Summary
Denna artikel rapporterar en in vivo-hämning av CENP-E genom bukkirurgi och testikelinjektion av GSK923295, en värdefull modell för manlig meiotisk delning. Med hjälp av immunofluorescens-, flödescytometri- och transmissionselektronmikroskopianalyser visar vi att CENP-E-hämning resulterar i kromosomfelinriktning och genominstabilitet i musspermatocyter.
Abstract
I eukaryoter är meios avgörande för genomstabilitet och genetisk mångfald vid sexuell reproduktion. Experimentella analyser av spermatocyter i testiklar är kritiska för undersökningar av spindelsammansättning och kromosomsegregering vid manlig meiotisk delning. Musspermatocyten är en idealisk modell för mekanistiska studier av meios, men effektiva metoder för analys av spermatocyter saknas. I denna artikel rapporteras en praktisk och effektiv metod för in vivo-hämning av kinesin-7 CENP-E i musspermatocyter. Ett detaljerat förfarande för testikelinjektion av en specifik hämmare GSK923295 genom bukkirurgi hos 3 veckor gamla möss presenteras. Vidare beskrivs här en serie protokoll för vävnadsinsamling och fixering, hematoxylin-eosinfärgning, immunofluorescens, flödescytometri och transmissionselektronmikroskopi. Här presenterar vi en in vivo-hämningsmodell via bukkirurgi och testikelinjektion, som kan vara en kraftfull teknik för att studera manlig meios. Vi visar också att CENP-E-hämning resulterar i kromosomfelinriktning och metafasstopp i primära spermatocyter under meios I. Vår in vivo-hämningsmetod kommer att underlätta meiosstudier, fungera som en användbar metod för genetiska modifieringar av manliga könslinjer och belysa framtida kliniska tillämpningar.
Introduction
Meios är en av de viktigaste, mycket styva, evolutionärt bevarade händelserna i eukaryota organismer och är avgörande för gametogenes, sexuell reproduktion, genomintegritet och genetisk mångfald 1,2,3. Hos däggdjur genomgår könscellerna två på varandra följande celldelningar, meios I och II, efter en enda omgång DNA-replikation. Till skillnad från systerkromatider vid mitos kopplas duplicerade homologa kromosomer ihop och separeras i två dotterceller under meios I 4,5. I meios II drar systerkromatider isär och separerar för att bilda haploida gameter utan DNA-replikation6. Fel i någon av de två meiotiska divisionerna, inklusive spindelmonteringsdefekter och kromosommissegregering, kan leda till förlust av könsceller, sterilitet eller aneuploidisyndrom 7,8,9.
Ackumulerande studier har visat att kinesinfamiljemotorer spelar en avgörande roll i regleringen av kromosomjustering och segregering, spindelmontering, cytokinese och cellcykelprogression i både mitotiska och meiotiska celler10,11,12. Kinesin-7 CENP-E (centromerprotein E) är en plus-end-riktad kinetokormotor som krävs för kromosomkongress, kromosomtransport och inriktning och reglering av spindelmonteringskontrollpunkt i mitos 13,14,15,16,17,18. Under meios leder CENP-E-hämning av den specifika hämmaren GSK923295 till cellcykelstopp, kromosomfelinriktning, spindeldisorganisation och genominstabilitet i spermatogena celler19. Lokaliseringsmönstren och dynamiken hos CENP-E vid centromererna för delande spermatocyter indikerar att CENP-E interagerar med kinetokorproteiner för sekventiell sammansättning av centromerer under meios I20,21. I oocyter krävs CENP-E för kromosomjustering och slutförande av meios I13,22,23. Antikroppar eller morfolinoinjektion av CENP-E resulterar i feljusterade kromosomer, onormal kinetokororientering och meios I arresterar i både mus- och Drosophila-oocyter 23. Jämfört med de väsentliga rollerna för CENP-E i mitos är funktionerna och mekanismerna för CENP-E i meios fortfarande i stort sett okända. Detaljerade mekanismer för CENP-E i kromosomkongress och genomstabilitet i manliga meiotiska celler återstår att klargöra.
Spermatogenes är en komplex och långvarig fysiologisk process, som involverar sekventiell spermatogoniaproliferation, meios och spermiogenes. Därför är hela processen utomordentligt svår att reproducera in vitro hos däggdjur och andra arter24,25. Det är omöjligt att inducera spermatocytdifferentiering efter pachytenstadiet in vitro. Studier av manliga meiotiska delningar har i allmänhet begränsats till experimentella analyser av tidig meiotisk profas25,26. Trots många tekniska ansträngningar, inklusive kortvarig odling av spermatocyter27,28 och organodlingsmetoder25, finns det få effektiva metoder för att studera manlig meiotisk delning. Dessutom resulterar genetisk deletion av essentiella gener vanligtvis i utvecklingsstopp och embryonal dödlighet. Till exempel misslyckas musembryon som saknar CENP-E att implantera och kan inte utvecklas efter implantation29, vilket är ett hinder i mekanistiska studier av CENP-E vid meios. Sammantaget kan upprättandet av ett praktiskt och genomförbart system för att studera manlig meiotisk uppdelning i hög grad främja forskningsområdet meios.
Den lilla cellgenomsläppliga hämmaren är ett kraftfullt verktyg för att studera kinesinmotorer i celldelning och utvecklingsprocesser. Den allosteriska hämmaren, GSK923295, binder specifikt till CENP-E-motordomänen, blockerar frisättningen av ADP (adenosindifosfat) och stabiliserar slutligen interaktionerna mellan CENP-E och mikrotubuli30. I denna studie presenteras en in vivo inhibitionsmusmodell genom bukkirurgi och testikelinjektion av GSK923295. CENP-E-hämning resulterar i feljustering av kromosomer i metafas I av primära spermatocyter. Vidare leder CENP-E-hämning till meiotisk arrestering av spermatocyter och störning av spermatogenesen. En serie protokoll beskrivs för analys av spermatocyter och kan tillämpas för att observera meiotiska spindelmikrotubuli, homologa kromosomer och subcellulära organeller i spermatocyter. Vår in vivo-hämningsmetod är en effektiv metod för studier av meiotisk delning och spermatogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök granskades och godkändes av Animal Care and Use Committee vid Fujian Medical University (protokollnummer SYXK 2016-0007). Alla musexperiment utfördes i enlighet med relevanta riktlinjer för vård och användning av laboratoriedjur från National Institutes of Health (NIH-publikationer nummer 8023, reviderad 1978).
1. Konstruktion av GSK923295-medierade CENP-E-hämningsmusmodeller
- Sterilisera operationsinstrumenten vid 121 °C i 30 minuter. Bestråla den kirurgiska ultrarena arbetsbänken med ultraviolett-C (UVC) i 2 timmar. Väg de 3 veckor gamla manliga ICR-mössen (Institute of Cancer Research) som används för experimenten och beräkna doserna av bedövningsmedel som krävs.
- Bedövar möss genom att administrera en kombination av ketamin (100 mg/kg) och xylazin (10 mg/kg) via intraperitoneal injektion. Kontrollera djupet av anestesi hos mössen genom en kombination av mushornhinnereflex, nociceptiv reflex, andning samt muskelton. Bekräfta att mössen är djupt bedövade.
OBS: Placera djuret på en värmedyna för att ge termiskt stöd under operationen. - Tie upp musbenen och fixa dem på vaxbrickan. Placera en droppe veterinärsalva på musögon för att förhindra torrhet under anestesi. Raka musens bukhår från underlivet till pungen med en rakhyvel för försöksdjur. Säkra operationsområdet med ett sterilt draperi.
- Desinficera den ventrala buken med en betadinskrubb följt av 75% etanol tre gånger. Öppna bukhålan med en steril skalpell och gör en öppning på <5 mm.
- Kläm fast huden med sterila kirurgiska klämmor och dra den epididymala fettkudden med sterila dissekeringspincett för att lokalisera testiklarna med en steril pincett. Fixera testiklarna med sterila pincett under ett stereoskop och injicera långsamt 10 μl GSK923295 i sädesledarna vid en slutlig koncentration på 10 μM med 10 μl rheodyn30. För konstruktion av kontrollgruppen, injicera 10 μL 1% DMSO (dimetylsulfoxid)/PBS (fosfatbuffrad saltlösning) lösning.
OBS: Förvara den GSK923295 lösningen i en koncentration av 10 mM vid -80 °C. Lös 0,1 μl 10 mM GSK923295 i 100 μl PBS-lösning för att bereda 10 μM GSK923295 lösning. - Tryck försiktigt testiklarna tillbaka in i bukhålan med sterila kirurgiska pincett. Suturera bukhinnan och huden separat med två till fyra stygn med suturlinjen med en diameter på 0,1 mm.
- Märk en 3 x 3 mm plats på djurets baksida med en permanent markör efter bukoperationen, sätt tillbaka musen i matningsburet och säkerställ en ren och patogenfri miljö med tillräckligt med mat och vatten.
- Håll miljön i sterilt tillstånd genom den filtrerade luften, den steriliserade maten och vattnet. Ta hand om djuret tills det har återfått tillräckligt med medvetande för att upprätthålla sternal liggande. För postoperativ analgesi, administrera en dos buprenorfin (0,1 mg/kg) subkutant var 12:e timme i 3 dagar. Se till att musen inte återlämnas till andra djur förrän den är helt återställd.
OBS: Mössen ges postoperativ vård och ger på lämpligt sätt såret lokalbedövning med 0,5% lidokain för att minska postoperativ smärta vid behov.
2. Färgning och histopatologi av hematoxylin-eosin (HE)
- Fyra dagar efter bukoperationen, avliva mössen med CO 2 med en flödeshastighet av 2 l / min i en CO2-kammare. Bekräfta döden genom cervikal dislokation som en bekräftande metod för eutanasi. Använd kirurgisk sax för att öppna pungen och ta bort testiklarna med pincett. Samla mustestiklar 4 dagar efter GSK923295 injektion och fixa dem i 30 ml 10% formaldehydlösning vid rumstemperatur i 12 timmar.
- För gradientdehydrering inkuberas provet sekventiellt i 40 ml 70 % etanol i 1 timme, i 40 ml 85 % etanol i 1 timme, i 40 ml 95 % etanol i 1 timme och i 40 ml 100 % etanol i 1 timme.
- Inkubera provet i 40 ml xylen i 40 minuter och därefter i 40 ml paraffin i 1 timme vid 65 °C. Placera vävnaderna längst ner på inbäddningslådan. Tillsätt det smälta paraffinet i inbäddningslådan. Kyl vävnaderna för fullständig stelning vid 4 °C i 6 timmar.
- Fixera proverna på hållaren av ultramikrotomen, håll vinkeln mellan proverna och knivytan på 5-10 ° och justera skivans tjocklek till 5 μm. Bered de 5 μm tjocka sektionerna med hjälp av en ultramikrotom, sprid ut objektglasen i ett vattenbad vid 40 °C och torka sektionerna i en torktumlare i 12 timmar vid 37 °C.
- Inkubera objektglasen i 200 ml xylen i 40 minuter, i 200 ml 100 % etanol i 6 minuter, i 200 ml 95 % etanol i 2 minuter, i 200 ml 90 % etanol i 2 minuter, i 200 ml 80 % etanol i 2 minuter och i 200 ml 70 % etanol i 2 minuter. respektive.
- Skölj glasen i destillerat vatten i 5 minuter och färga dem med Mayers hematoxylinlösning i 6 minuter vid rumstemperatur.
OBS: Mayers hematoxylinlösning: 0,011 mol / L hematoxylin, 6,7% vattenfri etanol, 0,646 mol / L aluminiumkaliumsulfat och 0,003 mol / L natriumjodat. - Skölj glasen i rinnande vatten i 5 minuter och inkubera med destillerat vatten i 2 minuter.
- Inkubera objektglasen i 1% etanolhydroklorid i 3 s och skölj dem sedan i rinnande vatten i 2 minuter.
- Färga provet med 1% eosin i 15 s och inkubera dem sedan med 95% etanol i 5 s, med 100% etanol i 2 minuter och i xylen i 40 minuter.
- Försegla glasen med 15 μl neutralt gummi och täckglaset på 24 x 50 mm.
3. Immunofluorescens och konfokalmikroskopi
- Samla upp de 5 μm tjocka paraffinsektionerna i mustestiklar för immunofluorescens. Inkubera glasen i xylen i 40 minuter, i 100 % etanol i 6 minuter, i 95 % etanol i 2 minuter, i 90 % etanol i 2 minuter, i 80 % etanol i 2 minuter och i 70 % etanol i 2 minuter. Skölj glasen i destillerat vatten i 5 minuter och skölj glasen med 0,01 M PBS i 5 minuter.
- Placera objektglasen i antigenlösningen (0,01 M citratbuffert) och koka under högt tryck med en tryckkokare i 4 minuter för antigenhämtning. Kyl glasen naturligt till rumstemperatur. Skölj med destillerat vatten i 5 min två gånger och med PBS i 5 min.
OBS: 0,01 M citratbuffert (pH 6,0): 2,1 mmol / L citronsyra, 11,6 mmol / L trinatriumcitratdihydrat. - Permeabilisera celler genom att inkubera objektglasen i 500 μL 0,25% TritonX-100/PBS i 10 minuter. Skölj bilderna med PBS i 5 min tre gånger.
- För antigenblockering, inkubera proverna med 300 μl 3% bovint serumalbumin (BSA)/PBST (0,1% Tween-20 i PBS) i 1 timme. Inkubera proverna med de primära antikropparna i 3 % BSA/PBST i 16 timmar vid 4 °C. Lägg glasen i en fuktad låda för att förhindra att vävnaderna torkar ut. Värm glasen naturligt till rumstemperatur i 30 minuter.
- Kassera den primära antikroppen och skölj sedan objektglasen i PBST i 5 minuter tre gånger. Utspädda sekundära antikroppar i 3% BSA/PBST. Inkubera proverna med sekundära antikroppar i 1–2 timmar vid 37 °C. Skölj proverna i PBST i 5 min fem gånger.
- Färga kärnorna med 50 μL 4', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i 5 minuter vid rumstemperatur. Montera täckglaset med anti-fade monteringsmediet och försegla täckglaset med nagellack.
- Observera och registrera fluorescerande signaler i objektglasen med hjälp av ett fluorescerande mikroskop utrustat med ett NA 40x / 0,75-mål.
4. Flödescytometri
- Samla mustestiklar i 6 cm petriskålar och skär testiklarna i 1 mm3 stycken med kirurgisk sax.
- Smält testiklarna med 1 ml 1 % kollagenas i 1,5 ml centrifugrör i 10 minuter vid 37 °C och centrifugera sedan proverna vid 1 000 x g i 5 minuter för att fälla ut spermatogena celler.
- Kassera supernatanten och tillsätt sedan 1 ml 0,25 % trypsin-EDTA-lösning (etylendiamintetraättiksyra) i 20 minuter vid 37 °C och centrifugera sedan proverna vid 1 000 x g i 5 minuter.
- Kassera supernatanten och inkubera sedan de utfällda cellerna med 1 ml 70 % kall etanol i mer än 8 timmar vid 4 °C.
- Centrifugera proverna vid 1 000 x g i 5 minuter och samla sedan cellsediment. Färga de spermatogena cellerna med 500 μL propidiumjodid (PI) färgningslösning (50 μg/ml PI, 100 μg/ml RNas A och 0,2 % Triton X-100 i PBS) vid 37 °C i 30 minuter.
OBS: Skaka försiktigt centrifugröret var 5: e minut för att undvika cellaggregationer. - Filtrera proverna med en 300 nätskärm för att bli av med cellskräp; samla cellerna i ett flödesrör och förvara dem vid 4 °C.
- Detektera fluorescenssignaler och ljusspridning vid excitationsvåglängden 488 nm med hjälp av en flödescytometer. Analysera DNA-innehåll och ljusspridning med hjälp av programvaran Modfit MFLT32.
5. Transmissionselektronmikroskopi
- Skär testiklarna i 1 mm 3 bitar med den skarpa skalpellen och inkubera snabbt proverna med3 % glutaraldehyd-1,5% paraformaldehydlösning i 0,1 M PBS (pH 7,2) i 4 timmar vid 4 ° C för att undvika förändringar av ultrastrukturen. Skölj proverna med 0,1 M PBS i 5 min tre gånger.
OBS: Skalpellen och saxen ska vara vassa och försök att undvika konstgjord klämning och dragning. Bearbetningen av prover bör utföras i fixeringsvätskan. - Fixera proverna i 1% osmisk syra-1,5% kaliumferrocyanidlösning vid 4 °C i 1,5 timmar. Torka vattnet med filterpapper och skölj proverna med 0,1 M PBS i 5 min tre gånger.
- Dehydrera proverna i 40 ml 50 % etanol i 10 minuter vid 4 °C. Inkubera proverna i 40 ml 70 % etanolmättat uranacetatfärgämne vid 4 °C i 12 timmar, i 40 ml 90 % etanol i 10 minuter vid 4 °C, i 40 ml 90 % etanolaceton i 10 minuter vid rumstemperatur och i 40 ml vattenfri aceton i 10 minuter tre gånger vid rumstemperatur.
- Inkubera proverna i vattenfri aceton-epoxiharts 618 inbäddningsmedel (v / v = 1: 1) blandning i 1,5 h och bädda sedan in proverna i epoxiharts 618 inbäddningsmedel vid 35 ° C i 3 timmar.
- För hartspolymerisation, inkubera proverna i epoxiharts 618-inbäddningsmedel vid 35 °C i 12 timmar, vid 45 °C i 12 timmar och därefter vid 60 °C i 24 timmar.
- Installera proverna och glaskniven och justera sedan avstånden mellan proverna och kniven. Förbered de 90 nm tjocka ultratunna sektionerna med en ultratunn mikrotom. Skiva proverna med konstant hastighet och placera sedan objektglasen på ett nickelnät. Lägg bilderna i en petriskål vid rumstemperatur.
- Färga glasen med 2% uranylacetat i 10 minuter och färga sedan proverna med 2% blycitrat i 10 minuter. Skölj glasen med destillerat vatten. Torka glasen i 24 timmar vid rumstemperatur.
- Observera bilderna och spela in elektronbilder vid 70-100 kV med hjälp av ett transmissionselektronmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har framgångsrikt konstruerat en in vivo CENP-E-hämningsmodell av mustestiklar genom bukkirurgi och testikelinjektion av GSK92329519. De viktigaste tekniska stegen för denna metod visas i figur 1. Efter testikelinjektion av GSK923295 i 4 dagar skördades testiklarna för ytterligare analyser. I kontrollgruppen var den spermatogena vågen i seminiferous tubuli regelbunden och organiserad (figur 2A). I den GSK923295 gruppen förändrades emellertid den spermatogena vågen i sädesledarna och de metafasstoppade primära spermatocyterna ökade signifikant efter CENP-E-hämning (figur 2B-D). Det är viktigt att flera homologa kromosomer inte var inriktade på ekvatorialplattan efter CENP-E-hämning (figur 2B-D). Vidare ledde CENP-E-hämning också till ökningen av spermatocyter i metafas I i sädesledarna (figur 2E, F, G). Sammantaget resulterar CENP-E-hämning i kromosomfelinriktning i primära spermatocyter under meios I, vilket tyder på att CENP-E är ansvarig för kromosomkongress och anpassning av spermatocyter i meios.
För att ytterligare validera dessa resultat utförde vi immunofluorescensanalyserna för att detektera de spermatogena cellerna i seminiferösa tubuli. Vi fann att den vanliga spermatogena vågen som visades i kontrollgruppen uppenbarligen förändrades och blev oregelbunden i den GSK923295 gruppen (figur 3). Den meiotiska spindeln för att dela spermatocyter märktes med anti-α-tubulinantikropp, och det tvärgående filamentet av synaptonemala komplex i spermatocyterna märktes med anti-synaptonemal komplexprotein 3 (SYCP3) antikropp (figur 3A). De SYCP3-positiva cellerna per sädeskanaluli minskade efter CENP-E-hämning (figur 3B). Under tiden stördes inte SYCP3-punkterna per metafascell efter CENP-E-hämning (figur 3C). Dessutom påverkades inte heller SYCP3-sträckorna per cell i de GSK92395 grupperna (figur 3D). Påfallande nog fann vi att avståndet mellan spindelstolpar i spermatocyter i metafas I ökade efter CENP-E-hämning (figur 3E, F). Dessa immunofluorescerande resultat tyder på att CENP-E krävs för kromosomfelinriktning och spermatogenesprocesser, och är oumbärlig för underhåll av bipolär spindel och organisationen av den meiotiska spindeln.
För att undersöka cellpopulationer i mustestiklar smälte vi testiklarna och utförde PI-färgning och flödescytometrianalyser (figur 4). De viktiga tekniska förfarandena visas i figur 4A–C. De spermatogena cellerna består av flera cellpopulationer, inklusive spermatogoni, primära spermatocyter, sekundära spermatocyter, spermatider och spermier. DNA-innehållet i dessa spermatogena celler visades i figur 4A. Vi visade att CENP-E-hämning resulterade i minskningen av de haploida cellerna från 42,95 ± 1,09% i kontrollgruppen till 38,26 ± 1,86% i GSK923295 gruppen (figur 4B-D). Förhållandena mellan de diploida cellerna och aneuploidicellerna påverkades inte signifikant efter CENP-E-hämning (figur 4E,F). Vidare ökar förhållandena mellan tetraploida celler från 17,76 ± 1,52% i kontrollgruppen till 28,88 ± 2,05% i GSK923295 gruppen (figur 4G). Sammantaget finner vi att cellpopulationerna i de spermatogena cellerna förändras något efter CENP-E-hämning. CENP-E-hämning resulterar i minskning av de haploida cellerna och ökningen av tetraploida celler, vilket indikerar att CENP-E-hämning är associerad med metafasstopp i de delande spermatocyterna.
Vidare observerade vi den submikroskopiska strukturen hos de spermatogena cellerna med hjälp av transmissionselektronmikroskopi (figur 5). Kromatinorganisationen, endoplasmatisk retikulum och mitokondrier av spermatocyter visades i figur 5. Vi fann att organisationen av spermatogena celler stördes något i den GSK923295 gruppen (figur 5).
Figur 1: Etablering av en in vivo-hämningsmodell av mustestiklar genom bukkirurgi och testikeladministrering. (A) Alla kirurgiska instrument som används vid bukkirurgi. 1) dissekera sax, 2) nålpincett, 3) rak pincett, 4) pincett, 5) rheodyn, 6) 1 ml spruta, 7) skalpell med nr 3 handtag och blad nr 11, 8) stylolit, 9) runda sömnålar, 1/2 0,6 x 14 mm, 1/2 0,7 x 17 mm, 10) etanolpinnar. (B) Efter anestesi placerades mössen i ryggläge på en vaxbricka, underlivet bereddes och desinficerades med 75% etanol. (C) En öppning på <5 mm gjordes i mitten av underlivet. (D) Den epididymala fettkudden drogs med sterila dissekerande pincett för att lokalisera testiklarna. Testiklarna injicerades med 10 μL GSK923295 med en 10 μL rheodyn. (E) Bukhinnan och huden sys samtidigt med två stygn. (F) Såret desinficerades med 75% etanol. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: CENP-E-hämning resulterade i arrestering av meios I och kromosomfelinriktning i musspermatocyter . A) Färgning av de spermatogena cellerna i kontrollgruppen. Pilarna indikerar spermatocyterna. B) Färgning av de spermatogena cellerna i den GSK923295 gruppen. Testiklarna injicerades med GSK923295 i 4 dagar vid en slutlig koncentration av 10 μM. Pilarna indikerar kromosomfelinriktning i spermatocyterna. För alla bilder, skalstapel, 10 μm. (C) Förhållandet mellan spermatocyter i metafas i sädesrör. Kontroll, 13,43 ± 1,68%; GSK923295, 42,29 ± 3,94%. N = 1308 celler analyserades. Grupp = 4. Elevens t-test. Felstaplar, betyder ± SEM. ** *, P < 0,001 . (D) Förhållandet mellan sädesledarna och de delande spermatocyterna. Kontroll, 5,38 ± 2,64%; GSK923295, 33,96 ± 3,87%. N = 151 seminiferösa tubuli analyserades. Grupp = 4. E) Immunofluorescensbilder av histon H3 (fosfo Ser 10) och TUBA4A i kontroll- och GSK923295 grupperna. TUBA4A, röd; Histon H3 (fosfo Ser 10), grön; DAPI, blå. Skalstång, 10 μm. Den förstorade rutan är inzoomad. (F) Kvantifiering av antalet metafasceller i sädeskanal. Kontroll, 11,45 ± 1,55; GSK923295, 18,91 ± 2,36. N = 11. (G,H) Linjeskanningsanalyser av fluorescerande intensiteter av histon H3 och TUBA4A i metafas I-spermatocyter i kontrollgruppen (G) och GSK923295-gruppen (H). TUBA4A, röd; Histon H3 (fosfo Ser 10), grön; DAPI, blå. X-axeln anger det relativa avståndet. Y-axeln indikerar fluorescerande intensiteter. Elevens t-test. Felstaplar, medelvärde ± SEM. *, P < 0,05 ; ** *, P < 0,001 . Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: CENP-E-hämning genom GSK923295 ledde till desorganisering av sädesledare och störning av spermatogenesen. (A) Representativa immunofluorescensbilder av SYCP3 och TUBA4A i kontroll- och GSK923295 grupperna. SYCP3, röd; TUBA4A, grön; DAPI, blå. Skalstång, 10 μm. (B) SYCP3-positiva celler per sädesledare i kontroll- och GSK923295 grupperna. Kontroll, 56,00 ± 5,43%; GSK923295, 39,00 ± 1,73%. N = 10. (C) Kvantifieringar av SYCP3-punkter per metafasceller. Kontroll, 10.00 ± 1.02; GSK923295, 9, 71 ± 0, 86, N = 7. (D) Kvantifieringarna av SYCP3 sträcker sig per cell i kontroll- och GSK923295 grupperna. Kontroll, 8,63 ± 0,22; GSK923295, 8,21 ± 0,21. N = 19. E) Analyser av avståndet mellan spindelstolpar i spermatocyterna i metafas I. Kontroll, 8,20 ± 0,28 μm; GSK923295, 9,30 ± 0,29 μm. N = 30. (F) Immunofluorescensbilder av sädesledarna i kontroll- och GSK923295 grupperna. Pilarna indikerar spermatocyterna. DAPI, grön; β-tubulin, grön. De förstorade bilderna av den streckade rutan visades i zoomen. För alla bilder, skalstapel, 10 μm. Elevens t-test. Felstaplar, medelvärde ± SEM. ns, P > 0,05; **, P < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Flödescytometrianalys av spermatogena celler i mustestiklar. (A) Schematiska illustrationer av de viktigaste stegen i cellcykelanalys av spermatogena celler från möss. De diploida spermatocyterna genomgår meios I och II för att bilda de haploida spermatiderna. C-värdet anger DNA-innehållet. N-värdet (ploidi) anger antalet uppsättningar kromosomer. (B,C) Flödescytometrianalys av de spermatogena cellerna i kontrollgruppen (B) och den GSK923295 gruppen (C). För CENP-E-hämning in vivo injicerades GSK923295 i 3 veckor gamla ICR-mustestiklar hos hanar vid en slutlig koncentration vid 10 μM i 4 dagar. För cellcykelanalys mättes och analyserades n = 3 000 celler. P4, de haploida cellerna (1C). P5, de diploida cellerna (2C). P6, tetraploida celler (4C). d) Förhållanden mellan de haploida cellerna i kontrollgruppen och GSK923295 grupperna. Kontroll, 42,95 ± 1,09%; GSK923295, 38,26 ± 1,86%. N = 8. (E) Förhållanden mellan de diploida cellerna i kontrollgruppen och GSK923295 grupperna. Kontroll, 20,10 ± 0,91%; GSK923295, 17,95 ± 0,81%. N = 8. (F) Förhållanden mellan de aneuploida cellerna (2C ~ 4C) i kontroll- och GSK923295 grupperna. Kontroll, 3,41 ± 0,23%; GSK923295, 3,39 ± 0,25%. N = 8. g) Förhållanden mellan de tetraploida cellerna i kontrollgruppen och GSK923295 grupperna. Kontroll, 17,76 ± 1,52%; GSK923295, 28,88 ± 2,05%. N = 8. För alla grafer, Elevens inte test. Felstaplar, medelvärde ± SEM. ns, P > 0,05; *, P < 0,05; , P < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Elektronmikroskopianalys av de spermatogena cellerna i kontroll- och GSK923295 gruppen . a) Representativa bilder av sädesledarna i kontrollgruppen. Skalstång, 5 μm. (B) Den förstorade bilden av spermatocytkärnan. Pilarna indikerar homologt kromatin av spermatocyterna. Skalstapel, 1 μm. (C) Den förstorade bilden av spermatocyternas cytoplasma. Skalstapel, 1 μm. (D) Representativa bilder av sädesledarna i GSK923295 gruppen. Testiklarna behandlades med 10 μM GSK923295 i 4 dagar. Skalstång, 5 μm. (E) Den förstorade bilden av spermatocytkärnan i GSK923295 gruppen. Skalstapel, 1 μm. (F) Den förstorade bilden av cytoplasman hos spermatocyterna i GSK923295-gruppen. Skalstång, 1 μm. För alla grafer, sc, spermatocyt; SD, spermatid. ER, endoplasmatisk retikulum; MT, Mitokondrier. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie har vi etablerat en in vivo CENP-E-hämningsmodell av mustestiklar med hjälp av bukkirurgi och mikroinjektion av GSK923295. Bukkirurgi och testikelinjektionsmetod som används i denna studie har följande fördelar. För det första är det inte begränsat till mössens ålder. Experimenter kan utföra testikelinjektion i ett tidigt skede, till exempel vid 3 veckor gamla eller yngre möss. För det andra har GSK923295 en specifik och utmärkt hämmande effekt på CENP-E. För det tredje är denna metod enkel att använda och mycket reproducerbar. Dessutom upprätthålls testiklarnas integritet, vilket är lämpligt för studier av intakta vävnader i organens sammanhang.
Det finns flera kritiska steg i detta protokoll. Det är till exempel viktigt att upprätthålla en steril miljö under bukkirurgi för att förebygga postoperativa infektioner31. För möss i olika åldrar eller olika försöksdjur bör dessutom injektionsmängderna justeras på lämpligt sätt beroende på testiklarnas storlek och läkemedlets effektivitet19,32. Dessutom krävs korrekt matsmältningstid och mikroskopisk observation för bestämning av enskilda celler och efterföljande cellpopulationstestning under flödescytometri. Det finns dock flera begränsningar i dessa protokoll. Det är svårt att använda bukkirurgi för att konstruera en musmodell när musens ålder är mindre än 2 veckor gammal. De främsta orsakerna är att mössen är för unga, den postoperativa kosten är svår och överlevnaden är låg. Läkemedlen som används i djurmodeller är flytande och har egenskaperna att lätt penetrera cellmembran 19,32,33, vilka är lämpliga för tillämpningar av denna administreringsmetod.
Att förstå meios stimuleras av in vitro-cellodling och genknockoutstudier, men det är inte lätt att tillämpa i spermatocyter hos däggdjur28. Hindret för de mekanistiska studierna av manlig meios har varit bristen på ett lämpligt system för manipulation och observation av delande spermatocyter i meios27. Musen är en utmärkt modellorganism i forskningen av cellulära och molekylära mekanismer för meios under spermatogenesen. Den första vågen av musspermatocyter startar meios vid dag 10 postpartum (dpp) och utvecklas till mogna spermier vid 35 dpp, vilket ger ett utvecklingstidsfönster för studier av meiotisk delning och spermatogenes34.
Testikelinjektion, inklusive direkt injektion genom pungen och mikroinjektion via bukkirurgi, är en användbar teknik för studier av spermatogenes35,36. Direkt injektion genom pungen är snabb och enkel och orsakar endast ett mindre kirurgiskt trauma, vilket är lämpligt för möss på 4 veckor eller äldre med testiklarna ner till pungen. Det är emellertid omöjligt att injicera de icke nedstigna testiklarna hos de 3 veckor gamla eller yngre mössen. Mikroinjektion genom intraperitoneal kirurgi eller skrotkirurgi är lämplig för injektion av icke nedstigna testiklar, vilket kräver skickliga kirurgiska färdigheter hos experimentella operatörer, ett stereomikroskop och kirurgisk och laboratorieutrustning. Enligt injektionsställena kan mikroinjektion klassificeras i seminiferös tubuliinjektion, testikelnätinjektion och testikelinterstitiell injektion. Jämfört med andra injektionsbaserade testikelmodeller kan injektion av hämmare genom bukkirurgi effektivt hämma proteinernas funktioner och ha fördelarna i cellmembranpenetration, enkla procedurer och långvarig hämning19,32. Metoderna som använder siRNA, antisensoligonukleotider eller lentivirus har större begränsningar i låg penetrationseffektivitet hos cellmembran, biverkningar utanför målet och lätt nedbrytning av siRNA eller oligonukleotider in vivo37,38,39,40.
Den meiotiska uppdelningen i levande vävnader är mer komplex än den under odlingsförhållanden, där vävnadsarkitekturen, utvecklingssignaleringen och miljöfaktorer in vivo bör beaktas41. Tidigare studier har visat att odlingsmedier och cellautonoma faktorer är avgörande för stimulering av uppkomsten av meiotisk delningsfas. Till exempel främjar fosfatashämmaren okadasyra (OA)42, spermatocytspecifik histon HIST1H1T 43, topoisomeras II44 och metafasfrämjande faktor (MPF)45 G2 / MI-övergången i odlade spermatocyter. Dessa komplexa odlingsförhållanden och faktorer bidrar till begränsningarna av kortvarig odling av spermatocyter.
Direkt injektion av plasmid-DNA i testiklar tillämpas framgångsrikt i testikelmedierad genöverföring och produktion av transgena möss32,46. In vivo-elektroporeringen involverar injektion av en DNA-uttrycksplasmid i lumen av seminiferösa tubuli och använder sedan en serie elektriska pulser för att ändra cellmembranpermeabilitet, förbättra effektiviteten av transgenuttryck och genetisk modifiering 45,46,47,48,49. Vår metod kan kombineras med in vivo-elektroporering, såväl som fluorescerande märkta proteiner och genredigeringsverktyg, vilket gör detta tillvägagångssätt mer kraftfullt för analyser av manlig meiotisk delning i det fysiologiska sammanhanget av vävnader och organ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar alla medlemmar i Cytoskeleton Laboratory vid Fujian Medical University för hjälpsamma diskussioner. Vi tackar Jun-Jin Lin på Public Technology Service Center, Fujian Medical University för teknisk hjälp inom flödescytometri. Vi tackar Ming-Xia Wu och Lin-Ying Zhou vid Electron Microscopy Lab of Public Technology Service Center, Fujian Medical University för teknisk hjälp inom elektronmikroskopi. Vi tackar Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke och Jun Song på Experimental Teaching Center of Basic Medical Sciences vid Fujian Medical University för deras stöd. Denna studie stöddes av följande bidrag: National Natural Science Foundation of China (bidragsnummer 82001608), Natural Science Foundation of Fujian-provinsen, Kina (bidragsnummer 2019J05071), Fujian Provincial Health Technology Project (bidragsnummer 2018-1-69), Startup Fund for Scientific Research, Fujian Medical University (bidragsnummer 2017XQ1001), Fujian Medical University high level talents scientific research start-up funding project (bidragsnummer XRCZX2017025) och forskningsprojekt av online-utbildning och undervisning av doktorander i kinesisk medicin (bidragsnummer B-YXC20200202-06).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 1 ml Syringe | Several commercial brands available | Sterile. | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430828 | |
| 6 cm Petri dish | Corning | 430166 | |
| 95% Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009164 | |
| tubulin rabbit polyclonal antibody | Beyotime | AF0001 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibody | Abcam | ab267372 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibody | Sangon Biotech | D110022 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab175191 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | 188105 | |
| Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibody | Beyotime | A0423 | Sencodary antibody. Use at 1:500. |
| Aluminium potassium sulphate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10001060 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 100092690 | |
| Anti-fade mounting medium | Beyotime | P0131 | Prevent photobleching of flourescent signals. |
| BD FACS Canto II | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69003435 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424BK745380 | |
| Chloral hydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80037516 | |
| Citric acid | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 122670 | |
| Collagenase | Sangon Biotech | A004194-0100 | |
| Coverslips | CITOTEST | 10212020C | 20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm. |
| DAPI | Beyotime | C1006 | |
| Dye vat | Several commercial brands available | 91347802 | |
| Eosin Y, alcohol soluble | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71014460 | |
| Ether | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009318 | |
| Formaldehyde - aqueous solution | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10010018 | |
| GSK923295 | MedChemExpress | HY-10299 | |
| Hematoxylin, anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71020784 | |
| ICR mouse | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd | ||
| Image J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | Fluorescent image analysis. |
| Leica ultramicrotome | Leica | ||
| Leica EM UC-7 ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Modfit MFLT32 | Verity Software House | For analysis of flow cytometry results. | |
| Nail polish | Several commercial brands available | ||
| Neutral gum | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10004160 | |
| Nikon Ti-S2 microscope | Nikon | Ti-S2 | |
| Picric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | J60807 | |
| Rheodyne | Sangon Biotech | F519160-0001 | 10 μl rheodyne |
| Sliced paraffin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69019461 | |
| Sodium iodate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80117214 | |
| Surgical instruments | Several commercial brands available | For abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min. | |
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 173970 | |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30188928 | Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution. |
| Tween 20 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30189328 | Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution. |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80096618 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10023418 |
References
- Lenormand, T., Engelstädter, J., Johnston, S. E., Wijnker, E., Haag, C. R.
- Brandeis, M. New-age ideas about age-old sex: separating meiosis from mating could solve a century-old conundrum. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 93 (2), 801-810 (2018).
- Lane, S., Kauppi, L. Meiotic spindle assembly checkpoint and aneuploidy in males versus females. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 76 (6), 1135-1150 (2019).
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nature Reviews Genetics. 11 (2), 124-136 (2010).
- Miller, M. P., Amon, A., Ünal, E. Meiosis I: when chromosomes undergo extreme makeover. Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 687-696 (2013).
- Duro, E., Marston, A. L. From equator to pole: splitting chromosomes in mitosis and meiosis. Genes & Development. 29 (2), 109-122 (2015).
- Eaker, S., Pyle, A., Cobb, J., Handel, M. A. Evidence for meiotic spindle checkpoint from analysis of spermatocytes from Robertsonian-chromosome heterozygous mice. Journal of Cell Science. 114, Pt 16 2953-2965 (2001).
- Faisal, I., Kauppi, L. Reduced MAD2 levels dampen the apoptotic response to non-exchange sex chromosomes and lead to sperm aneuploidy. Development. 144 (11), 1988-1996 (2017).
- Bolcun-Filas, E., Handel, M. A.
- Lawrence, C. J., et al.
- Cross, R. A., McAinsh, A. Prime movers: the mechanochemistry of mitotic kinesins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 257-271 (2014).
- Camlin, N. J., McLaughlin, E. A., Holt, J. E. Motoring through: the role of kinesin superfamily proteins in female meiosis. Human Reproduction Update. 23 (4), 409-420 (2017).
- Yen, T. J., Li, G., Schaar, B. T., Szilak, I., Cleveland, D. W. CENP-E is a putative kinetochore motor that accumulates just before mitosis. Nature. 359 (6395), 536-539 (1992).
- Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
- Abrieu, A., Kahana, J. A., Wood, K. W., Cleveland, D. W. CENP-E as an essential component of the mitotic checkpoint in vitro. Cell. 102 (6), 817-826 (2000).
- Mao, Y., Desai, A., Cleveland, D. W. Microtubule capture by CENP-E silences BubR1-dependent mitotic checkpoint signaling. The Journal of Cell Biology. 170 (6), 873-880 (2005).
- Gudimchuk, N., et al. Kinetochore kinesin CENP-E is a processive bi-directional tracker of dynamic microtubule tips. Nature Cell Biology. 15 (9), 1079-1088 (2013).
- Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
- She, Z. Y., et al. Kinesin-7 CENP-E regulates chromosome alignment and genome stability of spermatogenic cells. Cell Death Discovery. 6, 25 (2020).
- Parra, M. T., et al. Sequential assembly of centromeric proteins in male mouse meiosis. PLoS Genetics. 5 (3), 1000417 (2009).
- Parra, M. T., et al. Expression and behaviour of CENP-E at kinetochores during mouse spermatogenesis. Chromosoma. 111 (1), 53-61 (2002).
- Duesbery, N. S., et al. CENP-E is an essential kinetochore motor in maturing oocytes and is masked during mos-dependent, cell cycle arrest at metaphase II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (17), 9165-9170 (1997).
- Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
- Parks, J. E., Lee, D. R., Huang, S., Kaproth, M. T.
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
- Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. Journal of Andrology. 22 (6), 911-926 (2001).
- Handel, M. A., Caldwell, K. A., Wiltshire, T. Culture of pachytene spermatocytes for analysis of meiosis. Developmental Genetics. 16 (2), 128-139 (1995).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods in Molecular Biology. 558, 279-297 (2009).
- Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
- Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
- Nam, D., Sershon, R. A., Levine, B. R., Della Valle, C. J. The use of closed incision negative-pressure wound therapy in orthopaedic surgery. Journal of the American Academy Orthopaedic Surgeons. 26 (9), 295-302 (2018).
- She, Z. Y., et al. Kinesin-5 Eg5 is essential for spindle assembly and chromosome alignment of mouse spermatocytes. Cell Division. 15, 6 (2020).
- She, Z. Y., et al. Kinesin-6 family motor KIF20A regulates central spindle assembly and acrosome biogenesis in mouse spermatogenesis. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1867 (4), 118636 (2020).
- Wellard, S. R., Hopkins, J., Jordan, P. W. A seminiferous tubule squash technique for the cytological analysis of spermatogenesis using the mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56453 (2018).
- Sato, M., Ishikawa, A., Kimura, M. Direct injection of foreign DNA into mouse testis as a possible in vivo gene transfer system via epididymal spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (1), 49-56 (2002).
- Coward, K., et al. Expression of a fluorescent recombinant form of sperm protein phospholipase C zeta in mouse epididymal sperm by in vivo gene transfer into the testis. Fertility and Sterility. 85, 1281-1289 (2006).
- Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
- Zhao, H. T., et al. LRRK2 antisense oligonucleotides ameliorate α-Synuclein inclusion formation in a Parkinson's Disease mouse model. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 8, 508-519 (2017).
- Shahzad, K., et al. CHOP-ASO Ameliorates Glomerular and Tubular Damage on Top of ACE Inhibition in Diabetic Kidney Disease. Journal of the American Society of Nephrology. 3, 2021040431 (2021).
- Kang, K., Niu, B., Wu, C., Hua, J., Wu, J. The construction and application of lentiviral overexpression vector of goat miR-204 in testis. Research in Veterinary Science. 130, 52-58 (2020).
- Karabasheva, D., Smyth, J. T. Preparation of Drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60961 (2020).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).
- Cobb, J., Cargile, B., Handel, M. A. Acquisition of competence to condense metaphase I chromosomes during spermatogenesis. Developmental Biology. 205 (1), 49-64 (1999).
- Cobb, J., Reddy, R. K., Park, C., Handel, M. A. Analysis of expression and function of topoisomerase I and II during meiosis in male mice. Molecular Reproduction and Development. 46 (4), 489-498 (1997).
- Inselman, A., Handel, M. A. Mitogen-activated protein kinase dynamics during the meiotic G2/MI transition of mouse spermatocytes. Biology of Reproduction. 71 (2), 570-578 (2004).
- Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer. Biochemical and Biophysical Research Communications. 233 (1), 45-49 (1997).
- Yamazaki, Y., et al. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells by deoxyribonucleic acid injection into seminiferous tubules and subsequent electroporation. Biology of Reproduction. 59 (6), 1439-1444 (1998).
- Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a marker. The Journal of Experimental Zoology. 286 (2), 212-218 (2000).
- Coward, K., Kubota, H., Parrington, J. In vivo gene transfer into testis and sperm: developments and future application. Archives of Andrology. 53 (4), 187-197 (2007).
