Summary
Este artículo informa una inhibición in vivo de CENP-E a través de cirugía abdominal e inyección testicular de GSK923295, un modelo valioso para la división meiótica masculina. Usando los ensayos de inmunofluorescencia, citometría de flujo y microscopía electrónica de transmisión, mostramos que la inhibición de CENP-E da como resultado una desalineación cromosómica e inestabilidad del genoma en espermatocitos de ratón.
Abstract
En eucariotas, la meiosis es esencial para la estabilidad del genoma y la diversidad genética en la reproducción sexual. Los análisis experimentales de los espermatocitos en los testículos son críticos para las investigaciones del ensamblaje del huso y la segregación cromosómica en la división meiótica masculina. El espermatocito de ratón es un modelo ideal para estudios mecanicistas de meiosis, sin embargo, faltan métodos efectivos para el análisis de espermatocitos. En este artículo, se informa un método práctico y eficiente para la inhibición in vivo de kinesina-7 CENP-E en espermatocitos de ratón. Se presenta un procedimiento detallado para la inyección testicular de un inhibidor específico GSK923295 a través de cirugía abdominal en ratones de 3 semanas de edad. Además, aquí se describen una serie de protocolos para la recolección y fijación de tejidos, tinción de hematoxilina-eosina, inmunofluorescencia, citometría de flujo y microscopía electrónica de transmisión. Aquí presentamos un modelo de inhibición in vivo mediante cirugía abdominal e inyección testicular, que podría ser una técnica potente para estudiar la meiosis masculina. También demostramos que la inhibición de CENP-E da como resultado una desalineación cromosómica y detención en metafase en los espermatocitos primarios durante la meiosis I. Nuestro método de inhibición in vivo facilitará los estudios mecanicistas de la meiosis, servirá como un método útil para las modificaciones genéticas de las líneas germinales masculinas y arrojará luz sobre futuras aplicaciones clínicas.
Introduction
La meiosis es uno de los eventos más importantes, altamente rígidos y conservados evolutivamente en los organismos eucariotas, y es esencial para la gametogénesis, la reproducción sexual, la integridad del genoma y la diversidad genética 1,2,3. En los mamíferos, las células germinales experimentan dos divisiones celulares sucesivas, meiosis I y II, después de una sola ronda de replicación del ADN. A diferencia de las cromátidas hermanas en la mitosis, los cromosomas homólogos duplicados se emparejan y segregan en dos células hijas durante la meiosis I 4,5. En la meiosis II, las cromátidas hermanas se separan y segregan para formar gametos haploides sin replicación del ADN6. Los errores en cualquiera de las dos divisiones meióticas, incluyendo defectos de ensamblaje del huso y segregación cromosómica, pueden resultar en la pérdida de gametos, esterilidad o síndromes de aneuploidía 7,8,9.
Los estudios acumulados han demostrado que los motores de la familia de las quinesinas desempeñan un papel crucial en la regulación de la alineación y segregación cromosómica, el ensamblaje del huso, la citocinesis y la progresión del ciclo celular en células mitóticas y meióticas10,11,12. La quinesina-7 CENP-E (proteína Centromérica E) es un motor cinetocoro dirigido al extremo adicional requerido para el congreso cromosómico, el transporte y la alineación de cromosomas, y la regulación del punto de control del ensamblaje del huso en la mitosis 13,14,15,16,17,18. Durante la meiosis, la inhibición de CENP-E por el inhibidor específico GSK923295 conduce a la detención del ciclo celular, desalineación cromosómica, desorganización del huso e inestabilidad del genoma en células espermatogénicas19. Los patrones de localización y la dinámica de CENP-E en los centrómeros de los espermatocitos en división indican que CENP-E interactúa con las proteínas cinetocoros para el ensamblaje secuencial de centrómeros durante la meiosis I20,21. En ovocitos, CENP-E es necesario para la alineación cromosómica y la realización de la meiosis I13,22,23. La inyección de anticuerpos o morfolino de CENP-E da como resultado cromosomas desalineados, orientación anormal del cinetocoro y detención de la meiosis I tanto en ovocitos de ratón como de Drosophila 23. En comparación con las funciones esenciales de CENP-E en la mitosis, las funciones y mecanismos de CENP-E en la meiosis siguen siendo en gran parte desconocidos. Los mecanismos detallados de CENP-E en el congreso cromosómico y la estabilidad del genoma en células meióticas masculinas aún no se han aclarado.
La espermatogénesis es un proceso fisiológico complejo y duradero, que implica la proliferación secuencial de espermatogonias, la meiosis y la espermiogénesis. Por lo tanto, todo el proceso es extraordinariamente difícil de reproducir in vitro en mamíferos y otras especies24,25. Es imposible inducir la diferenciación de los espermatocitos después de la etapa de paquiteno in vitro. Los estudios sobre las divisiones meióticas masculinas se han limitado generalmente a análisis experimentales de la profase meiótica temprana25,26. A pesar de muchos esfuerzos tecnológicos, incluyendo el cultivo a corto plazo de espermatocitos27,28 y los métodos de cultivo de órganos25, existen pocos métodos efectivos para estudiar la división meiótica masculina. Además, la eliminación genética de genes esenciales generalmente resulta en una detención del desarrollo y letalidad embrionaria. Por ejemplo, los embriones de ratón que carecen de CENP-E no se implantan y no pueden desarrollarse más allá de la implantación29, lo que es un obstáculo en los estudios mecanicistas de CENP-E en la meiosis. En conjunto, el establecimiento de un sistema práctico y factible para estudiar la división meiótica masculina puede promover en gran medida el campo de investigación de la meiosis.
El inhibidor permeable a las células pequeñas es una herramienta poderosa para estudiar los motores de quinesina en la división celular y los procesos de desarrollo. El inhibidor alostérico, GSK923295, se une específicamente al dominio motor CENP-E, bloquea la liberación de ADP (difosfato de adenosina) y finalmente estabiliza las interacciones entre CENP-E y los microtúbulos30. En este estudio, se presenta un modelo de ratón de inhibición in vivo mediante cirugía abdominal e inyección testicular de GSK923295. La inhibición de CENP-E da lugar a una desalineación cromosómica en la metafase I de los espermatocitos primarios. Además, la inhibición de CENP-E conduce a la detención meiótica de los espermatocitos y la interrupción de la espermatogénesis. Se describen una serie de protocolos para el análisis de espermatocitos y se pueden aplicar para observar microtúbulos fusiformes meióticos, cromosomas homólogos y orgánulos subcelulares en espermatocitos. Nuestro método de inhibición in vivo es un método eficaz para los estudios de división meiótica y espermatogénesis.
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Protocol
Todos los experimentos con animales fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Fujian (número de protocolo SYXK 2016-0007). Todos los experimentos con ratones se realizaron de acuerdo con las directrices pertinentes del Cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (publicaciones de los NIH número 8023, revisadas en 1978).
1. Construcción de modelos de ratón de inhibición de CENP-E mediados por GSK923295
- Esterilizar los instrumentos quirúrgicos a 121 °C durante 30 min. Irradiar el banco de trabajo ultralimpio quirúrgico con ultravioleta-C (UVC) durante 2 h. Pese los ratones machos ICR (Instituto de Investigación del Cáncer) de 3 semanas de edad utilizados para los experimentos y calcule las dosis de anestesia requeridas.
- Anestesiar ratones administrando una combinación de ketamina (100 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal. Verifique la profundidad de la anestesia de los ratones a través de una combinación de reflejo corneal del ratón, reflejo nociceptivo, respiración y tono muscular. Confirme que los ratones están profundamente anestesiados.
NOTA: Coloque al animal en una almohadilla térmica para proporcionar soporte térmico durante la cirugía. - Ate las extremidades del ratón y fíjelas en la bandeja de cera. Coloque una gota de ungüento veterinario en los ojos del ratón para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia. Afeite el pelo abdominal del ratón desde la parte inferior del abdomen hasta el escroto con una navaja de afeitar experimental para animales. Asegure el área quirúrgica con una cortina estéril.
- Desinfecte el abdomen ventral con un exfoliante Betadine seguido de etanol al 75% tres veces. Abra la cavidad abdominal con un bisturí estéril y haga una abertura de <5 mm.
- Sujete la piel con pinzas quirúrgicas estériles y tire de la almohadilla de grasa del epidídimo con pinzas de disección estériles para localizar los testículos con unas pinzas estériles. Fijar el testículo con fórceps estériles bajo un estereoscopio, e inyectar lentamente 10 μL de GSK923295 en túbulos seminíferos a una concentración final de 10 μM usando 10 μL de reodino30. Para la construcción del grupo control, inyecte 10 μL de solución de DMSO (dimetilsulfóxido)/PBS (solución salina tamponada con fosfato) al 1%.
NOTA: Conservar la solución GSK923295 a una concentración de 10 mM a -80 °C. Disolver 0,1 μL de 10 mM GSK923295 en 100 μL de solución de PBS para preparar los 10 μM de solución de GSK923295. - Empuje suavemente el testículo hacia la cavidad abdominal con fórceps quirúrgicos estériles. Suturar el peritoneo y la piel por separado con dos a cuatro puntos utilizando la línea de sutura con un diámetro de 0,1 mm.
- Etiquete un lugar de 3 x 3 mm en la espalda del animal con un marcador permanente después de la cirugía abdominal, vuelva a colocar al ratón en la jaula de alimentación y asegúrese de un ambiente limpio y libre de patógenos con suficiente comida y agua.
- Mantenga el ambiente en un estado estéril a través del aire filtrado, los alimentos esterilizados y el agua. Cuide al animal hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. Para la analgesia postoperatoria, administrar una dosis de buprenorfina (0,1 mg/kg) por vía subcutánea cada 12 h durante 3 días. Asegúrese de que el ratón no sea devuelto a la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado.
NOTA: Los ratones reciben cuidados postoperatorios y administran adecuadamente anestesia local a la herida utilizando lidocaína al 0,5% para reducir el dolor postoperatorio cuando sea necesario.
2. Tinción e histopatología de hematoxilina-eosina (HE)
- Cuatro días después de la cirugía abdominal, sacrificar a los ratones con CO 2 a una velocidad de flujo de 2 L / min en una cámara de CO2. Confirmar la muerte por luxación cervical como método confirmatorio de eutanasia. Use tijeras quirúrgicas para abrir el escroto y extirpar los testículos con fórceps. Recoger los testículos de ratón 4 días después de GSK923295 inyección y fijarlos en 30 ml de solución de formaldehído al 10% a temperatura ambiente durante 12 h.
- Para la deshidratación por gradiente, incubar secuencialmente la muestra en 40 mL de etanol al 70% durante 1 h, en 40 mL de etanol al 85% durante 1 h, en 40 mL de etanol al 95% durante 1 h, y en 40 mL de etanol al 100% durante 1 h.
- Incubar la muestra en 40 mL de xileno durante 40 min, y luego en 40 mL de parafina durante 1 h a 65 °C. Coloque los pañuelos en la parte inferior de la caja de incrustación. Agregue la parafina derretida en la caja de incrustación. Enfriar los tejidos para una solidificación completa a 4 °C durante 6 h.
- Fije las muestras en el soporte del ultramicrótomo, mantenga el ángulo entre las muestras y la superficie del cuchillo a 5-10° y ajuste el grosor de la rebanada a 5 μm. Preparar las secciones de 5 μm de espesor con un ultramicrótomo, extender los portaobjetos en un baño maría a 40 °C y secar las secciones en un secador de diapositivas durante 12 h a 37 °C.
- Incubar los portaobjetos en 200 mL de xileno durante 40 min, en 200 mL de etanol al 100% durante 6 min, en 200 mL de etanol al 95% durante 2 min, en 200 mL de etanol al 90% durante 2 min, en 200 mL de etanol al 80% durante 2 min, y en 200 mL de etanol al 70% durante 2 min, respectivamente.
- Enjuague los portaobjetos con agua destilada durante 5 minutos y tiñe con la solución de hematoxilina de Mayer durante 6 minutos a temperatura ambiente.
NOTA: Solución de hematoxilina de Mayer: 0.011 mol / L de hematoxilina, 6.7% de etanol anhidro, 0.646 mol / L de sulfato de potasio de aluminio y 0.003 mol / L de yodato de sodio. - Enjuague los toboganes con agua corriente durante 5 minutos e incube con agua destilada durante 2 minutos.
- Incubar los portaobjetos en clorhidrato de etanol al 1% durante 3 s, y luego enjuáguelos con agua corriente durante 2 minutos.
- Teñir la muestra con eosina al 1% durante 15 s, y luego incubarlas con etanol al 95% durante 5 s, con etanol al 100% durante 2 min y en xileno durante 40 min.
- Selle los portaobjetos con 15 μL de goma neutra y el cubreobjetos de 24 x 50 mm.
3. Inmunofluorescencia y microscopía confocal
- Recolecte las secciones de parafina de 5 μm de espesor de los testículos de ratón para la inmunofluorescencia. Incubar los portaobjetos en xileno durante 40 min, en etanol al 100% durante 6 min, en etanol al 95% durante 2 min, en etanol al 90% durante 2 min, en etanol al 80% durante 2 min y en etanol al 70% durante 2 min. Enjuague los portaobjetos con agua destilada durante 5 minutos y enjuague los portaobjetos con PBS de 0,01 M durante 5 minutos.
- Colocar los portaobjetos en la solución de recuperación de antígenos (tampón citrato 0,01 M) y hervir a alta presión con una olla a presión durante 4 min para la recuperación del antígeno. Enfríe los portaobjetos naturalmente a temperatura ambiente. Enjuague con agua destilada durante 5 minutos dos veces y con PBS durante 5 minutos.
NOTA: tampón citrato 0.01 M (pH 6.0): 2.1 mmol/L de ácido cítrico, 11.6 mmol/L de citrato trisódico dihidrato. - Permeabilizar las células incubando los portaobjetos en 500 μL de TritonX-100/PBS al 0,25% durante 10 min. Enjuague las diapositivas con PBS durante 5 minutos tres veces.
- Para el bloqueo de antígenos, incubar las muestras con 300 μL de albúmina sérica bovina (BSA)/PBST al 3% (Tween-20 al 0,1% en PBS) durante 1 h. Incubar las muestras con los anticuerpos primarios en BSA/PBST al 3% durante 16 h a 4 °C. Coloque los portaobjetos en una caja humidificada para evitar que los pañuelos se sequen. Vuelva a calentar los portaobjetos naturalmente a temperatura ambiente durante 30 minutos.
- Deseche el anticuerpo primario y luego enjuague los portaobjetos en PBST durante 5 minutos tres veces. Diluir anticuerpos secundarios en BSA/PBST al 3%. Incubar las muestras con anticuerpos secundarios durante 1-2 h a 37 °C. Enjuague las muestras en PBST durante 5 minutos cinco veces.
- Teñir los núcleos con 50 μL de 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 5 min a temperatura ambiente. Monte el cubreobjetos con el medio de montaje antidecoloración y selle el cubreobjetos con esmalte de uñas.
- Observe y registre señales fluorescentes en los portaobjetos utilizando un microscopio fluorescente equipado con un objetivo NA 40x/ 0.75.
4. Citometría de flujo
- Recolectar testículos de ratón en placas de Petri de 6 cm y cortar los testículos en trozos de 1 mm3 con tijeras quirúrgicas.
- Digerir los testículos usando 1 ml de colagenasa al 1% en un tubo de centrífuga de 1,5 ml durante 10 min a 37 °C, y luego centrifugar las muestras a 1.000 x g durante 5 min para precipitar las células espermatogénicas.
- Deseche el sobrenadante y, a continuación, añada 1 ml de solución de tripsina-EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) al 0,25% durante 20 min a 37 °C, y luego centrifugar las muestras a 1.000 x g durante 5 min.
- Desechar el sobrenadante y, a continuación, incubar las células precipitadas con 1 ml de etanol frío al 70% durante más de 8 h a 4 °C.
- Centrifugar las muestras a 1.000 x g durante 5 minutos, y luego recoger los sedimentos celulares. Teñir las células espermatogénicas con una solución de tinción de yoduro de propidio (PI) de 500 μL (50 μg/ml PI, 100 μg/ml de RNasa A y Tritón X-100 al 0,2% en PBS) a 37 °C durante 30 min.
NOTA: Agite suavemente el tubo de centrífuga cada 5 minutos para evitar agregaciones celulares. - Filtre las muestras utilizando una pantalla de malla 300 para deshacerse de los restos celulares; recoger las células en un tubo de flujo y almacenarlas a 4 °C.
- Detecte señales de fluorescencia y dispersión de luz en la longitud de onda de excitación de 488 nm utilizando un citómetro de flujo. Analice el contenido de ADN y la dispersión de la luz con el software Modfit MFLT32.
5. Microscopía electrónica de transmisión
- Cortar los testículos entrozos de 1 mm 3 utilizando el bisturí afilado, e incubar rápidamente las muestras con solución de glutaraldehído-1,5% de paraformaldehído al 3% en PBS 0,1 M (pH 7,2) durante 4 h a 4 °C para evitar los cambios de ultraestructura. Enjuague las muestras con PBS 0.1 M durante 5 min tres veces.
NOTA: El bisturí y las tijeras deben estar afilados, y trate de evitar apretar y tirar artificialmente. El procesamiento de las muestras debe llevarse a cabo en el fluido de fijación. - Fijar las muestras en solución de ferrocianuro de potasio al 1% de ácido ósmico-1,5% a 4 °C durante 1,5 h. Seque el agua con papel de filtro y enjuague las muestras con PBS 0,1 M durante 5 minutos tres veces.
- Deshidratar las muestras en 40 mL de etanol al 50% durante 10 min a 4 °C. Incubar las muestras en 40 mL de colorante acetato de uranio saturado con etanol al 70% a 4 °C durante 12 h, en 40 mL de etanol al 90% durante 10 min a 4 °C, en 40 mL de etanol-acetona al 90% durante 10 min a temperatura ambiente, y en 40 mL de acetona anhidra durante 10 min tres veces a temperatura ambiente.
- Incubar las muestras en una mezcla anhidra de acetona-epoxi resina 618 agentes incrustadores (v / v = 1:1) durante 1,5 h, y luego incrustar las muestras en resina epoxi 618 agentes incrustadores a 35 °C durante 3 h.
- Para la polimerización con resina, incubar las muestras en agentes incrustantes de resina epoxi 618 a 35 °C durante 12 h, a 45 °C durante 12 h y luego a 60 °C durante 24 h.
- Instale las muestras y el cuchillo de vidrio, y luego ajuste las distancias entre las muestras y el cuchillo. Prepare las secciones ultrafinas de 90 nm de espesor utilizando un micrótomo ultrafino. Corte las muestras a una velocidad constante y luego coloque los portaobjetos en una malla de níquel. Coloque los portaobjetos en una placa de Petri a temperatura ambiente.
- Manchar los portaobjetos con acetato de uranilo al 2% durante 10 min, y luego teñir las muestras con citrato de plomo al 2% durante 10 min. Enjuague los toboganes con agua destilada. Secar los portaobjetos durante 24 h a temperatura ambiente.
- Observe las diapositivas y registre imágenes electrónicas a 70-100 kV utilizando un microscopio electrónico de transmisión.
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Representative Results
Hemos construido con éxito un modelo de inhibición in vivo de CENP-E de testículos de ratón mediante cirugía abdominal e inyección testicular de GSK92329519. Los pasos técnicos clave de este método se muestran en la Figura 1. Después de la inyección testicular de GSK923295 durante 4 días, los testículos se cosecharon para análisis adicionales. En el grupo control, la onda espermatogénica en los túbulos seminíferos fue regular y organizada (Figura 2A). Sin embargo, en el grupo GSK923295, la onda espermatogénica se alteró en los túbulos seminíferos, y la metafase detuvo los espermatocitos primarios aumentaron significativamente después de la inhibición de CENP-E (Figura 2B-D). Es importante destacar que varios cromosomas homólogos no se alinearon en la placa ecuatorial después de la inhibición de CENP-E (Figura 2B-D). Además, la inhibición de CENP-E también condujo al aumento de espermatocitos metafásicos I en túbulos seminíferos (Figura 2E, F, G). En conjunto, la inhibición de CENP-E da como resultado una desalineación cromosómica en los espermatocitos primarios durante la meiosis I, lo que sugiere que CENP-E es responsable de la conformación cromosómica y la alineación de los espermatocitos en la meiosis.
Para validar aún más estos resultados, realizamos los ensayos de inmunofluorescencia para detectar las células espermatogénicas en los túbulos seminíferos. Encontramos que la onda espermatogénica regular mostrada en el grupo control obviamente cambió y se volvió irregular en el grupo GSK923295 (Figura 3). El huso meiótico de los espermatocitos en división se marcó con anticuerpos anti-α-tubulina, y el filamento transversal de complejos sinaptonemales en los espermatocitos se marcó con anticuerpo anti-proteína del complejo sinaptonémico 3 (SYCP3) (Figura 3A). Las células positivas para SYCP3 por túbulo seminífero disminuyeron después de la inhibición de CENP-E (Figura 3B). Mientras tanto, los puntos SYCP3 por célula metafásica no se interrumpieron después de la inhibición de CENP-E (Figura 3C). Además, los estiramientos SYCP3 por célula tampoco se vieron afectados en los grupos GSK92395 (Figura 3D). Sorprendentemente, encontramos que las distancias de los polos del huso en los espermatocitos de metafase I aumentaron después de la inhibición de CENP-E (Figura 3E, F). Estos resultados inmunofluorescentes sugieren que CENP-E es necesario para la desalineación cromosómica y los procesos de espermatogénesis, y es indispensable para el mantenimiento del huso bipolar y la organización del huso meiótico.
Para investigar las poblaciones celulares en testículos de ratón, digerimos los testículos y realizamos tinción PI y ensayos de citometría de flujo (Figura 4). Los procedimientos técnicos importantes se muestran en la Figura 4A-C. Las células espermatogénicas consisten en varias poblaciones celulares, incluyendo las espermatogonias, espermatocitos primarios, espermatocitos secundarios, espermátidas y espermatozoides. El contenido de ADN de estas células espermatogénicas se mostró en la Figura 4A. Demostramos que la inhibición de CENP-E resultó en la disminución de las células haploides de 42.95 ± 1.09% en el grupo control a 38.26 ± 1.86% en el grupo GSK923295 (Figura 4B-D). Las proporciones de las células diploides y las células aneuploidías no se vieron significativamente influenciadas después de la inhibición de CENP-E (Figura 4E, F). Además, las proporciones de las células tetraploides aumentan de 17,76 ± 1,52% en el grupo control a 28,88 ± 2,05% en el grupo GSK923295 (Figura 4G). Tomados en conjunto, encontramos que las poblaciones celulares de las células espermatogénicas están ligeramente alteradas después de la inhibición de CENP-E. La inhibición de CENP-E resulta en la disminución de las células haploides y el aumento de células tetraploides, lo que indica que la inhibición de CENP-E está asociada con la detención de la metafase en los espermatocitos en división.
Además, observamos la estructura submicroscópica de las células espermatogénicas mediante microscopía electrónica de transmisión (Figura 5). La organización de la cromatina, el retículo endoplásmico y las mitocondrias de los espermatocitos se mostraron en la Figura 5. Encontramos que la organización de las células espermatogénicas estaba ligeramente alterada en el grupo GSK923295 (Figura 5).
Figura 1: Establecimiento de un modelo de inhibición in vivo de testículos de ratón mediante cirugía abdominal y administración testicular. (A) Todos los instrumentos quirúrgicos utilizados en la cirugía abdominal. 1) tijera de disección, 2) pinzas de aguja, 3) pinzas rectas, 4) pincetín, 5) reodino, 6) jeringa de 1 ml, 7) bisturí con mango nº 3 y hoja nº 11, 8) estilolita, 9) agujas de costura redondas, 1/2 0,6 x 14 mm, 1/2 0,7 x 17 mm, 10) hisopos de etanol. (B) Después de la anestesia, los ratones se colocaron en posición supina en una bandeja de cera, se preparó la parte inferior del abdomen y se desinfectó con etanol al 75%. (C) Se hizo una abertura de <5 mm en el centro de la parte inferior del abdomen. (D) La almohadilla de grasa del epidídimo se tiró con pinzas de disección estériles para localizar los testículos. El testículo fue inyectado con 10 μL GSK923295 usando un reodino de 10 μL. (E) El peritoneo y la piel se suturaron simultáneamente con dos puntos de sutura. (F) La herida fue desinfectada con etanol al 75%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La inhibición de CENP-E resultó en la detención de la meiosis I y la desalineación cromosómica en espermatocitos de ratón . (A) Tinción HE de las células espermatogénicas en el grupo control. Las flechas indican los espermatocitos. (B) Tinción HE de las células espermatogénicas en el grupo GSK923295. Los testículos fueron inyectados con GSK923295 durante 4 días a una concentración final de 10 μM. Las flechas indican desalineación cromosómica en los espermatocitos. Para todas las imágenes, barra de escala, 10 μm. (C) Relación de espermatocitos metafásicos en túbulos seminíferos. Control, 13,43 ± 1,68%; GSK923295, 42,29 ± 3,94%. Se analizaron N = 1308 células. Grupo = 4. Prueba t del estudiante. Barras de error, significa ± SEM. ***, P < 0.001. (D) Proporción de túbulos seminíferos con espermatocitos en división. Control, 5,38 ± 2,64%; GSK923295, 33,96 ± 3,87%. Se analizaron N = 151 túbulos seminíferos. Grupo = 4. (E) Imágenes de inmunofluorescencia de la histona H3 (fosfo Ser 10) y TUBA4A en los grupos control y GSK923295. TUBA4A, rojo; Histona H3 (fosfo Ser 10), verde; DAPI, azul. Barra de escala, 10 μm. El cuadro ampliado está ampliado. (F) La cuantificación del número de células metafásicas en túbulos seminíferos. Control, 11,45 ± 1,55; GSK923295, 18,91 ± 2,36. N = 11. (G,H) Análisis de barrido lineal de intensidades fluorescentes de histona H3 y TUBA4A en espermatocitos metafase I del grupo control (G) y del grupo GSK923295 (H). TUBA4A, rojo; Histona H3 (fosfo Ser 10), verde; DAPI, azul. El eje X indica la distancia relativa. El eje Y indica intensidades fluorescentes. Prueba t del estudiante. Barras de error, media ± SEM. *, p < 0,05 ; ***, P < 0,001 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La inhibición de CENP-E por GSK923295 condujo a la desorganización de los túbulos seminíferos y a la interrupción de la espermatogénesis. (A) Imágenes representativas de inmunofluorescencia de SYCP3 y TUBA4A en los grupos control y GSK923295. SYCP3, rojo; TUBA4A, verde; DAPI, azul. Barra de escala, 10 μm. (B) Células SYCP3 positivas por túbulos seminíferos en los grupos control y GSK923295. Control, 56,00 ± 5,43%; GSK923295, 39,00 ± 1,73%. N = 10. (C) Las cuantificaciones de puntos SYCP3 por células metafásicas. Control, 10.00 ± 1.02; GSK923295, 9,71 ± 0,86, N = 7. (D) Las cuantificaciones de los estiramientos de SYCP3 por célula en los grupos control y GSK923295. Control, 8,63 ± 0,22; GSK923295, 8,21 ± 0,21. N = 19. (E) Los análisis de la distancia de los polos del huso en los espermatocitos de metafase I. Control, 8,20 ± 0,28 μm; GSK923295, 9,30 ± 0,29 μm. N = 30. (F) Imágenes de inmunofluorescencia de túbulos seminíferos en los grupos control y GSK923295. Las flechas indican los espermatocitos. DAPI, verde; β-tubulina, verde. Las imágenes ampliadas del cuadro discontinuo se mostraron en el zoom. Para todas las imágenes, barra de escala, 10 μm. Prueba t de Student. Barras de error, media ± SEM. ns, p > 0,05; **, P < 0,01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis por citometría de flujo de células espermatogénicas en testículos de ratón. (A) Ilustraciones esquemáticas de los pasos clave en el análisis del ciclo celular de células espermatogénicas de ratón. Los espermatocitos diploides sufren meiosis I y II para formar las espermátidas haploides. El valor C indica el contenido de ADN. El valor N (ploidía) indica el número de conjuntos de cromosomas. (B,C) Análisis por citometría de flujo de las células espermatogénicas en el grupo control (B) y el grupo GSK923295 (C). Para la inhibición in vivo de CENP-E, GSK923295 se inyectó en testículos de ratones ICR machos de 3 semanas de edad a una concentración final a 10 μM durante 4 días. Para el análisis del ciclo celular, se midieron y analizaron n = 3.000 células. P4, las células haploides (1C). P5, las células diploides (2C). P6, las células tetraploides (4C). (D) Proporciones de las células haploides en los grupos control y GSK923295. Control, 42,95 ± 1,09%; GSK923295, 38,26 ± 1,86%. N = 8. (E) Proporciones de las células diploides en los grupos control y GSK923295. Control, 20,10 ± 0,91%; GSK923295, 17,95 ± 0,81%. N = 8. (F) Proporciones de las células aneuploides (2C ~ 4C) en los grupos control y GSK923295. Control, 3,41 ± 0,23%; GSK923295, 3,39 ± 0,25%. N = 8. (G) Proporciones de las células tetraploides en los grupos control y GSK923295. Control, 17,76 ± 1,52%; GSK923295, 28,88 ± 2,05%. N = 8. Para todos los gráficos, prueba t de Student. Barras de error, media ± SEM. ns, P > 0,05; *, p < 0,05; , p < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Análisis por microscopía electrónica de las células espermatogénicas del grupo control y GSK923295 . (A) Imágenes representativas de túbulos seminíferos en el grupo control. Barra de escala, 5 μm. (B) La imagen ampliada del núcleo del espermatocito. Las flechas indican cromatina homóloga de los espermatocitos. Barra de escala, 1 μm. (C) La imagen ampliada del citoplasma de los espermatocitos. Barra de escala, 1 μm. (D) Imágenes representativas de túbulos seminíferos en el grupo GSK923295. Los testículos fueron tratados con 10 μM GSK923295 durante 4 días. Barra de escala, 5 μm. (E) La imagen ampliada del núcleo del espermatocito en el grupo GSK923295. Barra de escala, 1 μm. (F) La imagen ampliada del citoplasma de los espermatocitos en el grupo GSK923295. Barra de escala, 1 μm. Para todos los gráficos, sc: espermatocito; SD, espermátida. RE: retículo endoplásmico; MT: mitocondrias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este estudio, hemos establecido un modelo de inhibición in vivo de CENP-E de testículos de ratón utilizando la cirugía abdominal y la microinyección de GSK923295. La cirugía abdominal y el método de inyección testicular utilizados en este estudio tienen las siguientes ventajas. En primer lugar, no se limita a la edad de los ratones. Los experimentadores pueden realizar la inyección testicular en una etapa temprana, por ejemplo, en ratones de 3 semanas o más jóvenes. En segundo lugar, GSK923295 tiene un efecto inhibitorio específico y excelente sobre el CENP-E. En tercer lugar, este método es fácil de operar y altamente reproducible. Además, se mantiene la integridad de los testículos, lo que es adecuado para los estudios de tejidos intactos en el contexto de los órganos.
Hay varios pasos críticos en este protocolo. Por ejemplo, es importante mantener un ambiente estéril durante la cirugía abdominal para la prevención de infecciones postoperatorias31. Además, para ratones de diferentes edades o diferentes animales de experimentación, las cantidades de inyección deben ajustarse adecuadamente de acuerdo con el tamaño de los testículos y la efectividad de los medicamentos19,32. Además, se requiere el tiempo de digestión adecuado y la observación microscópica para la determinación de células individuales y la posterior prueba de población celular durante la citometría de flujo. Sin embargo, existen varias limitaciones en estos protocolos. Es difícil utilizar la cirugía abdominal para construir un modelo de ratón cuando la edad del ratón es inferior a 2 semanas de edad. Las principales razones son que los ratones son demasiado jóvenes, la dieta postoperatoria es difícil y la tasa de supervivencia es baja. Los fármacos utilizados en modelos animales son líquidos y tienen las características de membranas celulares fácilmente penetrantes 19,32,33, que son adecuados para las aplicaciones de este método de administración.
La comprensión de la meiosis es estimulada por el cultivo celular in vitro y los estudios de eliminación de genes, sin embargo, no es fácilmente aplicable en espermatocitos de mamíferos28. El obstáculo para los estudios mecanicistas de la meiosis masculina ha sido la falta de un sistema adecuado para la manipulación y observación de los espermatocitos en división en la meiosis27. El ratón es un excelente organismo modelo en la investigación de los mecanismos celulares y moleculares de la meiosis durante la espermatogénesis. La primera ola de espermatocitos de ratón comienza la meiosis en el día 10 después del parto (dpp) y se convierte en espermatozoides maduros a 35 dpp, lo que proporciona una ventana de tiempo de desarrollo para los estudios de división meiótica y espermatogénesis34.
La inyección testicular, incluyendo la inyección directa a través del escroto y la microinyección a través de la cirugía abdominal, es una técnica útil para los estudios de la espermatogénesis35,36. La inyección directa a través del escroto es rápida y simple, y solo causa un trauma quirúrgico menor, que es adecuado para ratones de 4 semanas de edad o más con los testículos que descienden al escroto. Sin embargo, es imposible inyectar el testículo no descendido de los ratones de 3 semanas de edad o más jóvenes. La microinyección a través de la cirugía intraperitoneal o la cirugía del escroto es adecuada para la inyección de testículos no descendidos, lo que requiere habilidades quirúrgicas competentes de operadores experimentales, un microscopio estereoscópico y el equipo quirúrgico y de laboratorio. De acuerdo con los sitios de inyección, la microinyección se puede clasificar en inyección de túbulo seminífero, inyección neta testicular e inyección intersticial testicular. En comparación con otros modelos de testículos basados en inyecciones, la inyección de inhibidores a través de cirugía abdominal puede inhibir eficazmente las funciones de las proteínas y tener las ventajas en la penetración de la membrana celular, procedimientos fáciles e inhibición a largo plazo19,32. Los métodos que utilizan siRNAs, oligonucleótidos antisentido o lentivirus tienen mayores limitaciones en la baja eficiencia de penetración de las membranas celulares, efectos secundarios fuera del objetivo y fácil degradación de siRNA u oligonucleótidos in vivo37,38,39,40.
La división meiótica en los tejidos vivos es más compleja que en las condiciones de cultivo, en las que la arquitectura del tejido, la señalización del desarrollo y los factores ambientales in vivo deben ser tomados en consideración41. Estudios previos han demostrado que los medios de cultivo y los factores autónomos celulares son cruciales para la estimulación del inicio de la fase de división meiótica. Por ejemplo, el inhibidor de la fosfatasa ácido okadaico (OA)42, la histona específica de espermatocito HIST1H1T43, la topoisomerasa II 44 y el factor promotor de metafase (MPF)45 promueven la transición G2/MI en espermatocitos cultivados. Estas complejas condiciones y factores de cultivo contribuyen a las limitaciones del cultivo a corto plazo de espermatocitos.
La inyección directa de ADN plásmido en testículos se aplica con éxito en la transferencia de genes mediada por testículos y la producción de ratones transgénicos32,46. La electroporación in vivo implica la inyección de un plásmido de expresión de ADN en la luz de los túbulos seminíferos, y luego utilizar una serie de pulsos eléctricos para cambiar la permeabilidad de la membrana celular, mejorar la eficiencia de la expresión transgénica y la modificación genética 45,46,47,48,49. Nuestro método podría combinarse con electroporación in vivo, así como proteínas marcadas con fluorescencia y herramientas de edición de genes, haciendo que este enfoque sea más poderoso para los análisis de la división meiótica masculina en el contexto fisiológico de tejidos y órganos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a todos los miembros del Laboratorio de Citoesqueleto de la Universidad Médica de Fujian por sus útiles discusiones. Agradecemos a Jun-Jin Lin en el Centro de Servicios de Tecnología Pública de la Universidad Médica de Fujian por su asistencia técnica en citometría de flujo. Agradecemos a Ming-Xia Wu y Lin-Ying Zhou del Laboratorio de Microscopía Electrónica del Centro de Servicios de Tecnología Pública de la Universidad Médica de Fujian por su asistencia técnica en microscopía electrónica. Agradecemos a Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke y Jun Song en el Centro de Enseñanza Experimental de Ciencias Médicas Básicas de la Universidad Médica de Fujian por su apoyo. Este estudio fue apoyado por las siguientes subvenciones: Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (número de subvención 82001608), Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Fujian, China (número de subvención 2019J05071), Proyecto de Tecnología de Salud Provincial de Fujian (número de subvención 2018-1-69), Fondo de inicio para la investigación científica, Universidad Médica de Fujian (número de subvención 2017XQ1001), Proyecto de financiación de la investigación científica de talentos de alto nivel de la Universidad Médica de Fujian (número de subvención XRCZX2017025) y Proyecto de investigación de educación en línea y enseñanza de estudiantes graduados de medicina china (número de beca B-YXC20200202-06).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 1 ml Syringe | Several commercial brands available | Sterile. | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430828 | |
| 6 cm Petri dish | Corning | 430166 | |
| 95% Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009164 | |
| tubulin rabbit polyclonal antibody | Beyotime | AF0001 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibody | Abcam | ab267372 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibody | Sangon Biotech | D110022 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab175191 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | 188105 | |
| Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibody | Beyotime | A0423 | Sencodary antibody. Use at 1:500. |
| Aluminium potassium sulphate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10001060 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 100092690 | |
| Anti-fade mounting medium | Beyotime | P0131 | Prevent photobleching of flourescent signals. |
| BD FACS Canto II | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69003435 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424BK745380 | |
| Chloral hydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80037516 | |
| Citric acid | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 122670 | |
| Collagenase | Sangon Biotech | A004194-0100 | |
| Coverslips | CITOTEST | 10212020C | 20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm. |
| DAPI | Beyotime | C1006 | |
| Dye vat | Several commercial brands available | 91347802 | |
| Eosin Y, alcohol soluble | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71014460 | |
| Ether | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009318 | |
| Formaldehyde - aqueous solution | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10010018 | |
| GSK923295 | MedChemExpress | HY-10299 | |
| Hematoxylin, anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71020784 | |
| ICR mouse | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd | ||
| Image J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | Fluorescent image analysis. |
| Leica ultramicrotome | Leica | ||
| Leica EM UC-7 ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Modfit MFLT32 | Verity Software House | For analysis of flow cytometry results. | |
| Nail polish | Several commercial brands available | ||
| Neutral gum | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10004160 | |
| Nikon Ti-S2 microscope | Nikon | Ti-S2 | |
| Picric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | J60807 | |
| Rheodyne | Sangon Biotech | F519160-0001 | 10 μl rheodyne |
| Sliced paraffin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69019461 | |
| Sodium iodate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80117214 | |
| Surgical instruments | Several commercial brands available | For abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min. | |
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 173970 | |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30188928 | Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution. |
| Tween 20 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30189328 | Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution. |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80096618 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10023418 |
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