Summary
Este protocolo describe los métodos de subcultivo y criopreservación de organoides del adenocarcinoma de esófago con y sin digestión unicelular para permitir a los investigadores elegir estrategias apropiadas basadas en su diseño experimental.
Abstract
La falta de modelos de investigación traslacional adecuados que reflejen la enfermedad primaria para explorar la tumorigénesis y las estrategias terapéuticas es un obstáculo importante en el adenocarcinoma de esófago (CAO). Los organoides derivados de pacientes (PDO) han surgido recientemente como un modelo preclínico notable en una variedad de cánceres. Sin embargo, todavía hay protocolos limitados disponibles para desarrollar DOP de EAC. Una vez que se establecen las DOP, la propagación y la criopreservación son esenciales para futuros análisis posteriores. Aquí, se han estandarizado dos métodos diferentes para el subcultivo y la criopreservación de las DOP EAC, es decir, con y sin digestión unicelular. Ambos métodos pueden obtener de manera confiable la viabilidad celular adecuada y son aplicables para una configuración experimental diversa. El estudio actual demostró que subcultivar las PDO de EAC con digestión de una sola célula es adecuado para la mayoría de los experimentos que requieren control del número de células, densidad uniforme y una estructura hueca que facilita el seguimiento del tamaño. Sin embargo, el método basado en una sola célula muestra un crecimiento más lento en el cultivo, así como después del recultivo de las poblaciones congeladas. Además, el subcultivo con digestión unicelular se caracteriza por formar estructuras huecas con un núcleo hueco. Por el contrario, el procesamiento de PDO de CAO sin digestión unicelular es favorable para la criopreservación, la expansión y la caracterización histológica. En este protocolo, se describen las ventajas y desventajas del subcultivo y la criopreservación de las DOP EAC con y sin digestión unicelular para permitir a los investigadores elegir un método apropiado para procesar e investigar sus organoides.
Introduction
El cáncer de esófago (CE) es la décima causa más común y la sexta causa de muerte por cáncer en todo el mundo1. El adenocarcinoma de esófago (CAO) es uno de los principales subtipos histológicos de la CE y se presenta principalmente en los países occidentales2. En la última década, la incidencia de la CAO ha aumentado significativamente en muchos países desarrollados, incluida Alemania3. Debido a la agresividad del cáncer y la falta de síntomas durante la etapa temprana del desarrollo del tumor, el pronóstico general en los pacientes con CAO es pobre, mostrando una tasa de supervivencia a 5 años de alrededor del 20%2,4,5.
Desde finales del siglo XX, se han establecido varios modelos para la investigación biomédica de la EAC. Las líneas celulares clásicas de EAC humanas que se establecieron en la década de 19906, amplían nuestro conocimiento de la biología tumoral de EAC, la genética tumoral y las estrategias antitumorales, y se utilizan comúnmente en la investigación de EAC. Además, algunos grupos de investigación han desarrollado con éxito modelos animales de EAC o esófago de Barrett al exponer a los animales a factores de riesgo conocidos como el reflujo gastroesofágico a través de enfoques quirúrgicos o inflamatorios 7,8,9. Además, se desarrollaron modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) que injertan tejidos de cáncer primario de EAC por vía subcutánea u ortotópica en ratones inmunodeficientes, para simular el comportamiento biológico del tumor EAC humano y el entorno tumoral 10,11,12. Sin embargo, a pesar de que estos modelos mejoran las aplicaciones clínicas y nuestra comprensión de los mecanismos moleculares detrás de la tumorigénesis y progresión de EAC, todavía existe un gran desafío para extrapolar los resultados de estos modelos de investigación a los humanos.
Los organoides tumorales derivados del paciente (PDO) se cultivan en un sistema de cultivo 3D que imita el desarrollo humano y la regeneración de órganos in vitro. Generadas a partir del tejido primario de los pacientes, las DOP recapitulan las características moleculares y fenotípicas del tumor humano y han mostrado aplicaciones prometedoras en el desarrollo de fármacos y el tratamiento personalizado del cáncer13,14. Al comparar diez casos de PDO de EAC con su tejido tumoral pareado, se informa que las PDO de EAC comparten características histopatológicas y un panorama genómico similares con el tumor primario, conservan la heterogeneidad intratumoral y facilitan el cribado farmacológico eficiente in vitro15. Los PDO de EAC también se utilizaron en el estudio de la interacción de las células tumorales de EAC con fibroblastos asociados al cáncer (CAF) derivados de pacientes, lo que indica una poderosa aplicación en el campo de la investigación del microambiente tumoral16. Desafortunadamente, ha habido protocolos limitados disponibles para desarrollar y propagar PDO de EAC. Aquí, se describen dos métodos diferentes para subculpir y preservar las DOP de LA CAO en detalle: con y sin digestión unicelular. Los métodos estandarizados para el mantenimiento de las DOP de EAC y sus aplicaciones pueden ayudar a los investigadores a elegir métodos apropiados para diferentes propósitos en su investigación de DOP de EAC.
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Protocol
Una cultura de DOP establecida y en buen crecimiento representa la base para una subcultura y criopreservación exitosas descritas en este protocolo. Aquí, las PDO de EAC se generaron a partir del tejido tumoral primario de los pacientes con EAC utilizando el protocolo descrito por Karakasheva T. A. et al17. Los tejidos de EAC se recolectaron del biobanco bajo la aprobación de BioMaSOTA (aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Colonia, ID: 13-091).
NOTA: Las DOP de CAO se han cultivado en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2 utilizando un medio de cultivo DOP (Tabla 1). En los siguientes pasos, se describen en detalle dos métodos de la subcultura. Se recomienda una placa de 12 pocillos para subculpir las PDO con una densidad de siembra de tres domos de gel de matriz extracelular (ECM) por pozo, ya que permite el uso flexible de cada pozo y la cantidad adecuada de PDO para diferentes propósitos. Una técnica aséptica es obligatoria durante el manejo de las DOP.
1. Preparativos por adelantado
- Precaliente una placa de 12 pocillos colocándola en una incubadora de CO2 de 37 °C durante la noche antes del subcultivo para garantizar el calentamiento completo de la placa. Si está disponible, use pozos vacíos de una placa con el cultivo actual de DOP.
NOTA: Se recomienda el almacenamiento continuo de 1-2 platos frescos a 37 °C para una planificación flexible de los subcultivos. - Puntas de 1.000 μL y 200 μL preenfriadas con un orificio ancho a -20 °C (se recomienda almacenamiento continuo). Centrífuga preenfriada a 4 °C.
- Ajuste la temperatura de la incubadora giratoria a 37 °C (si se realiza la digestión de una sola célula).
- Incubar un volumen apropiado de gel ECM durante 1 h sobre hielo para licuar. Coloque la solución de recuperación celular sobre hielo.
2. Sustracción de organoides
- Retire la placa con PDO en crecimiento de la incubadora de CO2.
- Aspirar medio viejo usando una bomba de vacío.
NOTA: Evite tocar las cúpulas. - Agregue un volumen apropiado de solución de recuperación de células heladas (500 μL / domo) en el pozo.
- Desintegre el gel ECM mediante pipeteos hacia arriba y hacia abajo varias veces para fragmentar las cúpulas de gel ECM en trozos pequeños utilizando puntas de 1.000 μL con un orificio ancho.
- Combine la mezcla de DOP, gel ECM y solución de recuperación celular de un máximo de dos pocillos (seis cúpulas) y transfiérala a un tubo de unión baja de 5 ml (use un segundo tubo en caso de que se utilicen más pozos para el subcultivo).
NOTA: Opcionalmente, si el gel ECM no se disolvió por completo, agregue 1,5 ml adicionales de solución de recuperación celular a la mezcla de DOP, gel ECM y solución de recuperación celular. - Incubar el tubo que contiene la mezcla en el paso 2.5 sobre hielo durante 20 min, mezclar cada 5 min invirtiendo el tubo cinco veces para asegurar la licuefacción del gel ECM.
- Centrifugadora a 500 x g durante 4 min a 4° C.
- Si hay un gránulo visible y estable después de la centrifugación, continúe con el paso 2.10. De lo contrario, continúe con el paso 2.9.
- Si no hay un gránulo visible y los PDO todavía parecen estar atascados en una fase de gel, retire cuidadosamente el sobrenadante con una bomba de vacío hasta que se alcance la fase que contiene ECM gel-PDO-Solution y agregue 3 ml de solución de recuperación de células heladas.
- Invierta el tubo varias veces e incube en hielo durante otros 10 minutos. Mezclar invirtiendo el tubo de vez en cuando.
- Centrifugar a 500 x g durante 4 min a 4 °C y continuar con el paso 2.10.
- Deseche el sobrenadante cuidadosamente utilizando una bomba de vacío o una pipeta de 1.000 μL. Trate de quitar el sobrenadante tanto como sea posible.
NOTA: Debido a la baja superficie de unión del tubo, el pellet no será tan estable como de costumbre. - Guarde el pellet de DOP en hielo y proceda con el paso 3 (sin digestión) o el paso 4 (con digestión unicelular) dependiendo de los diferentes propósitos.
3. Subcultivo sin digestión
NOTA: Este método tiene como objetivo aumentar el tamaño y la densidad de las DOP. El mayor tamaño y la mayor densidad facilitan el proceso de incrustación, la caracterización histológica y la expansión de la DOP. Dependiendo de las proporciones de división de la DOP (según la densidad de los DOP, se recomienda una relación entre 1: 3 y 1: 6), resuspenda el pellet del paso 2.8 en un volumen apropiado de gel líquido de ECM.
- Retire las puntas preenfriadas de 200 μL y 1.000 μL con un orificio ancho del congelador de -20 °C y colóquelas en un banco limpio.
- Resuspenda el pellet del paso 2.11 en gel ECM utilizando puntas de 1.000 μL preenfriadas. Mezcle canalizando hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 10 veces para asegurarse de que los DOP no se agrupen y se distribuyan uniformemente en el gel ECM.
NOTA: Utilice gel/domo ECM de 50 μL. Siempre calcule para una cúpula más de lo requerido (por ejemplo, para nueve cúpulas (es decir, tres pozos), resuspenda el pellet en 500 μL de gel ECM líquido (450 + 50 μL extra). ¡Trate de evitar producir burbujas durante la resuspensión! - Retire la placa de 12 pocillos precalentada de la incubadora justo antes de sembrar las cúpulas.
- Domos de semillas que contienen 50 μL de gel ECM en la placa caliente (tres cúpulas/pozo). Evite pipetear burbujas en las cúpulas de gel ECM.
- Vuelva a colocar la placa en la incubadora de 37 °C y 5% de CO2e incube durante 20-30 min para solidificar el gel ECM.
- Añadir el medio DOP precalentado (Tabla 1) con cuidado sin perturbar las cúpulas.
- Cultive las DOP durante 7-14 días hasta que se produzca la densidad y la morfología requeridas.
4. Subcultivo con digestión unicelular
NOTA: Los siguientes pasos tienen como objetivo aumentar el número de DOP por domo. La digestión unicelular facilita el control del número celular y la expansión de la DOP.
- Preparar el medio de digestión mezclando 2 mL de Tripsina-EDTA al 0,25% y 20 μL DNasa I (para la digestión de tres domos).
- Vuelva a suspender el pellet del paso 2.11 con un volumen apropiado de tripsina-EDTA + DNasa I al 0,25% precalentado y mézclelo unas 10 veces mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1.000 μL (use puntas normales de 1.000 μL).
- Incubar durante 10 min a 37 °C en una incubadora giratoria con una velocidad de rotación de un mínimo de 28 rpm.
- Prepare un tubo de 15 ml que contenga 6 ml de solución inhibidora de tripsina de soja (ITS, Tabla 2) (por 2 ml de tripsina-EDTA al 0,25%).
- Después de la digestión, mezcle los PDO digeridos a fondo varias veces con una pipeta de 1,000 μL para interrumpir los PDO.
- Transfiera los PDO digeridos al tubo de 15 ml que contiene la solución de ITS para detener el proceso de digestión.
- Centrifugar a 500 x g durante 4 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante cuidadosamente utilizando una bomba de vacío o una pipeta de 1.000 μL. Resuspendir el pellet en 1 mL de medio basal (Tabla 3).
- Determine la concentración celular y la viabilidad utilizando un contador celular automatizado o un hemocitómetro.
- Semilla digerida DOP en una placa de 12 pocillos con 2 x 104 células por cúpula.
- Calcule el número de células de acuerdo con las cúpulas planificadas para la siembra y transfiéralas a un tubo de unión baja fresco de 1,5 ml.
NOTA: Calcule para una cúpula más (+ 2 x 104 celdas adicionales). Por ejemplo, para sembrar tres cúpulas en un pozo, tome 8 x 104 (2 x 104 * 3 + 2 x 104 extra) celdas. - Centrifugar a 500 x g durante 4 min a 4 °C.
- En caso de que no haya un pellet visible, recuerde la orientación del tubo dentro de la centrífuga para saber dónde se encuentra el pellet.
- Deseche cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de 1.000 μL. Retire el sobrenadante tanto como sea posible sin molestar el pellet.
- Añadir el volumen adecuado de gel ECM al pellet utilizando una pipeta de 1.000 μL con punta de orificio de 1.000 μL de ancho preenfriada (50 μL/domo + 50 μL extra).
- Siga los pasos 3.3-3.7.
- Calcule el número de células de acuerdo con las cúpulas planificadas para la siembra y transfiéralas a un tubo de unión baja fresco de 1,5 ml.
5. Criopreservación de las DOP digeridas y no digeridas
NOTA: Las DOP digeridas y no digeridas de una sola célula son adecuadas para la preparación de existencias de respaldo congeladas. Tenga en cuenta que las PDO recultivadas a partir de las existencias congeladas de una sola célula requieren un tiempo más largo para recuperarse y alcanzar un cierto tamaño.
- Criopreservación de las DOP no digeridas.
- Inicie el proceso de criopreservación con el pellet a partir del paso 2.8. Utilice 500 μL de medio de congelación en frío para resuspendir el pellet y transferirlo a un vial criogénico.
NOTA: Guarde dos domos por vial. - Congele las DOP durante la noche en un congelador de -80 °C utilizando un recipiente de congelación celular apropiado.
- Inicie el proceso de criopreservación con el pellet a partir del paso 2.8. Utilice 500 μL de medio de congelación en frío para resuspendir el pellet y transferirlo a un vial criogénico.
- Criopreservación de las DOP digeridas unicelulares
- Después de cosechar y digerir los DOP, comience la criopreservación a partir del paso 4.8.
- Para almacenar un vial criogénico, transfiera 4-5 x 105 células a un tubo fresco de unión baja de 1,5 ml.
NOTA: Guarde tres domos/vial. - Centrifugar a 500 x g durante 4 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante cuidadosamente con una pipeta de 1.000 μL. Retire el sobrenadante tanto como sea posible sin molestar el pellet.
- Vuelva a suspender el pellet en un volumen apropiado de medio de congelación (500 μL/vial) y transfiéralo a un vial criogénico.
- Congele las DOP durante la noche en un congelador de -80 °C utilizando un recipiente de congelación celular apropiado y transfiéralas a un congelador de -150 °C o nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
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Representative Results
Este protocolo presenta los procedimientos que incluyen el subcultivo y la criopreservación de las DOP de CAO con y sin digestión unicelular.
La Figura 1 muestra imágenes representativas de contraste de fase de las dos estrategias de subcultura diferentes. Las DOP de CAO alcanzaron la densidad adecuada para el subcultivo (Figura 1, izquierda). El subcultivo sin digestión unicelular tarda menos tiempo en alcanzar una densidad comparable y conduce principalmente a estructuras compactas (Figura 1, fila superior). En contraste, las PDO digeridas de una sola célula muestran estructuras huecas con un núcleo hueco (Figura 1, fila inferior). La Figura 2 muestra la tinción de hematoxilina-eosina (H&E) y la tinción de inmunohistoquímica (IHC) de PDO de EAC incrustadas en parafina con estructuras compactas y huecas. La pancitoqueratina (Pan-CK) permite la identificación de células tumorales epiteliales18. La citoqueratina 7 (CK7) resalta las células tumorales diferenciadas glandulares19. La estructura compacta (fila superior) existe predominantemente en el cultivo no digerido, mientras que la estructura hueca (fila inferior) es dominante en el cultivo que se sometió a la digestión de una sola célula.
La Figura 3 muestra la tinción de inmunofluorescencia (IHC) de tejido EAC pareado y PDO con estructura compacta y estructura hueca. El Ki67 destaca las poblaciones celulares con mayor proliferación celular20. El Ki67 (rojo) y el Pan-CK (verde) se distribuyeron de manera similar entre el tejido primario de EAC, la estructura compacta de EAC PDO y la estructura hueca de EAC PDO. La Figura 4 muestra las características morfológicas de las DOP EAC en el primer día de recuperación de la población congelada con criopreservación basada en una sola célula (izquierda) y criopreservación basada en DOP no digerida (derecha).
La Figura 5 resume un diagrama de flujo del proceso de subcultivo de las DOP de CAO con y sin digestión unicelular. Brevemente, una DOP EAC en buen crecimiento está lista para ser aprobada. Las DOP de la CAO se cosecharon y peletizaron. Para la digestión de una sola célula, los PDO se digirieron enzimáticamente durante 5-10 minutos para obtener células individuales, que probablemente se convertirían en estructuras huecas que facilitaran los experimentos que requieren control del número de células, densidad uniforme y seguimiento del tamaño. Para la subcultura no digerida, las PDO se dividieron para ganar más espacio de crecimiento sin interrupciones enzimáticas, que probablemente se convertirían en estructuras compactas que facilitan los análisis histológicos, la expansión rápida y la recuperación más rápida de la criopreservación.
Figura 1: Características morfológicas del subcultivo de DOP EAC con y sin digestión unicelular bajo un microscopio de contraste de fase. Las DOP de CAO crecen a una cierta densidad antes de la subcultura (izquierda). Al subculpir las PDO de EAC sin digestión de una sola célula, las PDO crecen gradualmente de estructuras huecas a estructuras compactas (derecha, fila superior), mientras que las PDO cultivadas a partir de células individuales muestran estructuras predominantemente huecas (derecha, fila inferior). Las imágenes se tomaron con microscopio de luz invertida utilizando un objetivo 5x. Barra de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Características histológicas de la estructura compacta y la estructura hueca de las DOP EAC. La tinción H&E (izquierda), la tinción Pan-CK (centro) y la tinción CK7 (derecha) de la estructura compacta (fila superior) y la estructura hueca (fila inferior). Las imágenes se tomaron con microscopio de luz invertida utilizando un objetivo de 20x. Barra de escala: 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Tinción inmunohistoquímica de tejido EAC pareado y PDOs. La tinción de inmunofluorescencia (IF) de tejido EAC emparejado (fila superior), estructura compacta (fila central) y estructura hueca (fila inferior) con Pan-CK (verde), Ki67 (rojo) y DAPI (azul). Las imágenes se tomaron con un microscopio de fluorescencia automatizado invertido utilizando un objetivo 20x. Barra de escala: 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Características morfológicas de las DOP de la CAO en el primer día de recuperación de las existencias congeladas. Imágenes de contraste de fase del recultivo de la criopreservación basada en una sola célula (izquierda) y la criopreservación basada en DOP no digerida (derecha) el primer día de recuperación. Las imágenes se tomaron con microscopio de luz invertida utilizando un objetivo 5x. Barra de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Diagrama de flujo del proceso de subcultivo de las DOP de CAO con y sin digestión de una sola célula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Acción | Concentración final | 50 ml | |||
| Medio basal (ver Tabla 3) | 24 ml | ||||
| Medio acondicionado Wnt-3A | 12 ml | ||||
| Medio condicionado R-Spondin1 de Cultrex R-Spondin Cells | 12 ml | ||||
| N-2 | 100x | 1x | 500 μL | ||
| B-27 | 50x | 1x | 1 ml | ||
| N-acetilcisteína | 0,5 M | 1 mM | 100 μL | ||
| CHIR-99021 | 5 mM | 0,5 μM | 5 μL | ||
| Factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (EGF) | 100 μg/ml | 250 ng/ml | 125 μL | ||
| A83-01 | 25 mM | 0,5 μM | 1 μL | ||
| SB202190 | 10 mM | 1 μM | 5 μL | ||
| Gastrina | 100 μM | 0,1 μM | 50 μL | ||
| Nicotinamida | 1 M | 20 μM | 1 ml | ||
| Gentamicina | 50 mg/ml | 10 μM | 5 μL | ||
| Penicilina/Estreptomicina | 100x | 1x | 500 μL | ||
| Anfotericina B | 250 μg/ml | 0.60% | 300 μL | ||
| Añadir recién hecho en el pozo: | |||||
| Cabeza | 100 μg/ml | 50 μL | |||
| Y-27632 | 10,5 mM | 50 μL | |||
| Añadir al establecer nuevas DOP a partir de tejidos primarios o a la recuperación de existencias congeladas | |||||
| FGF-10a | 100 μg/ml | 100 ng/ml | 50 μL | ||
Tabla 1: Preparación del medio de cultivo DOP EAC.
| Inhibidor de la tripsina de soja (ITS) | 12,5 mg |
| Ajuste a 50 ml con DPBS | |
| Filtrar a través de un filtro estéril de 0,2 μm |
Tabla 2: Preparación de la solución de inhibidor de tripsina (ITS) de soja.
| Reactivo | Volumen | Concentración final |
| DMEM/F-12 avanzado | 48,2 ml | |
| HEPES (1 M) | 500 μL | 10 mM |
| L-glutamina (100X) | 500 μL | 1X |
| Penicilina-Estreptomicina (100X) | 500 μL | 1X |
| Anfotericina B | 300 μL | 0.60% |
| Gentamicina (50 mg/ml) | 5 μL | 5 μg/ml |
Tabla 3: Preparación del medio basal.
| Digestión unicelular | |
| Pros | Contras |
| Control del número de celda | Frágil durante la incrustación |
| Comprobación de viabilidad | Se necesita más tiempo entre pasajes |
| Aplicable para, por ejemplo, detección de drogas, citometría de flujo | Mayor tiempo de recuperación de las existencias congeladas |
| Sin digestión unicelular | |
| Pros | Contras |
| La morfología es beneficiosa para los análisis histológicos | Expansión de las DOP más en tamaño que en número |
| Mayor estabilidad en el proceso de incrustación | No aplicable a los análisis en los que la suspensión unicelular es obligatoria |
| Rápida recuperación de las existencias congeladas | Falta de control del número de celdas y seguimiento del tamaño |
Tabla 4: Pros y contras para subculpir las PDO de CAO con y sin digestión unicelular.
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Discussion
En este protocolo, se describen dos métodos diferentes de subcultivo y criopreservación de las DOP de CAO, es decir, con y sin digestión unicelular. Varios estudios recomendaron pasar los PDO de EAC con digestión de una sola célula15,17, lo que es beneficioso para la mayoría de los experimentos que requieren control del número de células, densidad uniforme y una estructura hueca que facilita el seguimiento del tamaño. Sin embargo, el método basado en una sola célula se caracteriza por un crecimiento más lento después del recultivo de las existencias congeladas y una morfología menos compacta durante el período de cultivo. La experiencia indica 2-3 semanas para que el recultivo basado en una sola célula alcance la densidad aplicable para el proceso de subcultivo. Por el contrario, las DOP EAC congeladas sin digestión unicelular pueden alcanzar el mismo tamaño en un período más corto (aproximadamente 1 semana) después del recultivo. Una razón podría ser el estrés adicional de la digestión de tripsina durante un tiempo relativamente largo (10 minutos). Por lo tanto, se recomienda preservar las DOP de CAO no digeridas en una proporción de 1:1,5 (congelando dos domos de DOP de CAO no digeridas y sembrando de nuevo en tres cúpulas para el recultivo). Además, se recomienda el uso de PDO EAC no digeridos para una rápida expansión y caracterización histológica por tinción IHC o IF debido a la estructura compacta. Los pros y los contras de los dos métodos de subcultura se resumen en la Tabla 4.
Varios pasos críticos requieren atención en este protocolo. En primer lugar, las placas para el cultivo de DOP deben calentarse previamente durante la noche en una incubadora de 37 ° C para garantizar el proceso de solidificación de las cúpulas de gel ECM recién sembradas. Se recomienda utilizar una placa caliente para mantener la placa a 37 ° C mientras se trata de una duración prolongada de la siembra. En segundo lugar, se requieren tubos de baja unión durante el proceso de subcultivo para evitar una pérdida significativa de DOP. Para evitar la pérdida de gel ECM, las puntas con una amplia abertura de orificio se pueden enfriar previamente en el congelador de -20 ° C antes de su uso. Aquí, la amplia abertura de las puntas evita el daño de las estructuras de la DOP durante la etapa de cosecha. A continuación, se recomienda incubar los DOP durante 20 minutos en hielo antes del primer paso de centrifugación, para garantizar la licuefacción completa del gel ECM. Tenga en cuenta que la centrífuga debe ajustarse a 4 ° C durante los pasos de centrifugación para mantener el gel ECM residual en estado líquido. Además, para el método de una sola célula, se recomienda mezclar bien los PDO después de la incubación de tripsina utilizando una punta normal de 1.000 μL para romper los grupos celulares antes de agregar la ITS, en lugar de filtrar directamente la suspensión celular con coladores celulares, para evitar la pérdida celular.
Se pueden hacer algunas modificaciones en este protocolo. La solución de recuperación celular puede ser reemplazada por DPBS helado para disolver el gel ECM en la etapa de cosecha. Sin embargo, las experiencias mostraron una mejor capacidad para disolver el gel ECM utilizando la solución de recuperación celular. Por lo tanto, DPBS helado se recomienda solo como un método de copia de seguridad alternativo. Si el laboratorio no está equipado con una incubadora giratoria, las DOP EAC se pueden incubar con tripsina en un baño de agua de 37 °C junto con la mezcla invirtiendo el tubo cada 2-3 min. 10% DMSO con suero fetal bovino (FBS) se puede utilizar como alternativa para el medio de congelación para preparar existencias de DOP congeladas. Sin embargo, se prefiere un medio de congelación comercial con menor o ningún suero debido a una mejor recuperación de la DOP.
Algunas limitaciones deben abordarse en este protocolo. Dado que estos métodos se han probado solo en las DOP de la CAO, la aplicación de este protocolo a otros tipos de DOP no está clara. Aunque los procedimientos para pasar las PDO con y sin digestión unicelular están estandarizados para la mayoría de los tipos de organoides21,22, todavía existe la necesidad de intentar protocolos actuales sobre otros tipos de cáncer para garantizar la reproducibilidad. Además, una incubación de tripsina al 0,25% de 10 min puede estresar las células durante la digestión; por lo tanto, el tiempo de incubación podría variar en función de la condición de DOP pre-subcultivo y la diversidad individual de DOP. Durante los primeros intentos, se sugiere establecer diferentes tiempos de incubación de tripsina para cada DOP EAC.
En conclusión, este es el primer protocolo que describe y discute el subcultivo y la criopreservación de las DOP EAC con y sin digestión unicelular. Subculturizar las DOP de CAO con digestión unicelular es aplicable para experimentos de comparación entre grupos, mientras que las DOP de CAO no digeridas son beneficiosas para la caracterización histológica, la criopreservación y la expansión rápida. Aquí, el mantenimiento de rutina de las DOP de CAO está estandarizado, proporcionando una guía para que los investigadores elijan los métodos apropiados para la generación de organoides de CAO.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses en esta obra.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por Köln Fortune Program/Facultad de Medicina de la Universidad de Colonia. Agradecemos la asistencia técnica de Susanne Neiss, Michaela Heitmann y Anke Wienand-Dorweiler. Ningbo Fan fue apoyado financieramente por el Consejo de Becas de Élite de Guangzhou (GESC). Los autores agradecen al Dr. Joshua D'Rozario por su ayuda en la edición lingüística.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| -20°C Freezer | Bosch | Economic | |
| -80°C Freezer | Panasonic | MDF DU500VH-PE | |
| Automated Cell counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Countess II |
| Biological Safety Cabinet Class II | Thermo Scientific | 51022482 | Herasafe KS12 |
| Centrifuge | Heraeus | 75003060 | Megafuge 1.0R |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50116048 | Heracell 150i |
| Inverted automated fluorescence microscope | Olympus | IX83 | |
| Inverted light microscope | Leica | DMIL LED Fluo | |
| Pipette 1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | Research Plus |
| Pipette 200 µL | Eppendorf | 3123000039 | Research Plus |
| Rotating Incubator | Scientific Industries, sc. | SI-1200 | Enviro-genie |
| Shaker | Eppendorf | 5355 000.011 | Thermomixer Comfort |
| Vacuum pump | Vacuubrand | 20727200 | BVC control |
| Waterbath | Medingen | p2725 | W22 |
| Material | |||
| 15 mL tube | Sarstedt | 62.554.502 | Inc Screw cap tube PP 15 mL |
| Cryo vial 2 mL | Sarstedt | 72.379 | CryoPure 2.0 mL tube |
| Low bind tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.706.600 | Micro tube 1.5 mL protein LB |
| Low bind tube 5 mL | Eppendorf | 0030 108.302 | Protein LoBind Tube 5.0 mL |
| Pipette tip 200 µL | Starlab | E1011-8000 | 200 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Starlab | E1011-9000 | 1000 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Sarstedt | 70.3050 | Pipette tip 1000 µL |
| Sterile filter 0.2 µm | Sarstedt | 83.1826.001 | Filtropur 0.2 µm sterile filter |
| Tissue culture plate | Sarstedt | 83.3921 | 12 well-plate |
| Reagent/Chemical | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| B-27 | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| CHIR-99021 | MedChemExpress | HY-10182/CS-0181 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| FGF-10a | Peprotech | 100-26-100 | |
| Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium | Thermo Fisher Scientific | 12648010 | |
| Gastrin | Sigma | G9020 | |
| Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL) | PromoCell | C-36030 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| L-Glutamine 200 mM (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| N-2 | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100 | |
| Noggin | Peprotech | 120-10C-50 | |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells | Biotechne | 3710-001-01 | |
| SB202190 | MedChemExpress | 152121-30-7 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | 93620-1G | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Wnt-3A conditioned medium | Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group | ||
| Y-27632 | Sigma | Y0503 |
References
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