Summary
Этот протокол описывает методы субкультуры и криоконсервации органоидов аденокарциномы пищевода с одноклеточным пищеварением и без него, чтобы позволить исследователям выбирать соответствующие стратегии на основе их экспериментального дизайна.
Abstract
Отсутствие подходящих трансляционных исследовательских моделей, отражающих первичное заболевание, для изучения опухолевого генеза и терапевтических стратегий является основным препятствием при аденокарциноме пищевода (EAC). Органоиды, полученные от пациентов (PDO), недавно стали замечательной доклинической моделью при различных видах рака. Тем не менее, по-прежнему существуют ограниченные протоколы, доступные для разработки EAC PDO. После того, как PDO установлены, распространение и криоконсервация имеют важное значение для дальнейшего последующего анализа. Здесь два различных метода были стандартизированы для субкультуры EAC PDO и криоконсервации, то есть с одноклеточным пищеварением и без него. Оба метода могут надежно получить соответствующую жизнеспособность клеток и применимы для разнообразной экспериментальной установки. Текущее исследование показало, что субкультурирование EAC PDO с одноклеточным пищеварением подходит для большинства экспериментов, требующих контроля количества клеток, равномерной плотности и полой структуры, которая облегчает отслеживание размера. Однако одноклеточный метод показывает более медленный рост культуры, а также после повторного культивирования из замороженных запасов. Кроме того, субкультура с одноклеточным пищеварением характеризуется образованием полых структур с полым ядром. Напротив, обработка EAC PDO без одноклеточного пищеварения благоприятна для криоконсервации, расширения и гистологической характеристики. В этом протоколе описаны преимущества и недостатки субкультуры и криоконсервации EAC PDO с одноклеточным пищеварением и без него, чтобы позволить исследователям выбрать подходящий метод обработки и исследования своих органоидов.
Introduction
Рак пищевода (ЭК) является десятой наиболее распространенной и шестой по значимости причиной смерти от рака во всем мире1. Аденокарцинома пищевода (ЭАС) является одним из основных гистологических подтипов ЭК и в основном встречается в западных странах2. В последнее десятилетие заболеваемость EAC значительно возросла во многих развитых странах, включая Германию3. Из-за агрессивности рака и отсутствия симптомов на ранней стадии развития опухоли общий прогноз у пациентов с ЭАС неблагоприятный, показывая 5-летнюю выживаемость около 20%2,4,5.
С конца двадцатого века было создано несколько моделей для биомедицинских исследований EAC. Классические клеточные линии EAC человека, которые были установлены в 1990-хгодах 6, расширяют наши знания о биологии опухолей EAC, генетике опухолей, а также противоопухолевых стратегиях и обычно используются в исследованиях EAC. Кроме того, некоторые исследовательские группы успешно разработали животные модели EAC или пищевода Барретта, подвергая животных воздействию известных факторов риска, таких как гастроэзофагеальный рефлюкс, с помощью хирургических или воспалительных подходов 7,8,9. Кроме того, модели ксенотрансплантата (PDX), полученные от пациента, которые прививают первичные раковые ткани EAC подкожно или ортотопически в иммунодефицитных мышей, были разработаны для моделирования биологического поведения опухоли EAC человека и опухолевой среды 10,11,12. Однако, несмотря на то, что эти модели улучшают клиническое применение и наше понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе опухолевого генеза и прогрессирования EAC, по-прежнему существует серьезная проблема экстраполяции результатов этих исследовательских моделей на людей.
Полученные от пациента опухолевые органоиды (PDO) выращиваются в системе 3D-культур, которая имитирует развитие человека и регенерацию органов in vitro. Полученные из первичной ткани пациентов, PDO повторяют молекулярные и фенотипические характеристики опухоли человека и показали многообещающее применение в разработке лекарств и персонализированном лечении рака13,14. Сравнивая десять случаев EAC PDO с их парной опухолевой тканью, сообщается, что EAC PDO имеют сходные гистопатологические особенности и геномный ландшафт с первичной опухолью, сохраняют внутриопухолевую гетерогенность и облегчают эффективный скрининг лекарств in vitro15. EAC PDO также использовались при изучении взаимодействия опухолевых клеток EAC с полученными от пациента раковыми фибробластами (CAF), что указывает на мощное применение в области исследования микроокружения опухолей16. К сожалению, существуют ограниченные протоколы, доступные для разработки и распространения PDO EAC. Здесь подробно описаны два различных метода субкультурации и сохранения EAC PDO: с одноклеточным пищеварением и без него. Стандартизированные методы обслуживания EAC PDO и их приложений могут помочь исследователям выбрать подходящие методы для различных целей в своих исследованиях EAC PDO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Устоявшаяся и хорошо развивающаяся культура PDO представляет собой основу для успешной субкультуры и криоконсервации, описанных в этом протоколе. Здесь EAC PDO были сгенерированы из первичной опухолевой ткани пациентов с EAC с использованием протокола, описанного Karakasheva T. A. et al17. Ткани EAC были собраны из биобанка с одобрения BioMaSOTA (одобрены Комитетом по этике Кельнского университета, ID: 13-091).
ПРИМЕЧАНИЕ: КПК EAC культивировали в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 с использованием питательной среды PDO (таблица 1). На следующих шагах подробно описаны два метода субкультуры. 12-луночная пластина рекомендуется для субкультурирования PDO с плотностью посева трех гелевых куполов внеклеточного матрикса (ECM) на скважину, поскольку она позволяет гибко использовать каждую скважину и соответствующее количество PDO для различных целей. Асептический метод является обязательным при работе с PDO.
1. Предварительная подготовка
- Предварительно нагрейте 12-луночную плиту, поместив ее в инкубатор CO2 при температуре 37 °C на ночь перед субкультурой, чтобы обеспечить полное нагревание плиты. Если доступно, используйте пустые колодцы из тарелки с текущей культурой PDO.
ПРИМЕЧАНИЕ: Непрерывное хранение 1-2 свежих тарелок при 37 °C рекомендуется для гибкого планирования субкультуры. - Предварительно охлаждайте наконечники объемом 1000 мкл и 200 мкл с широким отверстием при -20 °C (рекомендуется непрерывное хранение). Центрифуга предварительного охлаждения при 4 °C.
- Установите температуру вращающегося инкубатора до 37 °C (если проводится одноклеточное пищеварение).
- Инкубировать соответствующий объем геля ECM в течение 1 ч на льду для разжижения. Поместите раствор для восстановления клеток на лед.
2. Извлечение органоидов
- Снимите пластину с растущими PDO из инкубатора CO2.
- Аспирировать старую среду с помощью вакуумного насоса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте прикосновения к куполам. - Добавьте в скважину соответствующий объем раствора для восстановления ледяных клеток (500 мкл/купол).
- Распадайте гель ECM путем пипетирования вверх и вниз несколько раз, чтобы раздробить купола геля ECM на небольшие кусочки, используя наконечники 1000 мкл с широким отверстием.
- Смешайте смесь PDO, геля ECM и раствора для восстановления клеток максимум из двух скважин (шесть куполов) и переложите ее в трубку с низким связующим содержанием 5 мл (используйте вторую трубку в случае, если для субкультуры используется больше скважин).
ПРИМЕЧАНИЕ: Необязательно, если гель ECM не был растворен полностью, добавьте дополнительные 1,5 мл раствора для восстановления клеток в смесь PDO, геля ECM и раствора для восстановления клеток. - Инкубируйте пробирку, содержащую смесь на стадии 2,5, на льду в течение 20 мин, перемешивайте каждые 5 мин, переворачивая трубку пять раз, чтобы обеспечить разжижение геля ECM.
- Центрифуга при 500 х г в течение 4 мин при 4°С.
- Если после центрифугирования есть видимая и стабильная гранула, перейдите к этапу 2.10. В противном случае перейдите к шагу 2.9.
- Если видимых гранул нет, а PDO все еще застряли в гелевой фазе, осторожно удалите супернатант вакуумным насосом до тех пор, пока не будет достигнута фаза, содержащая ECM гель-PDO-Solution, и добавьте 3 мл ледяного раствора для восстановления клеток.
- Переверните трубку несколько раз и высиживайте на льду еще 10 минут. Перемешивайте, время от времени переворачивая трубку.
- Центрифугу при 500 х г в течение 4 мин при 4 °C и продолжайте с шагом 2.10.
- Осторожно выбросьте супернатант с помощью вакуумного насоса или пипетки объемом 1000 мкл. Постарайтесь удалить супернатант как можно больше.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за низкой связующей поверхности трубки гранула не будет такой стабильной, как обычно. - Храните гранулу PDO на льду и переходите к этапу 3 (без пищеварения) или шагу 4 (с одноклеточным пищеварением) в зависимости от различных целей.
3. Субкультура без пищеварения
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод направлен на увеличение размера и плотности PDO. Больший размер и более высокая плотность облегчают процесс встраивания, гистологическую характеристику и расширение PDO. В зависимости от коэффициентов разделения PDO (на основе плотности PDO рекомендуется соотношение между 1:3 и 1:6), повторно суспендируйте гранулу со стадии 2,8 в соответствующем объеме жидкого геля ECM.
- Извлеките предварительно охлажденные наконечники объемом 200 мкл и 1000 мкл с широким отверстием из морозильной камеры при температуре -20 °C и поместите их на чистую скамейку.
- Повторно суспендируйте гранулу со стадии 2.11 в геле ECM с помощью предварительно охлажденных наконечников 1000 мкл. Перемешайте путем пипетки вверх и вниз около 10 раз, чтобы убедиться, что PDO не слипаются и равномерно распределяются в геле ECM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 50 мкл ECM геля / купола. Всегда рассчитывайте для одного купола больше, чем требуется (например, для девяти куполов (т.е. трех скважин), повторно суспендируйте гранулу в 500 мкл жидкого геля ECM (450 + 50 мкл дополнительно). Старайтесь избегать образования пузырьков во время повторного суспендирования! - Снимите предварительно нагретую 12-луночную плиту из инкубатора непосредственно перед посевом куполов.
- Семенные купола, содержащие 50 мкл геля ECM в теплой пластине (три купола/колодец). Избегайте пипетирования пузырьков в купола геля ECM.
- Поместите пластину обратно в инкубатор с температурой 37 °C и 5% CO2и инкубируйте в течение 20-30 минут, чтобы затвердеть гель ECM.
- Добавьте предварительно нагретую среду PDO (таблица 1) осторожно, не нарушая купола.
- Культивируйте PDO в течение 7-14 дней до тех пор, пока не произойдет необходимая плотность и морфология.
4. Субкультура с одноклеточным пищеварением
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги направлены на увеличение количества PDO на купол. Одноклеточное пищеварение облегчает контроль количества клеток и расширение PDO.
- Готовят среду для пищеварения, смешивая 2 мл 0,25% трипсина-ЭДТА и 20 мкл ДНКазы I (для переваривания трех куполов).
- Повторно суспендируют гранулу со стадии 2.11 соответствующим объемом предварительно нагретого 0,25% трипсина-ЭДТА + ДНКазы I и смешивают ее примерно 10 раз путем пипетки вверх и вниз с использованием пипетки 1000 мкл (используйте обычные наконечники 1000 мкл).
- Инкубировать в течение 10 мин при 37 °C во вращающемся инкубаторе со скоростью вращения не менее 28 об/мин.
- Готовят пробирку объемом 15 мл, содержащую 6 мл раствора ингибитора трипсина сои (ИППП, таблица 2) (на 2 мл 0,25% трипсина-ЭДТА).
- После пищеварения смешайте переваренные PDO несколько раз с пипеткой 1000 мкл, чтобы разрушить PDO.
- Переведите переваренные PDO в пробирку объемом 15 мл, содержащую раствор ИППП, чтобы остановить процесс пищеварения.
- Центрифуга при 500 х г в течение 4 мин при 4 °C. Осторожно выбросьте супернатант с помощью вакуумного насоса или пипетки объемом 1000 мкл. Повторно суспендировать гранулы в 1 мл базальной среды (табл. 3).
- Определите концентрацию и жизнеспособность клеток с помощью автоматизированного счетчика клеток или гемоцитометра.
- Семена переваривают PDO в 12-луночную пластину с 2 х 104 ячейками на купол.
- Рассчитайте количество ячеек в соответствии с куполами, запланированными к посеву, и перенесите их в свежую трубку с низким связыванием объемом 1,5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рассчитайте для одного купола больше (+ 2 x 104 ячейки дополнительно). Например, для посева трех куполов в один колодец возьмите 8 х 104 (2 х 104 * 3 + 2 х 104 дополнительных) ячеек. - Центрифуга при 500 х г в течение 4 мин при 4 °C.
- В случае, если нет видимой гранулы, запомните ориентацию трубки внутри центрифуги, чтобы знать, где находится гранула.
- Осторожно выбросьте супернатант, используя пипетку объемом 1000 мкл. Удалите супернатант как можно больше, не нарушая гранулу.
- Добавьте соответствующий объем геля ECM в гранулу, используя пипетку объемом 1000 мкл с предварительно охлажденным отверстием шириной 1000 мкл (50 мкл / купол + 50 мкл дополнительно).
- Выполните шаги 3.3-3.7.
- Рассчитайте количество ячеек в соответствии с куполами, запланированными к посеву, и перенесите их в свежую трубку с низким связыванием объемом 1,5 мл.
5. Криоконсервация переваренных и непереваренных PDO
ПРИМЕЧАНИЕ: Одноклеточные переваренные и непереваренные PDO подходят для подготовки замороженных резервных запасов. Обратите внимание, что рекультурированные PDO из одноклеточных замороженных запасов требуют более длительного времени для восстановления и достижения определенного размера.
- Криоконсервация непереваренных PDO.
- Начните процесс криоконсервации с гранулами с шага 2.8. Используйте 500 мкл холодной морозильной среды, чтобы повторно суспендировать гранулу и перенести ее в криогенный флакон.
ПРИМЕЧАНИЕ: Храните два купола на флакон. - Заморозьте PDO на ночь в морозильной камере при температуре -80 °C с помощью соответствующего контейнера для замораживания ячеек.
- Начните процесс криоконсервации с гранулами с шага 2.8. Используйте 500 мкл холодной морозильной среды, чтобы повторно суспендировать гранулу и перенести ее в криогенный флакон.
- Криоконсервация одноклеточных переваренных PDO
- После сбора и переваривания PDO начните криоконсервацию с шага 4.8.
- Для хранения одного криогенного флакона переложите 4-5 х 105 клеток в свежую трубку с низким связыванием объемом 1,5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Храните три купола/флакон. - Центрифуга при 500 х г в течение 4 мин при 4 °C. Осторожно выбросьте супернатант, используя пипетку объемом 1000 мкл. Удалите супернатант как можно больше, не нарушая гранулу.
- Повторно суспендировать гранулу в соответствующем объеме морозильной среды (500 мкл/флакон) и перенести ее в криогенный флакон.
- Заморозьте PDO на ночь в морозильной камере с температурой -80 °C с помощью соответствующего контейнера для замораживания ячеек и переложите их в морозильную камеру с температурой -150 °C или жидкий азот для длительного хранения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом протоколе представлены процедуры, включая субкультуру и криоконсервацию EAC PDO с одноклеточным пищеварением и без него.
На рисунке 1 показаны репрезентативные фазово-контрастные картины двух различных стратегий субкультуры. PDO EAC достигли соответствующей плотности для субкультуры (рисунок 1, слева). Субкультура без одноклеточного пищеварения занимает меньше времени для достижения сопоставимой плотности и в основном приводит к компактным структурам (рисунок 1, верхний ряд). Напротив, одноклеточные переваренные PDO показывают полые структуры с полым ядром (рисунок 1, нижний ряд). На рисунке 2 показано окрашивание гематоксилин-эозин (H&E) и иммуногистохимия (IHC) парафиновых встроенных EAC PDO с компактными и полыми структурами. Панцитокератин (Pan-CK) позволяет идентифицировать эпителиальные опухолевые клетки18. Цитокератин 7 (CK7) выделяет железистые дифференцированные опухолевые клетки19. Компактная структура (верхний ряд) преимущественно существует в непереваренной культуре, в то время как полая структура (нижний ряд) доминирует в культуре, которая подверглась одноклеточному пищеварению.
На рисунке 3 показано иммунофлуоресцентное (IHC) окрашивание парной ткани EAC и PDO с компактной структурой и полой структурой. Ki67 выделяет клеточные популяции с более высокой клеточной пролиферацией20. Ki67 (красный) и Pan-CK (зеленый) были аналогичным образом распределены между первичной тканью EAC, компактной структурой EAC PDO и полой структурой EAC PDO. На рисунке 4 показаны морфологические характеристики ПДО ЭАК в первый день восстановления из замороженного сырья с одноклеточной криоконсервацией (слева) и непереваренной криоконсервацией на основе ПДО (справа).
На рисунке 5 обобщена блок-схема субкультурного процесса EAC PDO с одноклеточным пищеварением и без него. Короче говоря, хорошо растущий EAC PDO готов к прохождению. PDO EAC были собраны и гранулированы. Для одноклеточного пищеварения PDO ферментативно переваривались в течение 5-10 минут, чтобы получить одиночные клетки, которые, вероятно, вырастали в полые структуры, которые облегчают эксперименты, требующие контроля количества клеток, равномерной плотности и отслеживания размера. Для непереваренной субкультуры PDO были разделены, чтобы получить больше места для роста без ферментативного разрушения, которые, вероятно, вырастут в компактные структуры, облегчающие гистологический анализ, быстрое расширение и более быстрое восстановление после криоконсервации.
Рисунок 1: Морфологические характеристики субкультуры КПК С одноклеточным пищеварением и без него под фазоконтрастным микроскопом. EAC PDO вырастают до определенной плотности до субкультуры (слева). При субкультурировании EAC PDO без одноклеточного пищеварения PDO постепенно растут от полых структур до компактных структур (справа, верхний ряд), тогда как PDO, выращенные из одиночных клеток, показывают преимущественно полые структуры (правый, нижний ряд). Снимки были сделаны с помощью инвертированного светового микроскопа с использованием 5-кратного объектива. Шкала: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Гистологические характеристики компактной структуры и полой структуры EAC PDO. Окрашивание H&E (слева), окрашивание Pan-CK (середина) и окрашивание CK7 (справа) компактной структуры (верхний ряд) и полой структуры (нижний ряд). Снимки были сделаны с помощью инвертированного светового микроскопа с использованием 20-кратного объектива. Шкала: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Иммуногистохимическое окрашивание парной ткани EAC и PDO. Иммунофлуоресцентное (IF) окрашивание парной ткани EAC (верхний ряд), компактной структуры (средний ряд) и полой структуры (нижний ряд) с Pan-CK (зеленый), Ki67 (красный) и DAPI (синий). Снимки были сделаны с помощью перевернутого автоматизированного флуоресцентного микроскопа с использованием 20-кратного объектива. Шкала: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Морфологические характеристики EAC PDO в первый день извлечения из замороженного запаса. Фазово-контрастные снимки рекультивации от одноклеточной криоконсервации (слева) и непереваренной криоконсервации на основе PDO (справа) в первый день выздоровления. Снимки были сделаны с помощью инвертированного светового микроскопа с использованием 5-кратного объектива. Шкала: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Блок-схема субкультурного процесса EAC PDO с и без одноклеточного пищеварения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Запас | Конечная концентрация | 50 мл | |||
| Базальная среда (см. таблицу 3) | 24 мл | ||||
| Wnt-3A кондиционированная среда | 12 мл | ||||
| Кондиционированная среда R-Spondin1 из клеток Культрекса R-спондина | 12 мл | ||||
| Н-2 | в 100 раз | в 1 раз | 500 мкл | ||
| Б-27 | в 50 раз | в 1 раз | 1 мл | ||
| N-ацетилцистеин | 0.5 млн | 1 мМ | 100 мкл | ||
| ЧИР-99021 | 5 мМ | 0.5 мкМ | 5 мкл | ||
| Рекомбинантный эпидермальный фактор роста человека (EGF) | 100 мкг/мл | 250 нг/мл | 125 мкл | ||
| А83-01 | 25 мМ | 0.5 мкМ | 1 мкл | ||
| СБ202190 | 10 мМ | 1 мкМ | 5 мкл | ||
| Гастрин | 100 мкМ | 0,1 мкМ | 50 мкл | ||
| Никотинамид | 1 М | 20 мкМ | 1 мл | ||
| Гентамицин | 50 мг/мл | 10 мкМ | 5 мкл | ||
| Пенициллин/Стрептомицин | в 100 раз | в 1 раз | 500 мкл | ||
| Амфотерицин B | 250 мкг/мл | 0.60% | 300 мкл | ||
| Добавить свежим в хорошо: | |||||
| Башка | 100 мкг/мл | 50 мкл | |||
| Y-27632 | 10.5 мМ | 50 мкл | |||
| Добавить при создании новых PDO из первичной ткани или извлечении из замороженных запасов | |||||
| ФГФ-10а | 100 мкг/мл | 100 нг/мл | 50 мкл | ||
Таблица 1: Приготовление питательной среды ПДО ЭАК.
| Ингибитор трипсина сои (ИППП) | 12,5 мг |
| Настройка до 50 мл с помощью DPBS | |
| Фильтр через стерильный фильтр 0,2 мкм |
Таблица 2: Приготовление раствора ингибитора трипсина сои (ИППП).
| Реагент | Том | Конечная концентрация |
| Усовершенствованный DMEM/F-12 | 48.2 мл | |
| ХЕПЕС (1 М) | 500 мкл | 10 мМ |
| L-глютамин (100X) | 500 мкл | в 1 раз |
| Пенициллин-стрептомицин (100X) | 500 мкл | в 1 раз |
| Амфотерицин B | 300 мкл | 0.60% |
| Гентамицин (50 мг/мл) | 5 мкл | 5 мкг/мл |
Таблица 3: Приготовление базальной среды.
| Одноклеточное пищеварение | |
| Плюсы | Минусы |
| Контроль номера ячейки | Хрупкий при встраивании |
| Проверка жизнеспособности | Больше времени между проходами |
| Применимо, например, для скрининга лекарств, проточной цитометрии | Более длительное время извлечения замороженных запасов |
| Без одноклеточного пищеварения | |
| Плюсы | Минусы |
| Морфология полезна для гистологического анализа | Расширение PDO больше по размеру, чем по количеству |
| Более высокая стабильность процесса встраивания | Не применяется для анализов, где одноклеточная суспензия является обязательной |
| Быстрое извлечение замороженных запасов | Отсутствие контроля количества ячеек и отслеживания размера |
Таблица 4: Плюсы и минусы субкультурирования КДС С одноклеточным пищеварением и без него.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе описаны два различных метода субкультуры и криоконсервации КПК, т.е. с одноклеточным пищеварением и без него. В нескольких исследованиях рекомендовалось пропускать EAC PDO с одноклеточным пищеварением15,17, что полезно для большинства экспериментов, требующих контроля количества клеток, равномерной плотности и полой структуры, которая облегчает отслеживание размера. Однако одноклеточный метод характеризуется более медленным ростом после рекультивации из замороженных запасов и менее компактной морфологией в течение периода культивирования. Опыт показывает 2-3 недели для рекультивации на основе одной клетки, чтобы достичь применимой плотности для процесса субкультуры. Напротив, замороженные EAC PDO без одноклеточного пищеварения могут достигать того же размера за более короткий период (около 1 недели) после рекультивации. Одной из причин может быть дополнительный стресс от переваривания трипсина в течение относительно длительного времени (10 мин). Поэтому рекомендуется сохранять непереваренные EAC PDO в соотношении 1:1,5 (замораживание двух куполов непереваренных EAC PDO и посев обратно в три купола для рекультивации). Кроме того, использование непереваренных EAC PDO рекомендуется для быстрого расширения и гистологической характеристики окрашиванием IHC или IF из-за компактной структуры. Плюсы и минусы двух методов субкультуры обобщены в таблице 4.
Несколько критических шагов требуют внимания в этом протоколе. Во-первых, пластины для культуры PDO должны быть предварительно прогреты в течение ночи в инкубаторе с температурой 37 °C, чтобы обеспечить процесс затвердевания свежепосеменных гелевых куполов ECM. Рекомендуется использовать конфорку для поддержания плиты при температуре 37 °C при длительной продолжительности посева. Во-вторых, во время субкультурного процесса требуются трубки с низким связыванием, чтобы избежать значительных потерь PDO. Чтобы предотвратить потерю геля ECM, наконечники с широким отверстием отверстия могут быть предварительно охлаждены в морозильной камере -20 °C перед использованием. Здесь широкое открытие наконечников позволяет избежать повреждения конструкций PDO на этапе уборки урожая. Далее рекомендуется инкубировать ПДО в течение 20 мин на льду перед первой стадией центрифугирования, чтобы обеспечить полное сжижение геля ECM. Обратите внимание, что центрифуга должна быть установлена при 4 °C на этапах центрифугирования, чтобы сохранить остаточный гель ECM в жидком состоянии. Кроме того, для одноклеточного метода рекомендуется тщательно смешивать PDO после инкубации трипсина с использованием нормального наконечника 1000 мкл для разрушения клеточных сгустков перед добавлением STI, а не напрямую фильтровать клеточную суспензию с помощью клеточных сетчатых фильтров, чтобы избежать потери клеток.
В этот протокол могут быть внесены некоторые изменения. Раствор для восстановления клеток может быть заменен ледяным DPBS для растворения геля ECM на этапе сбора. Тем не менее, опыт показал лучшую способность растворять гель ECM с использованием раствора для восстановления клеток. Поэтому ледяной DPBS скорее рекомендуется только в качестве альтернативного метода резервного копирования. Если лаборатория не оборудована вращающимся инкубатором, EAC PPO можно инкубировать с трипсином на водяной бане 37 °C вместе с смешиванием путем инвертирования трубки каждые 2-3 мин. 10% DMSO с фетальной бычьей сывороткой (FBS) может быть использовано в качестве альтернативы для замораживания среды для приготовления замороженных запасов PDO. Тем не менее, коммерческая морозильная среда с более низкой сывороткой или без нее является предпочтительной из-за лучшего восстановления PDO.
Некоторые ограничения должны быть устранены в этом протоколе. Поскольку эти методы были протестированы только в EAC PDO, применение этого протокола к другим типам PDO не ясно. Хотя процедуры прохождения PDO с одноклеточным пищеварением и без него стандартизированы для большинства органоидных типов21,22, все еще существует необходимость в попытке попробовать современные протоколы по другим типам рака для обеспечения воспроизводимости. Кроме того, 10-минутная инкубация 0,25% трипсина может нагружать клетки во время пищеварения; поэтому время инкубации может варьироваться в зависимости от предсубкультурного состояния PDO и индивидуального разнообразия PDO. Во время ранних попыток предлагается установить разное время инкубации трипсина для каждого EAC PDO.
В заключение, это первый протокол, описывающий и обсуждающий субкультуру и криоконсервацию EAC PDO с одноклеточным пищеварением и без него. Субкультурные КПК С одноклеточным пищеварением применимы для сравнительных экспериментов между группами, в то время как непереваренные КПК полезны для гистологической характеристики, криоконсервации и быстрого расширения. Здесь рутинное обслуживание EAC PDO стандартизировано, предоставляя руководство для исследователей по выбору подходящих методов для генерации органоидов EAC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в данной работе.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана программой Köln Fortune / медицинским факультетом Кельнского университета. Мы благодарим за техническую помощь Сюзанну Нейсс, Микаэлу Хайтманн и Анке Винанд-Дорвейлер. Нинбо Фань получил финансовую поддержку от Совета элитных стипендий Гуанчжоу (GESC). Авторы благодарят доктора Джошуа Д'Розарио за помощь в лингвистическом редактировании.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| -20°C Freezer | Bosch | Economic | |
| -80°C Freezer | Panasonic | MDF DU500VH-PE | |
| Automated Cell counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Countess II |
| Biological Safety Cabinet Class II | Thermo Scientific | 51022482 | Herasafe KS12 |
| Centrifuge | Heraeus | 75003060 | Megafuge 1.0R |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50116048 | Heracell 150i |
| Inverted automated fluorescence microscope | Olympus | IX83 | |
| Inverted light microscope | Leica | DMIL LED Fluo | |
| Pipette 1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | Research Plus |
| Pipette 200 µL | Eppendorf | 3123000039 | Research Plus |
| Rotating Incubator | Scientific Industries, sc. | SI-1200 | Enviro-genie |
| Shaker | Eppendorf | 5355 000.011 | Thermomixer Comfort |
| Vacuum pump | Vacuubrand | 20727200 | BVC control |
| Waterbath | Medingen | p2725 | W22 |
| Material | |||
| 15 mL tube | Sarstedt | 62.554.502 | Inc Screw cap tube PP 15 mL |
| Cryo vial 2 mL | Sarstedt | 72.379 | CryoPure 2.0 mL tube |
| Low bind tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.706.600 | Micro tube 1.5 mL protein LB |
| Low bind tube 5 mL | Eppendorf | 0030 108.302 | Protein LoBind Tube 5.0 mL |
| Pipette tip 200 µL | Starlab | E1011-8000 | 200 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Starlab | E1011-9000 | 1000 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Sarstedt | 70.3050 | Pipette tip 1000 µL |
| Sterile filter 0.2 µm | Sarstedt | 83.1826.001 | Filtropur 0.2 µm sterile filter |
| Tissue culture plate | Sarstedt | 83.3921 | 12 well-plate |
| Reagent/Chemical | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| B-27 | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| CHIR-99021 | MedChemExpress | HY-10182/CS-0181 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| FGF-10a | Peprotech | 100-26-100 | |
| Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium | Thermo Fisher Scientific | 12648010 | |
| Gastrin | Sigma | G9020 | |
| Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL) | PromoCell | C-36030 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| L-Glutamine 200 mM (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| N-2 | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100 | |
| Noggin | Peprotech | 120-10C-50 | |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells | Biotechne | 3710-001-01 | |
| SB202190 | MedChemExpress | 152121-30-7 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | 93620-1G | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Wnt-3A conditioned medium | Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group | ||
| Y-27632 | Sigma | Y0503 |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Coleman, H. G., Xie, S. -H., Lagergren, J.
- Rumgay, H., et al. International trends in esophageal squamous cell carcinoma and adenocarcinoma incidence. The American Journal of Gastroenterology. 116 (5), 1072-1076 (2021).
- Qian, H., et al. Clinical characteristics, prognosis, and nomogram for esophageal cancer based on adenosquamous carcinoma: a seer database analysis. Frontiers in Oncology. 11, 603349 (2021).
- Lagergren, J., Smyth, E., Cunningham, D., Lagergren, P.
- Rockett, J. C., Larkin, K., Darnton, S. J., Morris, A. G., Matthews, H. R. Five newly established oesophageal carcinoma cell lines: phenotypic and immunological characterization. British Journal of Cancer. 75 (2), 258-263 (1997).
- Hashimoto, N. Expression of COX2 and p53 in rat esophageal cancer induced by reflux of duodenal contents. ISRN Gastroenterology. 2012, 1-5 (2012).
- Quante, M., et al. Bile acid and inflammation activate gastric cardia stem cells in a mouse model of barrett-like metaplasia. Cancer Cell. 21 (1), 36-51 (2012).
- Kapoor, H., Lohani, K. R., Lee, T. H., Agrawal, D. K., Mittal, S. K. Animal models of Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma-past, present, and future. Clinical and Translational Science. 8 (6), 841-847 (2015).
- Lan, T., Xue, X., Dunmall, L. C., Miao, J., Wang, Y. Patient-derived xenograft: a developing tool for screening biomarkers and potential therapeutic targets for human esophageal cancers. Aging. 13 (8), Albany NY. 12273-12293 (2021).
- Liu, D. S. H., et al. APR-246 potently inhibits tumour growth and overcomes chemoresistance in preclinical models of oesophageal adenocarcinoma. Gut. 64 (10), 1506-1516 (2015).
- Ebbing, E. A., et al. Esophageal adenocarcinoma cells and xenograft tumors exposed to Erb-b2 receptor tyrosine kinase 2 and 3 inhibitors activate transforming growth factor beta signaling, which induces epithelial to mesenchymal transition. Gastroenterology. 153 (1), 63-76 (2017).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Drost, J., Clevers, H.
- Li, X., et al. Organoid cultures recapitulate esophageal adenocarcinoma heterogeneity providing a model for clonality studies and precision therapeutics. Nature Communications. 9, 2983 (2018).
- Ebbing, E. A., et al. Stromal-derived interleukin 6 drives epithelial-to-mesenchymal transition and therapy resistance in esophageal adenocarcinoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2237-2242 (2019).
- Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).
- Ordóñez, N. G. Broad-spectrum immunohistochemical epithelial markers: a review. Human Pathology. 44 (7), 1195-1215 (2013).
- Maniar, K. P., Umpires, B.
- Sun, X., Kaufman, P. D. Ki-67: more than a proliferation marker. Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
