Summary
Este artigo relata uma inibição in vivo do CENP-E através de cirurgia abdominal e injeção testicular de GSK923295, um modelo valioso para a divisão meiótica masculina. Usando os ensaios de imunofluorescência, citometria de fluxo e microscopia eletrônica de transmissão, mostramos que a inibição do CENP-E resulta em desalinhamento cromossômico e instabilidade do genoma em espermatócitos de camundongos.
Abstract
Em eucariotos, a meiose é essencial para a estabilidade do genoma e diversidade genética na reprodução sexuada. Análises experimentais de espermatócitos em testículos são críticas para as investigações da montagem do fuso e segregação cromossômica na divisão meiótica masculina. O espermatócito de camundongo é um modelo ideal para estudos mecanísticos da meiose, no entanto, faltam métodos efetivos para a análise de espermatócitos. Neste artigo, um método prático e eficiente para a inibição in vivo da cinesina-7 CENP-E em espermatócitos de camundongos é relatado. Um procedimento detalhado para injeção testicular de um inibidor específico GSK923295 através de cirurgia abdominal em camundongos de 3 semanas de idade é apresentado. Além disso, é descrita uma série de protocolos para coleta e fixação de tecidos, coloração hematoxilina-eosina, imunofluorescência, citometria de fluxo e microscopia eletrônica de transmissão. Apresentamos aqui um modelo de inibição in vivo via cirurgia abdominal e injeção testicular, que poderia ser uma técnica poderosa para estudar a meiose masculina. Também demonstramos que a inibição do CENP-E resulta em desalinhamento cromossômico e parada metafásica em espermatócitos primários durante a meiose I. Nosso método de inibição in vivo facilitará estudos mecanísticos da meiose, servirá como um método útil para modificações genéticas de linhagens germinativas masculinas e lançará uma luz sobre futuras aplicações clínicas.
Introduction
A meiose é um dos eventos evolutivos conservados mais importantes, altamente rígidos, em organismos eucarióticos, sendo essencial para a gametogênese, reprodução sexuada, integridade do genoma e diversidade genética 1,2,3. Em mamíferos, as células germinativas sofrem duas divisões celulares sucessivas, meiose I e II, após uma única rodada de replicação do DNA. Ao contrário das cromátides irmãs na mitose, cromossomos homólogos duplicados se emparelham e segregam em duas células filhas durante a meiose I 4,5. Na meiose II, cromátides irmãs se separam e segregam para formar gametas haploides sem replicação do DNA6. Erros em qualquer uma das duas divisões meióticas, incluindo defeitos na montagem do fuso e má segregação cromossômica, podem resultar em perda de gametas, esterilidade ou síndromes aneuploidias7,8,9.
Estudos acumulados têm demonstrado que os motores da família das cinesinas desempenham um papel crucial na regulação do alinhamento e segregação cromossômica, montagem do fuso, citocinese e progressão do ciclo celular em células mitóticas e meióticas10,11,12. A cinesina-7 CENP-E (proteína E do centrômero) é um motor de cinetócoro direcionado para a extremidade superior necessário para o congresso cromossômico, transporte e alinhamento cromossômico e regulação do ponto de verificação da montagem do fuso na mitose 13,14,15,16,17,18. Durante a meiose, a inibição do CENP-E pelo GSK923295 inibidor específico leva à parada do ciclo celular, desalinhamento cromossômico, desorganização do fuso e instabilidade do genoma das células espermatogênicas19. Os padrões de localização e a dinâmica do CENP-E nos centrômeros dos espermatócitos em divisão indicam que o CENP-E interage com proteínas cinetocoras para a montagem sequencial de centrômeros durante a meiose I20,21. Nos ovócitos, o CENP-E é necessário para o alinhamento cromossômico e a completação da meiose I13,22,23. A injeção de anticorpos ou morfolinos do CENP-E resulta em cromossomos desalinhados, orientação anormal do cinetócoro e parada da meiose I em ovócitos de camundongos e Drosophila 23. Em comparação com os papéis essenciais do CENP-E na mitose, as funções e mecanismos do CENP-E na meiose permanecem em grande parte desconhecidos. Mecanismos detalhados do CENP-E no congresso cromossômico e na estabilidade do genoma em células meióticas masculinas ainda precisam ser esclarecidos.
A espermatogênese é um processo fisiológico complexo e duradouro, envolvendo proliferação sequencial de espermatogônias, meiose e espermiogênese. Portanto, todo o processo é extraordinariamente difícil de ser reproduzido in vitro em mamíferos e outras espécies24,25. É impossível induzir a diferenciação dos espermatócitos após o estágio de paquiteno in vitro. Estudos sobre divisões meióticas masculinas têm sido geralmente limitados a análises experimentais de prófase meiótica inicial25,26. Apesar de muitos esforços tecnológicos, incluindo cultura de espermatócitos em curto prazo27,28 e métodos de cultura de órgãos25, existem poucos métodos eficazes para estudar a divisão meiótica masculina. Além disso, a deleção genética de genes essenciais geralmente resulta em parada do desenvolvimento e letalidade embrionária. Por exemplo, embriões de camundongos sem CENP-E não conseguem se implantar e não podem desenvolver implantação passada29, o que é um obstáculo nos estudos mecanísticos do CENP-E na meiose. Em conjunto, o estabelecimento de um sistema prático e viável para estudar a divisão meiótica masculina pode promover grandemente o campo de pesquisa da meiose.
O inibidor permeável a pequenas células é uma poderosa ferramenta para estudar motores de cinesina em processos de divisão celular e desenvolvimento. O inibidor alostérico, GSK923295, liga-se especificamente ao domínio motor do CENP-E, bloqueia a liberação de ADP (adenosina difosfato) e, finalmente, estabiliza as interações entre o CENP-E e os microtúbulos30. Neste estudo, um modelo de inibição in vivo em camundongos é apresentado através de cirurgia abdominal e injeção testicular de GSK923295. A inibição do CENP-E resulta em desalinhamento cromossômico na metáfase I dos espermatócitos primários. Além disso, a inibição do CENP-E leva à parada meiótica dos espermatócitos e à interrupção da espermatogênese. Uma série de protocolos é descrita para a análise de espermatócitos e pode ser aplicada para observar microtúbulos fusiformes meióticos, cromossomos homólogos e organelas subcelulares em espermatócitos. Nosso método de inibição in vivo é um método eficaz para os estudos da divisão meiótica e espermatogênese.
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Fujian Medical University (Protocolo número SYXK 2016-0007). Todos os experimentos com camundongos foram realizados de acordo com as diretrizes relevantes do Care and Use of Laboratory Animals do National Institutes of Health (NIH publications number 8023, revised 1978).
1. Construção de modelos de camundongos inibidores do CENP-E mediados por GSK923295
- Esterilizar os instrumentos cirúrgicos a 121 °C por 30 min. Irradiar a bancada cirúrgica ultralimpa com C ultravioleta (UVC) por 2 h. Pesar os camundongos machos de 3 semanas de idade ICR (Institute of Cancer Research) usados para os experimentos e calcular as doses de anestésico necessárias.
- Anestesiar camundongos administrando uma combinação de cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) por injeção intraperitoneal. Verifique a profundidade da anestesia dos ratos através de uma combinação de reflexo corneano de camundongo, reflexo nociceptivo, respiração, bem como tônus muscular. Confirme se os ratos estão profundamente anestesiados.
OBS: Coloque o animal em uma almofada de aquecimento para fornecer suporte térmico durante a cirurgia. - Amarre os membros do rato e fixe-os na bandeja de cera. Coloque uma gota de pomada veterinária nos olhos do rato para evitar o ressecamento enquanto estiver sob anestesia. Faça a barba dos pelos abdominais do camundongo do abdome inferior até o escroto usando uma navalha animal experimental. Fixar a área cirúrgica com um campo estéril.
- Desinfetar o abdome ventral com uma esfoliação de Betadine seguida de etanol 75% três vezes. Abra a cavidade abdominal com bisturi estéril e faça uma abertura de <5 mm.
- Aperte a pele com pinças cirúrgicas estéreis e puxe o coxim adiposo epididimal com pinça dissecante estéril para localizar os testículos usando uma pinça estéril. Fixar o testículo com pinça estéril sob um estereoscópio e injetar lentamente 10 μL de GSK923295 nos túbulos seminíferos a uma concentração final de 10 μM usando 10 μL de reodyne30. Para a construção do grupo controle, injetar 10 μL de solução de DMSO (dimetil sulfóxido) a 1%/PBS (solução salina tamponada com fosfato).
NOTA: Conservar a solução GSK923295 a uma concentração de 10 mM a -80 °C. Dissolver 0,1 μL de 10 mM GSK923295 em 100 μL de solução de PBS para preparar os 10 μM de GSK923295 solução. - Empurre suavemente o testículo de volta para a cavidade abdominal com pinças cirúrgicas estéreis. Sutura separada do peritônio e da pele com dois a quatro pontos utilizando a linha de sutura com diâmetro de 0,1mm.
- Rotule um lugar de 3 x 3 mm no dorso do animal com um marcador permanente após a cirurgia abdominal, coloque o rato de volta à gaiola de alimentação e garanta um ambiente limpo e livre de patógenos com comida e água suficientes.
- Mantenha o ambiente em estado estéril através do ar filtrado, dos alimentos esterilizados e da água. Cuide do animal até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Para analgesia pós-operatória, administrar uma dose de buprenorfina (0,1 mg/kg) por via subcutânea a cada 12 h por 3 dias. Certifique-se de que o rato não é devolvido à companhia de outros animais até estar totalmente recuperado.
NOTA: Os camundongos recebem cuidados pós-operatórios e administram adequadamente a anestesia local da ferida usando lidocaína a 0,5% para reduzir a dor pós-operatória quando necessário.
2. Coloração hematoxilina-eosina (HE) e histopatologia
- Quatro dias após a cirurgia abdominal, eutanasiar os camundongos com CO 2 a uma taxa de fluxo de 2 L/min em uma câmara de CO2. Confirmar morte por luxação cervical como método confirmatório de eutanásia. Use tesoura cirúrgica para abrir o escroto e remover os testículos com pinças. Recolher testículos de ratinhos 4 dias após GSK923295 injeção e fixá-los em 30 ml de solução de formaldeído a 10% à temperatura ambiente durante 12 horas.
- Para desidratação do gradiente, incubar sequencialmente a amostra em 40 mL de etanol 70% por 1 h, em 40 mL de etanol 85% por 1 h, em 40 mL de etanol 95% por 1 h e em 40 mL de etanol 100% por 1 h.
- Incubar a amostra em 40 mL de xileno por 40 min e, em seguida, em 40 mL de parafina por 1 h a 65 °C. Coloque os lenços na parte inferior da caixa de incorporação. Adicione a parafina derretida na caixa de incorporação. Arrefecer os tecidos para solidificação completa a 4 °C durante 6 h.
- Fixar as amostras no suporte do ultramicrótomo, manter o ângulo entre as amostras e a superfície da faca em 5-10° e ajustar a espessura do corte para 5 μm. Preparar as secções de 5 μm de espessura utilizando um ultramicrótomo, espalhar as lâminas em banho-maria a 40 °C e secar as secções num secador de lâminas durante 12 h a 37 °C.
- Incubar as lâminas em 200 mL de xileno por 40 min, em 200 mL de etanol 100% por 6 min, em 200 mL de etanol 95% por 2 min, em 200 mL de etanol 90% por 2 min, em 200 mL de etanol 80% por 2 min e em 200 mL de etanol 70% por 2 min, respectivamente.
- Enxaguar as lâminas em água destilada por 5 min e corá-las com a solução de hematoxilina de Mayer por 6 min à temperatura ambiente.
OBS: Solução de hematoxilina de Mayer: hematoxilina 0,011 mol/L, etanol anidro a 6,7%, sulfato de alumínio e potássio a 0,646 mol/L e iodato de sódio a 0,003 mol/L. - Enxaguar as lâminas em água corrente por 5 min e incubar com água destilada por 2 min.
- Incubar as lâminas em cloridrato de etanol a 1% por 3 s e, em seguida, enxaguar-as em água corrente por 2 min.
- Manchar a amostra com eosina a 1% por 15 s e, em seguida, incubá-la com etanol 95% por 5 s, com etanol 100% por 2 min e em xileno por 40 min.
- Sele as lâminas usando 15 μL de goma neutra e a lamínula de 24 x 50 mm.
3. Imunofluorescência e microscopia confocal
- Coletar as seções de parafina de 5 μm de espessura dos testículos de camundongos para imunofluorescência. Incubar as lâminas em xileno por 40 min, em etanol 100% por 6 min, em etanol 95% por 2 min, em etanol 90% por 2 min, em etanol 80% por 2 min e em etanol 70% por 2 min. Enxaguar as lâminas em água destilada por 5 min e enxaguar as lâminas com PBS 0,01 M por 5 min.
- Colocar as lâminas na solução de recuperação de antígeno (tampão citrato 0,01 M) e ferver sob alta pressão usando uma panela de pressão por 4 min para recuperação do antígeno. Resfriar as lâminas naturalmente à temperatura ambiente. Enxágue com água destilada por 5 min duas vezes e com PBS por 5 min.
NOTA: Tampão citrato 0,01 M (pH 6,0): 2,1 mmol/L de ácido cítrico, 11,6 mmol/L de citrato trissódico di-hidratado. - Permeabilizar as células incubando as lâminas em 500 μL de TritonX-100/PBS a 0,25% por 10 min. Enxágue as lâminas com PBS por 5 min três vezes.
- Para bloqueio antigênico, incubar as amostras com 300 μL de albumina de soro bovino (BSA) a 3%/PBST (0,1% Tween-20 em PBS) por 1 h. Incubar as amostras com os anticorpos primários em BSA/PBST a 3% durante 16 h a 4 °C. Coloque as lâminas em uma caixa umidificada para evitar que os tecidos sequem. Reaqueça as lâminas naturalmente à temperatura ambiente por 30 min.
- Descarte o anticorpo primário e, em seguida, enxágue as lâminas em PBST por 5 min três vezes. Diluir anticorpos secundários em BSA/PBST a 3%. Incubar as amostras com anticorpos secundários durante 1-2 h a 37 °C. Enxaguar as amostras em PBST por 5 min cinco vezes.
- Manchar os núcleos com 50 μL de 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) por 5 min à temperatura ambiente. Monte a lamínula com o meio de montagem anti-desbotamento e sele a lamínula com esmalte.
- Observe e registre sinais fluorescentes nas lâminas usando um microscópio fluorescente equipado com uma objetiva NA 40x/ 0,75.
4. Citometria de fluxo
- Coletar testículos de camundongos em placas de Petri de 6 cm e cortar os testículos em pedaços de 1 mm3 usando tesoura cirúrgica.
- Digerir os testículos usando 1 mL de colagenase a 1% em tubo centrífugo de 1,5 mL por 10 min a 37 °C e, em seguida, centrifugar as amostras a 1.000 x g por 5 min para precipitar as células espermatogênicas.
- Eliminar o sobrenadante e, em seguida, adicionar 1 ml de solução de tripsina-EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) a 0,25% durante 20 minutos a 37 °C e, em seguida, centrifugar as amostras a 1.000 x g durante 5 minutos.
- Eliminar o sobrenadante e, em seguida, incubar as células precipitadas com 1 mL de etanol gelado a 70% por mais de 8 h a 4 °C.
- Centrifugar as amostras a 1.000 x g por 5 min e, em seguida, coletar sedimentos celulares. Corar as células espermatogênicas com 500 μL de solução corada com iodeto de propídio (PI) (50 μg/mL PI, 100 μg/mL RNase A e 0,2% Triton X-100 em PBS) a 37 °C por 30 min.
NOTA: Agite suavemente o tubo da centrífuga a cada 5 minutos para evitar agregações celulares. - Filtre as amostras usando uma tela de malha 300 para se livrar de detritos celulares; recolher as células num tubo de fluxo e armazená-las a 4 °C.
- Detectar sinais de fluorescência e espalhamento de luz no comprimento de onda de excitação de 488 nm usando um citômetro de fluxo. Analise o conteúdo de DNA e espalhamento de luz usando o software Modfit MFLT32.
5. Microscopia eletrônica de transmissão
- Cortar os testículos em pedaços de 1 mm 3 usando o bisturi afiado e incubar rapidamente as amostras com solução de paraformaldeído a3 % de glutaraldeído a 1,5% em PBS 0,1 M (pH 7,2) por 4 h a 4 °C para evitar as alterações da ultraestrutura. Enxaguar as amostras com PBS 0,1 M por 5 min três vezes.
OBS: O bisturi e a tesoura devem ser afiados e tentar evitar apertos e puxadas artificiais. O processamento das amostras deve ser realizado no fluido de fixação. - Fixar as amostras em solução de ferrocianeto de potássio a 1% de ácido ósmico a 1,5% a 4 °C durante 1,5 horas. Secar a água com papel filtro e enxaguar as amostras com PBS 0,1 M por 5 min três vezes.
- Desidratar as amostras em 40 mL de etanol a 50% por 10 min a 4 °C. Incubar as amostras em 40 mL de etanol 70% de etanol saturado com acetato de urânio a 4 °C por 12 h, em 40 mL de etanol 90% por 10 min a 4 °C, em 40 mL de etanol-acetona a 90% por 10 min à temperatura ambiente e em 40 mL de acetona anidra por 10 min três vezes à temperatura ambiente.
- Incubar as amostras em mistura anidra de acetona-resina epóxi 618 (v / v = 1:1) durante 1,5 h e, em seguida, incluir as amostras em agentes incorporadores de resina epóxi 618 a 35 °C durante 3 horas.
- Para a polimerização da resina, incubar as amostras em agentes incorporadores de resina epóxi 618 a 35 °C por 12 h, a 45 °C por 12 h e, em seguida, a 60 °C por 24 h.
- Instale as amostras e a faca de vidro e, em seguida, ajuste as distâncias entre as amostras e a faca. Prepare as seções ultrafinas de 90 nm de espessura usando um micrótomo ultrafino. Corte as amostras a uma velocidade constante e, em seguida, coloque as lâminas em uma malha de níquel. Coloque as lâminas em uma placa de Petri à temperatura ambiente.
- Manchar as lâminas com acetato de uranila a 2% por 10 min e, em seguida, corar as amostras com citrato de chumbo a 2% por 10 min. Enxágue as lâminas com água destilada. Secar as lâminas por 24 h à temperatura ambiente.
- Observe as lâminas e registre imagens eletrônicas a 70-100 kV usando um microscópio eletrônico de transmissão.
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Representative Results
Construímos com sucesso um modelo in vivo de inibição do CENP-E de testículos de camundongos através de cirurgia abdominal e injeção testicular de GSK92329519. Os principais passos técnicos desse método foram mostrados na Figura 1. Após injeção testicular de GSK923295 por 4 dias, os testículos foram colhidos para análises posteriores. No grupo controle, a onda espermatogênica nos túbulos seminíferos era regular e organizada (Figura 2A). Entretanto, no grupo GSK923295, a onda espermatogênica estava alterada nos túbulos seminíferos, e os espermatócitos primários parados na metáfase estavam significativamente aumentados após a inibição do CENP-E (Figura 2B-D). É importante ressaltar que vários cromossomos homólogos não foram alinhados na placa equatorial após a inibição do CENP-E (Figura 2B-D). Além disso, a inibição do CENP-E também levou ao aumento de espermatócitos da metáfase I nos túbulos seminíferos (Figura 2E,F,G). Em conjunto, a inibição do CENP-E resulta em desalinhamento cromossômico nos espermatócitos primários durante a meiose I, o que sugere que o CENP-E é responsável pela congressação e alinhamento cromossômico dos espermatócitos na meiose.
Para validar ainda mais esses resultados, realizamos os ensaios de imunofluorescência para detectar as células espermatogênicas nos túbulos seminíferos. Observamos que a onda espermatogênica regular mostrada no grupo controle estava obviamente alterada e tornou-se irregular no grupo GSK923295 (Figura 3). O fuso meiótico dos espermatócitos em divisão foi marcado com anticorpo anti-α-tubulina, e o filamento transverso dos complexos sinaptonemais nos espermatócitos foi marcado com o anticorpo antiproteína do complexo sinaptonemal 3 (SYCP3) (Figura 3A). As células positivas para SYCP3 por túbulo seminífero diminuíram após a inibição do CENP-E (Figura 3B). Enquanto isso, os pontos SYCP3 por célula metafásica não foram interrompidos após a inibição do CENP-E (Figura 3C). Além disso, os estiramentos de SYCP3 por célula também não foram afetados nos grupos GSK92395 (Figura 3D). Surpreendentemente, observamos que as distâncias dos polos fusiformes nos espermatócitos da metáfase I estavam aumentadas após a inibição do CENP-E (Figura 3E,F). Esses resultados de imunofluorescência sugerem que o CENP-E é necessário para o desalinhamento cromossômico e os processos de espermatogênese, sendo indispensável para a manutenção do fuso bipolar e a organização do fuso meiótico.
Para investigar as populações celulares em testículos de camundongos, digerimos os testículos e realizamos ensaios de coloração de IP e citometria de fluxo (Figura 4). Os procedimentos técnicos importantes foram mostrados na Figura 4A-C. As células espermatogênicas consistem de várias populações celulares, incluindo espermatogônias, espermatócitos primários, espermatócitos secundários, espermátides e espermatozoides. O conteúdo de DNA dessas células espermatogênicas foi mostrado na Figura 4A. Demonstramos que a inibição do CENP-E resultou na diminuição das células haploides de 42,95 ± 1,09% no grupo controle para 38,26 ± 1,86% no grupo GSK923295 (Figura 4B-D). As proporções de células diploides e aneuploidias não foram influenciadas significativamente após a inibição do CENP-E (Figura 4E,F). Além disso, as proporções de células tetraploides aumentam de 17,76 ± 1,52% no grupo controle para 28,88 ± 2,05% no grupo GSK923295 (Figura 4G). Em conjunto, descobrimos que as populações celulares das células espermatogênicas são ligeiramente alteradas após a inibição do CENP-E. A inibição do CENP-E resulta na diminuição das células haploides e no aumento das células tetraploides, o que indica que a inibição do CENP-E está associada à parada metafásica nos espermatócitos em divisão.
Além disso, observamos a estrutura submicroscópica das células espermatogênicas utilizando microscopia eletrônica de transmissão (Figura 5). A organização da cromatina, o retículo endoplasmático e as mitocôndrias dos espermatócitos foram mostrados na Figura 5. Observamos que a organização das células espermatogênicas foi ligeiramente interrompida no grupo GSK923295 (Figura 5).
Figura 1: Estabelecimento de um modelo de inibição in vivo de testículos de camundongos através de cirurgia abdominal e administração testicular. (A) Todos os instrumentos cirúrgicos utilizados em cirurgia abdominal. 1) tesoura dissecante, 2) pinça de agulha, 3) pinça reta, 4) pinça, 5) reodina, 6) seringa de 1 mL, 7) bisturi com alça nº 3 e lâmina nº 11, 8) estilolita, 9) agulhas de costura redonda, 1/2 0,6 x 14 mm, 1/2 0,7 x 17 mm, 10) cotonetes de etanol. (B) Após a anestesia, os camundongos foram colocados em decúbito dorsal sobre uma bandeja de cera, o abdome inferior foi preparado e desinfetado com etanol 75%. (C) Uma abertura de <5 mm foi feita no meio do abdome inferior. (D) O coxim adiposo epididimal foi tracionado com pinça dissecante estéril para localização dos testículos. O testículo foi injetado com 10 μL GSK923295 usando um reodino de 10 μL. (E) O peritônio e a pele foram suturados simultaneamente com dois pontos. (F) A ferida foi desinfetada com etanol 75%. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A inibição do CENP-E resultou na parada da meiose I e desalinhamento cromossômico em espermatócitos de camundongos . (A) Coloração HE das células espermatogênicas do grupo controle. As setas indicam os espermatócitos. (B) Coloração HE das células espermatogênicas do grupo GSK923295. Os testículos foram injetados com GSK923295 por 4 dias na concentração final de 10 μM. As setas indicam desalinhamento cromossômico nos espermatócitos. Para todas as imagens, barra de escala, 10 μm. (C) Proporção de espermatócitos metafásicos em túbulos seminíferos. Controle, 13,43 ± 1,68%; GSK923295, 42,29 ± 3,94%. N = 1308 células foram analisadas. Grupo = 4. Teste t de Student. Barras de erro, significa ± SEM. ***, P < 0,001 . (D) Proporção de túbulos seminíferos com espermatócitos em divisão. Controle, 5,38 ± 2,64%; GSK923295, 33,96 ± 3,87%. N = 151 túbulos seminíferos foram analisados. Grupo = 4. (E) Imagens de imunofluorescência de histona H3 (fosfo Ser 10) e TUBA4A nos grupos controle e GSK923295. TUBA4A, vermelho; Histone H3 (fosfo Ser 10), verde; DAPI, azul. Barra de escala, 10 μm. A caixa ampliada é ampliada. (F) A quantificação do número de células metafásicas nos túbulos seminíferos. Controle, 11,45 ± 1,55; GSK923295, 18,91 ± 2,36. N = 11. (G,H) Análise linear das intensidades fluorescentes de histona H3 e TUBA4A em espermatócitos de metáfase I do grupo controle (G) e do grupo GSK923295 (H). TUBA4A, vermelho; Histone H3 (fosfo Ser 10), verde; DAPI, azul. O eixo X indica a distância relativa. O eixo Y indica intensidades fluorescentes. Teste t de Student. Barras de erro, média ± MEV. *, P < 0,05 ; ***, P < 0,001 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: A inibição do CENP-E pelo GSK923295 levou à desorganização dos túbulos seminíferos e à ruptura da espermatogênese . (A) Imagens representativas de imunofluorescência de SYCP3 e TUBA4A nos grupos controle e GSK923295. SYCP3, vermelho; TUBA4A, verde; DAPI, azul. Barra de escala, 10 μm. (B) Células positivas para SYCP3 por túbulos seminíferos nos grupos controle e GSK923295. Controle, 56,00 ± 5,43%; GSK923295, 39,00 ± 1,73%. N = 10. (C) As quantificações de pontos SYCP3 por células metafásicas. Controle, 10,00 ± 1,02; GSK923295, 9,71 ± 0,86, N = 7. (D) As quantificações de estiramentos de SYCP3 por célula nos grupos controle e GSK923295. Controle, 8,63 ± 0,22; GSK923295, 8,21 ± 0,21. N = 19. (E) As análises da distância dos polos fusiformes nos espermatócitos da metáfase I. Controle, 8,20 ± 0,28 μm; GSK923295, 9,30 ± 0,29 μm. N = 30. (F) Imagens de imunofluorescência dos túbulos seminíferos nos grupos controle e GSK923295. As setas indicam os espermatócitos. DAPI, verde; β-tubulina, verde. As imagens ampliadas da caixa tracejada foram mostradas no zoom. Para todas as imagens, barra de escala, 10 μm. Teste t de Student. Barras de erro, média ± SEM.ns, P > 0,05 ; **, P < 0,01 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise por citometria de fluxo de células espermatogênicas em testículos de camundongos . (A) Ilustrações esquemáticas das principais etapas da análise do ciclo celular de células espermatogênicas de camundongos. Os espermatócitos diploides sofrem meiose I e II para formar as espermátides haploides. O valor de C indica o conteúdo de DNA. O valor de N (ploidia) indica o número de conjuntos de cromossomos. (B,C) Análise por citometria de fluxo das células espermatogênicas do grupo controle (B) e do grupo GSK923295 (C). Para inibição in vivo do CENP-E, GSK923295 foi injetado em testículos de camundongos ICR machos com 3 semanas de idade em uma concentração final de 10 μM por 4 dias. Para a análise do ciclo celular, n = 3.000 células foram medidas e analisadas. P4, as células haploides (1C). P5, as células diploides (2C). P6, as células tetraploides (4C). (D) Proporções das células haploides nos grupos controle e GSK923295. Controle, 42,95 ± 1,09%; GSK923295, 38,26 ± 1,86%. N = 8. (E) Proporções das células diploides nos grupos controle e GSK923295. Controle, 20,10 ± 0,91%; GSK923295, 17,95 ± 0,81%. N = 8. (F) Proporções das células aneuplóides (2C ~ 4C) nos grupos controle e GSK923295. Controle, 3,41 ± 0,23%; GSK923295, 3,39 ± 0,25%. N = 8. (G) Proporções das células tetraploides nos grupos controle e GSK923295. Controle, 17,76 ± 1,52%; GSK923295, 28,88 ± 2,05%. N = 8. Para todos os gráficos, teste t de Student. Barras de erro, média ± SEM.ns, P > 0,05; *, P < 0,05; , P < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Análise por microscopia eletrônica das células espermatogênicas do grupo controle e GSK923295 . (A) Imagens representativas dos túbulos seminíferos no grupo controle. Barra de escala, 5 μm. (B) A imagem ampliada do núcleo do espermatócito. As setas indicam cromatina homóloga dos espermatócitos. Barra de escala, 1 μm. (C) Imagem ampliada do citoplasma dos espermatócitos. Barra de escala, 1 μm. (D) Imagens representativas dos túbulos seminíferos no grupo GSK923295. Os testículos foram tratados com 10 μM GSK923295 por 4 dias. Barra de escala, 5 μm. (E) Imagem ampliada do núcleo do espermatócito no grupo GSK923295. Barra de escala, 1 μm. (F) Imagem ampliada do citoplasma dos espermatócitos do grupo GSK923295. Barra de escala, 1 μm. Para todos os gráficos, sc, espermatócitos; sd, espermátida. RE, retículo endoplasmático; mt, mitocôndrias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste estudo, estabelecemos um modelo in vivo de inibição do CENP-E de testículos de camundongos usando a cirurgia abdominal e microinjeção de GSK923295. A cirurgia abdominal e o método de injeção testicular utilizados neste estudo apresentam as seguintes vantagens. Primeiro, não se limita à idade dos ratos. Os experimentadores podem realizar a injeção testicular em um estágio inicial, por exemplo, em camundongos de 3 semanas de idade ou mais jovens. Em segundo lugar, GSK923295 tem um efeito inibitório específico e excelente sobre o CENP-E. Terceiro, este método é simples de operar e altamente reprodutível. Além disso, a integridade dos testículos é mantida, o que é adequado para os estudos de tecidos intactos no contexto dos órgãos.
Há várias etapas críticas neste protocolo. Por exemplo, é importante manter um ambiente estéril durante a cirurgia abdominal para a prevenção de infecções pós-operatórias31. Além disso, para camundongos de diferentes idades ou diferentes animais experimentais, as quantidades de injeção devem ser ajustadas adequadamente de acordo com o tamanho dos testículos e a eficácia dos fármacos19,32. Além disso, o tempo de digestão adequado e a observação microscópica são necessários para a determinação de células únicas e subsequentes testes de população celular durante a citometria de fluxo. No entanto, existem várias limitações nesses protocolos. É difícil usar a cirurgia abdominal para construir um modelo de camundongo quando a idade do camundongo é inferior a 2 semanas. As principais razões são que os camundongos são muito jovens, a dieta pós-operatória é difícil e a taxa de sobrevivência é baixa. Os fármacos utilizados em modelos animais são líquidos e possuem características de fácil penetração nas membranas celulares 19,32,33, sendo adequados para as aplicações desse método de administração.
O entendimento da meiose é estimulado por cultura celular in vitro e estudos de knockout gênico, porém não é facilmente aplicável em espermatócitos de mamíferos28. O obstáculo para os estudos mecanísticos da meiose masculina tem sido a falta de um sistema adequado para manipulação e observação dos espermatócitos em divisão na meiose27. O camundongo é um excelente organismo modelo na pesquisa de mecanismos celulares e moleculares de meiose durante a espermatogênese. A primeira onda de espermatócitos de camundongos inicia a meiose no 10º dia pós-parto (dpp) e se desenvolve em espermatozoides maduros a 35 dpp, o que fornece uma janela de tempo de desenvolvimento para os estudos da divisão meiótica e da espermatogênese34.
A injeção testicular, incluindo injeção direta através do escroto e microinjeção via cirurgia abdominal, é uma técnica útil para os estudos da espermatogênese35,36. A injeção direta através do escroto é rápida e simples, e causa apenas um pequeno trauma cirúrgico, que é adequado para camundongos de 4 semanas de idade ou mais com os testículos descendo para o escroto. No entanto, é impossível injetar o testículo não descido dos ratos de 3 semanas ou mais jovens. A microinjeção através da cirurgia intraperitoneal ou cirurgia escrotal é adequada para a injeção de testículos não descidos, o que requer habilidades cirúrgicas proficientes de operadores experimentais, um estereomicroscópio e o equipamento cirúrgico e de laboratório. De acordo com os locais de injeção, a microinjeção pode ser classificada em injeção de túbulo seminífero, injeção de rede testicular e injeção intersticial testicular. Comparada a outros modelos de injeção testicular, a injeção de inibidores por meio de cirurgia abdominal pode inibir efetivamente as funções das proteínas e ter vantagens na penetração da membrana celular, facilidade de procedimentos e inibição a longo prazo19,32. Os métodos que utilizam siRNAs, oligonucleotídeos antisense ou lentivírus apresentam maiores limitações na baixa eficiência de penetração das membranas celulares, efeitos colaterais fora do alvo e fácil degradação de siRNA ou oligonucleotídeos in vivo37,38,39,40.
A divisão meiótica em tecidos vivos é mais complexa do que em condições de cultura, nas quais a arquitetura tecidual, a sinalização de desenvolvimento e os fatores ambientais in vivo devem ser levados em consideração41. Estudos prévios demonstraram que os meios de cultura e os fatores autônomos celulares são cruciais para a estimulação do início da fase de divisão meiótica. Por exemplo, o inibidor de fosfatase ácido ocadaico (OA)42, histona específica de espermatócito HIST1H1T43, topoisomerase II44 e fator promotor de metáfase (MPF)45 promovem a transição G2/MI em espermatócitos cultivados. Essas complexas condições e fatores de cultivo contribuem para as limitações do cultivo de espermatócitos em curto prazo.
A injeção direta de DNA plasmidial nos testículos é aplicada com sucesso na transferência gênica mediada pelo testículo e na produção de camundongos transgênicos32,46. A eletroporação in vivo envolve a injeção de um plasmídeo de expressão de DNA no lúmen dos túbulos seminíferos e, em seguida, utiliza uma série de pulsos elétricos para alterar a permeabilidade da membrana celular, melhorar a eficiência da expressão transgênica e modificação genética 45,46,47,48,49. Nosso método pode ser combinado com eletroporação in vivo, bem como proteínas marcadas fluorescentes e ferramentas de edição gênica, tornando esta abordagem mais poderosa para as análises da divisão meiótica masculina no contexto fisiológico de tecidos e órgãos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a todos os membros do Laboratório de Citoesqueleto da Fujian Medical University pelas discussões úteis. Agradecemos a Jun-Jin Lin, do Centro de Serviços de Tecnologia Pública da Fujian Medical University, pela assistência técnica em citometria de fluxo. Agradecemos a Ming-Xia Wu e Lin-Ying Zhou no Laboratório de Microscopia Eletrônica do Centro de Serviços de Tecnologia Pública da Fujian Medical University pelas assistências técnicas em microscopia eletrônica. Agradecemos a Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke, e Jun Song no Centro de Ensino Experimental de Ciências Médicas Básicas da Fujian Medical University por seus apoios. Este estudo foi apoiado pelas seguintes bolsas: Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (número de bolsa 82001608), Fundação de Ciências Naturais da Província de Fujian, China (número de bolsa 2019J05071), Projeto de Tecnologia de Saúde da Província de Fujian (número de bolsa 2018-1-69), Fundo de Startup para Pesquisa Científica, Universidade Médica de Fujian (número de bolsa 2017XQ1001), projeto de financiamento de start-up de pesquisa científica de talentos de alto nível da Fujian Medical University (número de bolsa XRCZX2017025) e projeto de pesquisa de educação on-line e ensino de estudantes de pós-graduação em medicina chinesa (bolsa número B-YXC20200202-06).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 1 ml Syringe | Several commercial brands available | Sterile. | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430828 | |
| 6 cm Petri dish | Corning | 430166 | |
| 95% Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009164 | |
| tubulin rabbit polyclonal antibody | Beyotime | AF0001 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibody | Abcam | ab267372 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibody | Sangon Biotech | D110022 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab175191 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | 188105 | |
| Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibody | Beyotime | A0423 | Sencodary antibody. Use at 1:500. |
| Aluminium potassium sulphate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10001060 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 100092690 | |
| Anti-fade mounting medium | Beyotime | P0131 | Prevent photobleching of flourescent signals. |
| BD FACS Canto II | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69003435 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424BK745380 | |
| Chloral hydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80037516 | |
| Citric acid | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 122670 | |
| Collagenase | Sangon Biotech | A004194-0100 | |
| Coverslips | CITOTEST | 10212020C | 20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm. |
| DAPI | Beyotime | C1006 | |
| Dye vat | Several commercial brands available | 91347802 | |
| Eosin Y, alcohol soluble | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71014460 | |
| Ether | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009318 | |
| Formaldehyde - aqueous solution | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10010018 | |
| GSK923295 | MedChemExpress | HY-10299 | |
| Hematoxylin, anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71020784 | |
| ICR mouse | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd | ||
| Image J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | Fluorescent image analysis. |
| Leica ultramicrotome | Leica | ||
| Leica EM UC-7 ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Modfit MFLT32 | Verity Software House | For analysis of flow cytometry results. | |
| Nail polish | Several commercial brands available | ||
| Neutral gum | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10004160 | |
| Nikon Ti-S2 microscope | Nikon | Ti-S2 | |
| Picric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | J60807 | |
| Rheodyne | Sangon Biotech | F519160-0001 | 10 μl rheodyne |
| Sliced paraffin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69019461 | |
| Sodium iodate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80117214 | |
| Surgical instruments | Several commercial brands available | For abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min. | |
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 173970 | |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30188928 | Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution. |
| Tween 20 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30189328 | Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution. |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80096618 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10023418 |
References
- Lenormand, T., Engelstädter, J., Johnston, S. E., Wijnker, E., Haag, C. R.
- Brandeis, M. New-age ideas about age-old sex: separating meiosis from mating could solve a century-old conundrum. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 93 (2), 801-810 (2018).
- Lane, S., Kauppi, L. Meiotic spindle assembly checkpoint and aneuploidy in males versus females. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 76 (6), 1135-1150 (2019).
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nature Reviews Genetics. 11 (2), 124-136 (2010).
- Miller, M. P., Amon, A., Ünal, E. Meiosis I: when chromosomes undergo extreme makeover. Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 687-696 (2013).
- Duro, E., Marston, A. L. From equator to pole: splitting chromosomes in mitosis and meiosis. Genes & Development. 29 (2), 109-122 (2015).
- Eaker, S., Pyle, A., Cobb, J., Handel, M. A. Evidence for meiotic spindle checkpoint from analysis of spermatocytes from Robertsonian-chromosome heterozygous mice. Journal of Cell Science. 114, Pt 16 2953-2965 (2001).
- Faisal, I., Kauppi, L. Reduced MAD2 levels dampen the apoptotic response to non-exchange sex chromosomes and lead to sperm aneuploidy. Development. 144 (11), 1988-1996 (2017).
- Bolcun-Filas, E., Handel, M. A.
- Lawrence, C. J., et al.
- Cross, R. A., McAinsh, A. Prime movers: the mechanochemistry of mitotic kinesins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 257-271 (2014).
- Camlin, N. J., McLaughlin, E. A., Holt, J. E. Motoring through: the role of kinesin superfamily proteins in female meiosis. Human Reproduction Update. 23 (4), 409-420 (2017).
- Yen, T. J., Li, G., Schaar, B. T., Szilak, I., Cleveland, D. W. CENP-E is a putative kinetochore motor that accumulates just before mitosis. Nature. 359 (6395), 536-539 (1992).
- Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
- Abrieu, A., Kahana, J. A., Wood, K. W., Cleveland, D. W. CENP-E as an essential component of the mitotic checkpoint in vitro. Cell. 102 (6), 817-826 (2000).
- Mao, Y., Desai, A., Cleveland, D. W. Microtubule capture by CENP-E silences BubR1-dependent mitotic checkpoint signaling. The Journal of Cell Biology. 170 (6), 873-880 (2005).
- Gudimchuk, N., et al. Kinetochore kinesin CENP-E is a processive bi-directional tracker of dynamic microtubule tips. Nature Cell Biology. 15 (9), 1079-1088 (2013).
- Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
- She, Z. Y., et al. Kinesin-7 CENP-E regulates chromosome alignment and genome stability of spermatogenic cells. Cell Death Discovery. 6, 25 (2020).
- Parra, M. T., et al. Sequential assembly of centromeric proteins in male mouse meiosis. PLoS Genetics. 5 (3), 1000417 (2009).
- Parra, M. T., et al. Expression and behaviour of CENP-E at kinetochores during mouse spermatogenesis. Chromosoma. 111 (1), 53-61 (2002).
- Duesbery, N. S., et al. CENP-E is an essential kinetochore motor in maturing oocytes and is masked during mos-dependent, cell cycle arrest at metaphase II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (17), 9165-9170 (1997).
- Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
- Parks, J. E., Lee, D. R., Huang, S., Kaproth, M. T.
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
- Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. Journal of Andrology. 22 (6), 911-926 (2001).
- Handel, M. A., Caldwell, K. A., Wiltshire, T. Culture of pachytene spermatocytes for analysis of meiosis. Developmental Genetics. 16 (2), 128-139 (1995).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods in Molecular Biology. 558, 279-297 (2009).
- Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
- Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
- Nam, D., Sershon, R. A., Levine, B. R., Della Valle, C. J. The use of closed incision negative-pressure wound therapy in orthopaedic surgery. Journal of the American Academy Orthopaedic Surgeons. 26 (9), 295-302 (2018).
- She, Z. Y., et al. Kinesin-5 Eg5 is essential for spindle assembly and chromosome alignment of mouse spermatocytes. Cell Division. 15, 6 (2020).
- She, Z. Y., et al. Kinesin-6 family motor KIF20A regulates central spindle assembly and acrosome biogenesis in mouse spermatogenesis. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1867 (4), 118636 (2020).
- Wellard, S. R., Hopkins, J., Jordan, P. W. A seminiferous tubule squash technique for the cytological analysis of spermatogenesis using the mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56453 (2018).
- Sato, M., Ishikawa, A., Kimura, M. Direct injection of foreign DNA into mouse testis as a possible in vivo gene transfer system via epididymal spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (1), 49-56 (2002).
- Coward, K., et al. Expression of a fluorescent recombinant form of sperm protein phospholipase C zeta in mouse epididymal sperm by in vivo gene transfer into the testis. Fertility and Sterility. 85, 1281-1289 (2006).
- Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
- Zhao, H. T., et al. LRRK2 antisense oligonucleotides ameliorate α-Synuclein inclusion formation in a Parkinson's Disease mouse model. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 8, 508-519 (2017).
- Shahzad, K., et al. CHOP-ASO Ameliorates Glomerular and Tubular Damage on Top of ACE Inhibition in Diabetic Kidney Disease. Journal of the American Society of Nephrology. 3, 2021040431 (2021).
- Kang, K., Niu, B., Wu, C., Hua, J., Wu, J. The construction and application of lentiviral overexpression vector of goat miR-204 in testis. Research in Veterinary Science. 130, 52-58 (2020).
- Karabasheva, D., Smyth, J. T. Preparation of Drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60961 (2020).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).
- Cobb, J., Cargile, B., Handel, M. A. Acquisition of competence to condense metaphase I chromosomes during spermatogenesis. Developmental Biology. 205 (1), 49-64 (1999).
- Cobb, J., Reddy, R. K., Park, C., Handel, M. A. Analysis of expression and function of topoisomerase I and II during meiosis in male mice. Molecular Reproduction and Development. 46 (4), 489-498 (1997).
- Inselman, A., Handel, M. A. Mitogen-activated protein kinase dynamics during the meiotic G2/MI transition of mouse spermatocytes. Biology of Reproduction. 71 (2), 570-578 (2004).
- Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer. Biochemical and Biophysical Research Communications. 233 (1), 45-49 (1997).
- Yamazaki, Y., et al. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells by deoxyribonucleic acid injection into seminiferous tubules and subsequent electroporation. Biology of Reproduction. 59 (6), 1439-1444 (1998).
- Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a marker. The Journal of Experimental Zoology. 286 (2), 212-218 (2000).
- Coward, K., Kubota, H., Parrington, J. In vivo gene transfer into testis and sperm: developments and future application. Archives of Andrology. 53 (4), 187-197 (2007).
