Summary
Detta protokoll beskriver metoderna för subkultur och kryokonservering av esofageal adenokarcinomorganoider med och utan encellsförtunning för att göra det möjligt för forskare att välja lämpliga strategier baserat på deras experimentella design.
Abstract
Bristen på lämpliga translationella forskningsmodeller som återspeglar primär sjukdom för att utforska tumorigenes och terapeutiska strategier är ett stort hinder i matstrupen adenokarcinom (EAC). Patient-härledda organoider (PDO) har nyligen framträtt som en anmärkningsvärd preklinisk modell i en mängd olika cancerformer. Det finns dock fortfarande begränsade protokoll tillgängliga för att utveckla EAC PDOs. När underofficerarna har fastställts är förökning och kryokonservering avgörande för ytterligare analyser nedströms. Här har två olika metoder standardiserats för EAC PDOs subkultur och kryokonservering, dvs med och utan encellsförtunning. Båda metoderna kan på ett tillförlitligt sätt erhålla lämplig cellviabilitet och är tillämpliga för en mångsidig experimentell inställning. Den aktuella studien visade att subkulturerande EAC-SUB med encellsförtunning är lämplig för de flesta experiment som kräver cellnummerkontroll, enhetlig densitet och en ihålig struktur som underlättar storleksspårning. Den enda cellbaserade metoden visar dock långsammare tillväxt i odling såväl som efter återodling från frysta lager. Dessutom kännetecknas subkulturering med encellsförtunning genom att bilda ihåliga strukturer med en ihålig kärna. Däremot är bearbetning av EAC-SUB utan encellsförtunning gynnsam för kryokonservering, expansion och histologisk karakterisering. I detta protokoll beskrivs fördelarna och nackdelarna med subkulturering och kryokonservering av EAC-SUB med och utan encellsförtunning för att göra det möjligt för forskare att välja en lämplig metod för att bearbeta och undersöka sina organoider.
Introduction
Matstrupscancer (EC) är den tionde vanligaste och den sjätte vanligaste dödsorsaken i cancer världen över1. Esofagusadenokarcinom (EAC) är en av de viktigaste histologiska subtyperna av EC och förekommer främst i västländer2. Under det senaste decenniet har EAC-förekomsten ökat avsevärt i många utvecklade länder, inklusive Tyskland3. På grund av cancerns aggressivitet och bristen på symtom under det tidiga skedet av tumörutveckling är den totala prognosen hos EAC-patienter dålig, vilket visar en 5-årig överlevnad på cirka 20%2,4,5.
Sedan slutet av 1900-talet har flera modeller etablerats för EAC: s biomedicinska forskning. De klassiska humana EAC-cellinjerna som etablerades på 1990-talet6, utökar vår kunskap om EAC-tumörbiologi, tumörgenetik samt antitumörstrategier och används ofta i EAC-forskning. Dessutom har vissa forskargrupper framgångsrikt utvecklat djurmodeller av EAC eller Barretts matstrupe genom att utsätta djuren för kända riskfaktorer som gastroesofageal reflux genom kirurgiska eller inflammatoriska tillvägagångssätt 7,8,9. Dessutom utvecklades patienthärledda xenograftmodeller (PDX) som inympa EAC primära cancervävnader subkutant eller ortopiskt till immunbristfälliga möss för att simulera humant EAC-tumörbiologiskt beteende och tumörmiljö 10,11,12. Trots att dessa modeller förbättrar kliniska tillämpningar och vår förståelse av molekylära mekanismer bakom EAC-tumörigenes och progression, finns det fortfarande en stor utmaning att extrapolera resultat från dessa forskningsmodeller till människor.
Patient-härledda tumörorganoider (PDO) odlas i ett 3D-odlingssystem som efterliknar mänsklig utveckling och organregenerering in vitro. PDOs, som genereras från patienternas primära vävnad, rekapitulerar de molekylära och fenotypiska egenskaperna hos den humana tumören och har visat lovande tillämpningar inom läkemedelsutveckling och personlig cancerbehandling13,14. Genom att jämföra tio fall av EAC-SUB med deras parade tumörvävnad rapporteras EAC-SUB dela liknande histopatologiska egenskaper och genomiska landskap med primärtumören, behålla heterogeniteten inom tumören och underlätta effektiv läkemedelsscreening in vitro15. EAC-PDO användes också för att studera interaktionen mellan EAC-tumörceller och patient-härledda cancerassocierade fibroblaster (CAF), vilket indikerar en kraftfull tillämpning inom tumörmikromiljöforskning16. Tyvärr har det funnits begränsade protokoll tillgängliga för att utveckla och sprida EAC-SUB. Här beskrivs två olika metoder för att subkulturera och bevara EAC-SUB i detalj: med och utan encellsförtunning. De standardiserade metoderna för underhåll av EAC-SUB och deras tillämpningar kan stödja forskare att välja lämpliga metoder för olika ändamål i sin EAC SUB-forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En etablerad och välväxande SUB-kultur utgör grunden för en framgångsrik subkultur och kryokonservering som beskrivs i detta protokoll. Här genererades EAC-PDO: er från EAC-patienternas primära tumörvävnad med hjälp av protokollet som beskrivs av Karakasheva T. A. et al17. EAC-vävnader samlades in från biobanken under godkännande av BioMaSOTA (godkänd av etikkommittén vid Kölns universitet, ID: 13-091).
OBS: EAC-SUB har odlats i en fuktad inkubator vid 37 °C och 5 %CO2 med hjälp av ett SUB-odlingsmedium (tabell 1). I följande steg beskrivs två metoder för subkulturen i detalj. En 12-brunnsplatta rekommenderas för subkulturering av SUB: erna med en sådddensitet av tre extracellulära matris (ECM) gelkupoler per brunn, eftersom det möjliggör flexibel användning av varje brunn och lämplig mängd SUB för olika ändamål. En aseptisk teknik är obligatorisk vid hantering av underofficerare.
1. Förberedelser i förväg
- Förvärm en 12-brunnsplatta genom att placera den i en 37 ° C CO2-inkubator över natten före subkultur för att säkerställa fullständig uppvärmning av plattan. Om det är tillgängligt, använd tomma brunnar från en tallrik med den nuvarande SUB-kulturen.
OBS: Kontinuerlig lagring av 1-2 färska tallrikar vid 37 ° C rekommenderas för flexibel subkulturplanering. - Förkylning av spetsar på 1 000 μL och 200 μL med en bred öppning vid -20 °C (kontinuerlig lagring rekommenderas). Förkyla centrifugen vid 4 °C.
- Ställ in temperaturen på den roterande inkubatorn till 37 ° C (om encellsförtunning utförs).
- Inkubera en lämplig volym ECM-gel i 1 timme på is för att kondensera. Placera cellåtervinningslösning på is.
2. Skörda organoider
- Ta bort plattan med växande PDO: er från CO2-inkubatorn.
- Aspirera gammalt medium med en vakuumpump.
OBS: Undvik att röra kupolerna. - Tillsätt en lämplig volym iskall cellåtervinningslösning (500 μL /kupol) i brunnen.
- Sönderdela ECM-gelén genom att pipettera upp och ner flera gånger för att fragmentera ECM-gelkupoler i små bitar med 1000 μL-spetsar med en bred öppning.
- Kombinera blandningen av SUB, ECM-gel och cellåtervinningslösning från högst två brunnar (sex kupoler) och överför den till ett 5 ml lågbindande rör (använd ett andra rör om fler brunnar används för subkultur).
OBS: Valfritt, om ECM-gel inte löstes helt, tillsätt ytterligare 1,5 ml cellåtervinningslösning till blandningen av SUB, ECM-gel och cellåtervinningslösning. - Inkubera röret som innehåller blandningen i steg 2,5 på is i 20 min, blanda var 5: e minut genom att invertera röret fem gånger för att säkerställa kondensering av ECM-gelén.
- Centrifug vid 500 x g i 4 min vid 4 ° C.
- Om det finns en synlig och stabil pellets efter centrifugering, fortsätt med steg 2.10. Annars fortsätter du med steg 2.9.
- Om det inte finns någon synlig pellets och UNDERDO: erna fortfarande verkar ha fastnat i en gelfas, ta försiktigt bort supernatanten med en vakuumpump tills fasen som innehåller ECM-gel-SUB-lösning har uppnåtts och tillsätt 3 ml iskall cellåtervinningslösning.
- Invertera röret några gånger och inkubera på is i ytterligare 10 minuter. Blanda genom att invertera röret då och då.
- Centrifug vid 500 x g i 4 min vid 4 °C och fortsätt med steg 2.10.
- Kassera supernatanten försiktigt med en vakuumpump eller en 1 000 μL pipett. Försök att ta bort supernatanten så mycket som möjligt.
OBS: På grund av rörets låga bindningsyta kommer pelletsen inte att vara lika stabil som vanligt. - Förvara SUB-pelletsen på is och fortsätt med steg 3 (utan matsmältning) eller steg 4 (med encellsförtunning) beroende på de olika syftena.
3. Subkulturering utan matsmältning
OBS: Denna metod syftar till att öka PDO: s storlek och densitet. Den större storleken och den högre densiteten underlättar inbäddningsprocessen, histologisk karakterisering och SUB-expansion. Beroende på SUB-delningsförhållandena (baserat på PDOs densitet rekommenderas ett förhållande mellan 1: 3 och 1: 6), resuspend pelletsen från steg 2.8 i en lämplig volym flytande ECM-gel.
- Ta bort förkylda 200 μL och 1 000 μL spetsar med en bred öppning från frysen -20 °C och lägg dem på en ren bänk.
- Resuspend pelletsen från steg 2.11 i ECM-gel med förkylda 1000 μL spetsar. Blanda genom att pipettera upp och ner cirka 10 gånger för att se till att PDO: er inte klumpar ihop sig och fördelas jämnt i ECM-gelén.
OBS: Använd 50 μL ECM gel / kupol. Beräkna alltid för en kupol mer än vad som krävs (t.ex. för nio kupoler (dvs. tre brunnar), återutnyttja pelletsen i 500 μL flytande ECM-gel (450 + 50 μL extra). Försök att undvika att producera bubblor under resuspension! - Ta bort den förvärmda 12-brunnsplattan från inkubatorn precis innan du såddar kupolerna.
- Frökupoler som innehåller 50 μL ECM-gel i den varma plattan (tre kupoler / brunn). Undvik att pipettera bubblor i ECM-gelkupolerna.
- Sätt tillbaka plattan i 37 ° C och 5% CO2-inkubatornoch inkubera i 20-30 minuter för att stelna ECM-gelén.
- Tillsätt förvärmt SUB-medium (tabell 1) försiktigt utan att störa kupolerna.
- Odla PDO: erna i 7-14 dagar tills den erforderliga densiteten och morfologin uppträder.
4. Subkulturering med encellig matsmältning
OBS: Följande steg syftar till att öka antalet PDF-filer per kupol. Digestionen av en cell underlättar cellnummerkontroll och SUB-expansion.
- Förbered matsmältningsmediet genom att blanda 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA och 20 μL DNasE I (för matsmältning av tre kupoler).
- Resuspend pelletsen från steg 2.11 med en lämplig volym förvärmd 0,25% Trypsin-EDTA + DNase I och blanda den cirka 10 gånger genom pipettering upp och ner med en 1000 μL pipett (använd normala 1000 μL spetsar).
- Inkubera i 10 min vid 37 °C i en roterande inkubator med en rotationshastighet på minst 28 rpm.
- Förbered ett 15 ml rör innehållande 6 ml sojabönstrypsinhämmare (STI, tabell 2) lösning (per 2 ml 0,25% trypsin-EDTA).
- Efter matsmältningen, blanda de smälta PPO: erna noggrant några gånger med en 1000 μL pipett för att störa PDO: erna.
- Överför de smälta PPO: erna till 15 ml röret som innehåller STI-lösning för att stoppa matsmältningsprocessen.
- Centrifug vid 500 x g i 4 min vid 4 °C. Kassera supernatanten försiktigt med en vakuumpump eller en 1 000 μL pipett. Resuspend pelletsen i 1 ml basalmedium (tabell 3).
- Bestäm cellkoncentration och livskraft med hjälp av en automatiserad cellräknare eller en hemocytometer.
- Frö smält SUB i en 12-brunnsplatta med 2 x 104 celler per kupol.
- Beräkna cellnumret enligt de kupoler som planeras för sådd och överför dem till ett nytt 1,5 ml lågbindande rör.
OBS: Beräkna för en kupol mer (+ 2 x 104 celler extra). Till exempel, för sådd av tre kupoler i en brunn, ta 8 x 104 (2 x 104 * 3 + 2 x 104 extra) celler. - Centrifug vid 500 x g i 4 min vid 4 °C.
- Om det inte finns någon synlig pellets, kom ihåg rörets orientering inuti centrifugen för att veta var pelletsen är belägen.
- Kasta försiktigt supernatanten med en 1000 μL pipett. Ta bort supernatanten så mycket som möjligt utan att störa pelletsen.
- Tillsätt lämplig volym ECM-gel till pelletsen med en 1 000 μL pipett med förkyld 1 000 μL bred öppningsspets (50 μL/kupol + 50 μL extra).
- Följ steg 3.3–3.7.
- Beräkna cellnumret enligt de kupoler som planeras för sådd och överför dem till ett nytt 1,5 ml lågbindande rör.
5. Kryokonservering av smälta och osmälta HANDdatorer
OBS: Encellssmälta och osmälta PDO: er är lämpliga för beredning av frysta reservlager. Observera att återodlade PPO från de frysta lagren med en cell kräver längre tid att återhämta sig och nå en viss storlek.
- Kryokonservering av de osmälta handdatorerna.
- Starta kryokonserveringsprocessen med pelletsen från steg 2.8. Använd 500 μL kallt frysmedium för att återsuspendera pelletsen och överföra den till en kryogen injektionsflaska.
OBS: Förvara två kupoler per injektionsflaska. - Frys PPO: er över natten i en -80 ° C frys med en lämplig cellfrysbehållare.
- Starta kryokonserveringsprocessen med pelletsen från steg 2.8. Använd 500 μL kallt frysmedium för att återsuspendera pelletsen och överföra den till en kryogen injektionsflaska.
- Kryokonservering av de encellssmälta UNDERPO: erna
- Efter skörd och smältning av HANDdatorer, börja kryokonservering från steg 4.8.
- För förvaring av en kryogen injektionsflaska, överför 4-5 x 105 celler till ett nytt 1,5 ml lågbindande rör.
OBS: Förvara tre kupoler / injektionsflaska. - Centrifug vid 500 x g i 4 min vid 4 °C. Kassera supernatanten försiktigt med en 1 000 μL pipett. Ta bort supernatanten så mycket som möjligt utan att störa pelletsen.
- Återsuspendera pelletsen i en lämplig volym frysmedium (500 μL/injektionsflaska) och överför den till en kryogen injektionsflaska.
- Frys PPO: er över natten i en -80 ° C frys med en lämplig cellfrysbehållare och överför dem till en -150 ° C frys eller flytande kväve för långvarig lagring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll presenterar förfarandena inklusive subkultur och kryokonservering av EAC-SUB med och utan encellsförtunning.
Figur 1 visar representativa faskontrastbilder av de två olika subkulturstrategierna. EAC PDOs nådde lämplig densitet för subkulturering (figur 1, vänster). Subkulturering utan encellsförtunning tar mindre tid att nå jämförbar densitet och leder huvudsakligen till kompakta strukturer (figur 1, översta raden). Däremot visar de encellssmälta PPO: erna ihåliga strukturer med en ihålig kärna (figur 1, nedre raden). Figur 2 visar hematoxylin-eosin (H&E) färgning och immunohistokemi (IHC) färgning av paraffininbäddade EAC-SUB med kompakta och ihåliga strukturer. Pancytokeratinet (Pan-CK) möjliggör identifiering av epiteliala tumörceller18. Cytokeratinet 7 (CK7) belyser de glandulära differentierade tumörcellerna19. Den kompakta strukturen (översta raden) existerar övervägande i den osmälta kulturen, medan den ihåliga strukturen (nedre raden) är dominerande i kulturen som genomgick encellsförtunning.
Figur 3 visar immunofluorescensfärgning (IHC) av parad EAC-vävnad och SUB med kompakt struktur och ihålig struktur. Ki67 belyser cellpopulationerna med högre cellulär proliferation20. Ki67 (röd) och Pan-CK (grön) fördelades på liknande sätt mellan EAC primär vävnad, EAC SUB kompakt struktur och EAC SUB ihålig struktur. Figur 4 visar de morfologiska egenskaperna hos EAC-SUB den första dagen av återhämtning från frysta bestånd med encellsbaserad kryokonservering (vänster) och osmält SUB-baserad kryokonservering (höger).
Figur 5 sammanfattar ett flödesschema över subkulturprocessen för EAC-SUB med och utan encellsförtunning. Kortfattat är en väl växande EAC SUB redo att passeras. EAC:s SUB:er skördades och pelleterades. För encellsförtunning smältes PDO: er enzymatiskt i 5-10 minuter för att få enstaka celler, som sannolikt skulle växa till ihåliga strukturer som underlättar experiment som kräver cellnummerkontroll, enhetlig densitet och storleksspårning. För osmält subkultur delades PDO: er för att få mer växande utrymme utan enzymatiskt störande, vilket sannolikt skulle växa till kompakta strukturer som underlättar histologiska analyser, snabb expansion och snabbare återhämtning från kryokonservering.
Figur 1: Morfologiska egenskaper hos EAC-SUB:s subkultur med och utan encellsförtunning under ett faskontrastmikroskop. EAC-PDO: er växer till en viss densitet före subkultur (vänster). Vid subkulturering av EAC-SUB utan encellsförtunning växer SUB gradvis från ihåliga strukturer till kompakta strukturer (höger, övre raden), medan PDO: er som odlas från enskilda celler visar övervägande ihåliga strukturer (höger, nedre raden). Bilderna togs med inverterat ljusmikroskop med ett 5x mål. Skala bar: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Histologiska egenskaper hos EAC:s PDOs kompakta struktur och ihåliga struktur. H&E-färgning (vänster), Pan-CK-färgning (mitten) och CK7-färgning (höger) av den kompakta strukturen (översta raden) och ihålig struktur (nedre raden). Bilderna togs med inverterat ljusmikroskop med ett 20x mål. Skala bar: 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Immunohistokemifärgning av parad EAC-vävnad och SUB. Immunofluorescens (IF) färgning av parad EAC-vävnad (övre raden), kompakt struktur (mittrad) och ihålig struktur (nedre raden) med Pan-CK (grön), Ki67 (röd) och DAPI (blå). Bilderna togs med inverterat automatiserat fluorescensmikroskop med ett 20x mål. Skala bar: 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Morfologiska egenskaper hos EAC-subdon den första dagen av återvinning från frysta lager. Faskontrastbilder av reodling från encellsbaserad kryokonservering (vänster) och osmält SUB-baserad kryokonservering (höger) den första dagen av återhämtningen. Bilderna togs med inverterat ljusmikroskop med ett 5x mål. Skala bar: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Flödesschemat för subkulturprocessen för EAC-SUB med och utan encellsförtunning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Lager | Slutlig koncentration | 50 ml | |||
| Basalt medium (se tabell 3) | 24 ml | ||||
| Wnt-3A konditionerat medium | 12 ml | ||||
| R-Spondin1 konditionerat medium från Cultrex R-Spondin Cells | 12 ml | ||||
| N-2 | 100x | 1x | 500 μL | ||
| B-27 | 50x | 1x | 1 ml | ||
| N-acetylcystein | 0,5 M | 1 mM | 100 μL | ||
| CHIR-99021 | 5 mM | 0,5 μM | 5 μL | ||
| Rekombinant human epidermal tillväxtfaktor (EGF) | 100 μg/ml | 250 ng/ml | 125 μL | ||
| A83-01 | 25 mM | 0,5 μM | 1 μL | ||
| SB202190 | 10 mM | 1 μM | 5 μL | ||
| Gastrin | 100 μM | 0,1 μM | 50 μL | ||
| Nikotinamid | 1 M | 20 μM | 1 ml | ||
| Gentamicin | 50 mg/ml | 10 μM | 5 μL | ||
| Penicillin/Streptomycin | 100x | 1x | 500 μL | ||
| Amfotericin B | 250 μg/ml | 0.60% | 300 μL | ||
| Lägg till färskt i brunnen: | |||||
| Skalle | 100 μg/ml | 50 μL | |||
| Y-27632 | 10,5 mM | 50 μL | |||
| Lägg till när du etablerar nya handdatorer från primärvävnad eller återvinner från frysta lager | |||||
| FGF-10a | 100 μg/ml | 100 ng/ml | 50 μL | ||
Tabell 1: Beredning av odlingsmedium för EAC SUB.
| Sojabönor trypsinhämmare (STI) | 12,5 mg |
| Justera till 50 ml med DPBS | |
| Filtrera genom 0,2 μm sterilt filter |
Tabell 2: Beredning av sojabönstrypsinhämmare (STI) lösning.
| Reagens | Volym | Slutlig koncentration |
| Avancerad DMEM/F-12 | 48,2 ml | |
| HEPES (1 M) | 500 μL | 10 mM |
| L-glutamin (100X) | 500 μL | 1X |
| Penicillin-streptomycin (100X) | 500 μL | 1X |
| Amfotericin B | 300 μL | 0.60% |
| Gentamicin (50 mg/ml) | 5 μL | 5 μg/ml |
Tabell 3: Beredning av basalt medium.
| Matsmältning med en cell | |
| Proffsen | Nackdelar |
| Kontroll av cellnummer | Bräcklig under inbäddning |
| Kontroll av livskraft | Längre tid behövs mellan passagerna |
| Gäller för t.ex. läkemedelsscreening, flödescytometri | Längre återhämtningstid från frysta lager |
| Utan matsmältning med en enda cell | |
| Proffsen | Nackdelar |
| Morfologi är fördelaktigt för histologiska analyser | Expansion av PDF-filer mer i storlek än i antal |
| Högre stabilitet i inbäddningsprocessen | Ej tillämpligt för analyser där encellssuspension är obligatorisk |
| Snabb återhämtning från frysta lager | Brist på cellnummerkontroll och storleksspårning |
Tabell 4: För- och nackdelar med subkulturerande EAC-SUB med och utan encellsförtunning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll beskrivs två olika subkultur- och kryokonserveringsmetoder för EAC-SUB, dvs med och utan encellsförtunning. Flera studier rekommenderade passerande EAC-PDO: er med encellsförtunning15,17, vilket är fördelaktigt för de flesta experiment som kräver cellnummerkontroll, enhetlig densitet och en ihålig struktur som underlättar storleksspårning. Den enda cellbaserade metoden kännetecknas emellertid av långsammare tillväxt efter reodling från frysta lager och mindre kompakt morfologi under odlingsperioden. Erfarenheten indikerar 2-3 veckor för encellsbaserad reodling för att nå tillämplig densitet för subkulturprocessen. Däremot kan frysta EAC-PDO: er utan encellsförtunning nå samma storlek på kortare tid (cirka 1 vecka) efter reodling. En orsak kan vara den extra stressen från trypsinsmältningen under relativt lång tid (10 min). Därför rekommenderas att bevara osmälta EAC-SUB i förhållandet 1: 1,5 (frysning av två kupoler av osmältA EAC-PDO: er och sådd tillbaka i tre kupoler för reodling). Dessutom rekommenderas användning av osmälta EAC-SUB för snabb expansion och histologisk karakterisering av IHC- eller IF-färgning på grund av den kompakta strukturen. För- och nackdelarna med de två subkulturmetoderna sammanfattas i tabell 4.
Flera kritiska steg kräver uppmärksamhet i detta protokoll. För det första måste plattorna för SUB-odling förvärmas över natten i en 37 ° C inkubator för att säkerställa stelningsprocessen av nysådda ECM-gelkupoler. Det rekommenderas att använda en kokplatta för att hålla plattan vid 37 °C vid förlängd såddtid. För det andra krävs lågbindande rör under subkulturprocessen för att undvika betydande SUB-förlust. För att förhindra FÖRLUST AV ECM-GEL KAN SPETSAR MED BRED BORRÖPPNING FÖRKYLAS I FRYSEN -20 °C före användning. Här undviker den breda öppningen av spetsarna skador på SUB-strukturer under skördesteget. Därefter rekommenderas att inkubera PDO: er i 20 minuter på is före det första centrifugeringssteget för att säkerställa fullständig kondensering av ECM-gelén. Observera att centrifugen måste ställas in på 4 °C under centrifugeringsstegen för att hålla kvarvarande ECM-gel i flytande tillstånd. För encellsmetoden rekommenderas dessutom att noggrant blanda PDO: erna efter trypsininkubation med en normal 1000 μL spets för att bryta cellklumpar innan STI tillsätts, snarare än att direkt filtrera cellsuspensionen med cellsilar, för att undvika cellförlust.
Vissa ändringar kan göras i detta protokoll. Cellåtervinningslösningen kan ersättas med iskall DPBS för upplösning av ECM-gelén i skördesteget. Erfarenheterna visade emellertid en bättre förmåga att lösa upp ECM-gelén med hjälp av cellåtervinningslösningen. Därför rekommenderas iskall DPBS snarare endast som en alternativ säkerhetskopieringsmetod. Om laboratoriet inte är utrustat med en roterande inkubator kan EAC-SUB inkuberas med trypsin i ett 37 °C vattenbad tillsammans med blandning genom att invertera röret var 2-3:e minut. 10 % DMSO med fetalt bovint serum (FBS) kan användas som ett alternativ till frysmedium för att bereda frysta SUB-lager. Ett kommersiellt frysmedium med lägre eller inget serum är dock att föredra på grund av en bättre SUB-återhämtning.
Vissa begränsningar måste åtgärdas i detta protokoll. Eftersom dessa metoder endast har testats i EAC-SUB är tillämpningen av detta protokoll på andra typer av SUB inte klart. Även om förfaranden för att passera PDO: er med och utan encellsförtunning är standardiserade för de flesta organoidtyper21,22, finns det fortfarande ett behov av att försöka nuvarande protokoll om andra cancertyper för att säkerställa reproducerbarhet. Dessutom kan en 10 min 0,25% trypsin inkubation stressa cellerna under matsmältningen; Därför kan inkubationstiden variera beroende på SUB-subkulturens tillstånd och den enskilda SUB-mångfalden. Under tidiga försök föreslås att man ställer in olika trypsininkubationstider för varje EAC SUB.
Sammanfattningsvis är detta det första protokollet som beskriver och diskuterar subkultur och kryokonservering av EAC-SUB med och utan encellsförtunning. Subkulturerande EAC-SUB med encellsförtunning är tillämplig för jämförelseexperiment mellan grupper medan osmälta EAC-PPO är fördelaktiga för histologisk karakterisering, kryokonservering och snabb expansion. Här standardiseras det rutinmässiga underhållet av EAC-PDO: er, vilket ger en guide för forskare att välja lämpliga metoder för EAC-organoidgenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter i detta arbete.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Köln Fortune Program / Medicinska fakulteten, Kölns universitet. Vi tackar den tekniska hjälpen från Susanne Neiss, Michaela Heitmann och Anke Wienand-Dorweiler. Ningbo stöddes ekonomiskt av Guangzhou Elite Scholarship Council (GESC). Författarna tackar Dr. Joshua D'Rozario för hans hjälp med språklig redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| -20°C Freezer | Bosch | Economic | |
| -80°C Freezer | Panasonic | MDF DU500VH-PE | |
| Automated Cell counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Countess II |
| Biological Safety Cabinet Class II | Thermo Scientific | 51022482 | Herasafe KS12 |
| Centrifuge | Heraeus | 75003060 | Megafuge 1.0R |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50116048 | Heracell 150i |
| Inverted automated fluorescence microscope | Olympus | IX83 | |
| Inverted light microscope | Leica | DMIL LED Fluo | |
| Pipette 1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | Research Plus |
| Pipette 200 µL | Eppendorf | 3123000039 | Research Plus |
| Rotating Incubator | Scientific Industries, sc. | SI-1200 | Enviro-genie |
| Shaker | Eppendorf | 5355 000.011 | Thermomixer Comfort |
| Vacuum pump | Vacuubrand | 20727200 | BVC control |
| Waterbath | Medingen | p2725 | W22 |
| Material | |||
| 15 mL tube | Sarstedt | 62.554.502 | Inc Screw cap tube PP 15 mL |
| Cryo vial 2 mL | Sarstedt | 72.379 | CryoPure 2.0 mL tube |
| Low bind tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.706.600 | Micro tube 1.5 mL protein LB |
| Low bind tube 5 mL | Eppendorf | 0030 108.302 | Protein LoBind Tube 5.0 mL |
| Pipette tip 200 µL | Starlab | E1011-8000 | 200 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Starlab | E1011-9000 | 1000 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Sarstedt | 70.3050 | Pipette tip 1000 µL |
| Sterile filter 0.2 µm | Sarstedt | 83.1826.001 | Filtropur 0.2 µm sterile filter |
| Tissue culture plate | Sarstedt | 83.3921 | 12 well-plate |
| Reagent/Chemical | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| B-27 | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| CHIR-99021 | MedChemExpress | HY-10182/CS-0181 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| FGF-10a | Peprotech | 100-26-100 | |
| Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium | Thermo Fisher Scientific | 12648010 | |
| Gastrin | Sigma | G9020 | |
| Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL) | PromoCell | C-36030 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| L-Glutamine 200 mM (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| N-2 | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100 | |
| Noggin | Peprotech | 120-10C-50 | |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells | Biotechne | 3710-001-01 | |
| SB202190 | MedChemExpress | 152121-30-7 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | 93620-1G | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Wnt-3A conditioned medium | Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group | ||
| Y-27632 | Sigma | Y0503 |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Coleman, H. G., Xie, S. -H., Lagergren, J.
- Rumgay, H., et al. International trends in esophageal squamous cell carcinoma and adenocarcinoma incidence. The American Journal of Gastroenterology. 116 (5), 1072-1076 (2021).
- Qian, H., et al. Clinical characteristics, prognosis, and nomogram for esophageal cancer based on adenosquamous carcinoma: a seer database analysis. Frontiers in Oncology. 11, 603349 (2021).
- Lagergren, J., Smyth, E., Cunningham, D., Lagergren, P.
- Rockett, J. C., Larkin, K., Darnton, S. J., Morris, A. G., Matthews, H. R. Five newly established oesophageal carcinoma cell lines: phenotypic and immunological characterization. British Journal of Cancer. 75 (2), 258-263 (1997).
- Hashimoto, N. Expression of COX2 and p53 in rat esophageal cancer induced by reflux of duodenal contents. ISRN Gastroenterology. 2012, 1-5 (2012).
- Quante, M., et al. Bile acid and inflammation activate gastric cardia stem cells in a mouse model of barrett-like metaplasia. Cancer Cell. 21 (1), 36-51 (2012).
- Kapoor, H., Lohani, K. R., Lee, T. H., Agrawal, D. K., Mittal, S. K. Animal models of Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma-past, present, and future. Clinical and Translational Science. 8 (6), 841-847 (2015).
- Lan, T., Xue, X., Dunmall, L. C., Miao, J., Wang, Y. Patient-derived xenograft: a developing tool for screening biomarkers and potential therapeutic targets for human esophageal cancers. Aging. 13 (8), Albany NY. 12273-12293 (2021).
- Liu, D. S. H., et al. APR-246 potently inhibits tumour growth and overcomes chemoresistance in preclinical models of oesophageal adenocarcinoma. Gut. 64 (10), 1506-1516 (2015).
- Ebbing, E. A., et al. Esophageal adenocarcinoma cells and xenograft tumors exposed to Erb-b2 receptor tyrosine kinase 2 and 3 inhibitors activate transforming growth factor beta signaling, which induces epithelial to mesenchymal transition. Gastroenterology. 153 (1), 63-76 (2017).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Drost, J., Clevers, H.
- Li, X., et al. Organoid cultures recapitulate esophageal adenocarcinoma heterogeneity providing a model for clonality studies and precision therapeutics. Nature Communications. 9, 2983 (2018).
- Ebbing, E. A., et al. Stromal-derived interleukin 6 drives epithelial-to-mesenchymal transition and therapy resistance in esophageal adenocarcinoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2237-2242 (2019).
- Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).
- Ordóñez, N. G. Broad-spectrum immunohistochemical epithelial markers: a review. Human Pathology. 44 (7), 1195-1215 (2013).
- Maniar, K. P., Umpires, B.
- Sun, X., Kaufman, P. D. Ki-67: more than a proliferation marker. Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
