Summary
Fungos entomopatômicos ganharam importância como agentes de controle biológico de pragas de insetos agrícolas. Neste estudo, a produção em massa de um número suficiente de propagules infecciosos resilientes de isolados sul-africanos tanto de Metarhizium robertsii quanto de M. pinghaense para aplicação comercial contra pragas de insetos foi realizada com sucesso utilizando produtos agrícolas de grãos.
Abstract
Fungos entomopatômicos do complexo de espécies anisopliae metarhizium ganharam importância como agentes de controle biológico de pragas de insetos agrícolas. O aumento da resistência a pragas a inseticidas químicos, as crescentes preocupações com os efeitos negativos dos inseticidas na saúde humana e a poluição ambiental dos pesticidas levaram a um impulso global para encontrar novas estratégias sustentáveis para a proteção das culturas e o controle de pragas. Anteriormente, foram conduzidas tentativas de cultura de massa, tais espécies de fungos entomopatômicos (EPF) como Beauveria bassiana . No entanto, apenas tentativas limitadas foram conduzidas à cultura de massa Metarhizium robertsii e M. pinghaense para uso contra pragas de insetos. Este estudo teve como objetivo produzir em massa um número suficiente de propagules infecciosos resilientes de isolados sul-africanos de M. robertsii e M. pinghaense para aplicação comercial. Três produtos agrícolas de grãos, aveia em flocos, cevada em flocos e arroz, foram utilizados como substratos de fermentação sólida da EPF. Dois métodos de inoculação, suspensões conidiais e a cultura fúngica líquida de blastospores foram usados para inocular os substratos sólidos. Observou-se que a inoculação por suspensões conidiais foi relativamente menos eficaz, uma vez que foram observados níveis de contaminação aumentados nos substratos sólidos em relação ao uso do método de inoculação blastospore. A aveia flocada não foi um substrato de crescimento adequado tanto para M. robertsii quanto para M. pinghaense, uma vez que nenhuma conidia seca foi colhida do substrato. A cevada flocada foi encontrada para favorecer a produção de M. robertsii conidia sobre a de M. pinghaense, e uma média de 1,83 g ± 1,47 g de M. robertsii conidia seca e zero gramas de M. pinghaense conidia foi colhida do substrato. Os grãos de arroz foram encontrados para favorecer a produção em massa conidial tanto dos isolados M. pinghaense quanto M. robertsii , com média de 8,2 g ± 4,38 g e 6 g ± 2 g colhidas do substrato, respectivamente.
Introduction
Os fungos entomopatômicos (EPF) ganharam importância como agentes de proteção de culturas no controle biológico de importantes pragas de insetos agrícolas 1,2. Os entomopatógenos, que ocorrem naturalmente no solo, causam epizooóticos nas populações de várias espécies de pragas3. As espécies de EPF são específicas do hospedeiro e representam relativamente poucos riscos em termos de ataque a espécies não-alvo, e não sãotóxiis para o meio ambiente4. A EPF tem um mecanismo único para invadir seu hospedeiro, bem como para propagar e persistir em seu ambiente imediato1. Eles atacam o hospedeiro principalmente através de esporos assexuados que se prendem e penetram na cutícula hospedeira para invadir e proliferar no hemocoel hospedeiro. O hospedeiro eventualmente morre devido ao esgotamento dos nutrientes hemofífonos ou como resultado da toxemia causada pelos metabólitos tóxicos liberados pelo fungo. Após a morte, sob condições ambientais ideais, o fungo emerge na superfície externa (micose exerce) do cadáverhospedeiro 5,6.
Preocupações crescentes com os efeitos negativos dos resíduos químicos na saúde humana, poluição ambiental e desenvolvimento da resistência a pragas levaram ao impulso global de reduzir os insumos de inseticidas de base química e a encontrar estratégias alternativas, novas e sustentáveis para a proteção das culturas e o controle de pragas 6,7,8 . Isso proporcionou oportunidades para desenvolver inseticidas à base de microbianos para uso em programas integrados de Manejo de Pragas (IPM), que são estratégias mais ecologicamente favoráveis do que o controle químico convencional 3,8.
Para desenvolver um agente de controle microbiano bem sucedido para uma praga agrícola, um organismo adequado deve primeiro ser isolado, caracterizado, identificado e sua patogenicidade para a praga alvo confirmada. No entanto, é necessário um método fácil e econômico para a produção em larga escala do agente microbiano para produzir um produto viável para uso em programas de controle biológico 9,10,11,12,13. A produção em massa de quantidades substanciais de entomopatógenos de boa qualidade depende da cepa microbiana, do meio ambiente, da praga-alvo, da formulação, do mercado, da estratégia de aplicação e do produto final desejado 14,15,16. O EPF pode ser produzido em massa usando fermentação de substrato líquido para produzir blastospores ou o processo de fermentação de substrato sólido para produzir conídio aéreo 6,17,18. No entanto, o processo de produção e formulação em massa de entomopatógenos influencia diretamente a virulência, o custo, a vida útil e a eficácia do campo do produto final. Para o uso bem-sucedido no IPM, o processo de produção dos entomopatógenos deve ser fácil de executar, exigir mão-de-obra mínima, produzir uma concentração de alto rendimento de propagules virulentas, viáveis e persistentes, e ser baixo no custo 4,13,14,16.
Compreender os requisitos nutricionais dos entomopatógenos é importante para o cultivo em massa com todos os métodos de cultivo 4,12. Os componentes nutricionais do meio de produção têm impacto significativo nos atributos dos propagules resultantes, incluindo eficácia de biocontrole, rendimento, tolerância à dessecação e persistência 8,19,20,21. A otimização dos procedimentos de produção é projetada para abordar tais fatores22. Para a EPF, os principais requisitos para o bom crescimento, esporulação e produção em massa de conídio fúngico são umidade adequada, temperatura de crescimento ideal, pH, troca de gás de CO2 e O2, e nutrição, incluindo boas fontes de fósforo, carboidratos, carbono e nitrogênio18.
Jaronski e Jackson18 descrevem o método de fermentação de substrato sólido como o método de aproximação mais eficiente e mais próximo do processo natural de produção de EPF em relação ao método de fermentação do substrato líquido porque, em condições naturais, o conidium fúngico é suportado em estruturas eretos sólidas, como a superfície dos cadáveres de insetos. Produtos agrícolas e subprodutos contendo amido são usados principalmente para a produção em massa de fungos hipocrealeanos, pois os fungos prontamente se decompõem o amido através da secreção de enzimas hidrolíticas altamente concentradas de suas pontas hífas, para penetrar a substância sólida e para acessar os nutrientes presentes na substância 11,17,18,23 . Os produtos de grãos também fornecem os requisitos para a produção saudável de biomassa, pois, quando são hidratados e esterilizados, os substratos podem absorver mais nutrientes de qualquer meio líquido 16,18,24.
Anteriormente, vários estudos tentaram cultivar espécies de EPF como Beauveria bassiana (Bals.) Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas e alguns dos metarhizium anisopliae (Metschn.) O complexo de espécies de Sorokin isola-se em vários substratos 16,23,24. Tais isolados produzidos em massa e comercialmente desenvolvidos incluem o Músculo® Verde (cepa IMI 330189), desenvolvido a partir de M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner) J.F. Bisch, Rehner & Humber, Metarhizium 69 (Meta 69 strain ICIPE69), e Real Metarhizium 69 (L9281), desenvolvidos a partir de M. anisopliae, e Banda larga® (cepa PPRI 5339) e Eco-Bb®, desenvolvido a partir de B. bassiana25,26 . No entanto, tentativas limitadas foram feitas à cultura de massa Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner & Humber e Metarhizium pinghaense Chen & Guo. Esses dois isolados foram selecionados em estudo anterior como o mais eficaz para o controle do mealybug, Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)27. Portanto, o presente estudo teve como objetivo formular e produzir em massa um número suficiente de propagules infecciosos resilientes dos isolados locais de M. robertsii e M. pinghaense para aplicação comercial contra pragas de insetos. O método de fermentação de substrato sólido foi utilizado para produzir em massa a conídia fúngica para ambos os isolados de EPF. Dois métodos de inoculação de EPF, utilizando suspensões conidiais e a cultura fúngica líquida de blastospores, foram utilizados para inocular os substratos sólidos.
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Protocol
1. Fonte de cepas fúngicas
- Use cepas fúngicas isoladas sul-africanas tanto do M. pinghaense 5 HEID (número de adesão do GenBank: MT367414/MT895630) e M. robertsii 6EIKEN (MT378171/MT380849), coletados de pomares de maçã na província do Cabo Ocidental, África do Sul.
- Culturas de cultivo de cada EPF isolam em 60 g de sabouraud dextrose agar medium, suplementado com 1 g de extrato de levedura (SDAY) e 10 μL de Estreptomicina.
NOTA: Incubar culturas EPF a uma temperatura controlada de ± 25 °C no escuro.
2. Metarhizium pinghaense e M. robertsii inoculação de suspensão conidial
- Preparação dos substratos sólidos
- Utilize dois produtos agrícolas, a aveia em flocos e cevada flocada, como meios de crescimento para os dois isolados EPF e sacos autoclave (305 mm × 660 mm) como sacos de fermentação.
- Use um pequeno tubo de resíduos de polivinilcloro (1000 mm × 50 mm) para criar um pescoço para o saco de fermentação na extremidade aberta do saco de autoclave e use fita autoclave para fixar o tubo no saco.
- Feche o tubo com um plugue de algodão estéril para permitir a troca de gás suficiente durante a fermentação.
- Pesar grãos secos (200 g) tanto da aveia flocada quanto da cevada flocada e colocá-los nos sacos de fermentação, e a cada saco, adicione 100 mL de água destilada e misture completamente o conteúdo dos sacos.
- Deixe os grãos molhados descansarem por 15-30 min para absorver umidade antes de autoclavar e esterilizar. Prepare seis sacos para cada tipo de grão e, para evitar contaminação, coloque os sacos em outros sacos de autoclave e autoclave os substratos a 121 °C por 55 min.
- Preparação de inóculo de suspensão conidial
- Colher conidia fúngica de 2-3 semanas de idade de culturas fúngicas tanto de M. pinghaense quanto M. robertsii raspando, usando uma lâmina cirúrgica estéril.
- Suspenda a conidia fúngica coletada em 20 mL de água destilada estéril, suplementada com 0,05% Tween 20, e misture as suspensões conidiais por 2 minutos.
- Prepare 20 mL de suspensões conidiais, com uma concentração de 1 × 107 conidia/mL, e inocula as substratas sólidas de aveia e cevada flocadas, respectivamente.
NOTA: Use um hemócito para determinar concentrações conidiais.
- Inoculação dos substratos sólidos
- Abra cada saco removendo os plugues de algodão e adicione a suspensão conidial preparada de 20 mL ao substrato autoclaved refrigerado.
- Feche os sacos novamente, usando os tampões do pescoço, e massageie o conteúdo do saco para permitir que o inóculo fúngico fique uniformemente misturado com o substrato de grãos.
- Incubar os sacos de fermentação a uma temperatura controlada de ± 25 °C, e garantir uma troca gasosa suficiente entre a cultura e o meio ambiente.
NOTA: Este procedimento deve ser conduzido sob um gabinete de fluxo laminar.
- Fase de fermentação
- Massageie manualmente os substratos de grãos nos sacos de fermentação 2 dias após a inoculação e incubação, quando ocorre crescimento micelial visível e o substrato começou a ser agrupado pelo fungo em crescimento.
NOTA: Isso é feito para misturar os grânulos inoculados para permitir que a ramificação micelial ocorra durante os primeiros estágios iniciais do crescimento vegetativo dos fungos. - Use um rolo de cozinha para manipular a cama do substrato para evitar a heterogeneidade física dos leitos de substrato de grãos e a espessura do leito da massa do substrato.
NOTA: O processo promove o metabolismo fúngico, que otimiza a produção de esporos fúngicos, e maximiza a área da superfície, promovendo o rendimento conidial18. - Deixe o processo de fermentação para continuar por até 4-5 semanas, e verifique os sacos de fermentação a cada 2 dias para a presença de qualquer crescimento vegetaldo branco que possa se desenvolver durante o processo de fermentação, o que pode afetar muito o rendimento da conidia fúngica.
NOTA: Termine imediatamente a fermentação nos sacos de fermentação contendo qualquer crescimento vegetaldo branco e seque as culturas fúngicas18.
- Massageie manualmente os substratos de grãos nos sacos de fermentação 2 dias após a inoculação e incubação, quando ocorre crescimento micelial visível e o substrato começou a ser agrupado pelo fungo em crescimento.
3. Inoculação de blastospore
- Produção e inoculação de blastospore
- Prepare um meio de cultura líquida, contendo 1 L de água destilada, 30 g de glicose, 20 g de extrato de levedura, 4 g de fosfato de potássio diabasic (K2HPO4), 15 mL de licor íngreme de milho, e 10 μg/mL do antibiótico Streptomicina, tanto para o M. pinghaense quanto para o M robertsii.
- Primeiro, aqueça a água destilada, desligue antes de chegar ao ponto de ebulição, e adicione cada um dos ingredientes, exceto a estreptomicina, à água quente na panela. Leve o meio para ferver suavemente por 3-4 min, e mexa constantemente o meio para permitir a mistura adequada dos ingredientes e evitar a fixação de alguns dos ingredientes na parte inferior da panela.
- Despeje um total de 100 mL do meio em nove frascos diferentes de 250 mL e coloque um plugue de algodão em cada frasco, e cubra a lã de algodão com papel alumínio como rolha (Figura 1A).
- Autoclave o meio nos frascos por 55 min a 121 °C. Após a autoclavação, deixe o meio nos frascos esfriar e adicione 10 mg/mL de estreptomicina ao meio em cada frasco (Figura 1B).
- Colete de duas a três alças bacterianas de conidia fúngica de placas de cultura fúngica de 2-3 semanas de idade para os isolados EPF, M. pinghaense e M. robertsii, e transfira para cada mídia líquida de 100 mL nos frascos de 250 mL, em condições estéreis, e selar os frascos.
- Incubar os frascos de cultura líquida a ± 25 °C, em um agitador orbital a 140 rpm por 3 dias, e cessar a incubação uma vez que as culturas mostram sinais de alta turbidez com o crescimento de blastospore fúngico (Figura 1C).
- Para detectar qualquer possível contaminação bacteriana das culturas, retire uma amostra de 100 μL de cada frasco de cultura líquida após 24 horas durante a incubação e placa em três placas SDA por isolante. Incubar as placas por 48 h, a uma temperatura controlada de ± 25 °C.
- Preparação do substrato sólido
- Use arroz branco de grão longo parboiled como um meio de substrato sólido para os blastospores tanto de M. pinghaense quanto de M. robertsii (adaptado de Jaronski e Jackson18).
- Prepare os sacos de fermentação conforme detalhado acima, nas etapas 2.1.1-2.1.3, e para cada saco, adicione 1 kg de arroz e 300 mL de água destilada estéril.
- Misture suavemente o conteúdo dos sacos de fermentação e coloque em sacos de autoclave externos em uma posição vertical e autoclave a 121 °C por 55 min. Após a autoclavagem, permita que os substratos esfriem por ± 45 min em condições estéreis.
- Inoculação e fermentação
- Remova o fechamento de cada um dos frascos de cultura líquida tanto de M. pinghaense quanto M. robertsii sob um fluxo laminar e flame a borda de cada frasco por 10 s.
- Despeje as culturas líquidas de 100 mL nos sacos de fermentação removendo os plugues de algodão de seus pescoços (Figura 2). Coloque os plugues de algodão de volta e cubra a parte superior do pescoço do saco com papel cirúrgico preso com um elástico.
NOTA: Determine a concentração de blastospore para cada frasco usando um hemócito, e use concentrações de blastospore de 1 × 107 - 5 × 108 blastospores/mL para innocular os substratos28. - Torça a parte superior da bolsa e misture o conteúdo do saco tremendo e a manipulação leve do substrato por massagem, e incubar os sacos a ± 25 °C, achatando o substrato nos sacos para evitar a formação de camas grossas18.
- Quebre o substrato nos sacos de fermentação massageando o conteúdo das sacolas, 2-3 dias após a inoculação e a incubação, quando ocorreu o crescimento micelial visível e a ligação do substrato pelo fungo (adaptado da técnica de Jaronski e Jackson18).
NOTA: Permitir que a fermentação continue por 4 semanas.
Figura 1: Cultura líquida em frascos de 250 mL. (A) Antes de autoclavar. (B) Após autoclavação e inoculação com esporos EPF. (C) Meio turva com blastospores fúngicos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Meio de cultura líquida blastospore preparado. (A) Metarhizium robertsii e (B) Metarhizium pinghaense antes da inoculação do arroz como um substrato sólido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
4. Secagem de culturas fúngicas
- Seque as culturas fúngicas por 10-12 dias após a fermentação, antes de seu uso em ensaios, transferindo as culturas esporuladas em sacos de papel marrom de 26-30 kg (30 x 43 x 15250 cm3).
- Para melhorar a resistência à tração dos sacos de papel, corte horizontalmente um terço da parte superior de cada saco e forra a parte inferior do saco (Figura 3A, B).
Figura 3: Preparação de sacos de papel, procedimento de secagem de culturas e embalagem. (A,B) A preparação de sacos de papel marrom. O procedimento de secagem das culturas das espécies de Metarhizium cultivadas em (C,E) arroz parboiled e (D,F) cevada flocada. (G) Sacos de papel fechados com grampos para criar uma estrutura de tenda triangular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Destrua suavemente o substrato em cada saco de fermentação, corte o canto de cada saco e transfira toda a cultura para os sacos de papel através do espaço deixado pelo canto de corte (Figura 3C-F). Para evitar a fuga excessiva de esporos fúngicos para o ar, realize este processo lentamente.
NOTA: Conduza este processo em condições estéreis, utilizando fluxo laminar, para evitar contaminação. - Rotule cada saco de papel e dobre sobre a extremidade superior de cada saco duas vezes e feche com grampos para criar uma estrutura de tenda triangular, e coloque os sacos em racks de secagem de arame para permitir a secagem adequada, mesmo secagem, a uma temperatura controlada de ± 25 °C e baixa umidade de 30-40%.
- Gire os sacos diariamente para permitir a secagem das culturas e evitar qualquer recrescimento vegetativo que possa ocorrer, o que diminuiria o rendimento dos esporos fúngicos colhiáveis.
- Pesar cada saco de secagem após cada 2 dias durante o processo de secagem, e continuar o processo de secagem de cada saco até que pouca ou nenhuma mudança seja observada na massa dos sacos entre os dias sucessivos.
5. Colheita de conidia fúngica
- Colher conidia fúngica mecanicamente das culturas usando três peneiras aninhadas, uma peneira de teste (ETS) tela nº 35 (com abertura de 500-μm), aninhada em uma peneira de teste (com abertura de 212-μm), aninhada na malha ETS nº 100 (com abertura de 150-μm), montada em uma panela de coleta.
- Carregue a amostra de cultura seca na peneira ETS nº 35 lentamente e coloque uma tampa na peneira para evitar a liberação de conídio fúngico no ar.
- Adicione 10-12 bolinhas de vidro nas peneiras para auxiliar a passagem da conídia fúngica através das telas de malha e evitar a retenção da conidia na peneira, o que pode resultar em redução da recuperação dos esporos.
- Fita e veda as juntas de peneira usando fita elétrica para evitar a fuga de pó conidial.
- Coloque as peneiras em um agitador vibratório, equipado com uma almofada pegajosa, para fixar a panela de coleta e peneiras, por 20-25 min, a um movimento de 560-640 vibrações por minuto (Figura 4).
NOTA: Técnica adaptada de Jaronski e Jackson18.
Figura 4: Colheita de esporos fúngicos das culturas secas de Metarhizium robertsii no arroz e cevada em flocos. (A) 10-12 mármores de vidro adicionados às peneiras para auxiliar a passagem da conidia fúngica através das telas de malha. M. robertsii conidia colhido de culturas em (B) arroz, e (C) flocou mal. (D) Peneira em um agitador vibratório. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Remova as peneiras de teste da panela de coleta, colete conidia e armazene as conidia coletadas em sacos de zíper herméticos e impermeáveis para armazenamento a longo prazo (3-6 meses).
6. Quantificação da conidia fúngica produzida
- Meça e regise a massa de cada substrato de grãos antes da colheita da conídia fúngica de cada substrato.
- Meça o peso total da conidia coletada subtraindo a massa dos esporos coletados da massa do substrato sólido.
NOTA: O rendimento total da conídia envolve não apenas a conídia colhida, mas também a conídia fúngica deixada no substrato sólido. - Pese o substrato e remova 10 g do substrato pesado. Suspenda os 10 g do substrato em 0,05% Tween 20 e dilua em 10 mL de água destilada estéril.
- Misture a suspensão por 2 minutos e use um hemócito para fazer a contagem de esporos para determinar o número de conídios lavados do substrato.
- Realizar novas diluições transferindo 1000 μL da suspensão conidial lavada de 10 mL para 9 mL de água destilada estéril para compor 10 mL de suspensões de diluição.
- Misture as suspensões conidiais por 2 minutos e determine as concentrações conidiais.
NOTA: Siga o procedimento e a fórmula descritos por Inglis, Enkerli e Goettel30 para determinar a concentração conidial das suspensões. - Recolher e suspender um total de 0,1 g do pó conidial coletado de cada cultura em 10 mL de água destilada estéril suplementada com 0,05% Tween 20, e vórtice-mistura a suspensão conidial por 2 min, e determinar a concentração conidial usando um hemocitômetro.
- Realizar novas diluições transferindo 1000 μL da suspensão conidial de 10 mL para 9 mL de água destilada estéril para compor as diluições de suspensão de 10 mL.
- Misture as suspensões conidiais por 2 minutos, calcule as concentrações conidiais e determine o número de conidia por grama.
- Multiplique o número de conidia por grama de pó colhido pela massa inicial do pó conidial colhido. Multiplique o número de conidia lavada do substrato pelo peso total do substrato gasto, sendo o substrato do qual as conidias foram colhidas.
- Adicione os dois valores dados juntos e divida pelo peso seco inicial do substrato para calcular o número de conidia por kg ou g do substrato18.
NOTA: Os cálculos foram feitos principalmente para o substrato de arroz. O teste de germinação ou viabilidade conidial foi realizado tanto para os isolados M. pinghaense quanto para o M. robertsii para determinar a viabilidade da conidia produzida.
7. Análise de dados
- Use um programa de software de computador adequado para realizar a análise estatística dos resultados obtidos.
NOTA: A análise estatística dos dados foi feita utilizando-se a versão STATISTICA 13.5.0.17.
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Representative Results
Um declínio na massa de conteúdo das culturas sobre arroz tanto para o M. pinghaense quanto para o M. robertsii foi observado ao longo do tempo durante a fase de secagem das culturas fúngicas, sem, ou pouco, mudança sendo observada na massa uma vez que as culturas estavam secas (Figura 5). O pó de conidia fúngica seca colhida tanto do M. pinghaense quanto do M. robertsii é mostrado na Figura 6.
Figura 5: A mudança na massa de conteúdo da bolsa do Metarhizium robertsii e das culturas M. pinghaense no arroz (intervalo de confiança de 95%) ao longo de 10 dias (ANOVA; F5,35 = 2,21; p = 0,08). Diferentes letras acima das barras indicam a diferença significativa (p < 0,05) obtida em massa de conteúdo de saco ao longo dos dias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Conidia colhida. (A) Conidia colhida na panela de coleta. (B) Metarhizium robertsii. (C) M. pinghaense. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Não foi observada diferença significativa no pó conidial médio que foi colhido de cada tipo de grão tanto para M. pinghaense quanto para M. robertsii. Conidia seca colhida para ambos tinha uma média de viabilidade >90% conidial tanto para M. pinghaense quanto para M. robertsii. No substrato de arroz, a M. pinghaense produziu uma média de 8,2 g ± 4,38 g de pó conidial, o que excedeu ligeiramente a quantidade obtida para M. robertsii (6 g ± 2 g). Uma média de 1,83 g ± 1,47 g de M. robertsii conidia seca foi colhida do substrato de cevada flocada, enquanto zero M. pinghaense foi colhido do substrato. Nenhuma conidia fúngica seca foi colhida do substrato de aveia em flocos para M. pinghaense ou M. robertsii (Figura 7).
Figura 7: Quantidade média de conidia em pó. A quantidade média de conidia em pó de Metarhizium pinghaense e M. robertsii, medida em gramas (intervalo de confiança de 95%) colhida a partir dos três substratos sólidos: arroz parboilado, cevada em flocos e aveia em flocos (ANOVA: F2,27 = 2,82; p = 0,08). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Observou-se diferença significativa na conidia média estimada por grama, colhida a partir dos grãos de arroz, observada entre m. pinghaense (3,51 x 107/g ± 0,43 x 107/g) e M. robertsii (4,31 x 107/g ± 0,38 x 107/g). M. robertsii teve uma contagem média ligeiramente maior de conidia por grama do que M. pinghaense (Figura 8).
Figura 8: Conidia média por grama. A média estimada conidia por grama para Metarhizium pinghaense e M. robertsii (intervalo de confiança de 95%) das culturas do arroz (ANOVA: F 1,7 = 8,47; p = 0,02). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Não foi observada diferença significativa no número estimado de conidia presente no substrato de arroz gasto entre M. pinghaense (5,02 x 107/mL ± 1,47 x 107/mL) e M. robertsii (3,70 x 107/mL ± 0,91 x 107/mL) (Figura 9). No entanto, m. pinghaense tinha um número ligeiramente maior de conidia presente no substrato de arroz do que M. robertsii.
Figura 9: Conidia fúngica média. A conidia fúngica média estimada de Metarhizium pinghaense e M robertsii (intervalo de confiança de 95%) das culturas (F1,7 = 2,45; p = 0,16) presentes nos substratos da cultura do arroz gasto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Não foi observada diferença significativa no rendimento total estimado da conidia entre o M. pinghaense (5,09 x 107/g ± 1,35 x 107/g) e o M. robertsii (3,55 x 107/g ± 0,85 x 107/g) obtidos a partir das culturas do substrato de arroz. No entanto, m. pinghaense produziu um rendimento conidial ligeiramente maior do que M. robertsii, que produziu um rendimento conidial menor (Figura 10).
Figura 10: Rendimento total da conidia. O rendimento total total estimado de Metarhizium pinghaense e M. robertsii (intervalo de confiança de 95%) das culturas sobre arroz (F1,7 = 3,91; p = 0,09). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A integração bem-sucedida dos agentes microbianos para o controle biológico de importantes pragas de insetos agrícolas em um agroecossistema depende tanto do sucesso quanto da facilidade de produção em massa dos entomopatógenos como o primeiro passo em condições laboratoriais. A produção em massa de EPF é importante para a aplicação em larga escala e disponibilidade de produtos EPF para programas de IPM utilizando controle biológico 9,10,11,12,13. O sucesso da produção em massa de diferentes isolados da EPF é influenciado pelos componentes nutricionais do substrato ou médio de produção, que impactam significativamente os atributos da conidia resultante, incluindo sua eficácia, tolerância à dessecação, persistência de campo e rendimento conidial 8,19,20,21 . Portanto,é importante desenvolver conhecimento das necessidades nutricionais dos entomopatógenos produzidos em massa durante o processo de cultivo e fermentação.
No presente estudo, a produção em massa tanto de M. robertsii quanto de M. pinghaense foi realizada utilizando três diferentes produtos agrícolas como substratos de fermentação: arroz parboilado, cevada em flocos e aveia em flocos. Os três substratos de grãos diferentes foram observados para influenciar significativamente o rendimento conidial dos isolados fúngicos. O arroz parboilizado foi altamente favorável para a produção em massa de ambos os isolados, enquanto os grãos de cevada em flocos favoreceram apenas a produção de M. robertsii . As observações foram feitas com base no rendimento do pó de conidia fúngica seca após a fermentação. Pouco ou não, conidia foram colhidas da aveia em flocos após a fermentação. As aveias flocadas foram encontradas para reter níveis mais elevados de umidade nos sacos de fermentação durante o processo de fermentação, o que pode ter resultado no fraco desempenho observado do grão como substrato para a produção de M. pinghaense e M. robertsii. O substrato de aveia flocado era propenso a um crescimento micúrquico vegetativo branco dos isolados fúngicos em alguns casos, o que influenciou muito o rendimento conidial, uma vez que a esporulação não ocorreu nos sacos de fermentação contendo o crescimento excessivo. Os sacos de fermentação com o substrato de aveia flocada também foram observados com altos níveis de contaminação bacteriana em relação aos sacos de fermentação contendo substratos de cevada em flocos.
Altos níveis de fungos saprofíticos ou contaminação por leveduras foram observados em relação à produção em massa de M. pinghaense utilizando cevada flocada como substrato. A contaminação fúngica saprofítica foi observada em estágio posterior do processo de fermentação através do crescimento e conidiogênese de um fungo diferente do usado para inocular o substrato. Diagnosticar a contaminação do substrato em um estágio inicial de fermentação, antes da esporulação conidial, foi difícil. Acredita-se que a contaminação bacteriana e de leveduras durante o processo de fermentação se manifeste por manchas úmidas no substrato, e tanto a aveia em flocos quanto os grãos de cevada tendem a absorver e reter a umidade por mais tempo do que os grãos de arroz. Esta foi uma limitação ao uso desses dois substratos como substratos de fermentação para a produção em massa dos dois isolados de Metarhizium .
As observações feitas durante o presente estudo mostraram que o tipo de método de inoculação utilizado para vacinar cada substrato de grãos afetou a produção conidial. O método de inoculação de suspensão conidial foi considerado relativamente menos eficaz, uma vez que a aveia em flocos e cevada flocada mostrou um aumento do nível de contaminação em relação ao momento em que o método de inoculação de blastospore cultivado em líquido foi usado em grãos de arroz. Ao contrário do método de inoculação de blastospore cultivado em líquido, o método de suspensão conidial não permite a detecção de possíveis contaminantes nas suspensões anteriores à inoculação dos substratos, resultando nos altos níveis de contaminação observados nos sacos de fermentação. Jaronski e Jackson18 descreveram vários fatores que poderiam levar à possível contaminação dos substratos utilizados, como a falta de esterilização completa do substrato, inoculação não téril e manuseio inadequado do substrato de fermentação nos sacos. A contaminação observada nos sacos de fermentação contendo cevada em flocos e aveia flocada também pode ter resultado da falta de esterilização completa do substrato, o que poderia ter ocorrido durante o processo de autoclavagem. Jaronski e Jackson18 também descreveram o uso de suspensões conidiais como inoculantes como desvantajosos, pois resulta em maiores chances de contaminação durante a colheita conidial de um meio de ágar.
No campo, durante a infecção de hospedeiros adequados, o fungo constrói pela primeira vez a biomassa no hemocoel dos insetos através da proliferação, antes de seu surgimento e esporulação na superfície sólida externa dos insetos30. Tal processo foi imitado ao usar o método de fermentação líquido-blastospore. Assim, o caldo representava o hemocoel do inseto, a inoculação do caldo com conídio fúngico representava o contato inicial e a infecção do inseto, e a formação de blastospores no caldo representava a proliferação do processo de blastospore que ocorre dentro do hemocoel do inseto infectado. A inoculação final dos grãos de arroz e a esporulação do fungo nos grãos ao longo do tempo representaram o que ocorre na cutícula do inseto uma vez que o fungo começa a emergir de dentro do cadáver do inseto. Isso pode explicar por que o método de fermentação de blastospore líquido funcionou melhor do que o método de inoculação de suspensão conidial.
Jaronski e Jackson18 descreveram aveia em flocos e grãos de cevada em flocos como os grãos agrícolas preferidos para a cultura de massa das espécies de Metarhizium , em comparação com os grãos de arroz, uma vez que os dois tipos de grãos foram encontrados para manter seu teor de umidade durante o processo de fermentação. No entanto, o presente estudo contradiz as observações e conclusões dos pesquisadores acima mencionados, uma vez que tanto a aveia flocada quanto a cevada flocada não foram encontradas como bons substratos de fermentação sólida para M. pinghaense ou M. robertsii. O arroz foi encontrado como um bom substrato de grãos para ambos os isolados, pois não se decompõe em pequenas partículas que poderiam se misturar com o produto final, como foi sugerido em estudos anteriores.
O presente estudo mostrou que os isolados da espécie Metarhizium podem ser cultivados com sucesso e produzidos em massa usando grãos de arroz e que os diferentes grãos tendem a influenciar a esporulação conidial e produzir de forma diferente. Isso pode ser devido ao fato de que diferentes grãos diferem em termos de tal composição nutricional, por exemplo, carbono: razões de nitrogênio e concentração de carbono. A concentração de carbono e o carbono: a razão de nitrogênio de um meio de crescimento é conhecida por afetar o rendimento da conídia, bem como sua qualidade em termos de viabilidade e virulência22. As técnicas de inoculação utilizadas para inocular os substratos também têm sido demonstradas para influenciar o grau de sucesso alcançado na produção em massa de isolados de EPF em substratos específicos de grãos agrícolas. Portanto, recomenda-se a técnica de fermentação de blastospore líquida descrita no presente estudo como sendo o melhor método de inoculação para substratos de grãos agrícolas para a produção em massa de isolados M. pinghaense e M. robertsii . O uso desse método permite a possível detecção de contaminação antes do uso dos inoculantes, o que pode dificultar a produção em massa do isolado EPF desejado em relação ao uso da técnica de inoculação de suspensão conidial. Recomenda-se também que os grãos de arroz sejam usados como substratos sólidos para a produção em massa de conidia tanto de M. pinghaense quanto de M. robertsii, em vez de cevada em flocos e aveia em flocos. A técnica descrita é importante para a produção em massa futura e aplicação comercial da conidia em condições de campo contra importantes pragas de insetos nos agroecossistemas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer hort Pome, Hort Stone, e o Programa de Tecnologia e Recursos Humanos para a Indústria (THRIP: TP14062571871) pelo financiamento do projeto.
ORCID:
Mathulwe http://orcid.org/0000-0002-5118-3578
Antoinette Http://orcid.org/0000-0002-9257-0312
Nomakholwa F. Stokwe http://orcid.org/0000-0003-2869-5652
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Tween 20 | Lasec | Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water | |
| 20 mL McCartney bottles | Lasec | Used to make conidial suspensions | |
| Aluminium foil | Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask | ||
| Autoclave | Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process | ||
| Autoclave bags | Lasec | Fermentation bags or solid substrate containers | |
| Autoclave tape | Lasec | To secure PVC pipes on the fermentation bags | |
| Brown Kraft paper bags | Used to dry conidia cultures on agricultural grains | ||
| Bunsen burnner | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks) | |
| Clear edge test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
| Corn steep liquor | SIGMA | 66071-94-1 | Ingredient of the blastospore liquid medium |
| Cotton Wool | Lasec | Used as plug of the neck for fermentation bags | |
| Duran laboratory bottles | Neolab | Used to autoclave SDA medium and distilled water | |
| Electrical tape | Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust | ||
| ENDECOTTS test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
| Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask | Lasec | Carrier of the blastospore liquid medium | |
| Ethanol (99%) | Lasec | Used to sterilize surgical blades and inoculating loops | |
| Flaked barley | Health Connection Wholefoods | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Flaked oats | Tiger brands | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Glucose | Merck | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
| Growth Chamber/ incubators | For growing fungal conidia culture | ||
| Haemocytometer | Used to determine conidial concentrations | ||
| Inoculating loops | Lasec | For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth | |
| Kitchen rolling pin | Used to manipulate the solid grain substrate bed | ||
| Laminar flow Cabinet | ESCO Laminar Flow Cabinet | Provide as sterile environment during substrate inoculation | |
| Metarhizium pinghaense conidia | Stellenbosch University | 5HEID | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense |
| Metarhizium robertsii conidia | Stellenbosch University | 6EIKEN | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii |
| Microscope | ZEIZZ (Scope. A1) | Used to determine conidial concentrations and conidial viability | |
| Orbital shaker | IncoShake- LABOTEC | Used for the blastospore production process | |
| Parboiled rice | Spekko | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Penicillin-Streptomycin | SIGMA | Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination | |
| Petri-dishes | Lasec | Containers for the SDA medium | |
| Pipettes and pipette tips | Labnet (BioPette PLUS) | Used to measure liquids ingredients | |
| Polyvinylchloride Marley waste pipe | Used to create a neck for the fermentation bag | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
| Rubber band | Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks | ||
| Sabaroud dextrose agar (SDA) | NEOGEN Culture Media | Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii | |
| Sterile distilled water | To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions | ||
| Sticky pad | Used to secure the seives on the vibratory shaker | ||
| Surgical blade | Lasec | Used to scrape off spores from fungal cultures | |
| Surgical paper | Lasec | Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag | |
| Vibratory shaker | Used to shake conidia off the agricultural grain substrates | ||
| Vortex mixer | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles | |
| Yeast extract | Biolab | Added to the SDA medium to improve spore germination and growth | |
| Zipper-lock bags | GLAD | Used to to store harvested fungal conidia |
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