Summary
Dit protocol beschrijft de methoden van subcultuur en cryopreservatie van oesofageale adenocarcinoom organoïden met en zonder eencellige vertering om onderzoekers in staat te stellen geschikte strategieën te kiezen op basis van hun experimentele ontwerp.
Abstract
Het gebrek aan geschikte translationele onderzoeksmodellen die primaire ziekte weerspiegelen om tumorigenese en therapeutische strategieën te onderzoeken, is een groot obstakel bij oesofageaal adenocarcinoom (EAC). Patient-derived organoids (PDOs) zijn onlangs naar voren gekomen als een opmerkelijk preklinisch model in een verscheidenheid aan kankers. Er zijn echter nog steeds beperkte protocollen beschikbaar voor het ontwikkelen van OAG-BOB's. Zodra de BOB's zijn vastgesteld, zijn de vermeerdering en cryopreservatie essentieel voor verdere downstream-analyses. Hier zijn twee verschillende methoden gestandaardiseerd voor EAC PDOs subcultuur en cryopreservatie, d.w.z. met en zonder eencellige vertering. Beide methoden kunnen op betrouwbare wijze de juiste levensvatbaarheid van de cel verkrijgen en zijn toepasbaar voor een diverse experimentele opstelling. De huidige studie toonde aan dat het subcultureren van EAC-BOB's met eencellige spijsvertering geschikt is voor de meeste experimenten die celnummercontrole, uniforme dichtheid en een holle structuur vereisen die het volgen van de grootte vergemakkelijkt. De op één cel gebaseerde methode laat echter een langzamere groei zien in de teelt en na herkweek uit bevroren bestanden. Bovendien wordt subculturing met eencellige spijsvertering gekenmerkt door het vormen van holle structuren met een holle kern. Daarentegen is het verwerken van EAC-BOB's zonder eencellige vertering gunstig voor cryopreservatie, expansie en histologische karakterisering. In dit protocol worden de voor- en nadelen beschreven van subculturen en cryopreservatie van EAC BOB's met en zonder eencellige vertering om onderzoekers in staat te stellen een geschikte methode te kiezen om hun organoïden te verwerken en te onderzoeken.
Introduction
Slokdarmkanker (EC) is de tiende meest voorkomende en de zesde belangrijkste doodsoorzaak van kanker wereldwijd1. Oesofageaal adenocarcinoom (EAC) is een van de belangrijkste histologische subtypen van EC en komt voornamelijk voor in westerse landen2. In het afgelopen decennium is de EAC-incidentie aanzienlijk toegenomen in veel ontwikkelde landen, waaronder Duitsland3. Vanwege de agressiviteit van kanker en het ontbreken van symptomen tijdens het vroege stadium van tumorontwikkeling, is de algemene prognose bij EAC-patiënten slecht, met een 5-jaarsoverleving van ongeveer 20% 2,4,5.
Sinds het einde van de twintigste eeuw zijn er verschillende modellen opgesteld voor het biomedisch onderzoek van EAC. De klassieke menselijke EAC-cellijnen die werden opgericht in de jaren 19906, breiden onze kennis van EAC-tumorbiologie, tumorgenetica en antitumorstrategieën uit en worden vaak gebruikt in EAC-onderzoek. Bovendien hebben sommige onderzoeksgroepen met succes diermodellen van EAC of Barrett's slokdarm ontwikkeld door de dieren bloot te stellen aan bekende risicofactoren zoals gastro-oesofageale reflux door chirurgische of inflammatoire benaderingen 7,8,9. Daarnaast werden patiënt-afgeleide xenograft (PDX) modellen die EAC primaire kankerweefsels subcutaan of orthotopisch enten in immunodeficiënte muizen, ontwikkeld om menselijk EAC tumor biologisch gedrag en tumoromgeving te simuleren 10,11,12. Ondanks dat deze modellen klinische toepassingen verbeteren en ons begrip van moleculaire mechanismen achter EAC-tumorigenese en progressie, is er nog steeds een grote uitdaging om de resultaten van deze onderzoeksmodellen naar mensen te extrapoleren.
Patiënt-afgeleide tumor organoïden (BOB's) worden gekweekt in een 3D-kweeksysteem dat de menselijke ontwikkeling en orgaanregeneratie in vitro nabootst. Gegenereerd uit het primaire weefsel van patiënten, reconstrueren PDO's de moleculaire en fenotypische kenmerken van de menselijke tumor en hebben veelbelovende toepassingen aangetoond bij de ontwikkeling van geneesmiddelen en gepersonaliseerde kankerbehandeling13,14. Door tien gevallen van EAC-BOB's te vergelijken met hun gepaarde tumorweefsel, wordt gemeld dat EAC-BOB's vergelijkbare histopathologische kenmerken en genomisch landschap delen met de primaire tumor, intratumorering heterogeniteit behouden en efficiënte screening van geneesmiddelen in vitro15 vergemakkelijken. EAC PDO's werden ook gebruikt bij het bestuderen van de interactie van EAC-tumorcellen met patiënt-afgeleide kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs), wat wijst op een krachtige toepassing op het gebied van tumormicro-omgevingsonderzoek16. Helaas zijn er beperkte protocollen beschikbaar voor het ontwikkelen en verspreiden van EAC-BOB's. Hier worden twee verschillende methoden beschreven voor het subcultureren en conserveren van EAC-BOB's in detail: met en zonder eencellige vertering. De gestandaardiseerde methoden voor het onderhoud van EAC BOB's en hun toepassingen kunnen onderzoekers ondersteunen bij het kiezen van geschikte methoden voor verschillende doeleinden in hun EAC BOB-onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Een gevestigde en goed groeiende BOB-cultuur vormt de basis voor een succesvolle subcultuur en cryopreservatie zoals beschreven in dit protocol. Hier werden EAC BOB's gegenereerd uit het primaire tumorweefsel van EAC-patiënten met behulp van het protocol beschreven door Karakasheva T. A. et al17. EAC-weefsels werden verzameld uit de biobank onder de goedkeuring van BioMaSOTA (goedgekeurd door de ethische commissie van de Universiteit van Keulen, ID: 13-091).
OPMERKING: EAC-BOB's zijn gekweekt in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2 met behulp van een BOB-kweekmedium (tabel 1). In de volgende stappen worden twee methoden van de subcultuur in detail beschreven. Een 12-well plaat wordt aanbevolen voor het subcultureren van de BOB's met een zaaidichtheid van drie extracellulaire matrix (ECM) gel domes per put, omdat het flexibel gebruik van elke put en de juiste hoeveelheid BOB's voor verschillende doeleinden mogelijk maakt. Een aseptische techniek is verplicht bij het hanteren van de BOB's.
1. Voorbereidingen vooraf
- Verwarm een 12-well plaat voor door deze een nacht voor de subcultuur in een CO2-incubator van 37 °C te plaatsen om een volledige opwarming van de plaat te garanderen. Gebruik, indien beschikbaar, lege putten van een plaat met de huidige BOB-cultuur.
OPMERKING: Continue opslag van 1-2 verse platen bij 37 °C wordt aanbevolen voor flexibele subcultuurplanning. - Koel 1.000 μL en 200 μL tips voor met een brede opening bij -20 °C (continue opslag aanbevolen). Centrifuge voorkoelen bij 4 °C.
- Stel de temperatuur van de roterende incubator in op 37 °C (als eencellige vertering wordt uitgevoerd).
- Incubeer een geschikt volume ECM-gel gedurende 1 uur op ijs om vloeibaar te maken. Plaats de celhersteloplossing op ijs.
2. Organoïden oogsten
- Verwijder de plaat met groeiende BOB's uit de CO2-incubator.
- Zuig oud medium op met behulp van een vacuümpomp.
OPMERKING: Vermijd het aanraken van de koepels. - Voeg een geschikt volume ijskoude celterugwinningsoplossing (500 μL/koepel) toe aan de put.
- Desintegreer de ECM-gel door meerdere keren op en neer te pipetteren om ECM-gelkoepels in kleine stukjes te fragmenteren met behulp van 1.000 μL-uiteinden met een brede opening.
- Combineer het mengsel van BOB, ECM-gel en celterugwinningsoplossing uit maximaal twee putten (zes koepels) en breng het over in een laag bindbuis van 5 ml (gebruik een tweede buis voor het geval er meer putten worden gebruikt voor subcultuur).
OPMERKING: Voeg eventueel, als ECM-gel niet volledig is opgelost, een extra 1,5 ml celhersteloplossing toe aan het mengsel van BOB, ECM-gel en celhersteloplossing. - Incubeer de buis met het mengsel in stap 2.5 op ijs gedurende 20 minuten, meng elke 5 minuten door de buis vijf keer om te keren om de vloeibaarmaking van de ECM-gel te garanderen.
- Centrifugeer bij 500 x g gedurende 4 min bij 4°C.
- Als er na het centrifugeren een zichtbare en stabiele pellet is, gaat u verder met stap 2.10. Ga anders verder met stap 2.9.
- Als er geen zichtbare pellet is en de BOB's nog steeds vast lijken te zitten in een gelfase, verwijder dan voorzichtig het supernatant met een vacuümpomp totdat de fase met ECM-gel-BOB-Solution is bereikt en voeg 3 ml ijskoude celterugwinningsoplossing toe.
- Keer de buis een paar keer om en incubeer nog 10 minuten op ijs. Meng door de buis van tijd tot tijd om te keren.
- Centrifugeer bij 500 x g gedurende 4 minuten bij 4 °C en ga verder met stap 2.10.
- Gooi het supernatant voorzichtig weg met behulp van een vacuümpomp of een pipet van 1.000 μL. Probeer het supernatant zoveel mogelijk te verwijderen.
OPMERKING: Vanwege het lage bindoppervlak van de buis zal de pellet niet zo stabiel zijn als normaal. - Bewaar de BOB-pellet op ijs en ga verder met stap 3 (zonder vertering) of stap 4 (met eencellige vertering), afhankelijk van de verschillende doeleinden.
3. Subculturen zonder vertering
OPMERKING: Deze methode is bedoeld om de grootte en dichtheid van de BOB's te vergroten. De grotere omvang en hogere dichtheid vergemakkelijken het inbeddingsproces, histologische karakterisering en BOB-uitbreiding. Afhankelijk van de PDO-splitsingsverhoudingen (op basis van de dichtheid van BOB's wordt een verhouding tussen 1:3 en 1:6 aanbevolen), resuspendeert u de pellet uit stap 2.8 in een geschikt volume vloeibare ECM-gel.
- Verwijder voorgekoelde uiteinden van 200 μL en 1.000 μL met een brede opening uit de vriezer van -20 °C en plaats ze op een schone bank.
- Resuspend de pellet uit stap 2.11 in ECM-gel met behulp van voorgekoelde tips van 1.000 μL. Meng door ongeveer 10 keer op en neer te pipetteren om ervoor te zorgen dat BOB's niet klonteren en gelijkmatig worden verdeeld in de ECM-gel.
OPMERKING: Gebruik 50 μL ECM gel/dome. Bereken altijd voor één koepel meer dan nodig is (bijvoorbeeld voor negen koepels (d.w.z. drie putten), resuspend de pellet in 500 μL vloeibare ECM-gel (450 + 50 μL extra). Probeer te voorkomen dat er bubbels ontstaan tijdens resuspensie! - Verwijder de voorverwarmde 12-well plaat uit de incubator vlak voordat je de koepels inzaait.
- Zaadkoepels met 50 μL ECM-gel in de warme plaat (drie koepels/put). Vermijd pipetteerbellen in de ECM-gelkoepels.
- Plaats de plaat terug in de incubator van 37 °C en 5% CO2en incubeer gedurende 20-30 minuten om de ECM-gel te stollen.
- Voeg voorverwarmd BOB-medium (tabel 1) voorzichtig toe zonder de koepels te storen.
- Kweek de BOB's gedurende 7-14 dagen totdat de vereiste dichtheid en morfologie optreden.
4. Subculturing met eencellige vertering
LET OP: De volgende stappen zijn bedoeld om het aantal BOB's per dome te verhogen. De eencellige vertering vergemakkelijkt de controle van het celnummer en de PDO-expansie.
- Bereid het verteringsmedium door 2 ml van 0,25% Trypsine-EDTA en 20 μL DNase I (voor de vertering van drie koepels) te mengen.
- Resuspend de pellet uit stap 2.11 met een geschikt volume voorverwarmd 0,25% Trypsine-EDTA + DNase I en meng het ongeveer 10 keer door op en neer te pipetteren met een pipet van 1.000 μL (gebruik normale 1.000 μL-tips).
- Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 °C in een roterende incubator met een rotatiesnelheid van minimaal 28 tpm.
- Bereid een buis van 15 ml met 6 ml soja-trypsineremmer (soa, tabel 2) oplossing (per 2 ml 0,25% trypsine-EDTA).
- Meng na de vertering de verteerde BOB's een paar keer grondig met een pipet van 1.000 μL om de BOB's te verstoren.
- Breng de verteerde BOB's over in de buis van 15 ml met soa-oplossing om het verteringsproces te stoppen.
- Centrifugeer bij 500 x g gedurende 4 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant voorzichtig weg met behulp van een vacuümpomp of een pipet van 1.000 μL. Resuspend de pellet in 1 ml basaal medium (tabel 3).
- Bepaal de celconcentratie en levensvatbaarheid met behulp van een geautomatiseerde celteller of een hemocytometer.
- Zaad verteerde BOB tot een 12-well plaat met 2 x 104 cellen per koepel.
- Bereken het celgetal volgens de koepels die gepland zijn voor het zaaien en breng ze over naar een verse 1,5 ml lage bindbuis.
OPMERKING: Bereken voor één koepel meer (+ 2 x 104 cellen extra). Neem bijvoorbeeld voor het zaaien van drie koepels in één put 8 x 104 (2 x 104 * 3 + 2 x 104 extra) cellen. - Centrifugeer bij 500 x g gedurende 4 minuten bij 4 °C.
- Als er geen zichtbare pellet is, onthoud dan de oriëntatie van de buis in de centrifuge om te weten waar de pellet zich bevindt.
- Gooi het supernatant voorzichtig weg met een pipet van 1.000 μL. Verwijder het supernatant zoveel mogelijk zonder de pellet te storen.
- Voeg het juiste volume ECM-gel toe aan de pellet met behulp van een pipet van 1.000 μL met voorgekoelde 1.000 μL brede opening (50 μL/dome + 50 μL extra).
- Volg stappen 3.3-3.7.
- Bereken het celgetal volgens de koepels die gepland zijn voor het zaaien en breng ze over naar een verse 1,5 ml lage bindbuis.
5. Cryopreservatie van de verteerde en onverteerde BOB's
OPMERKING: Eencellige verteerde en onverteerde BOB's zijn geschikt voor de bereiding van bevroren back-upvoorraden. Merk op dat opnieuw gekweekte BOB's uit de eencellige bevroren voorraden een langere tijd nodig hebben om te herstellen en een bepaalde grootte te bereiken.
- Cryopreservatie van de onverteerde BOB's.
- Start het cryopreservatieproces met de pellet uit stap 2.8. Gebruik 500 μL koud vriesmedium om de pellet opnieuw op te suspenderen en over te brengen naar een cryogene injectieflacon.
OPMERKING: Bewaar twee koepels per injectieflacon. - Vries BOB's een nacht in een vriezer van -80 °C in met behulp van een geschikte celbevriezingscontainer.
- Start het cryopreservatieproces met de pellet uit stap 2.8. Gebruik 500 μL koud vriesmedium om de pellet opnieuw op te suspenderen en over te brengen naar een cryogene injectieflacon.
- Cryopreservatie van de eencellige verteerde BOB's
- Na het oogsten en verteren van BOB's, start cryopreservatie vanaf stap 4.8.
- Voor het bewaren van één cryogene injectieflacon brengt u 4-5 x 105 cellen over in een verse laagbindbuis van 1,5 ml.
OPMERKING: Bewaar drie koepels/injectieflacon. - Centrifugeer bij 500 x g gedurende 4 minuten bij 4 °C. Gooi het bovennatuurlijke middel voorzichtig weg met een pipet van 1.000 μL. Verwijder het supernatant zoveel mogelijk zonder de pellet te storen.
- Resuspend de pellet in een geschikt volume vriesmedium (500 μL/injectieflacon) en breng deze over in een cryogene injectieflacon.
- Vries BOB's een nacht in een vriezer van -80 °C in met behulp van een geschikte celbevriezingscontainer en breng ze over in een vriezer van -150 °C of vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol presenteert de procedures inclusief subcultuur en cryopreservatie van EAC BOB's met en zonder eencellige vertering.
Figuur 1 toont representatieve fasecontrastfoto's van de twee verschillende subcultuurstrategieën. EAC-BOB's bereikten de juiste dichtheid voor subculturing (figuur 1, links). Subculturen zonder eencellige vertering kost minder tijd om een vergelijkbare dichtheid te bereiken en leidt vooral tot compacte structuren (figuur 1, bovenste rij). De eencellige verteerde BOB's vertonen daarentegen holle structuren met een holle kern (figuur 1, onderste rij). Figuur 2 toont de Hematoxyline-Eosine (H&E) kleuring en immunohistochemie (IHC) kleuring van paraffine-embedded EAC BOB's met compacte en holle structuren. Het pan-cytokeratine (Pan-CK) maakt de identificatie van epitheliale tumorcellenmogelijk 18. Het cytokeratine 7 (CK7) benadrukt de glandulaire gedifferentieerde tumorcellen19. De compacte structuur (bovenste rij) bestaat voornamelijk in de onverteerde cultuur, terwijl de holle structuur (onderste rij) dominant is in de cultuur die eencellige vertering onderging.
Figuur 3 toont de immunofluorescentie (IHC) kleuring van gepaard EAC-weefsel en BOB's met compacte structuur en holle structuur. De Ki67 benadrukt de celpopulaties met een hogere cellulaire proliferatie20. De Ki67 (rood) en Pan-CK (groen) waren op dezelfde manier verdeeld over EAC primair weefsel, EAC PDO compacte structuur en EAC PDO holle structuur. Figuur 4 toont de morfologische kenmerken van EAC-BOB's op de eerste dag van herstel van bevroren voorraad met cryopreservatie op basis van één cel (links) en onverteerde cryopreservatie op basis van BOB (rechts).
Figuur 5 vat een stroomschema samen van het subcultuurproces van EAC BOB's met en zonder eencellige vertering. Kortom, een goed groeiende EAC BOB is klaar om te worden doorgegeven. EAC BOB's werden geoogst en gepelletiseerd. Voor de vertering van één cel werden BOB's enzymatisch verteerd gedurende 5-10 minuten om afzonderlijke cellen te krijgen, die waarschijnlijk zouden uitgroeien tot holle structuren die experimenten mogelijk maken die celnummercontrole, uniforme dichtheid en groottetracking vereisen. Voor onverteerde subcultuur werden BOB's gesplitst om meer groeiruimte te krijgen zonder enzymatisch te verstoren, die waarschijnlijk zouden uitgroeien tot compacte structuren die histologische analyses, snelle expansie en sneller herstel van cryopreservatie mogelijk maakten.
Figuur 1: Morfologische kenmerken van EAC PDOs subcultuur met en zonder eencellige vertering onder een fasecontrastmicroscoop. EAC-BOB's groeien tot een bepaalde dichtheid voorafgaand aan subcultuur (links). Bij het subcultureren van EAC-BOB's zonder eencellige vertering groeien PDO's geleidelijk van holle structuren naar compacte structuren (rechts, bovenste rij), terwijl BOB's gekweekt uit afzonderlijke cellen overwegend holle structuren vertonen (rechts, onderste rij). Foto's zijn gemaakt met een omgekeerde lichtmicroscoop met behulp van een 5x objectief. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Histologische kenmerken van de compacte structuur en holle structuur van EAC BOB's. De H&E-beits (links), Pan-CK-beits (midden) en CK7-beits (rechts) van de compacte structuur (bovenste rij) en holle structuur (onderste rij). Foto's zijn gemaakt met omgekeerd licht microscoop met behulp van een 20x objectief. Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Immunohistochemische kleuring van gepaard EAC-weefsel en BOB's. De immunofluorescentie (IF) kleuring van gepaard EAC weefsel (bovenste rij), compacte structuur (middelste rij) en holle structuur (onderste rij) met Pan-CK (groen), Ki67 (rood) en DAPI (blauw). Foto's werden gemaakt met omgekeerde geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop met behulp van een 20x objectief. Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Morfologische kenmerken van OAG-BOB's op de eerste dag van herstel van bevroren bestand. Fasecontrastfoto's van hercultivatie van cryopreservatie op basis van één cel (links) en onverteerde cryopreservatie op basis van BOB (rechts) op de eerste dag van herstel. Foto's zijn gemaakt met een omgekeerde lichtmicroscoop met behulp van een 5x objectief. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Het stroomschema van het subcultuurproces van OAG-BOB's met en zonder eencellige vertering. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur.
| Voorraad | Eindconcentratie | 50 ml | |||
| Basaal medium (zie tabel 3) | 24 ml | ||||
| Wnt-3A geconditioneerd medium | 12 ml | ||||
| R-Spondin1 geconditioneerd medium van Cultrex R-Spondin Cellen | 12 ml | ||||
| N-2 | 100x | 1x | 500 μL | ||
| B-27 | 50x | 1x | 1 ml | ||
| N-Acetylcysteïne | 0,5 m | 1mm | 100 μL | ||
| Chir-99021 | 5 meter | 0,5 μM | 5 μl | ||
| Recombinante menselijke epidermale groeifactor (EGF) | 100 μg/ml | 250 ng/ml | 125 μL | ||
| A83-01 | 25 meter | 0,5 μM | 1 μl | ||
| SB202190 | 10 meter | 1 μM | 5 μl | ||
| Gastrin | 100 μM | 0,1 μM | 50 μL | ||
| Nicotinamide | 1 miljoen | 20 μM | 1 ml | ||
| Gentamicine | 50mg/ml | 10 μM | 5 μl | ||
| Penicilline / Streptomycine | 100x | 1x | 500 μL | ||
| Amfotericine B | 250 μg/ml | 0.60% | 300 μL | ||
| Vers toevoegen in goed: | |||||
| Noggin | 100 μg/ml | 50 μL | |||
| Y-27632 | 10,5 mM | 50 μL | |||
| Toevoegen bij het vaststellen van nieuwe BOB's uit primair weefsel of het herstellen van bevroren voorraden | |||||
| FGF-10a | 100 μg/ml | 100 ng/ml | 50 μL | ||
Tabel 1: Bereiding van EAC BOB kweekmedium.
| Soja trypsineremmer (soa) | 12,5 mg |
| Aanpassen tot 50 ml met DPBS | |
| Filter door 0,2 μm steriel filter |
Tabel 2: Bereiding van soja trypsineremmer (soa) oplossing.
| Reagens | Volume | Eindconcentratie |
| Geavanceerde DMEM/F-12 | 48,2 ml | |
| HEPES (1 M) | 500 μL | 10 meter |
| L-Glutamine (100X) | 500 μL | 1x |
| Penicilline-Streptomycine (100X) | 500 μL | 1x |
| Amfotericine B | 300 μL | 0.60% |
| Gentamicine (50 mg/ml) | 5 μl | 5 μg/ml |
Tabel 3: Bereiding van basaal medium.
| Eencellige vertering | |
| Pros | Tegens |
| Controle over celnummers | Kwetsbaar tijdens inbedding |
| Haalbaarheidscontrole | Langere tijd nodig tussen passages |
| Toepasbaar voor bijvoorbeeld geneesmiddelenscreening, flowcytometrie | Langere hersteltijd van bevroren voorraden |
| Zonder eencellige vertering | |
| Pros | Tegens |
| Morfologie is gunstig voor histologische analyses | Uitbreiding van BOB's meer in omvang dan in aantal |
| Hogere stabiliteit in inbeddingsproces | Niet van toepassing op analyses waarbij eencellige suspensie verplicht is |
| Snel herstel van bevroren voorraden | Gebrek aan controle over het celnummer en het bijhouden van de grootte |
Tabel 4: Voor- en nadelen voor het subcultureren van EAC-BOB's met en zonder eencellige vertering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol worden twee verschillende subcultuur- en cryopreservatiemethoden van EAC-BOB's beschreven, namelijk met en zonder eencellige vertering. Verschillende studies adviseerden het doorgeven van EAC-BOB's met eencellige vertering15,17, wat gunstig is voor de meeste experimenten die celnummercontrole, uniforme dichtheid en een holle structuur vereisen die het volgen van de grootte vergemakkelijkt. De op één cel gebaseerde methode wordt echter gekenmerkt door een langzamere groei na herbebouwing van bevroren bestanden en minder compacte morfologie tijdens de kweekperiode. De ervaring wijst op 2-3 weken voor eencellige recultivatie om de toepasselijke dichtheid voor het subcultuurproces te bereiken. Daarentegen kunnen bevroren EAC-BOB's zonder eencellige vertering dezelfde grootte bereiken in een kortere periode (ongeveer 1 week) na hercultivatie. Een reden zou de extra stress van de trypsinevertering voor een relatief lange tijd (10 min) kunnen zijn. Daarom wordt aanbevolen om onverteerde EAC-BOB's in een verhouding van 1:1,5 te bewaren (twee koepels van onverteerde EAC-BOB's bevriezen en terugzaaien in drie koepels voor de herbebouwing). Bovendien wordt het gebruik van onverteerde EAC-BOB's aanbevolen voor snelle uitbreiding en histologische karakterisering door IHC- of IF-kleuring vanwege de compacte structuur. De voor- en nadelen van de twee subcultuurmethoden zijn samengevat in tabel 4.
Verschillende kritische stappen vragen aandacht in dit protocol. Ten eerste moeten de platen voor BOB-cultuur een nacht worden voorverwarmd in een incubator van 37 °C om het stollingsproces van vers gezaaide ECM-gelkoepels te garanderen. Het wordt aanbevolen om een hete plaat te gebruiken om de plaat op 37 °C te houden tijdens het omgaan met een langere zaaiduur. Ten tweede zijn buizen met een lage binding vereist tijdens het subcultuurproces om aanzienlijk BOB-verlies te voorkomen. Om verlies van ECM-gel te voorkomen, kunnen tips met een brede boringsopening voor gebruik worden voorgekoeld in de vriezer van -20 °C. Hier voorkomt de brede opening van de uiteinden de beschadiging van BOB-structuren tijdens de oogststap. Vervolgens wordt aanbevolen om BOB's gedurende 20 minuten op ijs te incuberen vóór de eerste centrifugatiestap, om ervoor te zorgen dat de ECM-gel volledig vloeibaar wordt. Merk op dat de centrifuge tijdens de centrifuge op 4 °C moet worden ingesteld om de resterende ECM-gel in vloeibare toestand te houden. Bovendien wordt voor de eencellige methode aanbevolen om de BOB's na trypsine-incubatie grondig te mengen met behulp van een normale tip van 1.000 μL om celklonten te breken voordat de soa wordt toegevoegd, in plaats van de celsuspensie rechtstreeks te filteren met cel strainers, om celverlies te voorkomen.
In dit protocol kunnen enkele wijzigingen worden aangebracht. De celhersteloplossing kan worden vervangen door ijskoude DPBS voor het oplossen van de ECM-gel in de oogststap. Ervaringen toonden echter een beter vermogen om de ECM-gel op te lossen met behulp van de celhersteloplossing. Daarom wordt ijskoude DPBS eerder alleen aanbevolen als een alternatieve back-upmethode. Als het laboratorium niet is uitgerust met een roterende incubator, kunnen EAC BOB's worden geïncubeerd met trypsine in een waterbad van 37 °C, samen met mengen door de buis om de 2-3 minuten om te keren. 10% DMSO met foetaal runderserum (FBS) kan worden gebruikt als alternatief voor vriesmedium om bevroren BOB-voorraden te bereiden. Een commercieel vriesmedium met lager of geen serum heeft echter de voorkeur vanwege een beter BOB-herstel.
Enkele beperkingen moeten in dit protocol worden aangepakt. Aangezien deze methoden alleen zijn getest in EAC-BOB's, is de toepassing van dit protocol op andere soorten BOB's niet duidelijk. Hoewel procedures voor het doorgeven van BOB's met en zonder eencellige spijsvertering gestandaardiseerd zijn voor de meeste organoïde typen21,22, is er nog steeds een noodzaak om de huidige protocollen voor andere kankertypen te proberen om reproduceerbaarheid te garanderen. Bovendien kan een 10 min 0,25% trypsine incubatie de cellen belasten tijdens de spijsvertering; daarom kan de incubatietijd variëren op basis van de PDO-conditie vóór de subcultuur en de individuele BOB-diversiteit. Tijdens vroege pogingen wordt voorgesteld om verschillende trypsine-incubatietijden in te stellen voor elke EAC-BOB.
Kortom, dit is het eerste protocol dat subcultuur en cryopreservatie van EAC-BOB's met en zonder eencellige vertering beschrijft en bespreekt. Het subcultureren van EAC-BOB's met eencellige vertering is van toepassing op vergelijkingsexperimenten tussen groepen, terwijl onverteerde EAC-BOB's gunstig zijn voor histologische karakterisering, cryopreservatie en snelle expansie. Hier is het routinematige onderhoud van EAC BOB's gestandaardiseerd, wat een gids biedt voor onderzoekers om geschikte methoden te kiezen voor het genereren van EAC-organoïden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten in dit werk.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Köln Fortune Program / Faculteit der Geneeskunde, Universiteit van Keulen. Wij danken de technische assistentie van Susanne Neiss, Michaela Heitmann en Anke Wienand-Dorweiler. Ningbo Fan werd financieel ondersteund door Guangzhou Elite Scholarship Council (GESC). De auteurs bedanken Dr. Joshua D'Rozario voor zijn hulp bij het taalkundig bewerken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| -20°C Freezer | Bosch | Economic | |
| -80°C Freezer | Panasonic | MDF DU500VH-PE | |
| Automated Cell counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Countess II |
| Biological Safety Cabinet Class II | Thermo Scientific | 51022482 | Herasafe KS12 |
| Centrifuge | Heraeus | 75003060 | Megafuge 1.0R |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50116048 | Heracell 150i |
| Inverted automated fluorescence microscope | Olympus | IX83 | |
| Inverted light microscope | Leica | DMIL LED Fluo | |
| Pipette 1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | Research Plus |
| Pipette 200 µL | Eppendorf | 3123000039 | Research Plus |
| Rotating Incubator | Scientific Industries, sc. | SI-1200 | Enviro-genie |
| Shaker | Eppendorf | 5355 000.011 | Thermomixer Comfort |
| Vacuum pump | Vacuubrand | 20727200 | BVC control |
| Waterbath | Medingen | p2725 | W22 |
| Material | |||
| 15 mL tube | Sarstedt | 62.554.502 | Inc Screw cap tube PP 15 mL |
| Cryo vial 2 mL | Sarstedt | 72.379 | CryoPure 2.0 mL tube |
| Low bind tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.706.600 | Micro tube 1.5 mL protein LB |
| Low bind tube 5 mL | Eppendorf | 0030 108.302 | Protein LoBind Tube 5.0 mL |
| Pipette tip 200 µL | Starlab | E1011-8000 | 200 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Starlab | E1011-9000 | 1000 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Sarstedt | 70.3050 | Pipette tip 1000 µL |
| Sterile filter 0.2 µm | Sarstedt | 83.1826.001 | Filtropur 0.2 µm sterile filter |
| Tissue culture plate | Sarstedt | 83.3921 | 12 well-plate |
| Reagent/Chemical | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| B-27 | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| CHIR-99021 | MedChemExpress | HY-10182/CS-0181 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| FGF-10a | Peprotech | 100-26-100 | |
| Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium | Thermo Fisher Scientific | 12648010 | |
| Gastrin | Sigma | G9020 | |
| Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL) | PromoCell | C-36030 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| L-Glutamine 200 mM (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| N-2 | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100 | |
| Noggin | Peprotech | 120-10C-50 | |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells | Biotechne | 3710-001-01 | |
| SB202190 | MedChemExpress | 152121-30-7 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | 93620-1G | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Wnt-3A conditioned medium | Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group | ||
| Y-27632 | Sigma | Y0503 |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Coleman, H. G., Xie, S. -H., Lagergren, J.
- Rumgay, H., et al. International trends in esophageal squamous cell carcinoma and adenocarcinoma incidence. The American Journal of Gastroenterology. 116 (5), 1072-1076 (2021).
- Qian, H., et al. Clinical characteristics, prognosis, and nomogram for esophageal cancer based on adenosquamous carcinoma: a seer database analysis. Frontiers in Oncology. 11, 603349 (2021).
- Lagergren, J., Smyth, E., Cunningham, D., Lagergren, P.
- Rockett, J. C., Larkin, K., Darnton, S. J., Morris, A. G., Matthews, H. R. Five newly established oesophageal carcinoma cell lines: phenotypic and immunological characterization. British Journal of Cancer. 75 (2), 258-263 (1997).
- Hashimoto, N. Expression of COX2 and p53 in rat esophageal cancer induced by reflux of duodenal contents. ISRN Gastroenterology. 2012, 1-5 (2012).
- Quante, M., et al. Bile acid and inflammation activate gastric cardia stem cells in a mouse model of barrett-like metaplasia. Cancer Cell. 21 (1), 36-51 (2012).
- Kapoor, H., Lohani, K. R., Lee, T. H., Agrawal, D. K., Mittal, S. K. Animal models of Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma-past, present, and future. Clinical and Translational Science. 8 (6), 841-847 (2015).
- Lan, T., Xue, X., Dunmall, L. C., Miao, J., Wang, Y. Patient-derived xenograft: a developing tool for screening biomarkers and potential therapeutic targets for human esophageal cancers. Aging. 13 (8), Albany NY. 12273-12293 (2021).
- Liu, D. S. H., et al. APR-246 potently inhibits tumour growth and overcomes chemoresistance in preclinical models of oesophageal adenocarcinoma. Gut. 64 (10), 1506-1516 (2015).
- Ebbing, E. A., et al. Esophageal adenocarcinoma cells and xenograft tumors exposed to Erb-b2 receptor tyrosine kinase 2 and 3 inhibitors activate transforming growth factor beta signaling, which induces epithelial to mesenchymal transition. Gastroenterology. 153 (1), 63-76 (2017).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Drost, J., Clevers, H.
- Li, X., et al. Organoid cultures recapitulate esophageal adenocarcinoma heterogeneity providing a model for clonality studies and precision therapeutics. Nature Communications. 9, 2983 (2018).
- Ebbing, E. A., et al. Stromal-derived interleukin 6 drives epithelial-to-mesenchymal transition and therapy resistance in esophageal adenocarcinoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2237-2242 (2019).
- Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).
- Ordóñez, N. G. Broad-spectrum immunohistochemical epithelial markers: a review. Human Pathology. 44 (7), 1195-1215 (2013).
- Maniar, K. P., Umpires, B.
- Sun, X., Kaufman, P. D. Ki-67: more than a proliferation marker. Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
