Summary
Entomopatogena svampar har fått betydelse som biologiska bekämpningsmedel för skadedjur inom jordbruket. I denna studie genomfördes massproduktionen av ett tillräckligt antal fjädrande infektiösa propaguler av sydafrikanska isolat av både Metarhizium robertsii och M. pinghaense för kommersiell applicering mot skadedjur framgångsrikt med användning av jordbruksprodukter.
Abstract
Entomopatogena svampar av Metarhizium anisopliae-artkomplexet har fått betydelse som biologiska bekämpningsmedel för skadedjur inom jordbruket. Ökningen av skadedjursresistens mot kemiska insekticider, den växande oron för de negativa effekterna av insekticider på människors hälsa och miljöföroreningarna från bekämpningsmedel har lett till en global strävan att hitta nya hållbara strategier för växtskydd och skadedjursbekämpning. Tidigare har försök att masskulturera sådana entomopatogena svampar (EPF) arter som Beauveria bassiana genomförts. Endast begränsade försök har dock gjorts för att masskulturera Metarhizium robertsii och M. pinghaense för användning mot skadedjur. Denna studie syftade till att massproducera ett tillräckligt antal fjädrande infektiösa propaguler av sydafrikanska isolat av M. robertsii och M. pinghaense för kommersiell tillämpning. Tre jordbrukskornsprodukter, flingad havre, flingat korn och ris, användes som EPF fasta jäsningssubstrat. Två inokuleringsmetoder, konidialsuspensioner och den flytande svampkulturen av blastosporer användes för att inokulera de fasta substraten. Inokulering med användning av konidiella suspensioner observerades vara relativt mindre effektiv, eftersom ökade nivåer av kontaminering observerades på de fasta substraten i förhållande till vid användning av blastosporinokuleringsmetoden. Flingad havre visade sig inte vara ett lämpligt tillväxtsubstrat för både M. robertsii och M. pinghaense, eftersom inga torra konidier skördades från substratet. Flingat korn visade sig gynna produktionen av M. robertsii conidia framför M. pinghaense, och i genomsnitt 1,83 g ± 1,47 g torr M. robertsii conidia och noll gram M. pinghaense conidia skördades från substratet. Riskorn visade sig gynna den konidiella massproduktionen av både M. pinghaense och M. robertsii isolat, med i genomsnitt 8,2 g ± 4,38 g respektive 6 g ± 2 g skördade från substratet.
Introduction
Entomopatogena svampar (EPF) har fått betydelse som växtskyddsmedel vid biologisk bekämpning av viktiga skadedjur inom jordbruket 1,2. Entomopatogenerna, som förekommer naturligt i jord, orsakar epizootier i populationerna av olikaskadedjursarter 3. Arterna av EPF är värdspecifika och utgör relativt få risker när det gäller att attackera icke-målarter, och de är inte toxiska för miljön4. EPF har en unik mekanism för att invadera sin värd, liksom för att föröka och kvarstå i sin omedelbara miljö1. De attackerar värden främst genom asexuella sporer som fäster vid och tränger in i värdkutikeln för att invadera och sprida sig i värdhemomiljön. Värden dör så småningom på grund av utarmning av hemolymfnäringsämnena eller som ett resultat av toxemi orsakad av de giftiga metaboliterna som frigörs av svampen. Efter döden, under idealiska miljöförhållanden, dyker svampen upp på den yttre ytan (öppen mykos) av värdkadavren 5,6.
Växande oro över de negativa effekterna av kemiska rester på människors hälsa, miljöföroreningar och utvecklingen av skadedjursresistens har lett till den globala drivkraften att minska tillförseln av kemikaliebaserade insekticider och att hitta alternativa, nya och hållbara strategier för växtskydd och skadedjursbekämpning 6,7,8 . Detta har gett möjligheter att utveckla mikrobiella insekticider för användning i integrerade skadedjursbekämpningsprogram (IPM), som är mer ekologiskt gynnsamma strategier än konventionell kemisk kontroll 3,8.
För att utveckla ett framgångsrikt mikrobiellt bekämpningsmedel för en jordbruksskadegörare måste en lämplig organism först isoleras, karakteriseras, identifieras och dess patogenicitet för målskadegöraren bekräftas. Det krävs dock en enkel och kostnadseffektiv metod för storskalig produktion av det mikrobiella medlet för att framställa en livskraftig produkt för användning i biologiska bekämpningsprogram 9,10,11,12,13. Massproduktion av betydande mängder entomopatogener av god kvalitet beror på den mikrobiella stammen, miljön, målskadegöraren, formuleringen, marknaden, applikationsstrategin och den önskade slutprodukten 14,15,16. EPF kan massproduceras med flytande substratfermentering för att producera blastosporer eller den fasta substratfermenteringsprocessen för att producera luftkonidier 6,17,18. Massproduktions- och formuleringsprocessen av entomopatogener påverkar emellertid direkt virulensen, kostnaden, hållbarheten och fälteffektiviteten hos slutprodukten. För framgångsrik användning i IPM måste produktionsprocessen för entomopatogenerna vara lätt att köra, kräva minimal arbetskraft, producera en högutbyteskoncentration av virulenta, livskraftiga och ihållande propaguler och vara låg i kostnad 4,13,14,16.
Att förstå näringsbehovet hos entomopatogener är viktigt för massodling med alla odlingsmetoder 4,12. Näringskomponenterna i produktionsmediet har en signifikant inverkan på egenskaperna hos de resulterande propagulerna, inklusive biokontrolleffekt, utbyte, uttorkningstolerans och persistens 8,19,20,21. Optimeringen av produktionsförfaranden är utformad för att hantera sådana faktorer22. För EPF är de viktigaste kraven för god tillväxt, sporulering och massproduktion av svampkonidier tillräcklig fukt, optimal tillväxttemperatur, pH, gasutbyte avCO2 ochO2 och näring, inklusive goda fosfor-, kolhydrat-, kol- och kvävekällor18.
Jaronski och Jackson18 beskriver den fasta substratfermenteringsmetoden som den mest effektiva och närmaste approximationsmetoden till den naturliga processen för EPF-produktion i förhållande till jäsningsmetoden för flytande substrat eftersom svampkonidiumet under naturliga förhållanden bärs på fasta upprätta strukturer, som ytan på insektskadaver. Jordbruksprodukter och biprodukter som innehåller stärkelse används mest för massproduktion av hypokrealeansvampar, eftersom svamparna lätt sönderdelar stärkelse genom utsöndring av högkoncentrerade hydrolytiska enzymer från deras hyphalspetsar, för att tränga in i den fasta substansen och för att komma åt de näringsämnen som finns i ämnet 11,17,18,23 . Spannmålsprodukterna ger också kraven för hälsosam biomassaproduktion eftersom substraten, när de hydratiseras och steriliseras, kan absorbera ytterligare näringsämnen från vilket flytande medium som helst 16,18,24.
Tidigare försökte flera studier masskulturera EPF-arter som Beauveria bassiana (Bals.) Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas och några av Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin artkomplex isolerar på olika substrat 16,23,24. Sådana massproducerade och kommersiellt utvecklade isolat inkluderar Green Muscle® (stam IMI 330189), utvecklad från M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver &Milner) J.F. Bisch, Rehner &Humber, Metarhizium 69 (Meta 69 stam ICIPE69) och Real Metarhizium 69 (L9281), utvecklad från M. anisopliae, och Bredband® (stam PPRI 5339) och Eco-Bb®, utvecklad från B. bassiana25,26 . Begränsade försök har dock gjorts att masskulturera Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner & Humber och Metarhizium pinghaense Chen & Guo. Dessa två isolat valdes i en tidigare studie som det mest effektiva för kontroll av mjölkfisken, Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)27. Därför syftade den aktuella studien till att formulera och massproducera ett tillräckligt antal motståndskraftiga infektiösa propaguler av de lokala isolaten av M. robertsii och M. pinghaense för kommersiell applicering mot skadedjur. Den fasta substratfermenteringsmetoden användes för att massproducera svampkonidierna för båda EPF-isolaten. Två EPF-inokuleringsmetoder, med användning av konidialsuspensioner och den flytande svampkulturen av blastosporer, användes för att inokulera de fasta substraten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Källa till svampstammar
- Använd sydafrikanska isolerade svampstammar av både M. pinghaense 5 HEID (GenBank Accession number: MT367414/MT895630) och M. robertsii 6EIKEN (MT378171/MT380849), insamlade från äppelodlingar i Västra Kapprovinsen, Sydafrika.
- Odla kulturer av varje EPF-isolat på 60 g Sabouraud dextrosagarmedium, kompletterat med 1 g jästextrakt (SDAY) och 10 μL Streptomycin.
OBS: Inkubera EPF-kulturer vid en kontrollerad temperatur på ± 25 °C i mörker.
2. Metarhizium pinghaense och M. robertsii conidial suspension inokulering
- Framställning av de fasta substraten
- Använd två jordbruksprodukter, nämligen flingad havre och flingat korn, som tillväxtmedium för de två EPF-isolaten och autoklavpåsarna (305 mm × 660 mm) som jäsningspåsar.
- Använd ett litet polyvinylkloridavfallsrör (1000 mm × 50 mm) för att skapa en hals för jäsningspåsen i den öppna änden av autoklavpåsen och använd autoklavtejp för att fästa röret i påsen.
- Stäng röret med en steril bomullsplugg för att möjliggöra tillräckligt med gasutbyte under jäsningen.
- Väg torra korn (200 g) av både flingad havre och flingat korn och lägg dem i jäsningspåsarna, och till varje påse, tillsätt 100 ml destillerat vatten och blanda noggrant innehållet i påsarna.
- Låt de våta kornen vila i 15-30 minuter för att absorbera fukt före autoklavering och sterilisering. Förbered sex påsar för varje korntyp och för att förhindra kontaminering, placera påsarna i andra autoklavpåsar och autoklavera substraten vid 121 °C i 55 minuter.
- Beredning av konidial suspensionsinokulum
- Skörda 2-3 veckor gamla svampkonidier från svampkulturer av både M. pinghaense och M. robertsii genom att skrapa med ett sterilt kirurgiskt blad.
- Suspendera de uppsamlade svampkonidierna i 20 ml sterilt destillerat vatten, kompletterat med 0,05% Tween 20, och virvelblanda de konidiella suspensionerna i 2 min.
- Bered 20 ml konidialsuspensioner med en koncentration av 1 × 107 konidier/ml och inokulera de fasta substraten flingad havre respektive flingat korn.
OBS: Använd en hemocytometer för att bestämma konidialkoncentrationer.
- Inokulering av de fasta substraten
- Öppna varje påse genom att ta bort bomullshalspluggarna och tillsätt den beredda 20 ml konidiella suspensionen till det kylda autoklaverade substratet.
- Stäng påsarna igen med nackpropparna och massera innehållet i påsen så att svampinokulumet blandas jämnt med kornsubstratet.
- Inkubera jäsningspåsarna vid en kontrollerad temperatur på ± 25 °C och säkerställ tillräckligt med gasformigt utbyte mellan kulturen och miljön.
OBS: Denna procedur måste utföras under ett laminärt flödesskåp.
- Fermenteringsfas
- Massera kornsubstraten manuellt i jäsningspåsarna 2 dagar efter inokulering och inkubation, när synlig myceltillväxt inträffar och substratet har börjat klumpas av den växande svampen.
OBS: Detta görs för att blanda de inokulerade granulerna för att möjliggöra mycelförgrening under de första tidiga stadierna av svampens vegetativa tillväxt. - Använd en kökskavel för att manipulera substratbädden för att undvika den fysiska heterogeniteten hos kornunderlagbäddarna och substratmassans bäddtjocklek.
OBS: Processen främjar svampmetabolism, vilket optimerar svampsporproduktionen och maximerar ytan, vilket främjar konidialutbyte18. - Låt jäsningsprocessen fortsätta i upp till 4-5 veckor och kontrollera jäsningspåsarna var 2: e dag för närvaron av någon vit vegetativ överväxt som kan utvecklas under jäsningsprocessen, vilket i hög grad kan påverka svampkonidiutbytet.
OBS: Avsluta omedelbart jäsningen i jäsningspåsarna som innehåller någon vit vegetativ överväxt och torka svampkulturerna18.
- Massera kornsubstraten manuellt i jäsningspåsarna 2 dagar efter inokulering och inkubation, när synlig myceltillväxt inträffar och substratet har börjat klumpas av den växande svampen.
3. Blastospore ympning
- Blastosporproduktion och ympning
- Bered ett flytande odlingsmedium innehållande 1 liter destillerat vatten, 30 g glukos, 20 g jästextrakt, 4 g kaliumfosfatdiabasiskt (K2HPO4), 15 ml majs brantlut och 10 μg/ml av antibiotikumet Streptomycin, för både M. pinghaense och M. robertsii.
- Värm först det destillerade vattnet, stäng av innan du når kokpunkten och tillsätt var och en av ingredienserna, förutom Streptomycin, till det heta vattnet i grytan. Koka upp mediet försiktigt i 3-4 minuter och rör om hela tiden mediet för att möjliggöra korrekt blandning av ingredienserna och förhindra att några av ingredienserna löses i botten av grytan.
- Häll totalt 100 ml av mediet i nio olika 250 ml kolvar och placera en bomullsplugg på varje kolv och täck bomullsullen med aluminiumfolie som en propp (figur 1A).
- Autoklavera mediet i kolvarna i 55 minuter vid 121 °C. Låt mediet i kolvarna svalna efter autoklavering och tillsätt 10 mg/ml Streptomycin till mediet i varje kolv (figur 1B).
- Samla upp två till tre bakterieslingor av svampkonidier från 2-3 veckor gamla svampodlingsplattor för både EPF-isolat, M. pinghaense och M. robertsii, och överför till varje 100 ml flytande media i 250 ml-kolvarna, under sterila förhållanden, och försegla kolvarna.
- Inkubera vätskekulturkolvarna vid ± 25 °C, på en orbitalskakare vid 140 rpm i 3 dagar, och avbryt inkubationen när kulturerna visar tecken på hög grumlighet med svampsprängningstillväxt (figur 1C).
- För att upptäcka eventuell bakteriell kontaminering från kulturerna, dra ett prov på 100 μL från varje vätskeodlingskolv efter 24 timmar under inkubationen och platta på tre SDA-plattor per isolat. Inkubera plattorna i 48 timmar vid en kontrollerad temperatur på ± 25 °C.
- Framställning av det fasta substratet
- Använd parboiled långkornigt vitt ris som ett fast substratmedium för blastosporerna hos både M. pinghaense och M. robertsii (anpassad från Jaronski och Jackson18).
- Förbered jäsningspåsarna enligt beskrivningen ovan, i steg 2.1.1-2.1.3, och tillsätt 1 kg ris och 300 ml sterilt destillerat vatten för varje påse.
- Blanda försiktigt innehållet i jäsningspåsarna och placera dem i yttre autoklavpåsar i upprätt läge och autoklavera vid 121 °C i 55 minuter. Efter autoklavering, låt substraten svalna i ± 45 minuter under sterila förhållanden.
- Inokulering och jäsning
- Avlägsna förslutningen av var och en av vätskekulturkolvarna i både M. pinghaense och M. robertsii under ett laminärt flöde och flamma kanten på varje kolv i 10 s.
- Häll 100 ml flytande kulturer i jäsningspåsarna genom att ta bort bomullspropparna från halsen (figur 2). Sätt på bomullspluggarna igen och täck toppen av påsens hals med kirurgiskt papper säkrat med ett gummiband.
OBS: Bestäm blastosporkoncentrationen för varje kolv med hjälp av en hemocytometer och använd blastosporkoncentrationer på 1 × 107 - 5 × 108 blastosporer/ml för att innokulera substraten28. - Vrid den övre delen av påsen och blanda innehållet i påsen genom att skaka och lättmanipulation av substratet genom massage och inkubera påsarna vid ± 25 °C genom att platta ut underlaget i påsarna för att förhindra bildandet av tjocka sängar18.
- Bryt substratet i jäsningspåsarna genom att massera innehållet i påsarna, 2-3 dagar efter inokuleringen och inkubationen, när synlig myceltillväxt och bindningen av substratet av svampen hade inträffat (anpassad från tekniken för Jaronski och Jackson18).
OBS: Låt jäsningen fortsätta i 4 veckor.
Figur 1: Flytande odlingsmedium i 250 ml kolvar. (B) Efter autoklavering och ympning med EPF-sporer. (C) Grumligt medium med svampblastosporer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Berett blastosporvätskeodlingsmedium. (A) Metarhizium robertsii och (B) Metarhizium pinghaense före inokulering av ris som ett fast substrat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
4. Torkning av svampkulturer
- Torka svampkulturerna i 10-12 dagar efter jäsning, innan de används i försök, genom att överföra de sporulerade kulturerna i 26-30 kg (30 x 43 x 15250 cm3) bruna papperspåsar.
- För att förbättra papperspåsarnas draghållfasthet, skär av en tredjedel av den övre delen av varje påse horisontellt och klä botten av påsen (figur 3A, B).
Figur 3: Beredning av papperspåsar, torkningsförfarande för kulturer och förpackning. Torkningsförfarandet för metarhiziumartkulturer som odlas på (C,E) förvällt ris och (D,F) flingat korn. (G) Papperspåsar stängda med häftklamrar för att skapa en triangulär tältstruktur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Smula försiktigt substratet i varje jäsningspåse, skär av hörnet på varje påse och överför hela kulturen till papperspåsarna genom utrymmet som lämnas av det avskurna hörnet (figur 3C-F). För att undvika överdriven utsläpp av svampsporer i luften, utför denna process långsamt.
OBS: Utför denna process under sterila förhållanden, med laminärt flöde, för att undvika kontaminering. - Märk varje papperspåse och vik över den övre änden av varje påse två gånger och stäng med häftklamrar för att skapa en triangulär tältstruktur och placera påsarna på trådtorkställ för att möjliggöra korrekt, jämn torkning, vid en kontrollerad temperatur på ± 25 ° C och låg luftfuktighet på 30-40%.
- Vänd påsarna dagligen för att möjliggöra jämn torkning av kulturerna och för att undvika vegetativ återväxt som kan äga rum, vilket skulle sänka utbytet av skördbara svampsporer.
- Väg varje torkpåse efter var 2: e dag under torkningsprocessen och fortsätt torkningsprocessen för varje påse tills liten eller ingen förändring observeras i påsarnas massa mellan de på varandra följande dagarna.
5. Skörd av svampkonidier
- Skörda svampkonidier mekaniskt från kulturerna med hjälp av tre kapslade siktar, en testsikt (ETS) nät nr 35 (med 500 μm bländare), kapslad på en testsikt (med 212-μm bländare), kapslad på ETS-nät nr 100 (med 150-μm bländare), monterad på en uppsamlingspanna.
- Fyll långsamt på torrodlingsprovet på ETS-maskan nr 35 och lägg ett lock på sikten för att förhindra utsläpp av svampkonidier i luften.
- Tillsätt 10-12 glaskulor i siktarna för att hjälpa svampkonidierna att passera genom nätskärmarna och undvik att konidierna hålls kvar i sikten, vilket kan resultera i minskad sporåtervinning.
- Tejpa och täta siktfogarna med elektrisk tejp för att förhindra utsläpp av konidialt damm.
- Placera siktarna på en vibrationsskakapparat, försedd med en klibbig dyna, för att säkra uppsamlingspannan och siktarna i 20-25 minuter, med en rörelse av 560-640 vibrationer per min (figur 4).
OBS: Teknik anpassad från Jaronski och Jackson18.
Figur 4: Skörd av svampsporer från torkade Metarhizium robertsii-kulturer på ris och flingat korn. (A) 10-12 glaskulor som läggs till siktarna för att hjälpa svampkonidierna att passera genom nätskärmarna. M. robertsii conidia skördad från kulturer på (B) ris och (C) flagnad knappt. (D) Siktar på en vibrationsskakapparat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Ta bort testsiktarna från uppsamlingspannan, samla upp konidier och förvara de uppsamlade konidierna i lufttäta och vattenogenomträngliga blixtlåspåsar för långvarig förvaring (3-6 månader).
6. Kvantifiering av producerade svampkonidier
- Mät och registrera massan av varje kornsubstrat före skörden av svampkonidierna från varje substrat.
- Mät den totala vikten av de uppsamlade konidierna genom att subtrahera massan av de uppsamlade sporerna från massan av det fasta substratet.
OBS: Det totala konidiautbytet involverar inte bara den skördade konidien utan också svampkonidierna som finns kvar på det fasta substratet. - Väg underlaget och ta bort 10 g från det vägda substratet. Suspendera 10 g av substratet i 0,05% Tween 20 och späd i 10 ml sterilt destillerat vatten.
- Vortex-blanda suspensionen i 2 min och använd en hemocytometer för att göra sporräkningen för att bestämma antalet konidier som tvättas från substratet.
- Genomför ytterligare utspädningar genom att överföra 1000 μL av den 10 ml tvättade konidiella suspensionen till 9 ml sterilt destillerat vatten för att bilda 10 ml utspädningssuspensioner.
- Vortex-blanda de konidiella suspensionerna i 2 min och bestäm de konidiella koncentrationerna.
OBS: Följ proceduren och formeln som beskrivs av Inglis, Enkerli och Goettel30 för att bestämma den konidiella koncentrationen av suspensionerna. - Samla och suspendera totalt 0,1 g av det uppsamlade konidialpulvret från varje kultur i 10 ml sterilt destillerat vatten kompletterat med 0,05% Tween 20 och virvelblanda den konidiella suspensionen i 2 min och bestäm den konidiella koncentrationen med hjälp av en hemocytometer.
- Genomför ytterligare utspädningar genom att överföra 1000 μL av 10 ml konidial suspension till 9 ml sterilt destillerat vatten för att utgöra 10 ml suspensionsutspädningar.
- Vortex-blanda de konidiella suspensionerna i 2 min, beräkna de konidiella koncentrationerna och bestäm antalet konidier per gram.
- Multiplicera antalet konidier per gram skördat pulver med den ursprungliga massan av det skördade konidialpulvret. Multiplicera antalet konidier som tvättas från substratet med den totala vikten av det förbrukade substratet, vilket är substratet från vilket konidierna skördades.
- Lägg ihop de två givna värdena och dividera med substratets ursprungliga torrvikt för att beräkna antalet konidier per kg eller g av substratet18.
OBS: Beräkningarna gjordes främst för rissubstratet. Grobarhets- eller konidialviabilitetstestet utfördes för både M. pinghaense och M. robertsii-isolaten för att bestämma livskraften hos de producerade konidierna.
7. Analys av data
- Använd ett lämpligt datorprogram för att utföra den statistiska analysen av de erhållna resultaten.
OBS: Statistisk analys av data gjordes med hjälp av STATISTICA version 13.5.0.17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En minskning av kulturernas innehållsmassa på ris för både M. pinghaense och M. robertsii observerades över tiden under svampkulturernas torkningsstadium, med ingen eller liten förändring som observerades i massan när kulturerna var torra (Figur 5). Det skördade torra svampkonidipulvret av både M. pinghaense och M. robertsii visas i figur 6.
Figur 5: Förändringen i påsinnehållsmassan för Metarhizium robertsii och M. pinghaense-kulturerna på ris (95% konfidensintervall) under 10 dagar (ANOVA; F5,35 = 2,21; p = 0,08). Olika bokstäver ovanför staplarna indikerar den signifikanta skillnaden (p < 0,05) erhållen i påsinnehållsmassa under dagarna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Skördade konidier. (B) Metarhizium robertsii. (C) M. pinghaense. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Ingen signifikant skillnad observerades i det genomsnittliga konidiala pulver som skördades från varje korntyp för både M. pinghaense och M. robertsii. Skördade torra konidier för båda hade i genomsnitt >90% konidial livskraft för både M. pinghaense och M. robertsii. På rissubstratet producerade M. pinghaense i genomsnitt 8,2 g ± 4,38 g konidialpulver, vilket något översteg den mängd som erhölls för M. robertsii (6 g ± 2 g). I genomsnitt 1,83 g ± 1,47 g torr M. robertsii conidia skördades från det flingade kornsubstratet, medan noll M. pinghaense skördades från substratet. Inga torra svampkonidier skördades från det flingade havresubstratet för vare sig M. pinghaense eller M. robertsii (figur 7).
Figur 7: Genomsnittlig mängd konidipulver. Den genomsnittliga mängden konidipulver av Metarhizium pinghaense och M. robertsii, mätt i gram (95% konfidensintervall) skördat från de tre fasta substraten: parboiled ris, flingat korn och flingad havre (ANOVA: F2,27 = 2,82; p = 0,08). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
En signifikant skillnad i den uppskattade genomsnittliga konidien per gram, skördad från riskornen, observerades mellan M. pinghaense (3,51 x 107/g ± 0,43 x 107/g) och M. robertsii (4,31 x 107/g ± 0,38 x 107/g). M. robertsii hade ett något högre genomsnittligt antal konidier per gram än M. pinghaense (figur 8).
Figur 8: Genomsnittlig konidier per gram. Det uppskattade genomsnittliga konidiet per gram för Metarhizium pinghaense och M. robertsii (95 % konfidensintervall) från riskulturerna (ANOVA: F 1,7 = 8,47; p = 0,02). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Ingen signifikant skillnad i det uppskattade antalet konidier som finns på det förbrukade rissubstratet observerades mellan M. pinghaense (5,02 x 107/ml ± 1,47 x 107/ml) och M. robertsii (3,70 x 107/ml ± 0,91 x 107/ml) (figur 9). M. pinghaense hade dock ett något högre antal konidier närvarande på rissubstratet än M. robertsii.
Figur 9: Genomsnittlig svampkonidier. Den uppskattade genomsnittliga svampkonidien av Metarhizium pinghaense och M robertsii (95% konfidensintervall) från de kulturer (F1,7 = 2,45; p = 0,16) som finns på de förbrukade risodlingssubstraten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Ingen signifikant skillnad i det uppskattade totala konidiutbytet observerades mellan M. pinghaense (5,09 x 107/g ± 1,35 x 107/g) och M. robertsii (3,55 x 107/g ± 0,85 x 107/g) erhållen från rissubstratkulturerna. M. pinghaense gav dock ett något högre konidialutbyte än M. robertsii, vilket gav ett lägre konidialutbyte (figur 10).
Figur 10: Totalt konidiutbyte. Det uppskattade totala utbytet av konidier av Metarhizium pinghaense och M. robertsii (95% konfidensintervall) från kulturerna på ris (F1,7 = 3,91; p = 0,09). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den framgångsrika integrationen av mikrobiella medel för biologisk bekämpning av viktiga jordbruksinsekter i ett agroekosystem beror på både framgång och enkel massproduktion av entomopatogenerna som det första steget under laboratorieförhållanden. Massproduktionen av EPF är viktig för storskalig tillämpning och tillgänglighet av EPF-produkter för IPM-program med biologisk bekämpning 9,10,11,12,13. Framgången för massproduktion av olika EPF-isolat påverkas av näringskomponenterna i produktionssubstratet eller mediet, vilket väsentligt påverkar egenskaperna hos de resulterande konidierna, inklusive deras effektivitet, uttorkningstolerans, fältpersistens och konidialutbyte 8,19,20,21 . Därför är det viktigt att utveckla kunskap om näringsbehoven hos massproducerade entomopatogener under odlings- och jäsningsprocessen29.
I den aktuella studien genomfördes massproduktionen av både M. robertsii och M. pinghaense med tre olika jordbruksprodukter som jäsningssubstrat: parboiled ris, flingat korn och flingad havre. De tre olika kornsubstraten observerades påverka det konidiella utbytet av svampisolaten signifikant. Det parboiled riset var mycket gynnsamt för massproduktion av båda isolaten, medan de flingade kornkornen endast gynnade produktionen av M. robertsii . Observationerna gjordes baserat på utbytet av torrt svampkonidipulver efter jäsning. Lite eller nej, konidier skördades från den flingade havren efter jäsning. Den flingade havren visade sig behålla högre fukthalter i jäsningspåsarna under jäsningsprocessen, vilket kan ha resulterat i den observerade dåliga prestandan hos kornet som substrat för produktion av M. pinghaense och M. robertsii. Det flingade havresubstratet var benäget för en vit vegetativ mycelöverväxt av svampisolaten i vissa fall, vilket i hög grad påverkade konidialutbytet, eftersom sporulering inte inträffade i jäsningspåsarna som innehöll överväxten. Jäsningspåsarna med det flingade havresubstratet observerades också ha höga nivåer av bakteriell kontaminering i förhållande till jäsningspåsarna som innehåller flingade kornsubstrat.
Höga nivåer av saprofytiska svampar eller jästföroreningar observerades angående massproduktion av M. pinghaense med flingat korn som substrat. Den saprofytiska svampföroreningen observerades i ett senare skede av jäsningsprocessen genom tillväxt och konidiogenes av en annan svamp än den som användes för att inokulera substratet. Att diagnostisera substratförorening vid ett första skede av jäsning, före konidial sporulering, var svårt. Bakteriell och jästförorening under jäsningsprocessen tros manifesteras av våta fläckar i substratet, och både flingad havre och kornkorn tenderar att absorbera och behålla fukt längre än riskorn. Detta var en begränsning för att använda dessa två substrat som jäsningssubstrat för massproduktion av de två Metarhizium-isolaten .
Observationerna som gjordes under den aktuella studien visade att den typ av ympningsmetod som användes för att inokulera varje kornsubstrat påverkade konidialproduktionen. Den konidiella suspensionsinokuleringsmetoden visade sig vara relativt mindre effektiv, eftersom den inokulerade flingade havren och flingkornet visade en ökad föroreningsnivå i förhållande till när den vätskeodlade blastosporinokuleringsmetoden användes på riskorn. Till skillnad från den vätskekulturerade blastosporinokuleringsmetoden tillåter den konidiella suspensionsmetoden inte detektering av möjliga föroreningar i suspensionerna före inokulering av substraten, vilket resulterar i de höga föroreningsnivåer som observerades i jäsningspåsarna. Jaronski och Jackson18 beskrev flera faktorer som kan leda till eventuell förorening av de använda substraten, såsom bristen på fullständig sterilisering av substratet, icke-steroid ympning och felaktig hantering av jäsningssubstratet i påsarna. Den observerade föroreningen i jäsningspåsarna innehållande flingat korn och flingad havre kan också ha orsakats av brist på fullständig sterilisering av substratet, vilket kunde ha inträffat under autoklaveringsprocessen. Jaronski och Jackson18 beskrev också användningen av konidialsuspensioner som inokulanter som ofördelaktig, eftersom det resulterar i ökade chanser för kontaminering under den konidiella skörden från ett agarmedium.
I fält, under infektion av lämpliga värdar, bygger svampen först upp biomassa i insekternas hemokoel genom spridning, före dess uppkomst och sporulering på den yttre fasta ytan av insekterna30. En sådan process efterliknades vid användning av vätske-blastosporfermenteringsmetoden. Följaktligen representerade buljongen insektens hemokoel, ympningen av buljongen med svampkonidier representerade insektens initiala kontakt och infektion, och bildandet av blastosporer i buljongen representerade spridningen av blastosporprocessen som uppträder inuti den infekterade insektens hemokoel. Den slutliga ympningen av riskornen och sporuleringen av svampen på kornen över tid representerade vad som händer på insektens nagelband när svampen börjar dyka upp inifrån insektens kadaver. Detta kan möjligen förklara varför den flytande blastosporfermenteringsmetoden fungerade bättre än den konidiella suspensionsinokuleringsmetoden.
Jaronski och Jackson18 beskrev flingad havre och flingade kornkorn som de föredragna jordbrukskornen för masskultur av Metarhizium-arter , jämfört med riskorn, eftersom de två korntyperna befanns bibehålla sin fukthalt under jäsningsprocessen. Den aktuella studien motsäger dock de ovannämnda forskarnas observationer och slutsatser, eftersom både den flingade havren och det flingade kornet inte befanns vara bra fasta jäsningssubstrat för varken M. pinghaense eller M. robertsii. Riset visade sig vara ett bra kornsubstrat för båda isolaten, eftersom det inte sönderdelades i små partiklar som kunde blandas med slutprodukten, vilket föreslogs i tidigare studier.
Den aktuella studien har visat att isolat av Metarhizium-arten framgångsrikt kan odlas och massproduceras med riskorn och att de olika kornen tenderar att påverka den konidiella sporuleringen och ge olika. Detta kan möjligen bero på att olika korn skiljer sig åt när det gäller sådan näringssammansättning, t.ex. kol: kväveförhållanden och kolkoncentration. Kolkoncentrationen och kolet: kväveförhållandet för ett tillväxtmedium är kända för att påverka utbytet av konidier, liksom dess kvalitet när det gäller livskraft och virulens22. Inokuleringsteknikerna som används för att inokulera substraten har också visat sig påverka graden av framgång som uppnås vid massproduktion av EPF-isolat på specifika jordbrukskornssubstrat. Därför rekommenderas den flytande blastosporfermenteringstekniken som beskrivs i den aktuella studien som den bästa ympningsmetoden för jordbrukskornsubstrat för massproduktion av både M. pinghaense och M. robertsii-isolat . Användning av en sådan metod möjliggör möjlig detektering av kontaminering före användning av inokulanterna, vilket kan hindra massproduktionen av det önskade EPF-isolatet i förhållande till användningen av konidial suspensionsinokuleringstekniken. Det rekommenderas också att riskorn används som fasta substrat för massproduktion av konidier av både M. pinghaense och M. robertsii, snarare än flingat korn och flingad havre. Den beskrivna tekniken är viktig för framtida massproduktion och kommersiell tillämpning av konidierna under fältförhållanden mot viktiga skadedjur i agroekosystemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Hort Pome, Hort Stone och programmet Technology and Human Resources for Industry (THRIP: TP14062571871) för finansieringen av projektet.
ORCID:
Letodi L. Mathulwe http://orcid.org/0000-0002-5118-3578
Antoinette P. Malan http://orcid.org/0000-0002-9257-0312
Nomakholwa F. Stokwe http://orcid.org/0000-0003-2869-5652
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Tween 20 | Lasec | Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water | |
| 20 mL McCartney bottles | Lasec | Used to make conidial suspensions | |
| Aluminium foil | Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask | ||
| Autoclave | Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process | ||
| Autoclave bags | Lasec | Fermentation bags or solid substrate containers | |
| Autoclave tape | Lasec | To secure PVC pipes on the fermentation bags | |
| Brown Kraft paper bags | Used to dry conidia cultures on agricultural grains | ||
| Bunsen burnner | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks) | |
| Clear edge test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
| Corn steep liquor | SIGMA | 66071-94-1 | Ingredient of the blastospore liquid medium |
| Cotton Wool | Lasec | Used as plug of the neck for fermentation bags | |
| Duran laboratory bottles | Neolab | Used to autoclave SDA medium and distilled water | |
| Electrical tape | Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust | ||
| ENDECOTTS test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
| Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask | Lasec | Carrier of the blastospore liquid medium | |
| Ethanol (99%) | Lasec | Used to sterilize surgical blades and inoculating loops | |
| Flaked barley | Health Connection Wholefoods | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Flaked oats | Tiger brands | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Glucose | Merck | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
| Growth Chamber/ incubators | For growing fungal conidia culture | ||
| Haemocytometer | Used to determine conidial concentrations | ||
| Inoculating loops | Lasec | For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth | |
| Kitchen rolling pin | Used to manipulate the solid grain substrate bed | ||
| Laminar flow Cabinet | ESCO Laminar Flow Cabinet | Provide as sterile environment during substrate inoculation | |
| Metarhizium pinghaense conidia | Stellenbosch University | 5HEID | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense |
| Metarhizium robertsii conidia | Stellenbosch University | 6EIKEN | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii |
| Microscope | ZEIZZ (Scope. A1) | Used to determine conidial concentrations and conidial viability | |
| Orbital shaker | IncoShake- LABOTEC | Used for the blastospore production process | |
| Parboiled rice | Spekko | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Penicillin-Streptomycin | SIGMA | Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination | |
| Petri-dishes | Lasec | Containers for the SDA medium | |
| Pipettes and pipette tips | Labnet (BioPette PLUS) | Used to measure liquids ingredients | |
| Polyvinylchloride Marley waste pipe | Used to create a neck for the fermentation bag | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
| Rubber band | Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks | ||
| Sabaroud dextrose agar (SDA) | NEOGEN Culture Media | Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii | |
| Sterile distilled water | To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions | ||
| Sticky pad | Used to secure the seives on the vibratory shaker | ||
| Surgical blade | Lasec | Used to scrape off spores from fungal cultures | |
| Surgical paper | Lasec | Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag | |
| Vibratory shaker | Used to shake conidia off the agricultural grain substrates | ||
| Vortex mixer | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles | |
| Yeast extract | Biolab | Added to the SDA medium to improve spore germination and growth | |
| Zipper-lock bags | GLAD | Used to to store harvested fungal conidia |
References
- Shah, P. A., Pell, J. K. Entomopathogenic fungi as biological control agents. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5), 413-423 (2003).
- Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. A review of the biology and control of the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae), with special reference to biological control using entomopathogenic fungi and nematodes. African Entomology. 29 (1), 1-16 (2020).
- Ibrahim, L., Laham, L., Touma, A., Ibrahim, S. Mass production, yield, quality, formulation and efficacy of entomopathogenic Metarhizium anisopliae conidia. Current Journal of Applied Science and Technology. 9 (5), 427-440 (2015).
- Banu, J. G., Rajalakshmi, S. Standardisation of media for mass multiplication of entomopathogenic fungi. Indian Journal of Plant Protection. 42 (1), 91-93 (2014).
- Roberts, D. W., Humber, R. A. Entomogenous fungi. Biology of Conidial Fungi. Cole, G. T., Kendrick, W. B. , Academic Press. New York. 201-236 (1981).
- Feng, M. G., Poprawski, T. J., Khachatourians, G. G. Production, formulation and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for insect control. Current status. Biocontrol Science and Technology. 4 (1), 3-34 (1994).
- Karanja, L. W., Phiri, N. A., Oduor, G. I. Effect of different solid substrates on mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae entomopathogens. The Proceedings of the12th KARI Biennial Scientific Conference. , Nairobi, Kenya. 8-12 (2010).
- Prasad, C. S., Pal, R. Mass production and economics of entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae and Verticillium lecanii on agricultural and industrial waste. Scholars Journal of Agriculture and Veterinary Sciences. 1 (1), 28-32 (2014).
- Ehlers, R. U. Mass production of entomopathogenic nematodes for plant protection. Applied Microbiology and Biotechnology. 56 (5), 623-633 (2001).
- Pham, T. A., Kim, J. J., Kim, S. G., Kim, K. Production of blastospore of entomopathogenic Beauveria bassiana in a submerged batch culture. Mycobiology. 37 (3), 218-224 (2009).
- Bhadauria, B. P., Puri, S., Singh, P. K. Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products. The Bioscan. 7 (2), 229-232 (2012).
- Latifian, M., Rad, B., Amani, M. Mass production of entomopathogenic fungi Metarhizium anisopliae by using agricultural products based on liquid-solid diphasic method for date palm pest control. International Journal of Farming and Allied Sciences. 3 (4), 368-372 (2014).
- Agale, S. V., Gopalakrishnan, S., Ambhure, K. G., Chandravanshi, H., Gupta, R., Wani, S. P. Mass production of entomopathogenic fungi (Metarhizium anisopliae) using different grains as a substrate. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7 (1), 2227-2232 (2018).
- Jackson, M. A. Optimizing nutritional conditions for the liquid culture production of effective fungal biological control agents. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 19 (3), 180-187 (1997).
- Deshpande, M. V. Mycopesticides production by fermentation. Potential and challenges. Critical Reviews in Microbiology. 25 (3), 229-243 (1999).
- Sahayaraj, K., Namasivayam, S. K. R. Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products and by products. African Journal of Biotechnology. 7 (12), 1907-1910 (2008).
- Feng, K. C., Liu, L. B., Tzeng, Y. M. Verticillium lecanii spore production in solid-state and liquid-state fermentations. Bioprocess Engineering. 23 (1), 25-29 (2000).
- Jaronski, S. T., Jackson, M. A. Mass production of entomopathogenic Hypocreales. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology 2nd edition. Lacey, L. A. , Academic Press. London. 255-284 (2012).
- Vega, F. E., Jackson, M. A., Mercandier, G., Poprawski, T. J. The impact of nutrition on spore yields for various fungal entomopathogens in liquid culture. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 19 (4), 363-368 (2003).
- El Damir, M. Effect of growing media and water volume on conidial production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Journal of Biological Sciences. 6 (2), 269-274 (2006).
- Pandey, A. K., Kanaujia, K. R. Effect of different grains as solid substrates on sporulation, viability and pathogenicity of Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin. Journal of Biological Control. 22 (2), 369-374 (2008).
- Kassa, A., et al. Whey for mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Mycological Research. 112 (5), 583-591 (2008).
- Sharma, S., Gupta, R. B. L., Yadavam, C. P. S. Selection of a suitable medium for mass multiplication of entomofungal pathogens. Indian Journal of Entomology. 64 (3), 254-261 (2002).
- Bich, G. A., Castrillo, M. L., Villalba, L. L., Zapata, P. D. Evaluation of rice by-products, incubation time, and photoperiod for solid state mass multiplication of the biocontrol agents Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Agronomy Research. 16 (5), 1921-1930 (2018).
- Price, R. E., Müller, E. J., Brown, H. D., D'Uamba, P., Jone, A. A. The first trial of a Metarhizium anisopliae var. acridum mycoinsecticide for the control of the red locust in a recognised outbreak area. International Journal of Tropical Insect Science. 19 (4), 323-331 (1999).
- Hatting, J. L., Moore, S. D., Malan, A. P. Microbial control of phytophagous invertebrate pests in South Africa. Current status and future prospects. Journal of Invertebrate Pathology. 165, 54-66 (2019).
- Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. Laboratory screening of entomopathogenic fungi and nematodes for pathogenicity against the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae). Biocontrol Science and Technology. , (2021).
- Inglis, G. D., Enkerli, J., Goettel, M. S. Laboratory techniques used for entomopathogenic fungi: Hypocreales. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , Academic Press, Elsevier. Chapter 7 189-253 (2012).
- Mehta, J., et al. Impact of carbon & nitrogen sources on the Trichoderma viride (Biofungicide) and Beauveria bassiana (entomopathogenic fungi). European Journal of Experimental Biology. 2 (6), 2061-2067 (2012).
- Burges, H. D. Formulation of mycoinsecticides. Formulation of Microbial Biopesticides. , Springer. Dordrecht. 131-185 (1998).
