Summary
이 기사는 남성 감수 분열에 대한 귀중한 모델인 복부 수술과 GSK923295의 고환 주사를 통한 CENP-E의 생체 내 억제를 보고합니다. 면역형광, 유세포 분석 및 투과 전자 현미경 분석을 사용하여 CENP-E 억제가 마우스 정자세포에서 염색체 정렬 불량 및 게놈 불안정성을 초래한다는 것을 보여줍니다.
Abstract
진핵생물에서 감수분열은 유성 생식의 게놈 안정성과 유전적 다양성에 필수적입니다. 고환의 정자 세포에 대한 실험적 분석은 남성 감수분열에서 방추 조립 및 염색체 분리를 조사하는 데 중요합니다. 마우스 정자 세포는 감수 분열의 기계론적 연구에 이상적인 모델이지만 정자 세포 분석을 위한 효과적인 방법이 부족합니다. 이 논문에서는 마우스 정자세포에서 kinesin-7 CENP-E의 생체 내 억제를 위한 실용적이고 효율적인 방법이 보고되어 있습니다. 3 주 된 마우스에서 복부 수술을 통해 GSK923295 특정 억제제의 고환 주사에 대한 자세한 절차가 제시됩니다. 또한, 여기에 설명된 것은 조직 수집 및 고정, 헤마톡실린-에오신 염색, 면역형광, 유세포 분석 및 투과 전자 현미경을 위한 일련의 프로토콜입니다. 여기에서 우리는 남성 감수분열을 연구하는 강력한 기술이 될 수 있는 복부 수술과 고환 주사를 통한 생체 내 억제 모델을 제시합니다. 우리는 또한 CENP-E 억제가 감수 분열 I 동안 일차 정자 세포에서 염색체 정렬 불량 및 중기 정지를 초래한다는 것을 입증합니다. 우리의 생체 내 억제 방법은 감수분열에 대한 기계론적 연구를 용이하게 하고, 남성 생식선의 유전자 변형에 유용한 방법으로 작용하며, 향후 임상 적용에 대한 빛을 비출 것입니다.
Introduction
감수 분열은 진핵 생물에서 가장 중요하고 매우 엄격하며 진화적으로 보존된 사건 중 하나이며 배우자 형성, 유성 생식, 게놈 무결성 및 유전적 다양성에 필수적입니다 1,2,3. 포유류에서 생식 세포는 단일 라운드의 DNA 복제 후 감수 분열 I과 II라는 두 가지 연속적인 세포 분열을 겪습니다. 유사분열의 자매 염색분체와 달리, 복제된 상동 염색체는 감수 분열 I 4,5 동안 쌍을 이루어 두 개의 딸 세포로 분리됩니다. 감수 분열 II에서 자매 염색분체는 분리되어 DNA 복제 없이 반수체 배우자를 형성합니다6. 방추 조립 결함 및 염색체 오분리를 포함한 두 감수 분열 중 하나의 실수는 배우자의 손실, 불임 또는 이수성 증후군을 초래할 수 있습니다 7,8,9.
축적된 연구에 따르면 키네신 계열 모터는 유사분열 세포와 감수분열 세포 모두에서 염색체 정렬 및 분리, 방추 조립, 사이토키네시스 및 세포 주기 진행의 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다10,11,12. Kinesin-7 CENP-E(Centromere protein E)는 유사분열 13,14,15,16,17,18에서 염색체 의회, 염색체 수송 및 정렬, 방추 조립 체크포인트 조절에 필요한 플러스 엔드 지향 키네토코어 모터입니다. 감수 분열 동안, 특정 억제제에 의한 CENP-E 억제는 정자 형성 세포에서 세포 주기 정지, 염색체 정렬 불량, 방추체 해체 및 게놈 불안정성을 유발할 GSK923295 있다19. 분열하는 정자 세포의 중심체에서 CENP-E의 국소화 패턴과 역학은 CENP-E가 감수분열 동안 중심체의 순차적 조립을 위해 키네토코어 단백질과 상호 작용한다는 것을 나타냅니다. 난모세포에서 CENP-E는 염색체 정렬 및 감수분열 I 13,22,23의 완료에 필요합니다. 항체 또는 모르폴리노 주사 CENP-E는 염색체 정렬 불량, 비정상적인 키네토코어 배향, 감수분열 I 정지를 마우스와 초파리 난모세포 모두에서 초래한다23. 유사분열에서 CENP-E의 필수적인 역할과 비교할 때, 감수분열에서 CENP-E의 기능과 메커니즘은 거의 알려지지 않은 채로 남아 있습니다. 염색체 의회에서 CENP-E의 자세한 메커니즘과 남성 감수 분열 세포의 게놈 안정성은 아직 밝혀지지 않았습니다.
정자 형성은 순차적인 정자 증식, 감수 분열 및 정자 형성을 포함하는 복잡하고 오래 지속되는 생리학 과정입니다. 그러므로, 전체 과정은 포유류 및 다른 종에서 시험관 내에서 재현되는 것이 매우 어렵다24,25. 시험관 내에서 pachytene 단계 후에 정자 세포 분화를 유도하는 것은 불가능합니다. 남성 감수 분열에 대한 연구는 일반적으로 초기 감수 분열 prophase25,26의 실험적 분석으로 제한되었습니다. 정자 세포의 단기 배양 27,28 및 장기 배양 방법25을 포함한 많은 기술적 노력에도 불구하고 남성 감수 분열을 연구하는 효과적인 방법은 거의 없습니다. 또한, 필수 유전자의 유전적 결실은 일반적으로 발달 정지 및 배아 치사를 초래합니다. 예를 들어, CENP-E가 결핍된 마우스 배아는 착상에 실패하고 과거 착상이 발달할 수 없다29, 이는 감수분열에서 CENP-E의 기계론적 연구에 장애물이 된다. 종합하면, 남성 감수 분열을 연구하기 위한 실용적이고 실현 가능한 시스템을 구축하면 감수 분열 연구 분야를 크게 촉진할 수 있습니다.
작은 세포 투과성 억제제는 세포 분열 및 발달 과정에서 키네신 모터를 연구하는 강력한 도구입니다. 알로스테릭 억제제 GSK923295는 CENP-E 운동 도메인에 특이적으로 결합하여 ADP(아데노신 이인산)의 방출을 차단하고 최종적으로 CENP-E와 미세소관 사이의 상호작용을 안정화시킨다30. 본 연구에서는 복부 수술과 GSK923295의 고환 주사를 통해 생체 내 억제 마우스 모델을 제시한다. CENP-E 억제는 일차 정자 세포의 중기 I에서 염색체 정렬 불량을 초래합니다. 또한, CENP-E 억제는 정자 세포의 감수 분열 정지 및 정자 형성의 파괴를 초래합니다. 정자 세포 분석을 위해 일련의 프로토콜이 설명되며 정자 세포에서 감수 분열 방추 미세소관, 상동 염색체 및 세포내 소기관을 관찰하는 데 적용할 수 있습니다. 우리의 생체 내 억제 방법은 감수 분열 및 정자 형성 연구에 효과적인 방법입니다.
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Protocol
모든 동물 실험은 복건 의과 대학의 동물 관리 및 사용위원회 (프로토콜 번호 SYXK 2016-0007)에 의해 검토되고 승인되었습니다. 모든 마우스 실험은 미국 국립보건원(NIH 간행물 번호 8023, 1978년 개정판)의 관련 가이드라인에 따라 수행하였다.
1. GSK923295 매개 CENP-E 억제 마우스 모델의 구성
- 수술 기구를 121°C에서 30분 동안 소독합니다. 수술용 울트라 클린 작업대에 자외선-C(UVC)를 2시간 동안 조사합니다. 실험에 사용된 3주령의 수컷 ICR(Institute of Cancer Research) 마우스의 무게를 측정하고 필요한 마취제의 투여량을 계산한다.
- 복강 주사를 통해 케타민(100mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)의 조합을 투여하여 마우스를 마취합니다. 마우스 각막 반사, 통각 반사, 호흡 및 근긴장의 조합을 통해 마우스의 마취 깊이를 확인하십시오. 마우스가 심하게 마취되었는지 확인합니다.
알림: 수술 중 열 지원을 제공하기 위해 동물을 가열 패드에 올려 놓습니다. - 마우스 팔다리를 묶어 왁스 트레이에 고정하십시오. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 마우스 눈에 수의사 연고 한 방울을 떨어 뜨립니다. 실험 동물 면도기를 사용하여 하복부에서 음낭까지 마우스의 복부 털을 면도합니다. 멸균 드레이프로 수술 부위를 고정하십시오.
- Betadine 스크럽으로 복부 복부를 소독 한 다음 75 % 에탄올을 세 번 소독하십시오. 멸균 메스를 사용하여 복강을 열고 <5mm의 구멍을 만드십시오.
- 멸균 수술용 클램프로 피부를 고정하고 멸균 해부 집게로 부고환 지방 패드를 당겨 멸균 핀셋을 사용하여 고환을 찾습니다. 입체경 아래에서 멸균 겸자로 고환을 고정하고 10μL의 rheodyne30을 사용하여 10μL의 최종 농도로 10μL의 GSK923295을 정세관에 천천히 주입합니다. 대조군의 구성을 위해 10μL의 1% DMSO(디메틸 설폭사이드)/PBS(인산염 완충 식염수) 용액을 주입합니다.
참고: GSK923295 용액을 -80°C에서 10mM 농도로 보관하십시오. 0.1 μL의 10 mM GSK923295를 100 μL의 PBS 용액에 용해시켜 10 μM의 GSK923295 용액을 제조하였다. - 멸균 수술용 집게로 고환을 복강 안으로 부드럽게 밀어 넣습니다. 직경 0.1mm의 봉합사를 사용하여 2-4 바늘로 복막과 피부를 별도로 봉합하십시오.
- 복부 수술 후 동물의 뒷면에 3 x 3mm 크기의 영구 마커를 붙이고 마우스를 수유 케이지에 다시 넣고 충분한 음식과 물로 깨끗하고 병원균이 없는 환경을 보장합니다.
- 여과 된 공기, 멸균 된 식품 및 물을 통해 환경을 멸균 상태로 유지하십시오. 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 동물을 돌보십시오. 수술 후 진통의 경우 부프레노르핀(0.1mg/kg)을 3일 동안 12시간마다 피하 투여한다. 완전히 회복될 때까지 마우스를 다른 동물의 회사로 돌려보내지 않도록 하십시오.
참고: 마우스는 수술 후 관리를 받고 필요한 경우 수술 후 통증을 줄이기 위해 0.5% 리도카인을 사용하여 상처에 국소 마취를 적절하게 합니다.
2. 헤마톡실린-에오신(HE) 염색 및 조직병리학
- 복부 수술 4일 후, CO2 챔버에서 2L/min의 유속으로CO2로 마우스를 안락사시킵니다. 안락사의 확인 방법으로 자궁 경부 탈구에 의한 사망을 확인하십시오. 수술 용 가위를 사용하여 음낭을 열고 집게로 고환을 제거하십시오. 주사 4일 후 마우스 고환GSK923295 채취하여 실온에서 10% 포름알데히드 용액 30mL에 12시간 동안 고정합니다.
- 그래디언트 탈수의 경우, 샘플을 70% 에탄올 40mL에서 1시간, 85% 에탄올 40mL에서 1시간, 95% 에탄올 40mL에서 1시간, 100% 에탄올 40mL에서 1시간 동안 순차적으로 배양합니다.
- 샘플을 40 mL의 자일렌에서 40 분 동안 배양 한 다음 40 mL의 파라핀에서 65 ° C에서 1 시간 동안 배양합니다. 임베딩 상자의 바닥에 티슈를 놓습니다. 녹인 파라핀을 임베딩 상자에 넣습니다. 조직을 4°C에서 6시간 동안 완전히 응고되도록 냉각합니다.
- 울트라마이크로톰 홀더에 샘플을 고정하고 샘플과 나이프 표면 사이의 각도를 5-10°로 유지하고 슬라이스 두께를 5μm로 조정합니다. 울트라마이크로톰을 이용하여 5μm 두께의 절편을 준비하고, 슬라이드를 40°C의 수조에 펼치고, 37°C에서 12시간 동안 슬라이드 건조기에서 절편을 건조시켰다.
- 슬라이드를 40 분 동안 200 mL의 크실렌, 6 분 동안 200 mL의 100 % 에탄올, 2 분 동안 200 mL의 95 % 에탄올, 2 분 동안 200 mL의 90 % 에탄올, 2 분 동안 80 % 에탄올 200 mL, 2 분 동안 70 % 에탄올 200 mL, 각각.
- 슬라이드를 증류수로 5분 동안 헹구고 실온에서 6분 동안 Mayer's hematoxylin 용액으로 염색합니다.
참고: Mayer의 헤마톡실린 용액: 0.011 mol/L 헤마톡실린, 6.7% 무수 에탄올, 0.646 mol/L 황산 알루미늄 칼륨 및 0.003 mol/L 요오드산 나트륨. - 흐르는 물에 슬라이드를 5분 동안 헹구고 증류수와 함께 2분 동안 배양합니다.
- 슬라이드를 1% 에탄올 염산염에 3초 동안 배양한 다음 흐르는 물에 2분 동안 헹굽니다.
- 샘플을 1% 에오신으로 15초 동안 염색한 다음 95% 에탄올로 5초, 100% 에탄올로 2분, 크실렌에서 40분 동안 배양합니다.
- 15 μL의 중성 고무와 24 x 50 mm 커버슬립을 사용하여 슬라이드를 밀봉합니다.
3. 면역형광 및 컨포칼 현미경
- 면역형광을 위해 마우스 고환의 5μm 두께의 파라핀 절편을 수집합니다. 슬라이드를 자일렌에서 40분, 100% 에탄올에서 6분, 95% 에탄올에서 2분, 90% 에탄올에서 2분, 80% 에탄올에서 2분, 70% 에탄올에서 2분 동안 배양합니다. 슬라이드를 증류수로 5분 동안 헹구고 슬라이드를 0.01M PBS로 5분 동안 헹굽니다.
- 항원 회수 용액(0.01M 구연산염 완충액)에 슬라이드를 넣고 항원 회수를 위해 압력솥을 사용하여 4분 동안 고압으로 끓입니다. 슬라이드를 실온으로 자연 냉각하십시오. 증류수로 5분 동안 두 번 헹구고 PBS로 5분 동안 헹굽니다.
참고: 0.01M 구연산염 완충액(pH 6.0): 2.1mmol/L 구연산, 11.6mmol/L 구연산 삼나트륨 이수화물. - 슬라이드를 500μL의 0.25% TritonX-100/PBS에서 10분 동안 배양하여 세포를 투과화합니다. 슬라이드를 PBS로 5분 동안 세 번 헹굽니다.
- 항원 차단을 위해 샘플을 300μL의 3% 소 혈청 알부민(BSA)/PBST(PBS의 0.1% Tween-20)와 함께 1시간 동안 배양합니다. 4°C에서 16시간 동안 3% BSA/PBST에서 1차 항체와 함께 샘플을 배양합니다. 슬라이드를 가습 상자에 넣어 티슈가 마르지 않도록하십시오. 슬라이드를 실온에서 30분 동안 자연 재가열합니다.
- 1차 항체를 버리고, 슬라이드를 PBST에서 5분 동안 3회 헹구었다. 2차 항체를 3% BSA/PBST로 희석합니다. 37°C에서 1-2시간 동안 2차 항체와 함께 샘플을 인큐베이션합니다. PBST에서 샘플을 5분 동안 5회 헹굽니다.
- 실온에서 5분 동안 50μL의 4', 6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 핵을 염색합니다. 페이드 방지 장착 매체로 커버슬립을 장착하고 매니큐어로 커버슬립을 밀봉합니다.
- NA 40x/0.75 대물렌즈가 장착된 형광 현미경을 사용하여 슬라이드의 형광 신호를 관찰하고 기록합니다.
4. 유세포 분석
- 6cm 페트리 접시에 마우스 고환을 수집하고 수술 용 가위를 사용하여 고환을 1mm3 개로 자릅니다.
- 1.5mL 원심분리 튜브에서 1% 콜라게나제 1mL를 사용하여 37°C에서 10분 동안 고환을 분해한 다음 샘플을 1,000 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 정자 형성 세포를 침전시킵니다.
- 상층액을 버리고 0.25% 트립신-EDTA(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid) 용액 1mL를 가하여 37°C에서 20분간 처리한 후 시료를 1,000 x g 에서 5분간 원심분리한다.
- 상층액을 버리고, 침전된 세포를 4°C에서 8시간 이상 동안 70% 차가운 에탄올 1 mL와 함께 배양한다.
- 샘플을 1,000 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 세포 침전물을 수집합니다. 500μL 프로피듐 요오드화물(PI) 염색 용액(50μg/mL PI, 100μg/mL RNase A 및 0.2% Triton X-100 in PBS)으로 정자 형성 세포를 37°C에서 30분 동안 염색합니다.
알림: 세포 응집을 방지하기 위해 5분마다 원심분리기 튜브를 부드럽게 흔듭니다. - 세포 파편을 제거하기 위해 300 메쉬 스크린을 사용하여 샘플을 필터링합니다. 플로우 튜브에 세포를 모아 4°C에서 보관합니다.
- 유세포 분석기를 사용하여 488nm의 여기 파장에서 형광 신호와 광 산란을 검출합니다. Modfit MFLT32 소프트웨어를 사용하여 DNA 함량 및 광 산란을 분석합니다.
5. 투과 전자 현미경
- 날카로운 메스를 사용하여 고환을 1mm 3개로 자르고, 미세구조의 변화를 피하기 위해 4°C에서 4시간 동안 0.1M PBS(pH 7.2)에서3 % 글루타르알데히드-1.5% 파라포름알데히드 용액으로 샘플을 빠르게 배양합니다. 샘플을 0.1M PBS로 5분 동안 3회 헹굽니다.
알림: 메스와 가위는 날카로워야 하며 인위적으로 쥐거나 당기지 않도록 해야 합니다. 샘플의 처리는 고정 유체에서 수행되어야합니다. - 샘플을 4°C에서 1.5시간 동안 1% 오스믹산-1.5% 페로시안화 칼륨 용액에 고정합니다. 여과지로 물을 건조시키고 샘플을 0.1M PBS로 5분 동안 세 번 헹굽니다.
- 샘플을 4°C에서 10분 동안 50% 에탄올 40mL로 탈수합니다. 시료를 4°C에서 70% 에탄올 포화 우라늄 아세테이트 염료 40mL에 12시간 동안, 90% 에탄올 40mL에 4°C에서 10분 동안, 90% 에탄올-아세톤 40mL에 실온에서 10분 동안, 무수 아세톤 40mL에 실온에서 3회 10분 동안 배양한다.
- 샘플을 무수 아세톤-에폭시 수지 618 임베딩제(v/v = 1:1) 혼합물에서 1.5시간 동안 인큐베이션한 다음, 샘플을 에폭시 수지 618 임베딩제에 3시간 동안 35°C에서 포매합니다.
- 수지 중합을 위해, 에폭시 수지 618 매립제에서 샘플을 35°C에서 12시간 동안, 45°C에서 12시간 동안, 그리고 60°C에서 24시간 동안 배양한다.
- 샘플과 유리 칼을 설치한 다음 샘플과 칼 사이의 거리를 조정합니다. 초박형 마이크로톰을 사용하여 90nm 두께의 초박형 절편을 준비합니다. 샘플을 일정한 속도로 슬라이스한 다음 슬라이드를 니켈 메쉬에 놓습니다. 슬라이드를 실온의 페트리 접시에 놓습니다.
- 슬라이드를 2% 우라닐 아세테이트로 10분 동안 염색한 다음 2% 구연산납으로 10분 동안 샘플을 염색합니다. 슬라이드를 증류수로 헹굽니다. 슬라이드를 실온에서 24시간 동안 건조시킵니다.
- 슬라이드를 관찰하고 투과 전자 현미경을 사용하여 70-100kV에서 전자 이미지를 기록합니다.
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Representative Results
복부 수술과GSK923295 19의 고환 주사를 통해 마우스 고환의 in vivo CENP-E 억제 모델을 성공적으로 구축했습니다. 이 방법의 주요 기술 단계는 그림 1에 나와 있습니다. 4일 동안 GSK923295의 고환 주사 후, 추가 분석을 위해 고환을 채취하였다. 대조군에서, 정세관의 정자 형성 파동은 규칙적이고 조직적이었다 (그림 2A). 그러나, GSK923295 그룹에서, 정세관에서 정자 형성 파동이 변경되었고, 중기 정지 된 일차 정자 세포는 CENP-E 억제 후 유의하게 증가했다 (그림 2B-D). 중요하게도, 여러 상동 염색체가 CENP-E 억제 후 적도 판에서 정렬되지 않았습니다(그림 2B-D). 또한, CENP-E 억제는 또한 정세뇨관에서 중기 I 정자 세포의 증가로 이어졌습니다(그림 2E,F,G). 종합하면, CENP-E 억제는 감수 분열 I 동안 일차 정자 세포에서 염색체 정렬 불량을 초래하며, 이는 CENP-E가 감수 분열에서 정자 세포의 염색체 의회 및 정렬을 담당한다는 것을 시사합니다.
이러한 결과를 추가로 검증하기 위해 면역형광 분석을 수행하여 정세관에서 정자 형성 세포를 검출했습니다. 우리는 대조군에서 나타난 규칙적인 정자 형성 파동이 GSK923295 그룹에서 분명히 변화하고 불규칙해졌다는 것을 발견했습니다(그림 3). 분열하는 정자의 감수분열 방추는 항-α-튜불린 항체로 표지되었고, 정자 세포에서 시냅톤 복합체의 횡 필라멘트는 항-시냅톤 복합체 단백질 3(SYCP3) 항체로 표지되었습니다(그림 3A). 정세뇨관당 SYCP3 양성 세포는 CENP-E 억제 후 감소했습니다(그림 3B). 한편, 중기 세포당 SYCP3 도트는 CENP-E 억제 후 파괴되지 않았습니다(그림 3C). 또한, 세포당 SYCP3 스트레치도 GSK92395 그룹에서 영향을 받지 않았습니다(그림 3D). 놀랍게도, 우리는 중기 I 정자 세포에서 방추 극의 거리가 CENP-E 억제 후에 증가한다는 것을 발견했습니다(그림 3E,F). 이러한 면역형광 결과는 CENP-E가 염색체 정렬 불량 및 정자 형성 과정에 필요하며 양극성 방추의 유지 및 감수분열 방추의 조직에 없어서는 안될 필수 요소임을 시사합니다.
마우스 고환의 세포 집단을 조사하기 위해 고환을 소화하고 PI 염색 및 유세포 분석을 수행했습니다(그림 4). 중요한 기술 절차는 그림 4A-C에 나와 있습니다. 정자 형성 세포는 정자, 일차 정자 세포, 이차 정자 세포, 정자 및 정자를 포함한 여러 세포 집단으로 구성됩니다. 이들 정자 형성 세포의 DNA 함량을 도 4A에 나타내었다. 우리는 CENP-E 억제가 반수체 세포의 42.95 ± 대조군의 1.09%에서 GSK923295 그룹의 38.26 ± 1.86%로 감소하는 결과를 가져왔다는 것을 입증했습니다(그림 4B-D). 이배체 세포와 이수성 세포의 비율은 CENP-E 억제 후 유의한 영향을 받지 않았습니다(그림 4E,F). 또한, 사배체 세포의 비율은 대조군에서 17.76± 1.52%에서 GSK923295군에서 28.88± 2.05%로 증가한다(도 4G). 종합하면, 우리는 정자 형성 세포의 세포 집단이 CENP-E 억제 후에 약간 변경된다는 것을 발견했습니다. CENP-E 억제는 반수체 세포의 감소 및 사배체 세포의 증가를 초래하며, 이는 CENP-E 억제가 분열하는 정자세포에서의 중기 정지와 관련이 있음을 나타낸다.
또한, 우리는 투과 전자 현미경을 사용하여 정자 형성 세포의 미세 구조를 관찰했습니다 (그림 5). 정자의 염색질 조직, 소포체 및 미토콘드리아를 도 5에 나타내었다. 우리는 정자 형성 세포의 조직이 GSK923295 그룹에서 약간 파괴되었음을 발견했습니다 (그림 5).
그림 1: 복부 수술 및 고환 투여를 통한 마우스 고환의 생체 내 억제 모델 확립. (A) 복부 수술에 사용되는 모든 수술 도구. 1) 해부 가위, 2) 바늘 집게, 3) 직선 집게, 4) 핀셋, 5) 레오다인, 6) 1mL 주사기, 7) 3번 손잡이와 11번 날이 있는 메스, 8) 스타일로라이트, 9) 원형 바느질 바늘, 1/2 0.6 x 14mm, 1/2 0.7 x 17mm, 10) 에탄올 면봉. (b) 마취 후, 마우스를 왁스 트레이 위에 앙와위 자세로 놓고, 하복부를 준비하고, 75% 에탄올로 소독하였다. (C) 하복부 중앙에 <5mm의 구멍이 생겼습니다. (D) 고환을 찾기 위해 멸균 해부 겸자로 부고환 지방 패드를 당겼습니다. 고환에 10 μL GSK923295 10 μL rheodyne을 사용하여 주입하였다. (E) 복막과 피부를 두 바늘로 동시에 봉합하였다. (F) 상처를 75% 에탄올로 소독하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: CENP-E 억제는 마우스 정자세포에서 감수분열 I의 정지 및 염색체 정렬 불량을 초래 했습니다. (A) 대조군의 정자 형성 세포의 HE 염색. 화살표는 정자 세포를 나타냅니다. (b) GSK923295 그룹의 정자 형성 세포의 HE 염색. 고환에 10 μM의 최종 농도로 4 일 동안 GSK923295를 주입 하였다. 화살표는 정자 세포의 염색체 정렬 불량을 나타냅니다. 모든 이미지에 대해 스케일 바, 10μm. (C) 정세관에서 중기 정자 세포의 비율. 대조군, 13.43 ± 1.68%; GSK923295 42.29 ± 3.94 %입니다. N=1308 세포를 분석하였다. 그룹 = 4. 학생의 t-검정. 오차 막대는 SEM± 의미합니다. ***, P < 0.001. (D) 정자 세포를 분열시키는 정세관의 비율. 대조군, 5.38 ± 2.64%; GSK923295 33.96 ± 3.87 %입니다. N = 151개의 정세관을 분석하였다. 그룹 = 4. (E) 대조군 및 GSK923295군에서 Histone H3(phospho Ser 10) 및 TUBA4A의 면역형광 이미지. TUBA4A, 빨간색; 히스톤 H3 (포스포Ser 10), 녹색; DAPI, 파란색. 스케일 바, 10 μm. 확대된 상자가 확대됩니다. (F) 정세관의 중기 세포 수의 정량화. 제어, 11.45 ± 1.55; GSK923295, 18.91 ± 2.36. N = 11입니다. (지, H) 대조군(G)과 GSK923295 그룹(H)의 중기 I 정자 세포에서 히스톤 H3 및 TUBA4A의 형광 강도에 대한 라인 스캔 분석. TUBA4A, 빨간색; 히스톤 H3 (포스포Ser 10), 녹색; DAPI, 파란색. X축은 상대 거리를 나타냅니다. Y축은 형광 강도를 나타냅니다. 학생의 t-검정. 오차 막대, 평균 ± SEM. *, P < 0.05; ***, P < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: GSK923295에 의한 CENP-E 억제는 정세뇨관의 해체와 정자 형성의 파괴로 이어졌습니다 . (A) 대조군 및 GSK923295군에서 SYCP3 및 TUBA4A의 대표적인 면역형광 이미지. SYCP3, 빨간색; TUBA4A, 녹색; DAPI, 파란색. 스케일 바, 10μm. (B) 대조군 및 GSK923295군의 정세관당 SYCP3 양성 세포. 대조군, 56.00 ± 5.43%; GSK923295 39.00 ± 1.73 %입니다. N = 10입니다. (C) 중기 세포당 SYCP3 점의 정량화. 제어, 10.00 ± 1.02; GSK923295, 9.71 ± 0.86, N = 7. (D) 대조군 및 GSK923295 그룹의 세포당 SYCP3 스트레치의 정량화. 제어, 8.63 ± 0.22; GSK923295, 8.21 ± 0.21. N = 19입니다. (E) 중기 I 정자 세포에서 방추 극의 거리 분석. 대조군, 8.20 ± 0.28 μm; GSK923295, 9.30 ± 0.29 μm. N = 30. (F) 대조군과 GSK923295군에서 정세뇨관의 면역형광 이미지. 화살표는 정자 세포를 나타냅니다. DAPI, 녹색; β-튜불린, 녹색. 점선 상자의 확대 이미지가 확대/축소에 표시되었습니다. 모든 이미지에 대해 스케일 바, 10μm. 스튜던트 t-검정. 오차 막대, 평균 ± SEM. ns, P > 0.05; **, P < 0.01입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 마우스 고환에서 정자 형성 세포의 유세포 분석 (A) 마우스 정자 형성 세포의 세포주기 분석의 주요 단계에 대한 개략도. 이배체 정자 세포는 감수 분열 I 및 II를 거쳐 반수체 정자를 형성합니다. C 값은 DNA 함량을 나타냅니다. N 값 (배수형)은 염색체 세트의 수를 나타냅니다. (나,씨) 대조군(B)과 GSK923295군(C)의 정자형성 세포의 유세포 분석. 생체 내 CENP-E 억제를 위해, GSK923295 3주령의 수컷 ICR 마우스 고환에 최종 농도 10 μM로 4일 동안 주사하였다. 세포 주기 분석을 위해, n=3,000 세포를 측정하고 분석하였다. P4, 반수체 세포(1C). P5, 이배체 세포(2C). P6, 사배체 세포(4C). (D) 대조군 및 GSK923295 그룹의 반수체 세포의 비율. 대조군, 42.95 ± 1.09%; GSK923295 38.26 ± 1.86 %입니다. N = 8입니다. (E) 대조군 및 GSK923295 그룹의 이배체 세포의 비율. 대조군, 20.10 ± 0.91%; GSK923295 17.95 ± 0.81 %입니다. N = 8입니다. (F) 대조군 및 GSK923295군에서 이수성 세포(2C~4C)의 비율. 대조군, 3.41 ± 0.23%; GSK923295 3.39 ± 0.25 %입니다. N = 8입니다. (G) 대조군 및 GSK923295 그룹의 사배체 세포의 비율. 대조군, 17.76 ± 1.52%; GSK923295 28.88 ± 2.05 %입니다. N = 8입니다. 모든 그래프에 대해 Student's t test입니다. 오차 막대, 평균 ± SEM. ns, P > 0.05; *, P < 0.05; , P < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 대조군과 GSK923295군의 정자 형성 세포의 전자 현미경 분석 . (A) 대조군의 정세뇨관의 대표 이미지. 스케일 바, 5 μm. (B) 정자 세포의 핵의 확대 이미지. 화살표는 정자 세포의 상동 염색질을 나타냅니다. 스케일 바, 1 μm. (C) 정자 세포의 세포질의 확대 이미지. 스케일 바, 1 μm. (D) GSK923295 그룹의 정세관의 대표 이미지. 고환을 4일 동안 10μM GSK923295로 처리하였다. 스케일 바, 5 μm. (E) GSK923295 그룹의 정자 세포 핵의 확대 이미지. 스케일 바, 1 μm. (F) GSK923295 그룹의 정자 세포 세포질의 확대 이미지. 스케일 바, 1 μm. 모든 그래프에 대해, sc, 정자세포; SD, 정자. ER, 소포체; MT, 미토콘드리아. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본 연구에서는 복부 수술과 GSK923295의 미세주입을 이용하여 마우스 고환의 in vivo CENP-E 억제 모델을 확립하였다. 본 연구에서 사용한 복부 수술 및 고환 주사 방법은 다음과 같은 장점이 있다. 첫째, 생쥐의 나이에 한정되지 않는다. 실험자는 초기 단계, 예를 들어 3 주 된 어린 마우스에서 고환 주사를 수행 할 수 있습니다. 둘째, GSK923295는 CENP-E에 특이적이고 우수한 억제 효과를 갖는다. 셋째, 이 방법은 작동이 간단하고 재현성이 높습니다. 또한, 고환의 완전성이 유지되며, 이는 장기의 맥락에서 손상되지 않은 조직의 연구에 적합합니다.
이 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 예를 들어, 수술 후 감염의 예방을 위해 복부 수술 중 무균 환경을 유지하는 것이 중요하다31. 또한, 다른 연령 또는 다른 실험 동물의 마우스의 경우, 주사량은 고환의 크기와 약물의 효과에 따라 적절하게 조절되어야한다19,32. 또한, 적절한 소화 시간과 현미경 관찰은 유세포 분석 중 단일 세포 측정 및 후속 세포 집단 테스트를 위해 필요합니다. 그러나 이 프로토콜에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 생후 2주 미만인 경우 복부 수술을 사용하여 마우스 모델을 구성하는 것은 어렵습니다. 주된 이유는 생쥐가 너무 어리고 수술 후 식단이 어렵고 생존율이 낮기 때문입니다. 동물 모델에 사용되는 약물은 액체이며 세포막 19,32,33을 쉽게 관통하는 특성을 가지며, 이는 이러한 투여 방법의 적용에 적합하다.
감수분열에 대한 이해는 시험관 내 세포 배양 및 유전자 녹아웃 연구에 의해 자극되지만, 포유류의 정자세포에는 쉽게 적용할 수 없다28. 남성 감수 분열에 대한 기계론적 연구의 장애물은 감수 분열에서 분열하는 정자 세포의 조작 및 관찰을 위한 적절한 시스템의 부족이었습니다27. 마우스는 정자 형성 중 감수 분열의 세포 및 분자 메커니즘 연구에서 우수한 모델 유기체입니다. 마우스 정자 세포의 첫 번째 물결은 산후 10일째(dpp)에 감수분열을 시작하여 35dpp에서 성숙한 정자로 발달하며, 이는 감수분열 및 정자 형성 연구를 위한 발달 시간 창을 제공합니다34.
음낭을 통한 직접 주사와 복부 수술을 통한 미세 주사를 포함한 고환 주사는 정자 형성 연구에 유용한 기술이다35,36. 음낭을 통한 직접 주사는 빠르고 간단하며 경미한 외과 적 외상을 유발하므로 고환이 음낭으로 내려가는 4 주 이상의 생쥐에게 적합합니다. 그러나 3 주 된 어린 생쥐의 하강하지 않은 고환을 주입하는 것은 불가능합니다. 복강내 수술 또는 음낭 수술을 통한 미세주입은 실험 조작자의 능숙한 수술 기술, 실체현미경, 수술 및 실험실 장비가 필요한 하강하지 않은 고환의 주입에 적합합니다. 주사 부위에 따라 미세주입은 정세관 주입, 고환망 주사, 고환 간질 주사로 분류할 수 있습니다. 다른 주사 기반 고환 모델과 비교할 때, 복부 수술을 통한 억제제 주입은 단백질의 기능을 효과적으로 억제 할 수 있으며 세포막 침투, 쉬운 절차 및 장기 억제에 이점이 있습니다19,32. siRNAs, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 렌티바이러스를 이용하는 방법은 세포막의 낮은 침투 효율, off-target 부작용 및 생체 내에서 siRNA 또는 올리고뉴클레오티드의 쉬운 분해에 더 큰 한계가 있다 37,38,39,40.
생체 조직의 감수 분열은 조직 구조, 생체 내 발달 신호 및 환경 요인을 고려해야 하는 배양 조건보다 더 복잡합니다41. 이전 연구에서는 배양 배지와 세포 자율 요인이 감수분열 단계의 시작을 자극하는 데 중요하다는 것을 입증했습니다. 예를 들어, 포스파타제 억제제 오카다익산(OA)42, 정자 세포 특이적 히스톤 HIST1H1T 43, 토포이소머라제 II44 및 중기 촉진 인자(MPF)45는 배양된 정자세포에서 G2/MI 전이를 촉진합니다. 이러한 복잡한 배양 조건과 요인은 정자 세포의 단기 배양의 한계에 기여합니다.
고환으로의 플라스미드 DNA의 직접 주입은 고환 매개 유전자 전달 및 형질전환 마우스의 생산에 성공적으로 적용된다32,46. 생체 내 전기천공은 DNA 발현 플라스미드를 정세관의 내강에 주입한 다음 일련의 전기 펄스를 사용하여 세포막 투과성을 변경하고 이식유전자 발현 효율을 개선하며 유전자 변형을 포함합니다(45,46,47,48,49). 우리의 방법은 생체 내 전기천공, 형광 태그 단백질 및 유전자 편집 도구와 결합될 수 있으며, 이 접근 방식은 조직 및 기관의 생리학적 맥락에서 남성 감수분열 분석에 더욱 강력해집니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
유용한 토론을 해주신 Fujian Medical University의 Cytoskeleton Laboratory의 모든 구성원에게 감사드립니다. 유세포 분석에 대한 기술 지원을 해주신 Fujian Medical University Public Technology Service Center의 Jun-Jin Lin에게 감사드립니다. 전자 현미경에 대한 기술 지원을 위해 Fujian Medical University 공공 기술 서비스 센터 전자 현미경 연구실의 Ming-Xia Wu와 Lin-Ying Zhou에게 감사드립니다. Fujian Medical University의 기초 의학 실험 교육 센터의 Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke 및 Jun Song의 지원에 감사드립니다. 이 연구는 다음과 같은 보조금의 지원을 받았습니다: 중국 국립 자연 과학 재단(보조금 번호 82001608), 중국 푸젠성 자연 과학 재단(보조금 번호 2019J05071), 복건성 보건 기술 프로젝트(보조금 번호 2018-1-69), 과학 연구 창업 기금, 복건 의과 대학(보조금 번호 2017XQ1001), 복건 의과 대학 고급 인재 과학 연구 창업 자금 지원 프로젝트(보조금 번호 XRCZX2017025) 및 연구 프로젝트 한의학 대학원생의 온라인 교육 및 교육(보조금 번호 B-YXC20200202-06).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 1 ml Syringe | Several commercial brands available | Sterile. | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430828 | |
| 6 cm Petri dish | Corning | 430166 | |
| 95% Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009164 | |
| tubulin rabbit polyclonal antibody | Beyotime | AF0001 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibody | Abcam | ab267372 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibody | Sangon Biotech | D110022 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab175191 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | 188105 | |
| Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibody | Beyotime | A0423 | Sencodary antibody. Use at 1:500. |
| Aluminium potassium sulphate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10001060 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 100092690 | |
| Anti-fade mounting medium | Beyotime | P0131 | Prevent photobleching of flourescent signals. |
| BD FACS Canto II | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69003435 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424BK745380 | |
| Chloral hydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80037516 | |
| Citric acid | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 122670 | |
| Collagenase | Sangon Biotech | A004194-0100 | |
| Coverslips | CITOTEST | 10212020C | 20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm. |
| DAPI | Beyotime | C1006 | |
| Dye vat | Several commercial brands available | 91347802 | |
| Eosin Y, alcohol soluble | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71014460 | |
| Ether | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009318 | |
| Formaldehyde - aqueous solution | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10010018 | |
| GSK923295 | MedChemExpress | HY-10299 | |
| Hematoxylin, anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71020784 | |
| ICR mouse | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd | ||
| Image J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | Fluorescent image analysis. |
| Leica ultramicrotome | Leica | ||
| Leica EM UC-7 ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Modfit MFLT32 | Verity Software House | For analysis of flow cytometry results. | |
| Nail polish | Several commercial brands available | ||
| Neutral gum | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10004160 | |
| Nikon Ti-S2 microscope | Nikon | Ti-S2 | |
| Picric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | J60807 | |
| Rheodyne | Sangon Biotech | F519160-0001 | 10 μl rheodyne |
| Sliced paraffin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69019461 | |
| Sodium iodate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80117214 | |
| Surgical instruments | Several commercial brands available | For abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min. | |
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 173970 | |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30188928 | Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution. |
| Tween 20 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30189328 | Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution. |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80096618 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10023418 |
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