroll 3,8.
For å utvikle et vellykket mikrobielt kontrollmiddel for et landbruksskade, må en passende organisme først isoleres, karakteriseres, identifiseres og dens patogenitet for målskade bekreftet. En enkel, kostnadseffektiv metode for storskala produksjon av mikrobielle midler er imidlertid nødvendig for å produsere et levedyktig produkt for bruk i biologiske kontrollprogrammer 9,10,11,12,13. Masseproduksjon av betydelige mengder entomopathogener av god kvalitet avhenger av mikrobiell belastning, miljø, mål, formulering, markedet, applikasjonsstrategien og ønsket sluttprodukt 14,15,16. EPF kan masseproduseres ved hjelp av flytende substratgjæring for å produsere blastosporer eller den faste substratgjæringsprosessen for å produsere luftkonidia 6,17,18. Imidlertid påvirker masseproduksjons- og formuleringsprosessen av entomopathogener direkte virulens, kostnaden, holdbarheten og felteffekten av sluttproduktet. For vellykket bruk i IPM må produksjonsprosessen til entomopathogenene være enkel å kjøre, kreve minimal arbeidskraft, produsere en høy avkastning konsentrasjon av virulente, levedyktige og vedvarende propagules, og være lav i kostnad 4,13,14,16.
Å forstå ernæringskravene til entomopathogener er viktig for massedyrking med alle dyrkingsmetoder 4,12. Næringskomponentene i produksjonsmediet har en betydelig innvirkning på egenskapene til de resulterende propagulene, inkludert biokontrolleffekt, utbytte, uttørkingstoleranse og utholdenhet 8,19,20,21. Optimalisering av produksjonsprosedyrer er utformet for å adressere slike faktorer22. For EPF er de viktigste kravene til god vekst, sporulering og masseproduksjon av soppfusi tilstrekkelig fuktighet, optimal veksttemperatur, pH, gassutveksling av CO2 og O2, og ernæring, inkludert gode fosfor-, karbohydrat-, karbon- og nitrogenkilder18.
Jaronski og Jackson18 beskriver den faste substratgjæringsmetoden som den mest effektive og nærmeste tilnærmingsmetoden til den naturlige prosessen for EPF-produksjon i forhold til den flytende substratgjæringsmetoden fordi, under naturlige forhold, bæres soppkonidiumet på faste oppreiste strukturer, som overflaten av insektkadaver. Landbruksprodukter og biprodukter som inneholder stivelse brukes for det meste til masseproduksjon av hypokreolske sopp, da soppene lett dekomponerer stivelse gjennom sekresjon av høyt konsentrerte hydrolytiske enzymer fra hyfaltspissene, for å trenge inn i det faste stoffet, og for å få tilgang til næringsstoffene som er tilstede i stoffet 11,17,18,23 . Kornproduktene stiller også krav til sunn biomasseproduksjon fordi substratene kan absorbere ytterligere næringsstoffer fra ethvert flytende medium 16,18,24 når de er hydrert og sterilisert.
Tidligere forsøkte flere studier å massekulturere EPF-arter som Beauveria bassiana (Bals.) Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha &Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas og noen av Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin artskompleks isolerer på ulike substrater 16,23,24. Slike masseproduserte og kommersielt utviklede isolasjoner inkluderer Green Muscle® (stamme IMI 330189), utviklet fra M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver &Milner) J.F. Bisch, Rehner &Humber, Metarhizium 69 (Meta 69 stamme ICIPE69) og Real Metarhizium 69 (L9281), utviklet fra M. anisopliae, og Bredbånd® (stamme PPRI 5339) og Eco-Bb®, utviklet fra B. bassiana25,26 . Det er imidlertid gjort begrensede forsøk på massekulturen Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner &Humber og Metarhizium pinghaense Chen &Guo. Disse to isolasjonene ble valgt ut i en tidligere studie som den mest effektive for kontroll av melkebollen, Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)27. Derfor hadde den nåværende studien som mål å formulere og masseprodusere et tilstrekkelig antall elastiske infektive propaguler av de lokale isolasjonene til M. robertsii og M. pinghaense for kommersiell anvendelse mot. Den faste substratgjæringsmetoden ble brukt til å masseprodusere soppkonidiaen for begge EPF-isolasjonene. To EPF-inokuleringsmetoder, ved hjelp av konidiale suspensjoner og den flytende soppkulturen av blastosporer, ble brukt til å inokulere de faste substratene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kilde til soppstammer
- Bruk sørafrikanske isolerte soppstammer av både M. pinghaense 5 HEID (GenBank Accession number: MT367414/MT895630) og M. robertsii 6EIKEN (MT378171/MT380849), hentet fra eplehager i Western Cape-provinsen, Sør-Afrika.
- Vokse kulturer av hver EPF isolere på 60 g Sabouraud dextrose agar medium, supplert med 1 g gjær ekstrakt (SDAY) og 10 μL Streptomycin.
MERK: Inkuber EPF-kulturer ved en kontrollert temperatur på ± 25 °C i mørket.
2. Metarhizium pinghaense og M. robertsii conidial suspensjon inokulering
- Forberedelse av de faste substratene
- Bruk to landbruksprodukter, nemlig flaket havre og flaket bygg, som vekstmedier for de to EPF-isolasjonene og autoklavposene (305 mm × 660 mm) som gjæringsposer.
- Bruk et lite polyvinylkloridavfallsrør (1000 mm × 50 mm) for å lage en hals for gjæringsposen i den åpne enden av autoklavposen og bruk autoklavbånd for å feste røret til posen.
- Lukk røret med en steril bomullsullplugg for å tillate tilstrekkelig gassutveksling under gjæring.
- Vei tørre korn (200 g) av både flaked havre og flaked bygg og legg dem i gjæringsposene, og legg til 100 ml destillert vann og bland innholdet i posene grundig.
- La de våte kornene hvile i 15-30 min for å absorbere fuktighet før autoklavering og sterilisering. Forbered seks poser for hver korntype, og for å forhindre forurensning, legg posene i andre autoklavposer, og autoklaver substratene ved 121 °C i 55 minutter.
- Fremstilling av konidial suspensjon inoculum
- Høst 2-3 uker gamle sopp conidia fra soppkulturer av både M. pinghaense og M. robertsii ved skraping, ved hjelp av et sterilt kirurgisk blad.
- Suspender den oppsamlede soppkontrofien i 20 ml sterilt destillert vann, supplert med 0,05% Tween 20, og virvelblanding av konidiale suspensjoner i 2 min.
- Forbered 20 ml konidial suspensjoner, med en konsentrasjon på henholdsvis 1 × 107 conidia/ml, og inokuler de flakede havre og flakede byggfaste substratene.
MERK: Bruk et hemocytometer for å bestemme konidialkonsentrasjoner.
- Inokulering av de faste substratene
- Åpne hver pose ved å fjerne bomullsullhalspluggene, og tilsett den tilberedte 20 ml konidialfjæringen til det avkjølte autoklavede substratet.
- Lukk posene igjen, bruk nakkepluggene, og masser innholdet i posen slik at soppulumet blir jevnt blandet med kornsubstratet.
- Inkuber gjæringsposene ved en kontrollert temperatur på ± 25 °C, og sørg for tilstrekkelig gassformige utveksling mellom kultur og miljø.
MERK: Denne prosedyren må utføres under et laminært strømningsskap.
- Gjæringsfase
- Masser kornsubstratene manuelt i gjæringsposene 2 dager etter inokulering og inkubasjon, når synlig mycelial vekst oppstår og substratet har begynt å bli klumpet av den voksende soppen.
MERK: Dette gjøres for å blande de inokulerte granulatene slik at mycelial forgrening finner sted i de første tidlige stadiene av soppens vegetative vekst. - Bruk et kjøkken rullestift for å manipulere substratsengen for å unngå den fysiske heterogeniteten til kornsubstratsengene og sengetykkelsen på substratmassen.
MERK: Prosessen fremmer soppmetabolismen, som optimaliserer soppsporproduksjonen, og maksimerer overflatearealet, og fremmer konidialutbytte18. - La gjæringsprosessen fortsette i opptil 4-5 uker, og kontroller gjæringsposene hver annen dag for tilstedeværelse av hvit vegetativ overvekst som kan utvikle seg under gjæringsprosessen, noe som i stor grad kan påvirke soppkondisiutbyttet.
MERK: Avslutt gjæringen umiddelbart i gjæringsposene som inneholder hvit vegetativ overvekst, og tørk soppkulturene18.
- Masser kornsubstratene manuelt i gjæringsposene 2 dager etter inokulering og inkubasjon, når synlig mycelial vekst oppstår og substratet har begynt å bli klumpet av den voksende soppen.
3. Blastospore inokulasjon
- Blastospore produksjon og inokulasjon
- Forbered et flytende kulturmedium, som inneholder 1 L destillert vann, 30 g glukose, 20 g gjærekstrakt, 4 g kaliumfosfatdiabasic (K2HPO4), 15 ml mais bratt brennevin og 10 μg/ml antibiotika Streptomycin, for både M. pinghaense og M. robertsii.
- Først oppvarmer du det destillerte vannet, slår av før du når kokepunktet, og tilsett hver av ingrediensene, unntatt Streptomycin, til det varme vannet i potten. Kok mediet forsiktig i 3-4 min, og rør hele tiden mediet for å tillate riktig blanding av ingrediensene og forhindre sedimentering av noen av ingrediensene på bunnen av potten.
- Hell totalt 100 ml av mediet i ni forskjellige 250 ml kolber og legg en bomullsullplugg på hver kolbe, og dekk bomullsullen med aluminiumsfolie som en stopper (figur 1A).
- Autoklaver mediet i kolbe i 55 min ved 121 °C. Etter autoklaven, la mediet i kolbeene avkjøles og tilsett 10 mg/ml Streptomycin til mediet i hver kolbe (figur 1B).
- Samle to til tre bakterielle løkker av sopp conidia fra 2-3 uker gamle soppkulturplater for både EPF-isolasjoner, M. pinghaense og M. robertsii, og overfør til hver 100 ml flytende medier i 250 ml kolber, under sterile forhold, og forsegle kolber.
- Inkuber de flytende kulturflaskene ved ± 25 °C, på en orbital shaker ved 140 o/min i 3 dager, og stopp inkubasjonen når kulturene viser tegn på høy turbiditet med soppblåsingsvekst (figur 1C).
- For å oppdage mulig bakteriell forurensning fra kulturene, tegn en 100 μL prøve fra hver flytende kulturflaske etter 24 timer under inkubasjon og tallerken på tre SDA-plater per isolat. Inkuber platene i 48 timer, ved en kontrollert temperatur på ± 25 °C.
- Forberedelse av det faste substratet
- Bruk parboiled langkornet hvit ris som et solidt substratmedium for blastospores av både M. pinghaense og M. robertsii (tilpasset fra Jaronski og Jackson18).
- Forbered gjæringsposene som beskrevet ovenfor, i trinn 2.1.1-2.1.3, og for hver pose, tilsett 1 kg ris og 300 ml sterilt destillert vann.
- Bland forsiktig innholdet i gjæringsposene og legg det i ytre autoklavposer i oppreist stilling, og autoklaver ved 121 °C i 55 minutter. Etter autoklaven, la substratene avkjøles i ± 45 min under sterile forhold.
- Inokulering og gjæring
- Fjern lukkingen av hver av de flytende kulturflaskene i både M. pinghaense og M. robertsii under en laminær strømning og flamme kanten av hver kolbe i 10 s.
- Hell de 100 ml flytende kulturene i gjæringsposene ved å fjerne bomullsullpluggene fra nakken (figur 2). Sett bomullspluggene på igjen og dekk toppen av posens hals med kirurgisk papir festet med et gummibånd.
MERK: Bestem blastosporkonsentrasjon for hver kolbe ved hjelp av et hemocytometer, og bruk blastosporkonsentrasjoner på 1 × 107 - 5 × 108 blastosporer/ml for å innkaulere substratene28. - Vri den øverste delen av posen og bland innholdet i posen ved å riste og lette manipulering av substratet ved massasje, og inkuber posene ved ± 25 °C, ved å flate ut substratet i posene for å forhindre dannelse av tykke senger18.
- Bryt substratet i gjæringsposene ved å massere innholdet i posene, 2-3 dager etter inokuleringen og inkubasjonen, når synlig mycelial vekst og bindingen av substratet av soppen hadde skjedd (tilpasset fra teknikken til Jaronski og Jackson18).
MERK: La gjæringen fortsette i 4 uker.
Figur 1: Flytende kulturmedium i 250 ml kolber. (A) Før autoklavering. (B) Etter autoklavering og inokulering med EPF-sporer. (C) Turbid medium med sopp blastospores. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Forberedt blastospore flytende kulturmedium. (A) Metarhizium robertsii og (B) Metarhizium pinghaense før inokulering av ris som et solidt substrat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
4. Tørking av soppkulturer
- Tørk soppkulturene i 10-12 dager etter gjæring, før bruk i forsøk, ved å overføre de sporulerte kulturene til 26-30 kg (30 x 43 x 15250 cm3) brune papirposer.
- For å forbedre strekkfastheten til papirposene, kutt av en tredjedel av den øverste delen av hver pose, og fyll bunnen av posen (figur 3A, B).
Figur 3: Tilberedning av papirposer, tørkeprosedyre av kulturer og emballasje. (A,B) Tilberedning av brune papirposer. Tørkeprosedyren for Metarhizium arter kulturer dyrket på (C, E) parboiled ris og (D, F) flaket bygg. (G) Papirposer lukket med stifter for å skape en trekantet teltstruktur. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Smuldre substratet forsiktig i hver gjæringspose, klipp av hjørnet av hver pose og overfør hele kulturen til papirposene gjennom plassen som er igjen av det avskårne hjørnet (figur 3C-F). For å unngå overdreven rømming av soppsporer i luften, utfør denne prosessen sakte.
MERK: Utfør denne prosessen under sterile forhold, ved hjelp av laminær strømning, for å unngå forurensning. - Merk hver papirpose og brett over den øverste enden av hver pose to ganger og lukk med stifter for å skape en trekantet teltstruktur, og legg posene på trådtørkestativer for å tillate riktig, til og med tørking, ved en kontrollert temperatur på ± 25 °C og lav luftfuktighet på 30-40%.
- Snu posene daglig for å tillate jevn tørking av kulturene og for å unngå vegetativ gjenvekst som kan finne sted, noe som vil redusere utbyttet av høstbare soppsporer.
- Vei hver tørkepose etter hver 2. dag under tørkeprosessen, og fortsett tørkeprosessen for hver pose til det observeres lite eller ingen endring i massen av posene mellom de påfølgende dagene.
5. Innhøsting av sopp conidia
- Høst sopp conidia mekanisk fra kulturer ved hjelp av tre nestede sikter, en test sikt (ETS) mesh nr. 35 (med 500-μm blenderåpning), nestet på en testsikte (med 212-μm blenderåpning), montert nestet på ETS mesh nr.
- Legg den tørre kulturprøven på ETS mesh nr.
- Tilsett 10-12 glasskuler til siktene for å hjelpe passasjen av soppkonidiaen gjennom maskeskjermene og unngå oppbevaring av conidia i sikten, noe som kan føre til redusert sporegjenoppretting.
- Tape og forsegle silleddene ved hjelp av elektrisk tape for å forhindre rømming av konidialt støv.
- Plasser silene på en vibratorisk shaker, utstyrt med en klebrig pute, for å feste oppsamlingspannen og siktene, i 20-25 min, med en bevegelse på 560-640 vibrasjoner per min (figur 4).
MERK: Teknikk tilpasset fra Jaronski og Jackson18.
Figur 4: Høsting av soppsporer fra tørkede Metarhizium robertsii-kulturer på ris og flaket bygg. (A) 10-12 glasskuler tilsatt til siktene for å hjelpe passasjen av sopp conidia gjennom maskeskjermene. M. robertsii conidia høstet fra kulturer på (B) ris, og (C) flaket knapt. (D) Sikter på en vibratorisk shaker. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Fjern testsiktene fra oppsamlingspannen, samle conidia og oppbevar den oppsamlede kondiiaen i lufttette og vanngjennomtrengelige glidelåslåsposer for langvarig lagring (3-6 måneder).
6. Kvantifisering av sopp conidia produsert
- Mål og registrer massen av hvert kornsubstrat før høsting av soppkefien fra hvert substrat.
- Mål den totale vekten av den oppsamlede konidiaen ved å trekke massen av de oppsamlede sporene fra massen av det faste substratet.
MERK: Det totale conidia utbyttet involverer ikke bare høstet conidia, men også sopp conidia igjen på det faste substratet. - Vei substratet og fjern 10 g fra det veide substratet. Suspender 10 g av substratet i 0,05% Tween 20 og fortynn i 10 ml sterilt destillert vann.
- Vortex-bland suspensjonen i 2 min, og bruk et hemocytometer for å gjøre sporantallet for å bestemme antall conidia vasket fra substratet.
- Utfør ytterligere fortynning ved å overføre 1000 μL av 10 ml vasket konidial suspensjon til 9 ml sterilt destillert vann for å utgjøre 10 ml fortynningssuspensjoner.
- Vortex-bland de konidiale suspensjonene i 2 min, og bestem konidialkonsentrasjonene.
MERK: Følg prosedyren og formelen beskrevet av Inglis, Enkerli og Goettel30 for å bestemme konidialkonsentrasjonen av suspensjonene. - Samle og suspender totalt 0,1 g av det oppsamlede konidialpulveret fra hver kultur i 10 ml sterilt destillert vann supplert med 0,05% Tween 20, og virvelblanding konidial suspensjon i 2 min, og bestem konidialkonsentrasjonen ved hjelp av et hemocytometer.
- Utfør ytterligere fortynning ved å overføre 1000 μL av 10 ml konidial suspensjon til 9 ml sterilt destillert vann for å utgjøre 10 ml suspensjonsfortynning.
- Vortex-bland konidial suspensjonene i 2 min, beregn konidialkonsentrasjonene og bestem antall conidia per gram.
- Multipliser antall conidia per gram høstet pulver med den første massen av det høstede konidialpulveret. Multipliser antall conidia vasket fra substratet med den totale vekten av det brukte substratet, som er substratet som conidia ble høstet fra.
- Tilsett de to gitte verdiene sammen og del på substratets opprinnelige tørrvekt for å beregne antall conidia per kg eller g av substratet18.
MERK: Beregningene ble gjort hovedsakelig for rissubstratet. Spirings- eller konidial levedyktighetstesten ble utført for både M. pinghaense og M. robertsii isolerer for å bestemme levedyktigheten til den produserte conidia.
7. Dataanalyse
- Bruk et passende dataprogram til å utføre den statistiske analysen av de oppnådde resultatene.
MERK: Statistisk analyse av dataene ble gjort ved hjelp av STATISTICA versjon 13.5.0.17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En nedgang i innholdsmassen til kulturene på ris for både M. pinghaense og M. robertsii ble observert over tid under tørkestadiet av soppkulturene, uten at det ble observert noen eller lite endring i massen når kulturene var tørre (figur 5). Det høstede tørre soppkonidiapulveret til både M. pinghaense og M. robertsii er vist i figur 6.
Figur 5: Endringen i poseinnholdsmassen til Metarhizium robertsii og M. pinghaense-kulturene på ris (95 % konfidensintervall) over 10 dager (ANOVA; F5,35 = 2,21; p = 0,08). Ulike bokstaver over stolpene indikerer den signifikante forskjellen (p < 0,05) oppnådd i poseinnholdsmasse i løpet av dagene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Høstet conidia. (A) Høstet conidia i oppsamlingspannen. (B) Metarhizium robertsii. (C) M. pinghaense. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Ingen signifikant forskjell ble observert i gjennomsnittlig konidialpulver som ble høstet fra hver korntype for både M. pinghaense og M. robertsii. Høstet tørr conidia for begge hadde i gjennomsnitt >90% conidial levedyktighet for både M. pinghaense og M. robertsii. På rissubstratet produserte M. pinghaense i gjennomsnitt 8,2 g ± 4,38 g konidialpulver, som litt oversteg mengden som ble oppnådd for M. robertsii (6 g ± 2 g). Et gjennomsnitt på 1,83 g ± 1,47 g tørr M. robertsii conidia ble høstet fra det flakede byggsubstratet, mens null M. pinghaense ble høstet fra substratet. Ingen tørr soppkonidia ble høstet fra det flakede havresubstratet for verken M. pinghaense eller M. robertsii (figur 7).
Figur 7: Gjennomsnittlig mengde conidiapulver. Den gjennomsnittlige mengden conidia pulver av Metarhizium pinghaense og M. robertsii, målt i gram (95% konfidensintervall) høstet fra de tre faste substratene: parboiled ris, flaked bygg og flaked havre (ANOVA: F2,27 = 2,82; p = 0,08). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
En signifikant forskjell i estimert gjennomsnittlig conidia per gram, høstet fra riskornene, ble observert mellom M. pinghaense (3,51 x 107/g ± 0,43 x 107/g) og M. robertsii (4,31 x 107/g ± 0,38 x 107/g). M. robertsii hadde et litt høyere gjennomsnittlig conidia-antall per gram enn M. pinghaense (figur 8).
Figur 8: Gjennomsnittlig conidia per gram. Estimert gjennomsnittlig conidia per gram for Metarhizium pinghaense og M. robertsii (95% konfidensintervall) fra riskulturene (ANOVA: F 1,7 = 8,47; p = 0,02). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Det ble ikke observert noen signifikant forskjell i det estimerte antallet conidia som var tilstede på det brukte rissubstratet mellom M. pinghaense (5,02 x 107/ml ± 1,47 x 107/ml) og M. robertsii (3,70 x 107/ml ± 0,91 x 107/ml) (figur 9). Imidlertid hadde M. pinghaense et litt høyere antall conidia tilstede på rissubstratet enn M. robertsii.
Figur 9: Gjennomsnittlig soppkonidia. Den estimerte gjennomsnittlige soppkonidiaen til Metarhizium pinghaense og M robertsii (95% konfidensintervall) fra kulturene (F1,7 = 2,45; p = 0,16) til stede på de brukte riskultursubstratene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Det ble ikke observert noen signifikant forskjell i det estimerte totale konidiautbyttet mellom M. pinghaense (5,09 x 107/g ± 1,35 x 107/g) og M. robertsii (3,55 x 107/g ± 0,85 x 107/g) oppnådd fra risunderlagskulturene. Imidlertid produserte M. pinghaense et litt høyere konidialt utbytte enn M. robertsii, som ga et lavere konidialt utbytte (figur 10).
Figur 10: Totalt conidia-utbytte. Det estimerte totale conidia-utbyttet av Metarhizium pinghaense og M. robertsii (95% konfidensintervall) fra kulturene på ris (F1,7 = 3,91; p = 0,09). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den vellykkede integrasjonen av mikrobielle midler for biologisk kontroll av viktige landbruksinsekt i et agroecosystem avhenger av både suksess og enkel masseproduksjon av entomopathogenene som det første trinnet under laboratorieforhold. Masseproduksjonen av EPF er viktig for den store applikasjonen og tilgjengeligheten av EPF-produkter for IPM-programmer ved hjelp av biologisk kontroll 9,10,11,12,13. Suksessen med masseproduksjon av forskjellige EPF-isolasjoner påvirkes av næringskomponentene i produksjonssubstratet eller mediet, noe som betydelig påvirker egenskapene til den resulterende conidia, inkludert deres effekt, uttørkingstoleranse, feltvarighet og konidial avkastning 8,19,20,21 . Derfor er det viktig å utvikle kunnskap om ernæringskravene til masseproduserte entomopathogener under dyrkings- og gjæringsprosessen.
I den nåværende studien ble masseproduksjonen av både M. robertsii og M. pinghaense utført ved hjelp av tre forskjellige landbruksprodukter som gjæringssubstrater: parboiled ris, flaket bygg og flaket havre. De tre forskjellige kornsubstratene ble observert for å påvirke det konidiale utbyttet av soppisolene betydelig. Den parboiled ris var svært gunstig for masseproduksjon av begge isolasjoner, mens de flakede byggkornene favoriserte produksjonen av M. robertsii bare. Observasjonene ble gjort basert på utbyttet av tørt soppkonidiapulver etter gjæring. Lite eller nei, conidia ble høstet fra de flakede havre etter gjæring. De flakede havre ble funnet å beholde høyere nivåer av fuktighet i gjæringsposene under gjæringsprosessen, noe som kan ha resultert i den observerte dårlige ytelsen til kornet som et substrat for produksjon av M. pinghaense og M. robertsii. Det flakede havresubstratet var utsatt for en hvit vegetativ mycelial overvekst av soppisolasjonene i noen tilfeller, noe som i stor grad påvirket det konidiale utbyttet, da sporulering ikke skjedde i gjæringsposene som inneholder overveksten. Gjæringsposene med det flakede havresubstratet ble også observert å ha høye nivåer av bakteriell forurensning i forhold til gjæringsposene som inneholder flakede byggsubstrater.
Høye nivåer av saprofytiske sopp eller gjærforurensning ble observert angående masseproduksjonen av M. pinghaense ved hjelp av flaked bygg som substrat. Den saprofytiske soppforurensningen ble observert på et senere stadium av gjæringsprosessen gjennom vekst og konidiogenese av en annen sopp enn den som brukes til å inokulere substratet. Det var vanskelig å diagnostisere substratforurensning i en innledende gjæringsfase, før konidial sporulering. Bakteriell og gjærforurensning under gjæringsprosessen antas å manifesteres av våte flekker i substratet, og både flakede havre og byggkorn har en tendens til å absorbere og beholde fuktighet lenger enn riskorn. Dette var en begrensning for å bruke disse to substratene som gjæringssubstrater for masseproduksjonen av de to Metarhizium-isolasjonene .
Observasjonene som ble gjort i den nåværende studien viste at typen inokulasjonsmetode som brukes til å inokulere hvert kornsubstrat påvirket konidialproduksjonen. Den konidiale suspensjonsinokuleringsmetoden ble funnet å være relativt mindre effektiv, da den inokulerte flakede havre og flaket bygg viste et økt forurensningsnivå i forhold til når den væskekulturerte blastosporinokulasjonsmetoden ble brukt på riskorn. I motsetning til den væskekulturerte blastosporinokuleringsmetoden tillater ikke den konidiale suspensjonsmetoden påvisning av mulige forurensninger i suspensjonene før inokulering av substratene, noe som resulterer i de høye forurensningsnivåene som ble observert i gjæringsposene. Jaronski og Jackson18 beskrev flere faktorer som kan føre til mulig forurensning av substratene som brukes, for eksempel mangel på fullstendig sterilisering av substratet, ikke-steril inokulasjon og feil håndtering av gjæringssubstratet i posene. Den observerte forurensningen i gjæringsposene som inneholder flaked bygg og flaket havre kan også ha resultert i mangel på fullstendig sterilisering av substratet, noe som kunne ha skjedd under autoklaveringsprosessen. Jaronski og Jackson18 beskrev også bruken av konidiale suspensjoner som inokulanter som ufordelaktige, da det resulterer i økte sjanser for forurensning under den konidiale høsten fra et agarmedium.
I feltet, under infeksjon av egnede verter, bygger soppen først opp biomasse i insektenes hemocoel gjennom spredning, før dens fremvekst og sporulering på den ytre faste overflaten av insekter30. En slik prosess ble mimicked ved bruk av væske-blastospore gjæringsmetoden. Følgelig representerte buljongen insektets hemocoel, inokulasjonen av buljongen med soppkoidia representerte insektets første kontakt og infeksjon, og dannelsen av blastosporer i buljongen representerte spredningen av blastosporeprosessen som oppstår inne i det infiserte insektets hemocoel. Den endelige inokulasjonen av riskornene og sporuleringen av soppen på kornene over tid representerte hva som skjer på insektets kutikula når soppen begynner å dukke opp fra innsiden av insektets. Dette kan muligens forklare hvorfor den flytende blastospore gjæringsmetoden fungerte bedre enn den konidiale suspensjonsinokuleringsmetoden.
Jaronski og Jackson18 beskrev flakede havre og flakede byggkorn som de foretrukne landbrukskornene for massekultur av Metarhizium-arter , sammenlignet med riskorn, da de to korntypene ble funnet å opprettholde fuktighetsinnholdet under gjæringsprosessen. Den nåværende studien motsier imidlertid de nevnte forskernes observasjoner og konklusjoner, da både flaked havre og flaked bygg ikke ble funnet å være gode solide gjæringssubstrater for verken M. pinghaense eller M. robertsii. Risen ble funnet å være et godt kornsubstrat for begge isolasjoner, da den ikke dekomponerte i små partikler som kunne blande seg med sluttproduktet, som det ble foreslått i tidligere studier.
Den nåværende studien har vist at isolasjoner av Metarhizium-artene kan dyrkes og masseproduseres ved hjelp av riskorn, og at de forskjellige kornene har en tendens til å påvirke den konidiale sporuleringen og utbyttet annerledes. Dette kan muligens skyldes at forskjellige korn varierer når det gjelder slik ernæringssammensetning, for eksempel karbon: nitrogenforhold og karbonkonsentrasjon. Karbonkonsentrasjonen og karbonet: Nitrogenforholdet til et vekstmedium er kjent for å påvirke utbyttet av conidia, samt kvaliteten når det gjelder levedyktighet og virulens22. Inokuleringsteknikkene som brukes til å inokulere substratene har også vist seg å påvirke graden av suksess oppnådd i masseproduksjonen av EPF-isolasjoner på spesifikke landbrukskornsubstrater. Derfor anbefales den flytende blastospore gjæringsteknikken beskrevet i den nåværende studien som den beste inokulasjonsmetoden for landbrukskornsubstrater for masseproduksjon av både M. pinghaense og M. robertsii isolerer. Ved hjelp av en slik metode muliggjør mulig deteksjon av forurensning før bruk av inokulantene, noe som kan hindre masseproduksjonen av ønsket EPF isolere i forhold til bruk av den smittsome suspensjonsinokulasjonsteknikken. Det anbefales også at riskorn brukes som de faste substratene for masseproduksjon av conidia av både M. pinghaense og M. robertsii, i stedet for flaked bygg og flaket havre. Den beskrevne teknikken er viktig for fremtidig masseproduksjon og kommersiell anvendelse av conidia under feltforhold mot viktige i agroecosystemene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke Hort Pome, Hort Stone og Technology and Human Resources for Industry Programme (THRIP: TP14062571871) for å finansiere prosjektet.
ORCID:
Letodi L. Mathulwe http://orcid.org/0000-0002-5118-3578
Antoinette P. Malan http://orcid.org/0000-0002-9257-0312
Nomakholwa F. Stokwe http://orcid.org/0000-0003-2869-5652
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Tween 20 | Lasec | Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water | |
| 20 mL McCartney bottles | Lasec | Used to make conidial suspensions | |
| Aluminium foil | Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask | ||
| Autoclave | Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process | ||
| Autoclave bags | Lasec | Fermentation bags or solid substrate containers | |
| Autoclave tape | Lasec | To secure PVC pipes on the fermentation bags | |
| Brown Kraft paper bags | Used to dry conidia cultures on agricultural grains | ||
| Bunsen burnner | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks) | |
| Clear edge test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
| Corn steep liquor | SIGMA | 66071-94-1 | Ingredient of the blastospore liquid medium |
| Cotton Wool | Lasec | Used as plug of the neck for fermentation bags | |
| Duran laboratory bottles | Neolab | Used to autoclave SDA medium and distilled water | |
| Electrical tape | Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust | ||
| ENDECOTTS test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
| Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask | Lasec | Carrier of the blastospore liquid medium | |
| Ethanol (99%) | Lasec | Used to sterilize surgical blades and inoculating loops | |
| Flaked barley | Health Connection Wholefoods | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Flaked oats | Tiger brands | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Glucose | Merck | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
| Growth Chamber/ incubators | For growing fungal conidia culture | ||
| Haemocytometer | Used to determine conidial concentrations | ||
| Inoculating loops | Lasec | For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth | |
| Kitchen rolling pin | Used to manipulate the solid grain substrate bed | ||
| Laminar flow Cabinet | ESCO Laminar Flow Cabinet | Provide as sterile environment during substrate inoculation | |
| Metarhizium pinghaense conidia | Stellenbosch University | 5HEID | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense |
| Metarhizium robertsii conidia | Stellenbosch University | 6EIKEN | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii |
| Microscope | ZEIZZ (Scope. A1) | Used to determine conidial concentrations and conidial viability | |
| Orbital shaker | IncoShake- LABOTEC | Used for the blastospore production process | |
| Parboiled rice | Spekko | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Penicillin-Streptomycin | SIGMA | Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination | |
| Petri-dishes | Lasec | Containers for the SDA medium | |
| Pipettes and pipette tips | Labnet (BioPette PLUS) | Used to measure liquids ingredients | |
| Polyvinylchloride Marley waste pipe | Used to create a neck for the fermentation bag | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
| Rubber band | Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks | ||
| Sabaroud dextrose agar (SDA) | NEOGEN Culture Media | Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii | |
| Sterile distilled water | To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions | ||
| Sticky pad | Used to secure the seives on the vibratory shaker | ||
| Surgical blade | Lasec | Used to scrape off spores from fungal cultures | |
| Surgical paper | Lasec | Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag | |
| Vibratory shaker | Used to shake conidia off the agricultural grain substrates | ||
| Vortex mixer | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles | |
| Yeast extract | Biolab | Added to the SDA medium to improve spore germination and growth | |
| Zipper-lock bags | GLAD | Used to to store harvested fungal conidia |
References
- Shah, P. A., Pell, J. K. Entomopathogenic fungi as biological control agents. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5), 413-423 (2003).
- Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. A review of the biology and control of the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae), with special reference to biological control using entomopathogenic fungi and nematodes. African Entomology. 29 (1), 1-16 (2020).
- Ibrahim, L., Laham, L., Touma, A., Ibrahim, S. Mass production, yield, quality, formulation and efficacy of entomopathogenic Metarhizium anisopliae conidia. Current Journal of Applied Science and Technology. 9 (5), 427-440 (2015).
- Banu, J. G., Rajalakshmi, S. Standardisation of media for mass multiplication of entomopathogenic fungi. Indian Journal of Plant Protection. 42 (1), 91-93 (2014).
- Roberts, D. W., Humber, R. A. Entomogenous fungi. Biology of Conidial Fungi. Cole, G. T., Kendrick, W. B. , Academic Press. New York. 201-236 (1981).
- Feng, M. G., Poprawski, T. J., Khachatourians, G. G. Production, formulation and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for insect control. Current status. Biocontrol Science and Technology. 4 (1), 3-34 (1994).
- Karanja, L. W., Phiri, N. A., Oduor, G. I. Effect of different solid substrates on mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae entomopathogens. The Proceedings of the12th KARI Biennial Scientific Conference. , Nairobi, Kenya. 8-12 (2010).
- Prasad, C. S., Pal, R. Mass production and economics of entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae and Verticillium lecanii on agricultural and industrial waste. Scholars Journal of Agriculture and Veterinary Sciences. 1 (1), 28-32 (2014).
- Ehlers, R. U. Mass production of entomopathogenic nematodes for plant protection. Applied Microbiology and Biotechnology. 56 (5), 623-633 (2001).
- Pham, T. A., Kim, J. J., Kim, S. G., Kim, K. Production of blastospore of entomopathogenic Beauveria bassiana in a submerged batch culture. Mycobiology. 37 (3), 218-224 (2009).
- Bhadauria, B. P., Puri, S., Singh, P. K. Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products. The Bioscan. 7 (2), 229-232 (2012).
- Latifian, M., Rad, B., Amani, M. Mass production of entomopathogenic fungi Metarhizium anisopliae by using agricultural products based on liquid-solid diphasic method for date palm pest control. International Journal of Farming and Allied Sciences. 3 (4), 368-372 (2014).
- Agale, S. V., Gopalakrishnan, S., Ambhure, K. G., Chandravanshi, H., Gupta, R., Wani, S. P. Mass production of entomopathogenic fungi (Metarhizium anisopliae) using different grains as a substrate. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7 (1), 2227-2232 (2018).
- Jackson, M. A. Optimizing nutritional conditions for the liquid culture production of effective fungal biological control agents. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 19 (3), 180-187 (1997).
- Deshpande, M. V. Mycopesticides production by fermentation. Potential and challenges. Critical Reviews in Microbiology. 25 (3), 229-243 (1999).
- Sahayaraj, K., Namasivayam, S. K. R. Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products and by products. African Journal of Biotechnology. 7 (12), 1907-1910 (2008).
- Feng, K. C., Liu, L. B., Tzeng, Y. M. Verticillium lecanii spore production in solid-state and liquid-state fermentations. Bioprocess Engineering. 23 (1), 25-29 (2000).
- Jaronski, S. T., Jackson, M. A. Mass production of entomopathogenic Hypocreales. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology 2nd edition. Lacey, L. A. , Academic Press. London. 255-284 (2012).
- Vega, F. E., Jackson, M. A., Mercandier, G., Poprawski, T. J. The impact of nutrition on spore yields for various fungal entomopathogens in liquid culture. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 19 (4), 363-368 (2003).
- El Damir, M. Effect of growing media and water volume on conidial production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Journal of Biological Sciences. 6 (2), 269-274 (2006).
- Pandey, A. K., Kanaujia, K. R. Effect of different grains as solid substrates on sporulation, viability and pathogenicity of Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin. Journal of Biological Control. 22 (2), 369-374 (2008).
- Kassa, A., et al. Whey for mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Mycological Research. 112 (5), 583-591 (2008).
- Sharma, S., Gupta, R. B. L., Yadavam, C. P. S. Selection of a suitable medium for mass multiplication of entomofungal pathogens. Indian Journal of Entomology. 64 (3), 254-261 (2002).
- Bich, G. A., Castrillo, M. L., Villalba, L. L., Zapata, P. D. Evaluation of rice by-products, incubation time, and photoperiod for solid state mass multiplication of the biocontrol agents Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Agronomy Research. 16 (5), 1921-1930 (2018).
- Price, R. E., Müller, E. J., Brown, H. D., D'Uamba, P., Jone, A. A. The first trial of a Metarhizium anisopliae var. acridum mycoinsecticide for the control of the red locust in a recognised outbreak area. International Journal of Tropical Insect Science. 19 (4), 323-331 (1999).
- Hatting, J. L., Moore, S. D., Malan, A. P. Microbial control of phytophagous invertebrate pests in South Africa. Current status and future prospects. Journal of Invertebrate Pathology. 165, 54-66 (2019).
- Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. Laboratory screening of entomopathogenic fungi and nematodes for pathogenicity against the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae). Biocontrol Science and Technology. , (2021).
- Inglis, G. D., Enkerli, J., Goettel, M. S. Laboratory techniques used for entomopathogenic fungi: Hypocreales. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , Academic Press, Elsevier. Chapter 7 189-253 (2012).
- Mehta, J., et al. Impact of carbon & nitrogen sources on the Trichoderma viride (Biofungicide) and Beauveria bassiana (entomopathogenic fungi). European Journal of Experimental Biology. 2 (6), 2061-2067 (2012).
- Burges, H. D. Formulation of mycoinsecticides. Formulation of Microbial Biopesticides. , Springer. Dordrecht. 131-185 (1998).
