Summary
Denne artikkelen rapporterer en in vivo hemming av CENP-E gjennom abdominal kirurgi og testikkelinjeksjon av GSK923295, en verdifull modell for mannlig meiotisk deling. Ved hjelp av immunfluorescens, flowcytometri og transmisjonselektronmikroskopianalyser viser vi at CENP-E-hemming resulterer i kromosomfeilstilling og genominstabilitet i musespermatocytter.
Abstract
I eukaryoter er meiose avgjørende for genomstabilitet og genetisk mangfold i seksuell reproduksjon. Eksperimentelle analyser av spermatocytter i testikler er avgjørende for undersøkelsene av spindelmontering og kromosomsegregering i mannlig meiotisk divisjon. Musespermatocytten er en ideell modell for mekanistiske studier av meiose, men de effektive metodene for analyse av spermatocytter mangler. I denne artikkelen rapporteres en praktisk og effektiv metode for in vivo-hemming av kinesin-7 CENP-E i spermatocytter fra mus. En detaljert prosedyre for testikkelinjeksjon av en spesifikk inhibitor GSK923295 gjennom abdominal kirurgi hos 3 uker gamle mus presenteres. Videre er beskrevet her en serie protokoller for vevsinnsamling og fiksering, hematoksylin-eosinfarging, immunfluorescens, flowcytometri og transmisjonselektronmikroskopi. Her presenterer vi en in vivo inhiberingsmodell via abdominal kirurgi og testikkelinjeksjon, som kan være en kraftig teknikk for å studere mannlig meiose. Vi demonstrerer også at CENP-E-hemming resulterer i kromosomfeilstilling og metafasestans i primære spermatocytter under meiose I. Vår in vivo inhiberingsmetode vil legge til rette for mekanistiske studier av meiose, tjene som en nyttig metode for genetiske modifikasjoner av mannlige kjønnslinjer, og kaste lys over fremtidige kliniske anvendelser.
Introduction
Meiose er en av de viktigste, svært stive, evolusjonære konserverte hendelsene i eukaryote organismer, og er avgjørende for gametogenese, seksuell reproduksjon, genomintegritet og genetisk mangfold 1,2,3. Hos pattedyr gjennomgår kimcellene to påfølgende celledelinger, meiose I og II, etter en enkelt runde med DNA-replikasjon. I motsetning til søsterkromatider i mitose, parrer dupliserte homologe kromosomer seg og segregerer i to datterceller under meiose I 4,5. I meiose II trekker søsterkromatider fra hverandre og segregerer for å danne haploide kjønnsceller uten DNA-replikasjon6. Feil i en av de to meiotiske divisjonene, inkludert spindelmonteringsfeil og kromosomfeilsegregering, kan føre til tap av kjønnsceller, sterilitet eller aneuploidisyndromer 7,8,9.
Akkumulerende studier har vist at kinesinfamiliemotorer spiller en avgjørende rolle i reguleringen av kromosomjustering og segregering, spindelmontering, cytokinese og cellesyklusprogresjon i både mitotiske og meiotiske celler10,11,12. Kinesin-7 CENP-E (Centromere protein E) er en pluss-ende-rettet kinetochore motor som kreves for kromosomkongress, kromosomtransport og justering, og regulering av spindelmonteringskontrollpunkt i mitose 13,14,15,16,17,18. Under meiose fører CENP-E-hemming av den spesifikke inhibitoren GSK923295 til cellesyklusstans, kromosomfeiljustering, spindeldisorganisering og genominstabilitet i spermatogene celler19. Lokaliseringsmønstrene og dynamikken til CENP-E ved sentromerer av delende spermatocytter indikerer at CENP-E interagerer med kinetochoreproteiner for sekvensiell montering av sentromerer under meiose I20,21. I oocytter er CENP-E nødvendig for kromosomjustering og fullføring av meiose I13,22,23. Antistoffer eller morfolinoinjeksjon av CENP-E resulterer i feiljusterte kromosomer, unormal kinetochore orientering og meiose jeg arresterer i både mus og Drosophila oocytter23. Sammenlignet med de essensielle rollene til CENP-E i mitose, forblir funksjonene og mekanismene til CENP-E i meiose stort sett ukjente. Detaljerte mekanismer for CENP-E i kromosomkongress og genomstabilitet i mannlige meiotiske celler gjenstår å bli avklart.
Spermatogenese er en kompleks og langvarig fysiologisk prosess, som involverer sekvensiell spermatogonia-proliferasjon, meiose og spermiogenese. Derfor er hele prosessen usedvanlig vanskelig å reprodusere in vitro hos pattedyr og andre arter24,25. Det er umulig å indusere spermatocytter differensiering etter pachytenstadiet in vitro. Studier på mannlige meiotiske divisjoner har generelt vært begrenset til eksperimentelle analyser av tidlig meiotisk profase25,26. Til tross for mange teknologiske bestrebelser, inkludert kortsiktig kultur av spermatocytter27,28 og organkulturmetoder25, er det få effektive metoder for å studere mannlig meiotisk deling. Videre resulterer genetisk sletting av essensielle gener vanligvis i utviklingsstans og embryonal dødelighet. For eksempel klarer ikke museembryoer som mangler CENP-E å implantere og kan ikke utvikle tidligere implantasjon29, noe som er et hinder i mekanistiske studier av CENP-E i meiose. Samlet sett kan etablering av et praktisk og gjennomførbart system for å studere mannlig meiotisk divisjon i stor grad fremme forskningsfeltet meiose.
Den lille cellepermeable inhibitoren er et kraftig verktøy for å studere kinesinmotorer i celledeling og utviklingsprosesser. Den allosteriske inhibitoren, GSK923295, binder seg spesifikt til CENP-E motorisk domene, blokkerer frigivelsen av ADP (adenosindifosfat), og stabiliserer til slutt interaksjonene mellom CENP-E og mikrotubuli30. I denne studien presenteres en in vivo hemmingsmusemodell ved abdominalkirurgi og testikkelinjeksjon av GSK923295. CENP-E-hemming resulterer i kromosomfeilstilling i metafase I av primære spermatocytter. Videre fører CENP-E-hemming til meiotisk stans av spermatocytter og forstyrrelse av spermatogenese. En rekke protokoller er beskrevet for analyse av spermatocytter og kan brukes til å observere meiotiske spindelmikrotubuli, homologe kromosomer og subcellulære organeller i spermatocytter. Vår in vivo inhiberingsmetode er en effektiv metode for studier av meiotisk deling og spermatogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble gjennomgått og godkjent av Animal Care and Use Committee ved Fujian Medical University (protokollnummer SYXK 2016-0007). Alle museforsøk ble utført i samsvar med de relevante retningslinjene for omsorg og bruk av forsøksdyr fra National Institutes of Health (NIH-publikasjonsnummer 8023, revidert 1978).
1. Konstruksjon av GSK923295-medierte CENP-E hemming musemodeller
- Steriliser de kirurgiske instrumentene ved 121 °C i 30 minutter. Bestråle den kirurgiske ultrarene arbeidsbenken med ultrafiolett-C (UVC) i 2 timer. Vei de 3 uker gamle mannlige ICR (Institute of Cancer Research) musene som brukes til forsøkene og beregne dosene av bedøvelse som kreves.
- Bedøv mus ved å administrere en kombinasjon av ketamin (100 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) via intraperitoneal injeksjon. Sjekk dybden av anestesi av musene gjennom en kombinasjon av musens hornhinnerefleks, nociceptiv refleks, respirasjon, samt muskelton. Bekreft at musene er dypt bedøvet.
MERK: Plasser dyret på en varmepute for å gi termisk støtte under operasjonen. - Bind musens lemmer og fest dem på voksbrettet. Legg en dråpe veterinærsalve på museøyne for å forhindre tørrhet mens du er under anestesi. Barbere bukhåret på musen fra underlivet til pungen ved hjelp av en eksperimentell dyrehøvel. Fest operasjonsområdet med en steril drapering.
- Desinfiser ventral abdomen med en Betadine skrubb etterfulgt av 75% etanol tre ganger. Åpne bukhulen med en steril skalpell og lag en <5 mm åpning.
- Klem huden med sterile kirurgiske klemmer og trekk den epididymale fettputen med steril dissekerende tang for å lokalisere testiklene ved hjelp av en steril pinsett. Fest testisene med steril tang under et stereoskop, og injiser sakte 10 μL GSK923295 i seminiferøse tubuli ved en endelig konsentrasjon på 10 μM ved bruk av 10 μL rheodyne30. For konstruksjon av kontrollgruppen, injiser 10 μL 1% DMSO (dimetylsulfoksid) / PBS (fosfatbufret saltvann) løsning.
MERK: Oppbevar den GSK923295 oppløsningen i en konsentrasjon på 10 mM ved -80 °C. Oppløs 0,1 μL 10 mM GSK923295 i 100 mikrol PBS-oppløsning for å fremstille 10 μM GSK923295 oppløsning. - Skyv testisene forsiktig tilbake i bukhulen med steril kirurgisk tang. Sutur bukhinnen og huden separat med to til fire masker ved hjelp av suturlinjen med en diameter på 0,1 mm.
- Merk en 3 x 3 mm plassering på baksiden av dyret med en permanent markør etter abdominal kirurgi, sett musen tilbake til fôringsburet og sørg for et rent og patogenfritt miljø med tilstrekkelig mat og vann.
- Hold miljøet i steril tilstand gjennom filtrert luft, sterilisert mat og vann. Ta vare på dyret til det har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal recumbency. Ved postoperativ analgesi, administrer en dose buprenorfin (0,1 mg/kg) subkutant hver 12. time i 3 dager. Forsikre deg om at musen ikke blir returnert til selskap med andre dyr før den er fullstendig gjenopprettet.
MERK: Musene får postoperativ behandling, og gir såret lokalbedøvelse på riktig måte ved hjelp av 0,5% lidokain for å redusere postoperativ smerte når det er nødvendig.
2. Hematoksylin-eosin (HE) farging og histopatologi
- Fire dager etter abdominal kirurgi, avlive musene med CO 2 med en strømningshastighet på 2 l / min i et CO2 kammer. Bekreft død ved cervical dislokasjon som en bekreftende metode for eutanasi. Bruk kirurgisk saks for å åpne pungen og fjerne testiklene med tang. Samle mustestiklene 4 dager etter GSK923295 injeksjon og fest dem i 30 ml 10% formaldehydoppløsning ved romtemperatur i 12 timer.
- For gradient dehydrering, inkuber prøven sekvensielt i 40 ml 70% etanol i 1 time, i 40 ml 85% etanol i 1 time, i 40 ml 95% etanol i 1 time og i 40 ml 100% etanol i 1 time.
- Inkuber prøven i 40 ml xylen i 40 minutter, og deretter i 40 ml parafin i 1 time ved 65 °C. Plasser vevet nederst i innebyggingsboksen. Tilsett smeltet parafin i innebyggingsboksen. Avkjøl vevet for fullstendig størkning ved 4 °C i 6 timer.
- Fest prøvene på holderen av ultramikrotomen, hold vinkelen mellom prøvene og knivoverflaten på 5-10 °, og juster skivetykkelsen til 5 μm. Forbered de 5 μm tykke seksjonene ved hjelp av en ultramikrotom, fordel skliene i et vannbad ved 40 °C, og tørk seksjonene i en lysbildetørker i 12 timer ved 37 °C.
- Inkuber lysbildene i 200 ml xylen i 40 minutter, i 200 ml 100% etanol i 6 minutter, i 200 ml 95% etanol i 2 minutter, i 200 ml 90% etanol i 2 minutter, i 200 ml 80% etanol i 2 minutter og i 200 ml 70% etanol i 2 minutter, henholdsvis.
- Skyll lysbildene i destillert vann i 5 min og flekk dem med Mayers hematoksylinoppløsning i 6 minutter ved romtemperatur.
MERK: Mayers hematoksylinløsning: 0,011 mol / l hematoksylin, 6,7% vannfri etanol, 0,646 mol / L aluminiumkaliumsulfat og 0,003 mol / l natriumjodat. - Skyll lysbildene i rennende vann i 5 min og rug med destillert vann i 2 minutter.
- Inkuber lysbildene i 1% etanolhydroklorid i 3 s, og skyll dem deretter i rennende vann i 2 minutter.
- Flekk prøven med 1% eosin i 15 s, og inkuber dem deretter med 95% etanol i 5 s, med 100% etanol i 2 minutter og i xylen i 40 minutter.
- Forsegl lysbildene med 15 μL nøytral tyggegummi og 24 x 50 mm deksel.
3. Immunfluorescens og konfokal mikroskopi
- Samle de 5 μm tykke parafinseksjonene av musetestikler for immunfluorescens. Inkuber lysbildene i xylen i 40 min, i 100% etanol i 6 min, i 95% etanol i 2 minutter, i 90% etanol i 2 minutter, i 80% etanol i 2 minutter og i 70% etanol i 2 minutter. Skyll skliene i destillert vann i 5 min, og skyll skliene med 0,01 M PBS i 5 min.
- Plasser lysbildene i antigengjenfinningsløsningen (0,01 M citratbuffer) og kok under høyt trykk ved hjelp av en trykkoker i 4 minutter for antigenhenting. Avkjøl lysbildene naturlig til romtemperatur. Skyll med destillert vann i 5 min to ganger, og med PBS i 5 min.
MERK: 0,01 M sitratbuffer (pH 6,0): 2,1 mmol/l sitronsyre, 11,6 mmol/l trinatriumsitratdihydrat. - Permeabiliser celler ved å inkubere lysbildene i 500 μL på 0,25% TritonX-100 / PBS i 10 minutter. Skyll lysbildene med PBS i 5 min tre ganger.
- For antigenblokkering, inkuber prøvene med 300 μL 3% bovint serumalbumin (BSA) / PBST (0,1% Tween-20 i PBS) i 1 time. Inkuber prøvene med de primære antistoffene i 3 % BSA/PBST i 16 timer ved 4 °C. Sett lysbildene i en fuktet boks for å forhindre at vevet tørker ut. Varm opp skliene naturlig til romtemperatur i 30 min.
- Kast det primære antistoffet, og skyll deretter lysbildene i PBST i 5 min tre ganger. Fortynn sekundære antistoffer i 3% BSA/PBST. Inkuber prøvene med sekundære antistoffer i 1-2 timer ved 37 °C. Skyll prøvene i PBST i 5 min fem ganger.
- Beis kjernene med 50 μL 4', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i 5 minutter ved romtemperatur. Monter dekselet med anti-fade-monteringsmediet, og forsegl dekselet med neglelakk.
- Observer og registrer fluorescerende signaler i lysbildene ved hjelp av et fluorescerende mikroskop utstyrt med et NA 40x / 0.75-mål.
4. Flowcytometri
- Samle musetestikler i 6 cm petriskåler og kutt testiklene i 1 mm3 stykker ved hjelp av kirurgisk saks.
- Fordøy testiklene ved hjelp av 1 ml 1% kollagenase i 1,5 ml sentrifugerør i 10 minutter ved 37 ° C, og sentrifuge deretter prøvene ved 1000 x g i 5 minutter for å utfelle spermatogene celler.
- Kast supernatanten, og tilsett deretter 1 ml 0,25 % trypsin-EDTA-oppløsning (etylendiamintetraeddiksyre) i 20 minutter ved 37 °C, og sentrifuge deretter prøvene ved 1000 x g i 5 minutter.
- Kast supernatanten og inkuber deretter de utfelte cellene med 1 ml 70 % kald etanol i mer enn 8 timer ved 4 °C.
- Sentrifuge prøvene ved 1000 x g i 5 minutter, og samle deretter cellesedimenter. Farg de spermatogene cellene med 500 μL propidiumjodid (PI) fargeløsning (50 μg/ml PI, 100 μg/ml RNase A og 0,2 % Triton X-100 i PBS) ved 37 °C i 30 minutter.
MERK: Rist sentrifugerøret forsiktig hvert 5. minutt for å unngå celleaggregeringer. - Filtrer prøvene ved hjelp av en 300 mesh-skjerm for å kvitte seg med celleavfall; samle cellene i et strømningsrør og lagre dem ved 4 °C.
- Oppdag fluorescenssignaler og lysspredning ved eksitasjonsbølgelengden på 488 nm ved hjelp av et flowcytometer. Analyser DNA-innhold og lysspredning ved hjelp av Modfit MFLT32-programvaren.
5. Transmisjonselektronmikroskopi
- Skjær testiklene i 1 mm 3 stykker ved hjelp av den skarpe skalpellen, og inkuber prøvene raskt med3 % glutaraldehyd-1,5% paraformaldehydoppløsning i 0,1 M PBS (pH 7,2) i 4 timer ved 4 °C for å unngå endringer i ultrastruktur. Skyll prøvene med 0,1 M PBS i 5 min tre ganger.
NOTAT: Skalpellen og saksen skal være skarpe, og prøv å unngå kunstig klemming og trekking. Behandlingen av prøver skal utføres i fikseringsvæsken. - Fest prøvene i 1% osminsyre-1,5% kaliumferrocyanidoppløsning ved 4 °C i 1,5 timer. Tørk vannet med filterpapir og skyll prøvene med 0,1 M PBS i 5 min tre ganger.
- Dehydrer prøvene i 40 ml 50 % etanol i 10 minutter ved 4 °C. Inkuber prøvene i 40 ml 70% etanolmettet uranacetatfargestoff ved 4 °C i 12 timer, i 40 ml 90% etanol i 10 minutter ved 4 °C, i 40 ml 90% etanol-aceton i 10 minutter ved romtemperatur og i 40 ml vannfri aceton i 10 minutter tre ganger ved romtemperatur.
- Inkuber prøvene i vannfri aceton-epoksyharpiks 618 innebyggingsmidler (v / v = 1: 1) blanding i 1,5 timer, og deretter innebygd prøvene i epoksyharpiks 618 innebyggingsmidler ved 35 ° C i 3 timer.
- For harpikspolymerisasjon, inkuber prøvene i epoksyharpiks 618 innebyggingsmidler ved 35 °C i 12 timer, ved 45 °C i 12 timer og deretter ved 60 °C i 24 timer.
- Monter prøvene og glasskniven, og juster deretter avstandene mellom prøvene og kniven. Forbered de 90 nm tykke ultratynne seksjonene ved hjelp av en ultratynn mikrotom. Del opp prøvene med konstant hastighet, og plasser deretter lysbildene på et nikkelnett. Legg lysbildene i en petriskål ved romtemperatur.
- Beis lysbildene med 2% uranylacetat i 10 min, og flekk deretter prøvene med 2% blycitrat i 10 min. Skyll lysbildene med destillert vann. Tørk lysbildene i 24 timer ved romtemperatur.
- Observer lysbildene og ta elektronbilder ved 70-100 kV ved hjelp av et transmisjonselektronmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har lykkes med å konstruere en in vivo CENP-E hemmingsmodell av musetestikler gjennom abdominal kirurgi og testikkelinjeksjon avGSK923295 19. De viktigste tekniske trinnene i denne metoden ble vist i figur 1. Etter testikkelinjeksjon av GSK923295 i 4 dager ble testiklene høstet for videre analyser. I kontrollgruppen var den spermatogene bølgen i sædkanalene regelmessig og organisert (figur 2A). I den GSK923295 gruppen ble imidlertid spermatogen bølge endret i sædtubuli, og metafasearresterte primære spermatocytter ble signifikant økt etter CENP-E-hemming (figur 2B-D). Det er viktig at flere homologe kromosomer ikke ble justert ved ekvatorialplaten etter CENP-E-hemming (figur 2B-D). Videre førte CENP-E-hemming også til økning av metafase I-spermatocytter i sædkanaler (figur 2E,F,G). Samlet sett resulterer CENP-E-hemming i kromosomfeiljustering i primære spermatocytter under meiose I, noe som antyder at CENP-E er ansvarlig for kromosomkongress og justering av spermatocytter i meiose.
For ytterligere å validere disse resultatene utførte vi immunfluorescensanalysene for å oppdage spermatogene celler i seminiferøse tubuli. Vi fant at den regulære spermatogene bølgen vist i kontrollgruppen åpenbart var endret og ble irregulær i GSK923295 gruppen (figur 3). Den meiotiske spindelen av delende spermatocytter ble merket med anti-α-tubulinantistoff, og det tverrgående filamentet av synaptonemalkomplekser i spermatocyttene ble merket med antisynaptonemal kompleksprotein 3 (SYCP3) antistoff (figur 3A). De SYCP3-positive cellene per sædkanal ble redusert etter CENP-E-hemming (figur 3B). Samtidig ble ikke SYCP3-punktene per metafasecelle forstyrret etter CENP-E-hemming (figur 3C). I tillegg var SYCP3-strekningene per celle heller ikke påvirket i de GSK92395 gruppene (figur 3D). Påfallende fant vi at avstandene til spindelpoler i metafase I-spermatocytter ble økt etter CENP-E-hemming (figur 3E,F). Disse immunfluorescerende resultatene antyder at CENP-E er nødvendig for kromosomfeilstilling og spermatogeneseprosessene, og er uunnværlig for vedlikehold av bipolar spindel og organisering av den meiotiske spindelen.
For å undersøke cellepopulasjoner i musetestikler fordøyde vi testiklene og utførte PI-farging og flowcytometrianalyser (figur 4). De viktige tekniske prosedyrene er vist i figur 4A-C. De spermatogene cellene består av flere cellepopulasjoner, inkludert spermatogonia, primære spermatocytter, sekundære spermatocytter, spermatider og spermatozoer. DNA-innholdet i disse spermatogene cellene ble vist i figur 4A. Vi viste at CENP-E-hemming resulterte i reduksjon av haploide celler fra 42,95 ± 1,09 % i kontrollgruppen til 38,26 ± 1,86 % i GSK923295 gruppen (figur 4B-D). Forholdet mellom de diploide cellene og aneuploidicellene ble ikke signifikant påvirket etter CENP-E-hemming (figur 4E,F). Videre øker forholdet mellom tetraploidcellene fra 17,76 ± 1,52 % i kontrollgruppen til 28,88 ± 2,05 % i GSK923295 gruppen (figur 4G). Samlet finner vi at cellepopulasjonene i de spermatogene cellene endres litt etter CENP-E-hemming. CENP-E-hemming resulterer i reduksjon av haploidcellene og økning av tetraploide celler, noe som indikerer at CENP-E-hemming er assosiert med metafasestans i de delende spermatocytter.
Videre observerte vi spermatogene cellers submikroskopiske struktur ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (figur 5). Kromatinorganisering, endoplasmatisk retikulum og mitokondrier av spermatocytter ble vist i figur 5. Vi fant at organiseringen av spermatogene celler var litt forstyrret i GSK923295 gruppen (figur 5).
Figur 1: Etablering av en in vivo hemmingsmodell av musetestikler ved abdominalkirurgi og testikkeladministrasjon. (A) Alle kirurgiske instrumenter som brukes ved abdominalkirurgi. 1) dissekere saks, 2) nåletang, 3) rett tang, 4) pincett, 5) rheodyne, 6) 1 ml sprøyte, 7) skalpell med nr. 3 håndtak og nr. 11 blad, 8) stylolitt, 9) runde sømåler, 1/2 0,6 x 14 mm, 1/2 0,7 x 17 mm, 10) etanolpinner. (B) Etter anestesi ble musene plassert i liggende stilling på et voksbrett, underlivet ble tilberedt og desinfisert med 75% etanol. (C) En <5 mm åpning ble laget midt i underlivet. (D) Den epididymale fettputen ble trukket med steril dissekerende tang for å lokalisere testiklene. Testisene ble injisert med 10 μL GSK923295 ved hjelp av en 10 μL rheodyne. (E) Bukhinnen og huden ble samtidig suturert med to masker. (F) Såret ble desinfisert med 75% etanol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 CENP-E-hemming resulterte i stans av meiose I og kromosomfeilstilling i spermatocytter fra mus. (A) HE-farging av spermatogene celler i kontrollgruppen. Pilene indikerer spermatocyttene. (B) HE farging av spermatogene celler i GSK923295 gruppen. Testiklene ble injisert med GSK923295 i 4 dager ved en endelig konsentrasjon på 10 μM. Pilene indikerer kromosomfeilstilling i spermatocyttene. For alle bilder, skala bar, 10 μm. (C) Forholdet mellom metafasespermatocytter i seminiferøse tubuli. Kontroll, 13,43 ± 1,68%; GSK923295, 42,29 ± 3,94%. N = 1308 celler ble analysert. Gruppe = 4. Student t-test. Feilfelt, betyr ± SEM. ***, P < 0,001. (D) Forholdet mellom seminiferøse tubuli og delende spermatocytter. Kontroll, 5,38 ± 2,64%; GSK923295, 33,96 ± 3,87%. N = 151 seminiferøse tubuli ble analysert. Gruppe = 4. (E) Immunfluorescensbilder av histon H3 (fosfos Ser 10) og TUBA4A i kontroll- og GSK923295 gruppene. TUBA4A, rød; Histone H3 (fospho Ser 10), grønn; DAPI, blå. Skala bar, 10 μm. Den forstørrede boksen er zoomet. (F) Kvantifisering av antall metafaseceller i seminiferøse tubuli. Kontroll, 11,45 ± 1,55; GSK923295, 18,91 ± 2,36. N = 11. (G,H) Linjeskanningsanalyser av fluorescerende intensiteter av histon H3 og TUBA4A i metafase I spermatocytter i kontrollgruppen (G) og GSK923295 gruppen (H). TUBA4A, rød; Histone H3 (fospho Ser 10), grønn; DAPI, blå. X-aksen angir den relative avstanden. Y-aksen indikerer fluorescerende intensiteter. Student t-test. Feilfelt, gjennomsnitt ± SEM. *, P < 0,05; ***, P < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: CENP-E-hemming ved GSK923295 førte til desorganisering av seminiferøse tubuli og forstyrrelse av spermatogenese. (A) Representative immunfluorescensbilder av SYCP3 og TUBA4A i kontroll- og GSK923295 gruppene. SYCP3, rød; TUBA4A, grønn; DAPI, blå. Skala bar, 10 μm. (B) SYCP3 positive celler per seminiferøse tubuli i kontroll- og GSK923295 gruppene. Kontroll, 56,00 ± 5,43%; GSK923295, 39,00 ± 1,73%. N = 10. (C) Kvantifiseringene av SYCP3 prikker per metafaseceller. Kontroll, 10,00 ± 1,02; GSK923295, 9,71 ± 0,86, N = 7. (D) Kvantifiseringene av SYCP3 strekker seg per celle i kontroll- og GSK923295 gruppene. Kontroll, 8,63 ± 0,22; GSK923295, 8,21 ± 0,21. N = 19. (E) Analysene av avstanden til spindelpolene i metafase I-spermatocytter. Kontroll, 8,20 ± 0,28 μm; GSK923295, 9,30 ± 0,29 μm. N = 30. (F) Immunfluorescensbilder av sædkanaler i kontroll- og GSK923295 gruppene. Pilene indikerer spermatocyttene. DAPI, grønn; β-tubulin, grønn. De forstørrede bildene av den stiplede boksen ble vist i zoomen. For alle bilder, skala bar, 10 μm. Student t-test. Feilfelt, gjennomsnitt ± SEM. ns, P > 0,05; **, P < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Flowcytometrianalyse av spermatogene celler i testikler hos mus. (A) Skjematiske illustrasjoner av de viktigste trinnene i cellesyklusanalyse av spermatogene celler fra mus. De diploide spermatocytter gjennomgår meiose I og II for å danne haploide spermatider. C-verdien indikerer DNA-innholdet. N-verdien (ploidi) indikerer antall sett med kromosomer. (B,C) Flowcytometrianalyse av spermatogene celler i kontrollgruppen (B) og GSK923295 gruppen (C). For in vivo CENP-E-hemming ble GSK923295 injisert i 3 uker gamle ICR-musetestikler hos menn ved en endelig konsentrasjon ved 10 μM i 4 dager. For cellesyklusanalyse ble n = 3000 celler målt og analysert. P4, de haploide cellene (1C). P5, de diploide cellene (2C). P6, de tetraploide cellene (4C). (D) Forholdet mellom de haploide cellene i kontroll- og GSK923295 gruppene. Kontroll, 42,95 ± 1,09%; GSK923295, 38,26 ± 1,86%. N = 8. (E) Forholdet mellom de diploide cellene i kontroll- og GSK923295 gruppene. Kontroll, 20,10 ± 0,91%; GSK923295, 17,95 ± 0,81%. N = 8. (F) Forholdet mellom de aneuploide cellene (2C ~ 4C) i kontroll- og GSK923295 gruppene. Kontroll, 3,41 ± 0,23%; GSK923295, 3,39 ± 0,25%. N = 8. (G) Forholdet mellom tetraploide celler i kontroll- og GSK923295 gruppene. Kontroll, 17,76 ± 1,52%; GSK923295, 28,88 ± 2,05%. N = 8. For alle grafer, Student er ikke test. Feilfelt, gjennomsnitt ± SEM. ns, P > 0,05; *, P < 0,05; , P < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5 Elektronmikroskopianalyse av spermatogene celler i kontroll- og GSK923295 gruppen. (A) Representative bilder av sædkanaler i kontrollgruppen. Skala bar, 5 μm. (B) Det forstørrede bildet av kjernen til spermatocytten. Pilene indikerer homologt kromatin av spermatocyttene. Skala bar, 1 μm. (C) Det forstørrede bildet av spermatocyttenes cytoplasma. Skala bar, 1 μm. (D) Representative bilder av seminiferøse tubuli i GSK923295 gruppen. Testiklene ble behandlet med 10 μM GSK923295 i 4 dager. Skala bar, 5 μm. (E) Det forstørrede bildet av kjernen til spermatocytten i den GSK923295 gruppen. Skala bar, 1 μm. (F) Det forstørrede bildet av cytoplasma av spermatocyttene i GSK923295 gruppen. Skala bar, 1 μm. For alle grafer, sc, spermatocytt; SD, spermatid. ER, endoplasmatisk retikulum; Mt, mitokondrier. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien har vi etablert en in vivo CENP-E hemmingsmodell av musetestikler ved bruk av abdominalkirurgi og mikroinjeksjon av GSK923295. Abdominal kirurgi og testikulær injeksjonsmetode som brukes i denne studien har følgende fordeler. For det første er det ikke begrenset til musens alder. Eksperimenter kan utføre testikkelinjeksjon på et tidlig stadium, for eksempel hos 3 uker gamle eller yngre mus. For det andre har GSK923295 en spesifikk og utmerket hemmende effekt på CENP-E. For det tredje er denne metoden enkel å betjene og svært reproduserbar. I tillegg opprettholdes integriteten til testikler, som er egnet for studier av intakte vev i sammenheng med organene.
Det er flere kritiske trinn i denne protokollen. For eksempel er det viktig å opprettholde et sterilt miljø under abdominal kirurgi for forebygging av postoperative infeksjoner31. Videre, for mus i forskjellige aldre eller forskjellige forsøksdyr, bør injeksjonsmengden justeres hensiktsmessig i henhold til størrelsen på testiklene og effektiviteten av legemidlene19,32. I tillegg er riktig fordøyelsestid og mikroskopisk observasjon nødvendig for bestemmelse av enkeltceller og påfølgende cellepopulasjonstesting under flowcytometri. Det er imidlertid flere begrensninger i disse protokollene. Det er vanskelig å bruke abdominal kirurgi for å konstruere en musemodell når musens alder er mindre enn 2 uker gammel. Hovedårsakene er at musene er for unge, det postoperative dietten er vanskelig og overlevelsesraten er lav. Legemidlene som brukes i dyremodeller er flytende og har egenskapene til lett gjennomtrengende cellemembraner 19,32,33, som er egnet for anvendelser av denne administrasjonsmetoden.
Forståelse av meiose stimuleres av in vitro cellekultur og genutslagsstudier, men det er ikke lett anvendelig i pattedyrspermatocytter28. Hindringen for de mekanistiske studiene av mannlig meiose har vært mangelen på et passende system for manipulering og observasjon av delende spermatocytter i meiose27. Musen er en utmerket modellorganisme i forskningen av cellulære og molekylære mekanismer for meiose under spermatogenese. Den første bølgen av musespermatocytter starter meiose ved dag 10 postpartum (dpp) og utvikler seg til modne sædceller ved 35 dpp, noe som gir et utviklingstidsvindu for studiene av meiotisk deling og spermatogenese34.
Testisinjeksjon, inkludert direkte injeksjon gjennom pungen og mikroinjeksjon via abdominal kirurgi, er en nyttig teknikk for studier av spermatogenese35,36. Direkte injeksjon gjennom pungen er rask og enkel, og forårsaker bare et mindre kirurgisk traume, som er egnet for mus på 4 uker eller eldre med testiklene ned til pungen. Det er imidlertid umulig å injisere de uendrede testiklene til de 3 uker gamle eller yngre musene. Mikroinjeksjon gjennom intraperitoneal kirurgi eller skrotkirurgi er egnet for injeksjon av uendrede testikler, noe som krever dyktige kirurgiske ferdigheter hos eksperimentelle operatører, et stereomikroskop og kirurgisk og laboratorieutstyr. I henhold til injeksjonsstedene kan mikroinjeksjon klassifiseres i seminiferøs tubuli injeksjon, testikulær nettinjeksjon og testikulær interstitiell injeksjon. Sammenlignet med andre injeksjonsbaserte testismodeller, kan injeksjon av inhibitorer gjennom abdominal kirurgi effektivt hemme funksjonene til proteiner og ha fordelene ved cellemembranpenetrasjon, enkle prosedyrer og langsiktig hemming19,32. Metodene som bruker siRNA, antisense-oligonukleotider eller lentivirus har større begrensninger i lav penetrasjonseffektivitet av cellemembraner, bivirkninger utenfor målet og lett nedbrytning av siRNA eller oligonukleotider in vivo37,38,39,40.
Den meiotiske inndelingen i levende vev er mer kompleks enn ved kulturforhold, der vevsarkitekturen, utviklingssignaleringen og miljøfaktorene in vivo bør tas i betraktning41. Tidligere studier har vist at kulturmedier og celleautonome faktorer er avgjørende for stimuleringen av begynnelsen av meiotisk delingsfase. For eksempel fremmer fosfatasehemmeren okadainsyre (OA)42, spermatocytt-spesifikk histon HIST1H1T 43, topoisomerase II44 og metafasefremmende faktor (MPF)45 G 2 / MI-overgangen i dyrkede spermatocytter. Disse komplekse kulturbetingelsene og faktorene bidrar til begrensningene av kortsiktig kultur av spermatocytter.
Direkte injeksjon av plasmid-DNA i testikler er vellykket anvendt i testismediert genoverføring og produksjon av transgene mus32,46. In vivo-elektroporeringen innebærer injeksjon av et DNA-ekspresjonsplasmid i lumen av seminiferøse tubuli, og bruk deretter en serie elektriske pulser for å endre cellemembranpermeabilitet, forbedre effektiviteten av transgenuttrykk og genetisk modifikasjon 45,46,47,48,49. Vår metode kan kombineres med in vivo elektroporering, samt fluorescerende merkede proteiner og genredigeringsverktøy, noe som gjør denne tilnærmingen kraftigere for analysene av mannlig meiotisk deling i den fysiologiske konteksten av vev og organer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker alle medlemmer av Cytoskeleton Laboratory ved Fujian Medical University for nyttige diskusjoner. Vi takker Jun-Jin Lin ved Public Technology Service Center, Fujian Medical University for teknisk assistanse innen flowcytometri. Vi takker Ming-Xia Wu og Lin-Ying Zhou ved Electron Microscopy Lab of Public Technology Service Center, Fujian Medical University for teknisk assistanse i elektronmikroskopi. Vi takker Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke, og Jun Song ved Experimental Teaching Center of Basic Medical Sciences ved Fujian Medical University for deres støtte. Denne studien ble støttet av følgende tilskudd: National Natural Science Foundation of China (tilskuddsnummer 82001608), Natural Science Foundation of Fujian Province, Kina (tilskuddsnummer 2019J05071), Fujian Provincial Health Technology Project (tilskuddsnummer 2018-1-69), Startup Fund for Scientific Research, Fujian Medical University (stipendnummer 2017XQ1001), Fujian Medical University høyt nivå talenter vitenskapelig forskning oppstartsfinansieringsprosjekt (tilskuddsnummer XRCZX2017025) og forskningsprosjekt av nettbasert utdanning og undervisning av studenter i kinesisk medisin (stipendnummer B-YXC20200202-06).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 1 ml Syringe | Several commercial brands available | Sterile. | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430828 | |
| 6 cm Petri dish | Corning | 430166 | |
| 95% Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009164 | |
| tubulin rabbit polyclonal antibody | Beyotime | AF0001 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibody | Abcam | ab267372 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibody | Sangon Biotech | D110022 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab175191 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | 188105 | |
| Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibody | Beyotime | A0423 | Sencodary antibody. Use at 1:500. |
| Aluminium potassium sulphate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10001060 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 100092690 | |
| Anti-fade mounting medium | Beyotime | P0131 | Prevent photobleching of flourescent signals. |
| BD FACS Canto II | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69003435 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424BK745380 | |
| Chloral hydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80037516 | |
| Citric acid | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 122670 | |
| Collagenase | Sangon Biotech | A004194-0100 | |
| Coverslips | CITOTEST | 10212020C | 20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm. |
| DAPI | Beyotime | C1006 | |
| Dye vat | Several commercial brands available | 91347802 | |
| Eosin Y, alcohol soluble | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71014460 | |
| Ether | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009318 | |
| Formaldehyde - aqueous solution | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10010018 | |
| GSK923295 | MedChemExpress | HY-10299 | |
| Hematoxylin, anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71020784 | |
| ICR mouse | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd | ||
| Image J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | Fluorescent image analysis. |
| Leica ultramicrotome | Leica | ||
| Leica EM UC-7 ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Modfit MFLT32 | Verity Software House | For analysis of flow cytometry results. | |
| Nail polish | Several commercial brands available | ||
| Neutral gum | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10004160 | |
| Nikon Ti-S2 microscope | Nikon | Ti-S2 | |
| Picric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | J60807 | |
| Rheodyne | Sangon Biotech | F519160-0001 | 10 μl rheodyne |
| Sliced paraffin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69019461 | |
| Sodium iodate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80117214 | |
| Surgical instruments | Several commercial brands available | For abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min. | |
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 173970 | |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30188928 | Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution. |
| Tween 20 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30189328 | Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution. |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80096618 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10023418 |
References
- Lenormand, T., Engelstädter, J., Johnston, S. E., Wijnker, E., Haag, C. R.
- Brandeis, M. New-age ideas about age-old sex: separating meiosis from mating could solve a century-old conundrum. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 93 (2), 801-810 (2018).
- Lane, S., Kauppi, L. Meiotic spindle assembly checkpoint and aneuploidy in males versus females. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 76 (6), 1135-1150 (2019).
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nature Reviews Genetics. 11 (2), 124-136 (2010).
- Miller, M. P., Amon, A., Ünal, E. Meiosis I: when chromosomes undergo extreme makeover. Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 687-696 (2013).
- Duro, E., Marston, A. L. From equator to pole: splitting chromosomes in mitosis and meiosis. Genes & Development. 29 (2), 109-122 (2015).
- Eaker, S., Pyle, A., Cobb, J., Handel, M. A. Evidence for meiotic spindle checkpoint from analysis of spermatocytes from Robertsonian-chromosome heterozygous mice. Journal of Cell Science. 114, Pt 16 2953-2965 (2001).
- Faisal, I., Kauppi, L. Reduced MAD2 levels dampen the apoptotic response to non-exchange sex chromosomes and lead to sperm aneuploidy. Development. 144 (11), 1988-1996 (2017).
- Bolcun-Filas, E., Handel, M. A.
- Lawrence, C. J., et al.
- Cross, R. A., McAinsh, A. Prime movers: the mechanochemistry of mitotic kinesins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 257-271 (2014).
- Camlin, N. J., McLaughlin, E. A., Holt, J. E. Motoring through: the role of kinesin superfamily proteins in female meiosis. Human Reproduction Update. 23 (4), 409-420 (2017).
- Yen, T. J., Li, G., Schaar, B. T., Szilak, I., Cleveland, D. W. CENP-E is a putative kinetochore motor that accumulates just before mitosis. Nature. 359 (6395), 536-539 (1992).
- Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
- Abrieu, A., Kahana, J. A., Wood, K. W., Cleveland, D. W. CENP-E as an essential component of the mitotic checkpoint in vitro. Cell. 102 (6), 817-826 (2000).
- Mao, Y., Desai, A., Cleveland, D. W. Microtubule capture by CENP-E silences BubR1-dependent mitotic checkpoint signaling. The Journal of Cell Biology. 170 (6), 873-880 (2005).
- Gudimchuk, N., et al. Kinetochore kinesin CENP-E is a processive bi-directional tracker of dynamic microtubule tips. Nature Cell Biology. 15 (9), 1079-1088 (2013).
- Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
- She, Z. Y., et al. Kinesin-7 CENP-E regulates chromosome alignment and genome stability of spermatogenic cells. Cell Death Discovery. 6, 25 (2020).
- Parra, M. T., et al. Sequential assembly of centromeric proteins in male mouse meiosis. PLoS Genetics. 5 (3), 1000417 (2009).
- Parra, M. T., et al. Expression and behaviour of CENP-E at kinetochores during mouse spermatogenesis. Chromosoma. 111 (1), 53-61 (2002).
- Duesbery, N. S., et al. CENP-E is an essential kinetochore motor in maturing oocytes and is masked during mos-dependent, cell cycle arrest at metaphase II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (17), 9165-9170 (1997).
- Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
- Parks, J. E., Lee, D. R., Huang, S., Kaproth, M. T.
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
- Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. Journal of Andrology. 22 (6), 911-926 (2001).
- Handel, M. A., Caldwell, K. A., Wiltshire, T. Culture of pachytene spermatocytes for analysis of meiosis. Developmental Genetics. 16 (2), 128-139 (1995).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods in Molecular Biology. 558, 279-297 (2009).
- Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
- Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
- Nam, D., Sershon, R. A., Levine, B. R., Della Valle, C. J. The use of closed incision negative-pressure wound therapy in orthopaedic surgery. Journal of the American Academy Orthopaedic Surgeons. 26 (9), 295-302 (2018).
- She, Z. Y., et al. Kinesin-5 Eg5 is essential for spindle assembly and chromosome alignment of mouse spermatocytes. Cell Division. 15, 6 (2020).
- She, Z. Y., et al. Kinesin-6 family motor KIF20A regulates central spindle assembly and acrosome biogenesis in mouse spermatogenesis. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1867 (4), 118636 (2020).
- Wellard, S. R., Hopkins, J., Jordan, P. W. A seminiferous tubule squash technique for the cytological analysis of spermatogenesis using the mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56453 (2018).
- Sato, M., Ishikawa, A., Kimura, M. Direct injection of foreign DNA into mouse testis as a possible in vivo gene transfer system via epididymal spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (1), 49-56 (2002).
- Coward, K., et al. Expression of a fluorescent recombinant form of sperm protein phospholipase C zeta in mouse epididymal sperm by in vivo gene transfer into the testis. Fertility and Sterility. 85, 1281-1289 (2006).
- Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
- Zhao, H. T., et al. LRRK2 antisense oligonucleotides ameliorate α-Synuclein inclusion formation in a Parkinson's Disease mouse model. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 8, 508-519 (2017).
- Shahzad, K., et al. CHOP-ASO Ameliorates Glomerular and Tubular Damage on Top of ACE Inhibition in Diabetic Kidney Disease. Journal of the American Society of Nephrology. 3, 2021040431 (2021).
- Kang, K., Niu, B., Wu, C., Hua, J., Wu, J. The construction and application of lentiviral overexpression vector of goat miR-204 in testis. Research in Veterinary Science. 130, 52-58 (2020).
- Karabasheva, D., Smyth, J. T. Preparation of Drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60961 (2020).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).
- Cobb, J., Cargile, B., Handel, M. A. Acquisition of competence to condense metaphase I chromosomes during spermatogenesis. Developmental Biology. 205 (1), 49-64 (1999).
- Cobb, J., Reddy, R. K., Park, C., Handel, M. A. Analysis of expression and function of topoisomerase I and II during meiosis in male mice. Molecular Reproduction and Development. 46 (4), 489-498 (1997).
- Inselman, A., Handel, M. A. Mitogen-activated protein kinase dynamics during the meiotic G2/MI transition of mouse spermatocytes. Biology of Reproduction. 71 (2), 570-578 (2004).
- Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer. Biochemical and Biophysical Research Communications. 233 (1), 45-49 (1997).
- Yamazaki, Y., et al. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells by deoxyribonucleic acid injection into seminiferous tubules and subsequent electroporation. Biology of Reproduction. 59 (6), 1439-1444 (1998).
- Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a marker. The Journal of Experimental Zoology. 286 (2), 212-218 (2000).
- Coward, K., Kubota, H., Parrington, J. In vivo gene transfer into testis and sperm: developments and future application. Archives of Andrology. 53 (4), 187-197 (2007).
