Summary
यह विशेष डिस्पोजेबल कल्चर वाहिकाओं का उपयोग करके सिम्युलेटेड माइक्रोग्रैविटी में लिम्फोसाइटों को कल्चर करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रोटरी सेल कल्चर सिस्टम का उपयोग करने के लिए एक चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका है। इस संवर्धन विधि को किसी भी निलंबन-प्रकार की सेल संस्कृति पर लागू किया जा सकता है।
Abstract
अंतरिक्ष में जैविक अनुसंधान करने की वर्तमान सीमाओं को देखते हुए, पृथ्वी पर नकली माइक्रोग्रैविटी (एसएमजी) के लिए सेल संस्कृति के अधीन होने के लिए कुछ विकल्प मौजूद हैं। ये विकल्प निलंबन सेल संस्कृति के साथ उपयोग के लिए उनके तरीकों, सिद्धांतों और उपयुक्तता में भिन्न होते हैं। यहां, एक सेल कल्चर विधि को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रोटरी सेल कल्चर सिस्टम का उपयोग करके लिम्फोसाइटों को सिम्युलेटेड माइक्रोग्रैविटी के अधीन करने के लिए वर्णित किया गया है, जिसे 2 डी क्लिनोस्टेट या घूर्णन दीवार पोत (आरडब्ल्यूवी) डिवाइस के रूप में भी जाना जाता है। यह सेल कल्चर विधि क्षैतिज अक्ष पर कोशिकाओं को घुमाकर माइक्रोग्रैविटी का अनुकरण करने के लिए समय-औसत गुरुत्वाकर्षण वेक्टर शून्यीकरण के सिद्धांत का उपयोग करती है। इस प्रणाली में संवर्धित कोशिकाओं को सेलुलर फ़ंक्शन और शरीर विज्ञान पर सिम्युलेटेड माइक्रोग्रैविटी के प्रभावों का आकलन करने के लिए कई अलग-अलग प्रयोगात्मक परखों में काटा और उपयोग किया जा सकता है। संवर्धन तकनीक उपयोग किए जाने वाले सेल प्रकार या रेखा के आधार पर थोड़ी भिन्न हो सकती है, लेकिन यहां वर्णित विधि किसी भी निलंबन-प्रकार सेल संस्कृति पर लागू की जा सकती है।
Introduction
स्पेसफ्लाइट को प्रतिरक्षा प्रणाली सहित मानव शरीर विज्ञान के कई पहलुओं को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है। कई अध्ययनों ने विवो में अंतरिक्ष यान के परिणामस्वरूप प्रतिरक्षा विकृति और विट्रो 1,2,3,4 में सिम्युलेटेड माइक्रोग्रैविटी (एसएमजी) के संपर्क में आने के सबूत दिखाए हैं। अंतरिक्ष वातावरण का एक प्रमुख पहलू जो मानव शरीर विज्ञान को प्रभावित करता है वह माइक्रोग्रैविटी है। माइक्रोग्रैविटी अंतरिक्ष वातावरण में कम गुरुत्वाकर्षण बलों के कारण अनुभव की जाने वाली "भारहीनता" को संदर्भित करताहै। जैसा कि मानवता चंद्रमा और मंगल ग्रह पर लंबे अंतरिक्ष मिशनों के लिए तैयार है, अंतरिक्ष यात्रियों में गंभीर स्वास्थ्य जोखिमों को कम करने के लिए अधिक शोध किए जाने की आवश्यकता है।
वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए वास्तविक माइक्रोग्रैविटी स्थितियों को अंतर्राष्ट्रीय अंतरिक्ष स्टेशन (आईएसएस) पर अंतरिक्ष में या कक्षा में लॉन्च किए गए नैनोउपग्रहों में प्राप्त किया जा सकता है; हालाँकि, ये विकल्प अविश्वसनीय रूप से महंगे और व्यवस्थित करने के लिए जटिल हो सकते हैं। अंतरिक्ष में जैविक अनुसंधान करने की वर्तमान सीमाओं को देखते हुए, पृथ्वी पर वास्तविक माइक्रोग्रैविटी और एसएमजी को प्रेरित करने के लिए कई विकल्प मौजूद हैं। बड़े पैमाने पर संचालन मौजूद हैं जो पृथ्वी पर वास्तविक माइक्रोग्रैविटी की छोटी अवधि का उत्पादन कर सकते हैं, जिसमें ड्रॉप टॉवर, परवलयिक उड़ान और साउंडिंग रॉकेट शामिल हैं। हालांकि, ये विधियां जैविक प्रणालियों पर माइक्रोग्रैविटी के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए अत्यधिक उपयुक्त नहीं हैं, बड़े पैमाने पर माइक्रोग्रैविटी उपचार की छोटी अवधि (यानी, सेकंड से 20 मिनट) के कारण। इन विधियों पर कहीं और अधिक विस्तार से चर्चा की गईहै 5,6. जैविक सेल संस्कृति के लिए उपयुक्त विकल्पों में छोटे पैमाने के उपकरण जैसे 2 डी क्लिनोस्टैट्स या घूर्णन दीवार पोत (आरडब्ल्यूवी) डिवाइस और 3 डी क्लिनोस्टैट्स या रैंडम पोजिशनिंग मशीन (आरपीएम) शामिल हैं। इन उपकरणों को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर बनाए गए सेल कल्चर इनक्यूबेटरों के अंदर स्थापित किया जा सकता है, और वे सेल संस्कृति को क्षैतिज अक्ष (2 डी) या दो लंबवत अक्षों (3 डी) 5 पर घुमाते हैं। हालांकि, इस बात पर जोर देना महत्वपूर्ण है कि ये संवर्धन विधियां वास्तविक माइक्रोग्रैविटी के विपरीत एसएमजी का उत्पादन करती हैं, जो जैविक अनुसंधान संदर्भों के लिए अंतरिक्ष में सबसे अधिक स्पष्ट रूप से प्राप्त होती है।
वर्तमान पेपर का लक्ष्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरडब्ल्यूवी डिवाइस (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके लिम्फोसाइटों को एसएमजी के अधीन करने के चरणों की रूपरेखा तैयार करना है, जो 2 डी क्लिनोस्टेट वर्गीकरण के अंतर्गत आता है। जबकि इस डिवाइस के संचालन के लिए निर्माता से एक सामान्य प्रोटोकॉल उपलब्ध है, वर्तमान लेख का उद्देश्य समस्या निवारण और अनुकूलन चरणों को अधिक विस्तार से कवर करना है। यह लेख इस सिद्धांत को भी शामिल करता है कि यह डिवाइस निलंबन सेल संस्कृति में एसएमजी का उत्पादन करने के लिए कैसे काम करता है, विशेष रूप से लिम्फोसाइटों के साथ। इस संदर्भ में, निलंबन सेल संस्कृति किसी भी अतिरिक्त मचान का पालन किए बिना पूरक संस्कृति मीडिया में स्वतंत्र रूप से बढ़ने वाली कोशिकाओं को संदर्भित करती है। लिम्फोसाइटों सहित निलंबन सेल संस्कृति में कई सेल प्रकार उगाए जाते हैं। लिम्फोसाइट्स प्रतिरक्षा प्रणाली की कोशिकाएं हैं, जिनमें टी, बी और प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाएं शामिल हैं, जो लिम्फोइड अंगों और रक्तप्रवाहमें रहती हैं।
यहां वर्णित आरडब्ल्यूवी 2 डी क्लिनोस्टेट समय-औसत गुरुत्वाकर्षण वेक्टर शून्यीकरण 5,6,8,9 के सिद्धांत पर काम करता है, जिससे गुरुत्वाकर्षण वेक्टर को क्षैतिज अक्ष पर सेल संस्कृति के रोटेशन के माध्यम से यादृच्छिक किया जाता है। यह कोशिकाओं के अवसादन वेग के लिए संस्कृति पोत के घूर्णी वेग का मिलान करके प्राप्त किया जाता है। जब तक संस्कृति पोत के घूर्णी वेग को कोशिकाओं के अवसादन वेग से अच्छी तरह से मेल खाता है, तब तक कोशिकाओं को मुक्त-पतन में बनाए रखा जाता है और तलछट में असमर्थ होता है, जैसा कि अंतरिक्ष वातावरण में अनुभव किया जाता है। प्रारंभिक गति-अप चरण के बाद, संस्कृति पोत में मीडिया अंततः समय के साथ "ठोस शरीर रोटेशन" तक पहुंच जाता है। यह क्षैतिज रोटेशन सेल कल्चर पोत में लैमिनार प्रवाह को भी प्रेरित करता है। यह एक "कम कतरनी" वातावरण बनाता है, यह देखते हुए कि लैमिनार प्रवाह द्वारा कोशिकाओं पर प्रेरित कतरनी तनाव अशांत प्रवाह की तुलना में बहुत कम है। हालांकि, यह देखते हुए कि क्लिनोस्टैट एक आदर्श प्रणाली नहीं है, कुछ छोटे, लैमिनार द्रव गतियां पेश की जाती हैं, जो कोशिकाओं पर न्यूनतम कतरनी तनाव पैदा करती हैं। इस प्रकार, मीडिया में निलंबित कोशिकाएं रोटेशन के दौरान इस प्रवाह द्वारा खींची जाती हैं। क्षैतिज रोटेशन के दौरान, गुरुत्वाकर्षण वेक्टर कोशिकाओं पर कार्य करता है और उन्हें एक ऑसिलेटिंग प्रक्षेपवक्र में लाता है, जैसा कि चित्र 1 में देखा गया है। कतरनी तनाव का एक और छोटा स्रोत मीडिया के माध्यम से कोशिकाओं के "गिरने" के कारण होता है, जिससे कोशिकाओं के चारों ओर लैमिनार प्रवाह होता है। जैसा कि संस्कृति पोत एक क्षैतिज अक्ष पर घूमता है, कोशिकाओं द्वारा अनुभव किया जाने वाला गुरुत्वाकर्षण वेक्टर भी घूमता है। समय के साथ, यह घूर्णन गुरुत्वाकर्षण वेक्टर औसत शून्य तक पहुंच जाता है; इस घटना को समय-औसत गुरुत्वाकर्षण वेक्टर शून्यीकरण कहा जाता है और एसएमजी 5,6,8,9 की स्थिति को प्रेरित करता है। इस उपकरण का उपयोग कई प्रकार की कोशिकाओं पर एसएमजी के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए किया गया है, जिनमें से कुछ संदर्भ 10,11,12 में शामिल हैं। अधिक उदाहरण डिवाइस निर्माता की वेबसाइट पर पाए जा सकते हैं।
यह आरडब्ल्यूवी डिवाइस डिवाइस निर्माता के माध्यम से उपलब्ध विशेष "उच्च पहलू अनुपात जहाजों" (एचएआरवी) का उपयोग करता है। इन एचएआरवी में प्रत्येक में 10 एमएल सेल कल्चर होता है; हालाँकि, 50 एमएल एचएआरवी भी उपलब्ध हैं। या तो 10 एमएल या 50 एमएल एचएआरवी का उपयोग इस बात पर निर्भर करता है कि किसी भी डाउनस्ट्रीम प्रयोगात्मक परख को पूरा करने के लिए कितनी कोशिकाओं की आवश्यकता है, जिसे चर्चा अनुभाग में आगे उल्लिखित किया गया है। एचएआरवी पॉली कार्बोनेट से बने होते हैं और इसमें सेल कल्चर के दौरान गैस विनिमय की अनुमति देने के लिए एक सिलिकॉन ऑक्सीकरण झिल्ली शामिल होती है। यह सेल मीडिया के पीएच को बनाए रखता है और कुशल सेलुलर श्वसन की अनुमति देता है। पोत के चेहरे पर एक मुख्य भरण बंदरगाह और दो कैप्ड सिरिंज बंदरगाह हैं (चित्रा 2 ए)। मुख्य भरण बंदरगाह के माध्यम से सेल संस्कृति को लोड करने के बाद, बुलबुला हटाने में सहायता के लिए पोत पर दो सिरिंज लोड किए जाते हैं। 10 एमएल जहाजों का उपयोग करते समय, दो 3 एमएल सिरिंज अच्छी तरह से काम करते हैं। एक सिरिंज डिवाइस से खाली जुड़ी होती है, जिसमें सिरिंज पूरी तरह से उदास होती है, और दूसरा 3 एमएल सेल कल्चर (चित्रा 2 ई) से भरा होता है। इनका उपयोग पोत से बुलबुले को हटाने के लिए संयोजन में किया जाता है, जो एसएमजी उपचार को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। सामान्य तौर पर, दो नकारात्मक नियंत्रण स्थापित करने की सलाह दी जाती है, जिन्हें "फ्लास्क" नियंत्रण और "1 जी" नियंत्रण के रूप में संदर्भित किया जा सकता है। "फ्लास्क" नियंत्रण उन कोशिकाओं से मेल खाता है जो एक मानक टी 25 निलंबन सेल कल्चर फ्लास्क में उगाए जाते हैं। 1 जी नियंत्रण उन कोशिकाओं से मेल खाता है जो विशेष 10 एमएल संस्कृति पोत में उगाए जाते हैं, जिसे बस इनक्यूबेटर में रखा जाता है (यानी, एसएमजी उपचार के अधीन किए बिना)। नियंत्रणों के बारे में अधिक जानकारी के लिए कृपया चर्चा अनुभाग देखें.
यहां वर्णित विधि किसी भी शोधकर्ता के लिए उपयुक्त है जो लिम्फोसाइटों पर एसएमजी के प्रभावों का अध्ययन करना चाहते हैं, एनके 92 सेल लाइन13 का उपयोग करके एनके कोशिकाओं पर एक विशिष्ट ध्यान देने के साथ। इन अध्ययनों के परिणाम हमें मानव प्रतिरक्षा प्रणाली पर अंतरिक्ष यान के प्रतिकूल प्रभावों को बेहतर ढंग से समझने और कम करने में मदद कर सकते हैं।
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Protocol
नोट: निम्नलिखित चरणों को बाँझ जैविक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर पूरा किया जाना चाहिए।
1. सेल संस्कृति के लिए जहाजों की तैयारी
- प्लास्टिक पैकेजिंग से संस्कृति जहाजों को बाहर निकालें। लाइन का उपयोग किस सेल प्रकार / लाइन का उपयोग किया जा रहा है, चाहे वह नियंत्रण (1 जी) या उपचार (एसएमजी) हो, और कोई अन्य प्रासंगिक जानकारी के अनुसार रिम पर प्रत्येक पोत को लेबल करें।
- पोत को स्थिर करें और भरण बंदरगाह टोपी पेग / ओ-रिंग को स्पर्श किए बिना, भरण बंदरगाह को सावधानी से खोलें। कैप को इथेनॉल पैड पर रखें, जिसमें खूंटी / ओ-रिंग ऊपर की ओर है, जबकि बर्तन भरा जा रहा है। सिरिंज पोर्ट से कैप्स न निकालें।
नोट: यदि खूंटी / ओ-रिंग गलती से छू लिया जाता है, तो कैप पेग को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें और बर्तन को भरते समय कुछ क्षणों के लिए इसे (ऊपर की ओर) बैठने दें। जब भरण बंदरगाह को फिर से बंद करने के लिए तैयार हो, तो जहाज पर वापस रखने से पहले टोपी को अच्छी तरह से सुखाने के लिए एक ताजा पेपर वाइप के साथ टोपी उठाएं। - एक बाँझ सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके सेल संस्कृति के लिए उपयुक्त पूर्ण मीडिया के 10 एमएल के साथ पोत को लोड करें, और सावधानीपूर्वक टोपी को भरण बंदरगाह पर वापस रखें।
नोट: यहां, एनके 92 एनके सेल लाइन का उपयोग किया गया था, जिसे जीएम 1 मीडिया में सुसंस्कृत किया गया था, जैसा कि पहले सेल थेरेपी14 के रूप में एनके 92 कोशिकाओं का उपयोग करके नैदानिक परीक्षण में मान्य किया गया था। उपयोग किया जाने वाला संस्कृति मीडिया सेल लाइन या सेल प्रकार को सुसंस्कृत होने पर निर्भर करता है। सेल लाइन या सेल प्रकार का उपयोग करने के लिए सही मीडिया नुस्खा के लिए आपूर्तिकर्ता की वेबसाइट की जांच करें। - सुनिश्चित करें कि सिरिंज पोर्ट कैप्स और फिल पोर्ट सुरक्षित रूप से बंद हैं, और भरे हुए जहाजों को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें, जबकि सेल कल्चर के लिए जहाजों को प्रमुख करने के लिए बाद के चरणों को पूरा करें।
नोट: यह प्राइमिंग चरण चरण 6 में बाद में बुलबुले को बाहर निकालना आसान बनाने के लिए बड़े बुलबुले के गठन को कम करने में मदद करता है।
2. एसएमजी उपचार सेटअप के लिए स्टॉक सेल संस्कृति की तैयारी
- जब उपयोग में नहीं होता है, तो रुचि की कोशिकाओं को -130 डिग्री सेल्सियस से कम तापमान पर या आदर्श रूप से, तरल नाइट्रोजन वाष्प चरण में स्टोर करें।
- नियोजित उपचार स्थापित करने से कम से कम 1 सप्ताह पहले, कोशिकाओं को पिघलाएं और आपूर्तिकर्ता की वेबसाइट पर पाए जाने वाले उपयुक्त सेल कल्चर मीडिया नुस्खा का उपयोग करके उन्हें कल्चर करें। योजना बनाएं कि उपचार स्थापित करने के लिए कितनी कोशिकाओं की आवश्यकता है (बाद के चरणों में नीचे दिए गए विवरण) और संस्कृति के लिए पर्याप्त प्रसार और अनुकूलन की अनुमति देने के लिए संस्कृतियों को जल्दी शुरू करना सुनिश्चित करें।
- सेल संस्कृति को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में स्टोर करें। मानक सेल संस्कृति अभ्यास पर अधिकविवरण कहीं और कवर किए गए हैं।
- नियोजित एसएमजी उपचार सेटअप के दिन, प्रारंभिक सेल संस्कृति की प्रारंभिक एकाग्रता और व्यवहार्यता निर्धारित करें।
- प्रारंभिक सेल संस्कृति की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए पसंदीदा विधि का उपयोग करें (जैसे, हेमोसाइटोमीटर, विसेल, फ्लो साइटोमेट्री, आदि)। कोशिकाओं की व्यवहार्य सेल एकाग्रता (कोशिकाएं प्रति एमएल) और व्यवहार्यता (%) पर ध्यान दें, यह सुनिश्चित करते हुए कि व्यवहार्यता आदर्श रूप से 85% से अधिक है। हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल कहीं और पाया जा सकताहै 16.
- विशेष सेल प्रकार/लाइन की इष्टतम सेल एकाग्रता सीमा, उनके दोगुना होने के समय और एसएमजी उपचार की लंबाई पर विचार करके एसएमजी उपचार के लिए सेल कल्चर के उपयुक्त सेल सीडिंग घनत्व /एकाग्रता का निर्धारण करें। कृपया आगे विस्तार के लिए चर्चा अनुभाग देखें।
नोट: अनुभव से, एनके 92 कोशिकाओं के लिए इष्टतम एकाग्रता सीमा 0.3 x 106- 1.2 x 106 कोशिकाओं / एमएल के बीच है। आम तौर पर, इन कोशिकाओं में 48-72 घंटे का दोगुना समय होता है और हर 2-3 दिनों में खिलाया जाता है। यह देखते हुए कि उपचार की लंबाई 72 घंटे थी, कोशिकाओं को 0.4-0.5 x 106 कोशिकाओं / एमएल पर उनकी इष्टतम सीमा के निचले छोर पर बीज दिया गया था। एनके 92 कोशिकाओं की एक ताजा शीशी से प्रारंभिक सेल संस्कृति शुरू करते समय आपूर्तिकर्ता इस सीडिंग घनत्व की भी सिफारिश करता है। - स्टॉक सेल संस्कृति की मात्रा निर्धारित करें जो उपचार और नियंत्रण स्थापित करने के लिए आवश्यक है।
नोट: प्रति प्रयोगात्मक समूह में 10 एमएल सेल कल्चर की आवश्यकता होती है। यदि तीन प्रयोगात्मक समूह स्थापित किए जाते हैं (यानी, एक उपचार: "एसएमजी", और दो नकारात्मक नियंत्रण: "फ्लास्क" और "1 जी"), तो एक और 10 एमएल सेल कल्चर एचएआरवी सिरिंज को लोड करने के लिए उपयोग की जाने वाली 15 एमएल ट्यूब में एलिकोट करने के लिए पर्याप्त है। यह कुल मिलाकर 40 एमएल है, जो विशिष्ट प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर उतार-चढ़ाव हो सकता है। - उपचार स्थापित करने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करें।
- चुने हुए सीडिंग घनत्व (कोशिकाओं /एमएल) को आवश्यक कुल मात्रा (एमएल) से गुणा करके आवश्यक कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करें।
नोट: एनके 92 के साथ अनुभव से, स्टॉक सेल संस्कृति के 40 एमएल को 0.4-0.5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल की सीडिंग एकाग्रता पर ऊपर विस्तृत रूप से तैयारकिया गया है। जैसे, विशिष्ट उपचार सेटअप को पूरा करने के लिए16-20 x 10 6 एनके 92 कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। एनके 92 सेल लाइन के लिए, उपचार के दौरान उच्च व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए थोड़ी कम कोशिकाओं की तुलना में थोड़ा अधिक कोशिकाओं का उपयोग करना बेहतर है।
- चुने हुए सीडिंग घनत्व (कोशिकाओं /एमएल) को आवश्यक कुल मात्रा (एमएल) से गुणा करके आवश्यक कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करें।
- नीचे घूमने के लिए प्रारंभिक सेल संस्कृति की मात्रा निर्धारित करें।
- यह देखते हुए कि सेल एकाग्रता को कोशिकाओं / एमएल के रूप में दर्शाया जाता है, सेल कल्चर (कोशिकाओं / एमएल) की मापा प्रारंभिक एकाग्रता द्वारा प्रयोग के लिए आवश्यक कोशिकाओं (कोशिकाओं) की कुल संख्या को विभाजित करें।
नोट: उदाहरण के लिए, यदि 16 x 106 कोशिकाओं की आवश्यकता है और संस्कृति की प्रारंभिक एकाग्रता 0.8 x 106 कोशिकाएं / एमएल है, तो संस्कृति के 20 एमएल को नीचे काटा जाना चाहिए।
- यह देखते हुए कि सेल एकाग्रता को कोशिकाओं / एमएल के रूप में दर्शाया जाता है, सेल कल्चर (कोशिकाओं / एमएल) की मापा प्रारंभिक एकाग्रता द्वारा प्रयोग के लिए आवश्यक कोशिकाओं (कोशिकाओं) की कुल संख्या को विभाजित करें।
- अंतिम स्टॉक सेल संस्कृति बनाएं।
- 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 8 मिनट के लिए 300 x g पर कोशिकाओं की उचित संख्या को सेंट्रीफ्यूज करें।
- सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक एक अपशिष्ट कंटेनर में डालें, और धीरे से ट्यूब को फ्लिक करें ताकि गोली को छोटे बचे हुए आयतन में फिर से निलंबित किया जा सके।
- संस्कृति को वांछित सीडिंग घनत्व में लाने के लिए गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) पूर्ण मीडिया की उचित मात्रा में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। इस खंड की गणना चरण 2.6 में की गई थी।
- 50 एमएल ट्यूब को सुरक्षित रूप से कैप करें, और सेल सस्पेंशन को अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए धीरे से इसे कुछ बार उलट दें।
नोट: यदि पूर्ण प्रयोग स्थापित करने के लिए 50 एमएल से अधिक की आवश्यकता होती है, तो 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में आवश्यक कोशिकाओं की कुल संख्या को सेंट्रीफ्यूज करना और इसे आवश्यक मात्रा के आधे हिस्से में पुन: निलंबित करना सबसे अच्छा है। फिर, अच्छी तरह से मिलाएं और एक अलग 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 1: 2 कमजोर पड़ने दें। उदाहरण के लिए, यदि 0.4 x 106 कोशिकाओं / एमएल पर 100 एमएल की आवश्यकता होती है, तो 50 एमएल ट्यूब में 40 x 106 कोशिकाओं को स्पिन करें, 50 एमएल मीडिया में पुन: निलंबित करें, 25 एमएल को अन्य 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, और फिर 25 एमएल ताजा मीडिया के साथ दोनों को टॉप अप करें।
3. स्टॉक सेल संस्कृति के साथ जहाजों को लोड करना
- इनक्यूबेटर से मीडिया-प्राइमेड जहाजों को पुनः प्राप्त करें।
- यदि "फ्लास्क" नियंत्रण का उपयोग किया जा रहा है, तो ऊपर तैयार स्टॉक से 10 एमएल सेल कल्चर के साथ टी 25 सस्पेंशन कल्चर फ्लास्क लोड करें। इसके अलावा, एक अलग 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 10 एमएल स्टॉक सेल संस्कृति जोड़ें, जिसका उपयोग सिरिंज को लोड करने के लिए किया जाएगा।
- जहाज से उन्हें हटाने के लिए सिरिंज पोर्ट कैप्स को अनस्क्रू करें और सुनिश्चित करें कि स्टॉपकॉक खुली स्थिति में हैं (चित्रा 2 सी)।
- पोत को स्थिर करें और भरण बंदरगाह टोपी पेग / ओ-रिंग को स्पर्श किए बिना, भरण बंदरगाह को सावधानी से खोलें। कैप को इथेनॉल पैड पर रखें, जिसमें खूंटी / ओ-रिंग ऊपर की ओर है, जबकि बर्तन भरा जा रहा है। सिरिंज बंदरगाहों से कैप्स को सावधानीपूर्वक हटा दें।
- सुनिश्चित करें कि स्टॉपकॉक खुली स्थिति में हैं (चित्रा 2 सी)। सावधानी से जहाज से मीडिया को एक अपशिष्ट कंटेनर में डालें, सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके मीडिया को हटा दें, या ऑक्सीजन झिल्ली को छूने के बिना वैक्यूम सिस्टम से जुड़े बाँझ ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके इसे एस्पिरेट करें।
- स्टॉक सेल कल्चर वाले 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब को कसकर बंद करें और सामग्री को अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए धीरे से इसे कुछ बार उलट दें।
- एक ताजा बाँझ सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ 50 एमएल ट्यूब से 10 एमएल सेल कल्चर स्टॉक तैयार करें। पोत को उठाएं और इसे झुकाएं ताकि भरण बंदरगाह शीर्ष की ओर हो और फिर भरण बंदरगाह के माध्यम से पोत में सेल कल्चर स्टॉक को सावधानीपूर्वक वितरित करें।
नोट: सावधान रहें और मात्रा देखें ताकि जहाज को झुकाते समय संस्कृति सिरिंज बंदरगाहों के माध्यम से न फैले। - बिना फैलने के भरने वाले बंदरगाह के होंठ के शीर्ष पर पोत को भरने का लक्ष्य रखें; रिसाव से बचने के लिए बर्तन को वापस नीचे झुकाएं क्योंकि इसे भरा जा रहा है। ध्यान रखें कि पिपेट के साथ ऑक्सीकरण झिल्ली को न छुएं क्योंकि यह बहुत नाजुक है।
नोट: पोत भरने की प्रक्रिया में कुछ अभ्यास हो सकता है; धैर्य रखें और धीरे-धीरे चलें। यदि भरण बंदरगाह के उद्घाटन पर एक बुलबुला फिल्म बनती है, तो यह पोत को लोड करने में हस्तक्षेप करेगा। यदि ऐसा होता है, तो बुलबुला फिल्म द्वारा बनाई गई सील को तोड़ने के लिए धीरे से पोत को मार दें। - एक बार जब जहाज लोड हो जाता है, तो फिल पोर्ट कैप को सावधानीपूर्वक वापस रखें, यह सुनिश्चित करते हुए कि पेग / ओ-रिंग को न छुएं।
- सिरिंज पर रखें।
नोट: पोत के चेहरे पर दो सिरिंज बंदरगाह हैं (चित्रा 2 ए)। एक में एक खाली सिरिंज होगी, और दूसरे में सेल संस्कृति से भरा सिरिंज होगा (चित्रा 2 ई)।- सबसे पहले, 3 एमएल खाली सिरिंज को सिरिंज बंदरगाहों में से एक में संलग्न करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि सिरिंज पूरी तरह से उदास है।
नोट: सिरिंज को पोत से जोड़ने से पहले कुछ बार पंप करें क्योंकि वे पहली बार में थोड़े तंग होते हैं। बाँझपन बनाए रखने के लिए जैविक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर ऐसा करें। - 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब को 10 एमएल एलिकोटेड सेल कल्चर के साथ कसकर बंद करें और सामग्री को अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए धीरे से इसे कुछ बार उलट दें।
- इसके बाद, सेल संस्कृति में दूसरे 3 एमएल सिरिंज को सावधानीपूर्वक अर्ध-जलमग्न करें और कुछ संस्कृति तैयार करें। सिरिंज के शीर्ष में हवा के बुलबुले को कम करने के लिए, इसे पूरी तरह से ट्यूब में वापस निकालें, और फिर संस्कृति के 3 एमएल को खींचें।
- भरे हुए सिरिंज को शेष सिरिंज बंदरगाह से संलग्न करें, और सावधानीपूर्वक सिरिंज को साफ करें और इथेनॉल पैड के साथ भरण बंदरगाह के आसपास। ऑक्सीकरण झिल्ली पर इथेनॉल न प्राप्त करें। अब जहाज बुलबुले से छुटकारा पाने के लिए तैयार है।
नोट: दूसरे पोत के लिए दूसरी भरी हुई सिरिंज 15 एमएल ट्यूब की गहराई को देखते हुए लोड करना अधिक कठिन है। यह सिरिंज भरते समय ट्यूब को झुकाने में मदद करता है ताकि सिरिंज भरे जाने और सेल कल्चर के बीच सील को बनाए रखा जा सके। - शेष जहाजों के लिए चरण 3.3-3.10 दोहराएं। यदि अंतिम पोत के लिए 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में सेल कल्चर की थोड़ी अपर्याप्त मात्रा बची है (उदाहरण के लिए, 10 एमएल के बजाय 9.5 एमएल), तो सिरिंज लोड करने के लिए उपयोग किए जाने वाले 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब से शेष राशि पुनर्प्राप्त करें।
नोट: निम्नलिखित चरणों को बाँझ जैविक सुरक्षा कैबिनेट के भीतर होने की आवश्यकता नहीं है, क्योंकि पोत अब एक बंद, बाँझ प्रणाली है।
- सबसे पहले, 3 एमएल खाली सिरिंज को सिरिंज बंदरगाहों में से एक में संलग्न करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि सिरिंज पूरी तरह से उदास है।
4. जहाजों से बुलबुले निकालना
नोट: बुलबुले इस सेटअप के भीतर अपरिहार्य हैं और पूरे उपचार के दौरान लगातार हटाए जाने चाहिए (चित्रा 3)। कृपया इस पर अधिक जानकारी के लिए चर्चा अनुभाग देखें।
- सुनिश्चित करें कि सिरिंज पोर्ट स्टॉपकॉक्स बंद स्थिति में हैं (चित्रा 2 डी) ताकि सिरिंज से वाहिकाओं में कोशिकाओं और बुलबुले के प्रवास को सीमित किया जा सके। यह बाद में उपचार के दौरान विशेष रूप से महत्वपूर्ण है (नीचे चर्चा की गई है)। प्रारंभिक बुलबुले इकट्ठा करने के लिए, जहाज को उल्टा पलटें और इसके किनारे कुछ बार टकराएं।
- जल्दी से बर्तन को वापस ऊपर की ओर मोड़ें और फिर दूर की ओर एक मामूली कोण पर ताकि बुलबुले सभी पोत के ऊपर की ओर तैरें (चित्रा 3 बी)।
- खाली सिरिंज के साथ बंदरगाह के नीचे बुलबुले पैंतरेबाज़ी करें और उन्हें बंदरगाह में प्रवेश करना शुरू करें। सिरिंज पोर्ट स्टॉपकॉक्स (चित्रा 2 सी) दोनों खोलें।
- बुलबुले को खाली सिरिंज में तैरने के लिए प्रोत्साहित करने के लिए धीरे से बर्तन को मारो। धीरे-धीरे खाली सिरिंज के साथ बड़े बुलबुले को चूसें, जबकि पूर्ण सिरिंज को सावधानीपूर्वक निराश करें, ताकि बर्तन में दबाव बनाए रखा जा सके ताकि ऑक्सीकरण झिल्ली फट न जाए।
नोट: बड़े बुलबुले को चूसने की आवश्यकता होगी, जबकि छोटे बुलबुले और माइक्रोबबल को सिरिंज बंदरगाहों में पैंतरेबाज़ी करके और धीरे से पोत से टकराकर सिरिंज में तैरने के लिए प्रोत्साहित किया जा सकता है। उपचार के कुछ घंटों के बाद, सिरिंज में कोशिकाओं और संस्कृति पोत में कोशिकाओं के बीच "क्रॉस-संदूषण" को कम करना अत्यधिक महत्वपूर्ण है। ऐसा इसलिए है क्योंकि सिरिंज में कोशिकाओं को वाहिका में कोशिकाओं के समान ऑक्सीजन या एसएमजी के संपर्क में नहीं आता है। - सभी बुलबुले हटा दिए गए हैं यह सुनिश्चित करने के लिए चरण 4.2-4.4 को कुछ बार दोहराएं। जहाजों से माइक्रोबबल सहित सभी बुलबुले हटा दें।
नोट: बुलबुले को आसानी से ऑक्सीकरण झिल्ली (पोत के पीछे) के माध्यम से देखा जा सकता है जब पोत का उद्देश्य प्रकाश स्रोत (खिड़की, प्रकाश, आदि) होता है। चरण 4.2 और 4.3 को पूरा करते समय, कठिन-से-देखने वाले बुलबुले की कल्पना करने में मदद करने के लिए जहाज के पीछे से चलने वाले बुलबुले को देखें। - जब बुलबुले प्रभावी ढंग से हटा दिए गए हैं, तो सिरिंज पोर्ट स्टॉपकॉक बंद करें। उपचार के दौरान सिरिंज को रखें ताकि बाद में बुलबुला हटाने की अनुमति मिल सके, यह सुनिश्चित करते हुए कि दोनों सिरिंज में मात्रा लगभग बराबर है।
5. पोत को घूर्णन आधार से जोड़ना
- 70% इथेनॉल के साथ घूर्णन आधार और रिबन केबल की सतह को सावधानीपूर्वक पोंछ दें।
- सुनिश्चित करें कि शामिल रिबन केबल बिजली की आपूर्ति से जुड़ा हुआ है। इनक्यूबेटर में घूर्णन आधार रखें और रिबन केबल को आधार से संलग्न करें। सुनिश्चित करें कि बिजली की आपूर्ति इनक्यूबेटर के पास लेकिन बाहर रखी गई है। चित्रा 4 संदर्भ के लिए घूर्णन आधार और बिजली की आपूर्ति को दर्शाता है।
- पोत के धागों को घूर्णन खूंटे से जोड़कर एसएमजी उपचार पोत को संलग्न करें और धीरे से आधार पर घूमने वाले खूंटे को एक प्रतिघड़ी दिशा में मोड़ें। सुनिश्चित करें कि जहाज सुरक्षित रूप से जुड़ा हुआ है। सुनिश्चित करें कि इनक्यूबेटर पर्याप्त आटोक्लेव, रिवर्स ऑस्मोसिस (आरओ) पानी के साथ पानी की ट्रे को भरकर 100% आर्द्रता बनाए रखता है।
- एक उपयुक्त रोटेशन गति (आरपीएम) चुनें। कोशिकाओं के अवसादन वेग से मेल खाने के लिए रोटेशन गति को समायोजित करें, जैसे कि कोशिकाएं "मीडिया के माध्यम से बिल्कुल नहीं गिरती हैं" लेकिन एक छोटे कक्षीय पथ में घूमती हैं। इस घटना को चित्र 1 में एक योजनाबद्ध आरेख के रूप में देखा गया है।
नोट: कंपनी लिम्फोसाइटों के लिए 8-10 आरपीएम पर रोटेशन शुरू करने की सिफारिश करती है। इस मामले में, एनके 92 कोशिकाओं को 11 आरपीएम पर घुमाया गया था, जैसा कि पिछले पेपर17 में दिखाया गया था। सेल के आकार के आधार पर, आरपीएम को बड़ी कोशिकाओं के लिए बढ़ाया जाना चाहिए और छोटी कोशिकाओं के लिए कम किया जाना चाहिए। एक ही पैटर्न लागू होता है यदि उपयोग की जाने वाली कोशिकाएं संवर्धन के दौरान झुरमुट करती हैं। कृपया इस पर अधिक जानकारी के लिए चर्चा अनुभाग देखें।
6. उपचार
- अनुसंधान अनुप्रयोग के लिए एक उपयुक्त उपचार लंबाई चुनें, जो इस बात पर निर्भर हो सकता है कि सेल फ़ंक्शन / फिजियोलॉजी के किन मापदंडों की परख की जा रही है। कृपया इस पर अधिक जानकारी के लिए चर्चा अनुभाग देखें।
नोट: इस मामले में, एनके 92 कोशिकाओं को पिछले अध्ययनों18,19 के परिणामों के आधार पर 72 एच एसएमजी उपचार के अधीन किया गया था। बुलबुले अनिवार्य रूप से पूरे उपचार में बनेंगे और उन्हें हटाने की आवश्यकता होगी। इसे सुविधाजनक बनाने के लिए रोटेशन को संक्षेप में रोका जा सकता है और फिर से शुरू किया जा सकता है। SMG पोत को सुरक्षित रूप से निकालने के तरीके के लिए चरण 7.1 देखें। - उपचार स्थापित करने के पहले दिन, चरण 4.2-4.6 को दोहराकर हर कुछ घंटों में बुलबुला गठन की जांच करें। पहले दिन के बाद, उपचार के अंत तक चरण 4.2-4.6 को दोहराते हुए आवश्यक (प्रति दिन कम से कम एक बार) वाहिकाओं की जांच करें।
7. वाहिकाओं से कोशिकाओं की कटाई
- एक बार नियोजित उपचार की लंबाई समाप्त हो जाने के बाद, रोटेशन को रोकें, और तंत्र को अलग करें। डिवाइस के घूर्णन खूंटे को घड़ी की दिशा में मोड़ते हुए पोत को धीरे से स्थिर पकड़कर एसएमजी उपचार पोत को हटा दें।
- नियंत्रण फ्लास्क लाएं, 1 जी पोत को नियंत्रित करें, और एसएमजी पोत को बाँझ जैविक सुरक्षा कैबिनेट में इलाज करें।
- प्रत्येक पोत (केवल 1 जी और एसएमजी; फ्लास्क नहीं) लें और इसे उल्टा पलटें ताकि यह नीचे की ओर हो और सभी कोशिकाओं को निलंबन में लाने के लिए धीरे से इसे मार दे। फिर, पोत को नीचे की ओर भरण बंदरगाह के साथ अपनी तरफ घुमाएं और कुशल आकांक्षा के लिए भरण बंदरगाह की ओर कोशिकाओं को प्रोत्साहित करने के लिए जहाज को फिर से मारें।
- प्रत्येक जहाज को व्यक्तिगत रूप से संभालें। दो बंदरगाहों से सिरिंज को हटा दें और उन्हें बायोहैजार्ड कचरे में फेंक दें। सिरिंज पोर्ट पर स्टॉपकॉक खोलें।
- फिल पोर्ट कैप को ध्यान से हटा दें और एक बाँझ 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके सामग्री को खींचें, बर्तन को झुकाएं क्योंकि इसे खाली किया जा रहा है। "फ्लास्क", "1 जी", और "एसएमजी" समूहों की सामग्री को व्यक्तिगत रूप से लेबल किए गए 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में वितरित करें।
- प्रत्येक ट्यूब को बंद करें और धीरे से उन्हें कुछ बार उलट दें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि वे ठीक से मिश्रित हैं। बाद के प्रयोगात्मक परखों के भीतर उपयोग के लिए तैयार करने के लिए परिणामी सेल संस्कृति की एकाग्रता और व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए पसंदीदा विधि का उपयोग करें।
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Representative Results
इस संवर्धन विधि को सफल माना जाता है यदि 1) कोशिकाओं का प्रसार नियंत्रण समूहों (और आदर्श रूप से सभी प्रयोगात्मक समूहों) में लगभग सुसंगत है, 2) सीडिंग घनत्व, उपचार की लंबाई और सेल प्रकार / लाइन के दोगुना समय को देखते हुए प्रसार उपयुक्त है, और 3) काटी गई कोशिकाओं की व्यवहार्यता 85% या उससे अधिक है (तालिका 1)। ). आदर्श रूप से, परिणामी कोशिकाओं को उतना ही स्वस्थ होना चाहिए जितना कि वे मानक सेल संस्कृति में होंगे, विशेष रूप से बाद के प्रयोगों और परखों (यानी, व्यवहार्यता 85% या अधिक) में उपयोग के लिए। इस संवर्धन विधि को असफल माना जाता है यदि विपरीत सच है, जिससे परिणामी कोशिकाएं या तो मर जाती हैं, नियंत्रण समूहों में प्रसार में काफी भिन्न होती हैं, या लगभग 70% या उससे कम व्यवहार्यता होती है (तालिका 1)। एसएमजी उपचार समूह में प्रसार नियंत्रण की तुलना में भिन्न हो सकता है या नहीं भी हो सकता है, यह इस बात पर निर्भर करता है कि एसएमजी उपचार सेलुलर शरीर विज्ञान को कैसे प्रभावित करता है। हालांकि, यह आज तक एक मुद्दा नहीं रहा है, और सेल प्रसार नियंत्रण और उपचार समूहों में लगभग बराबर था (तालिका 1)। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, ये पैरामीटर डाउनस्ट्रीम परख और प्रयोगों की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं, और दो नियंत्रण समूहों के परिणामस्वरूप कोशिकाओं को अपेक्षाकृत समान प्रदर्शन करना चाहिए।
चित्रा 1: ऑपरेशन के दौरान सिम्युलेटेड माइक्रोग्रैविटी (एसएमजी) पोत के भीतर संवर्धित कोशिकाओं के स्थानीय कक्षीय पथ का योजनाबद्ध आरेख। यहां वर्णित आरडब्ल्यूवी 2 डी क्लिनोस्टेट समय-औसत गुरुत्वाकर्षण वेक्टर शून्यीकरण 5,6,8,9 के सिद्धांत पर काम करता है, जिससे गुरुत्वाकर्षण वेक्टर को क्षैतिज अक्ष पर सेल संस्कृति के रोटेशन के माध्यम से यादृच्छिक किया जाता है। यह कोशिकाओं के अवसादन वेग के लिए संस्कृति पोत के घूर्णी वेग का मिलान करके प्राप्त किया जाता है। प्रारंभिक गति-अप चरण के बाद, संस्कृति पोत में मीडिया अंततः समय के साथ "ठोस शरीर रोटेशन" तक पहुंच जाता है। यह क्षैतिज रोटेशन सेल कल्चर पोत में लैमिनार प्रवाह को भी प्रेरित करता है। यह एक "कम कतरनी" वातावरण बनाता है, यह देखते हुए कि लैमिनार प्रवाह द्वारा कोशिकाओं पर प्रेरित कतरनी तनाव अशांत प्रवाह की तुलना में बहुत कम है। हालांकि, यह देखते हुए कि क्लिनोस्टैट एक आदर्श प्रणाली नहीं है, कुछ छोटे, लैमिनार द्रव गतियां पेश की जाती हैं, जो कोशिकाओं पर न्यूनतम कतरनी तनाव पैदा करती हैं। इस प्रकार, मीडिया में निलंबित कोशिकाएं रोटेशन के दौरान इस प्रवाह द्वारा खींची जाती हैं। क्षैतिज रोटेशन के दौरान, गुरुत्वाकर्षण वेक्टर कोशिकाओं पर कार्य करता है और उन्हें एक ऑसिलेटिंग प्रक्षेपवक्र में लाता है, जिसे यहां देखा गया है। जैसा कि संस्कृति पोत एक क्षैतिज अक्ष पर घूमता है, कोशिकाओं द्वारा अनुभव किया जाने वाला गुरुत्वाकर्षण वेक्टर भी घूमता है। समय के साथ, यह घूर्णन गुरुत्वाकर्षण वेक्टर औसत शून्य तक पहुंच जाता है; इस घटना को "समय-औसत गुरुत्वाकर्षण वेक्टर शून्यीकरण" कहा जाता है, और एसएमजी 5,6,8,9 की स्थिति को प्रेरित करता है। इस चित्र को कास्त्रो एट अल, 2011 20 से संशोधित किया गयाहै। BioRender.com के साथ बनाया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2: 10 एमएल उच्च पहलू अनुपात पोत (एचएआरवी) (ए) एचएआरवी का पक्षी-आंख दृश्य, मुख्य भरण बंदरगाह और दो सिरिंज बंदरगाहों को दर्शाता है। (बी) एचएआरवी का पिछला हिस्सा एचएआरवी को रोटरी बेस और ऑक्सीकरण झिल्ली से जोड़ने के लिए पेंच-ऑन पोर्ट दिखाता है। (ग) खुले सिरिंज बंदरगाहों को दर्शाने वाले एचएआरवी का साइड व्यू (कैप्ड)। (डी) बंद सिरिंज बंदरगाहों को दर्शाने वाले एचएआरवी का साइड व्यू (कैप्ड)। (ई) एचएआरवी का साइड व्यू जो संलग्न दो 3 एमएल सिरिंज को दर्शाता है; बाईं सिरिंज सेल संस्कृति से भरी हुई है और दाईं सिरिंज खाली है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3: एचएआरवी में बुलबुले(ए) एचएआरवी का पक्षी-आंख दृश्य, सेल संस्कृति से बुलबुले को समाप्त करने के लिए दिखाता है। (बी) एचएआरवी का साइड व्यू, एक ही बुलबुले दिखाता है। ध्यान दें कि बुलबुले आकार में कैसे भिन्न होते हैं; माइक्रोबबल को भी हटा दिया जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 4: आरडब्ल्यूवी डिवाइस का घूर्णन आधार और बिजली की आपूर्ति। (ए) घूर्णन आधार का सामने का दृश्य, जिसमें चार घूर्णन खूंटे दिखाए गए हैं जो चार संस्कृति जहाजों को समायोजित कर सकते हैं। (बी) घूर्णन आधार का बैक व्यू, रिबन केबल (चित्रित नहीं) के लिए इनपुट दिखाता है जो आधार और बिजली की आपूर्ति को जोड़ता है। (ग) इनक्यूबेटर के ऊपर रखी गई विद्युत आपूत का अग्र दृश्य। बाईं ओर चालू / बंद स्विच और दाईं ओर आरपीएम समायोजन डायल नोट करें। बिजली की आपूर्ति को निकटतम आउटलेट (आमतौर पर इनक्यूबेटर के पीछे) में प्लग किया जाता है और इसमें रिबन केबल के लिए घूर्णन आधार से कनेक्ट करने के लिए एक इनपुट शामिल होता है। बिजली की आपूर्ति इनक्यूबेटर के बाहर रहती है। ऑपरेशन के दौरान आधार को इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) के अंदर रखा जाता है, और रिबन केबल को इनक्यूबेटर दरवाजे के माध्यम से खिलाया जाता है और बिजली की आपूर्ति से जोड़ा जाता है। रिबन केबल इनक्यूबेटर सील के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है। जब घूर्णन आधार उपयोग में नहीं होता है, तो इसे इनक्यूबेटर के बाहर रखा जाना चाहिए, सुरक्षित रूप से लैब बेंच या शेल्फ पर संग्रहीत किया जाना चाहिए। उपयोग किए गए वाणिज्यिक उपकरण के विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| # | व्यवहार्यता शुरू करना | सीडिंग घनत्व कोशिकाएं/ | अंत व्यवहार्यता (एफ) | अंत व्यवहार्यता (1 जी) | अंत व्यवहार्यता (SMG) | एंड कॉनक (एफ) कोशिकाएं / | एंड कॉन्क (1जी) कोशिकाएं/ | एंड कॉनक (एसएमजी) कोशिकाएं/ | नोट्स | |||||
| उप-प्रारंभिक व्यवहार्यता और सीडिंग घनत्व (नकारात्मक परिणाम) | 1 | 79% | 0.2 x 106 | 67% | 60% | 60% | 0.10 x 106 | 0.075 x 106 | 0.071 x 106 | कम सीडिंग घनत्व और कम प्रारंभिक व्यवहार्यता ने उपचार अवधि के दौरान कोशिका मृत्यु को जन्म दिया | ||||
| 2 | 73% | 0.2 x 106 | 43% | 63% | 70% | 0.071 x 106 | 0.081 x 106 | 0.085 x 106 | ||||||
| इष्टतम प्रारंभिक व्यवहार्यता और सीडिंग घनत्व (सकारात्मक परिणाम) | 3 | 93% | 0.4 x 106 | 93% | 93% | 96% | 1.2 x 106 | 1.1 x 106 | 1.5 x 106 | उचित सीडिंग घनत्व और इष्टतम प्रारंभिक व्यवहार्यता ने उपचार के दौरान स्वस्थ सेल विकास और व्यवहार्यता का नेतृत्व किया | ||||
| 4 | 92% | 0.4 x 106 | 92% | 92% | 94% | 0.81 x 106 | 0.80 x 106 | 0.70 x 106 | ||||||
तालिका 1: असफल और सफल सिम्युलेटेड माइक्रोग्रैविटी (एसएमजी) उपचार दिखाने वाला तुलना चार्ट। एनके 92 प्रारंभिक व्यवहार्यता और सीडिंग घनत्व की तुलना 5% सीओ 2 के साथ पूरक 37 डिग्री सेल्सियस सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 72 एच एसएमजी उपचार के बाद परिणामी अंत व्यवहार्यता और अंत सांद्रता से की गई थी। नकारात्मक परिणामों के दो उदाहरणों और सकारात्मक परिणामों के दो उदाहरणों की तुलना की गई। तुलना के लिए, ध्यान दें कि उपयोग की जाने वाली एनके 92 सेल लाइन की इष्टतम एकाग्रता सीमा 0.3 x 106 कोशिकाओं / एमएल और 1.2 x 106 कोशिकाओं / एमएल के बीच थी, जिसमें लगभग 2-3 दिनों का दोगुना समय था।
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Discussion
जैसा कि मानवता चंद्रमा और मंगल ग्रह पर लंबे अंतरिक्ष मिशनों के लिए तैयार है, अंतरिक्ष यात्रियों में गंभीर स्वास्थ्य जोखिमों को कम करने के लिए अधिक शोध किए जाने की आवश्यकता है। अंतरिक्ष वातावरण का एक प्रमुख पहलू जो मानव शरीर विज्ञान को प्रभावित करता है वह माइक्रोग्रैविटी है। यहां, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रोटरी सेल कल्चर सिस्टम का उपयोग करके लिम्फोसाइटों को एसएमजी के अधीन करने के लिए एक सेल कल्चर विधि का वर्णन किया गया है।
इस प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण चरण हैं जिन्हें उपयोग किए जाने वाले सेल प्रकार या लाइन के आधार पर अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है। इनमें 1) कोशिकाओं के दोगुने समय और एसएमजी उपचार की लंबाई के आधार पर एक उपयुक्त सीडिंग घनत्व चुनना, और 2) इष्टतम उपचार लंबाई, रोटेशन गति और उचित नियंत्रण निर्धारित करना शामिल है। अध्ययन किए जा रहे सेल प्रकार या रेखा के लिए उपयुक्त सेल सांद्रता की मध्य-सीमा में एक सीडिंग घनत्व चुनना पर्याप्त होना चाहिए। हालांकि, बहुत कम सीडिंग घनत्व चुनने से कम सेल प्रसार और व्यवहार्यता हो सकती है (तालिका 1), और बहुत अधिक घनत्व चुनने से समय से पहले पोषक तत्वों की कमी और कम सेल व्यवहार्यता हो सकती है। चुना हुआ सीडिंग घनत्व उन कोशिकाओं के दोगुना समय पर भी निर्भर करता है जिनका अध्ययन किया जा रहा है; कम दोगुना समय वाली कोशिकाओं को कम घनत्व पर बीज दिया जा सकता है, और लंबे समय तक दोगुना समय वाले लोगों को उच्च घनत्व पर बीज देने की आवश्यकता हो सकती है। उपचार की सीडिंग घनत्व और लंबाई इस बात पर भी निर्भर करती है कि बाद के प्रयोगात्मक परखों को पूरा करने के लिए कितनी कोशिकाओं की आवश्यकता है। अनुभव से, 10 एमएल वाहिकाओं में 0.4-0.5 x 106 कोशिकाओं /एमएल पर अत्यधिक व्यवहार्य (90%+) एनके 92 कोशिकाओं को बीज देना (यानी, प्रति प्रयोगात्मक समूह 4-5 मिलियन कोशिकाएं; सेल लाइन के लिए इष्टतम सीमा = 0.3 x 10 6-1.2 x 106 कोशिकाएं / एमएल, दोगुना समय = 2-3 दिन) और उन्हें 72 घंटे के लिए इलाज करने से लगभग 8-15 मिलियन कोशिकाएं उत्पन्न हुई हैं (तालिका 1)। इस प्रकार, 10 एमएल वाहिकाएं कार्यात्मक परख (3 x 10 6 कोशिकाओं) और क्यूपीसीआर (1 x 106 कोशिकाओं) और पश्चिमी धब्बा (2 x 106-6 x10 6 कोशिकाओं) के लिए कोशिकाओं को इकट्ठा करने केलिए कोशिकाओं की कटाई के लिए उपयुक्त थीं। स्रावी घटकों के विश्लेषण के लिए सुपरनैटेंट भी एकत्र किए जा सकते हैं। हालांकि, 50 एमएल जहाज भी उपलब्ध हैं और इसका उपयोग तब किया जा सकता है जब अधिक सेल उपज की आवश्यकता होती है। 50 एमएल जहाजों का उपयोग करते समय, बड़े सिरिंज का भी उपयोग करने की आवश्यकता होती है।
एक उपयुक्त उपचार लंबाई निर्धारित करना सेल प्रकार / लाइन पर भी निर्भर करेगा जिसका उपयोग किया जाता है। यदि पिछले अध्ययन मौजूद हैं, तो उन्हें शुरू करने के लिए एक उपयुक्त उपचार लंबाई चुनने के लिए संदर्भित किया जाना चाहिए। कुछ अध्ययनों ने एनके कोशिकाओं को कल्चर करने के लिए आरडब्ल्यूवी उपकरणों का उपयोग किया है, और यहां 17,18,19 संदर्भित हैं। वहां से, उपचार के परिणाम या कोशिकाओं का कितना अच्छा प्रसार हुआ और उनकी व्यवहार्यता, और बाद के प्रयोगात्मक परखों में उनके प्रदर्शन की जांच की जानी चाहिए। वाहिकाओं से सेल कल्चर को एक ट्यूब में हटाकर, सेंट्रीफ्यूजिंग करके और फिर कोशिकाओं को 10 एमएल गर्म, ताजा पूर्ण संस्कृति मीडिया में पुन: निलंबित करके, उन्हें वाहिकाओं में प्रतिस्थापित करके और रोटेशन को फिर से शुरू करके उपचार की लंबाई को 72 घंटे तक बढ़ाना संभव हो सकता है। हालांकि, यह सेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से हाइपरग्रैविटी के संपर्क में आने के कारण भ्रम पैदा कर सकता है, और कोशिकाओं को विभाजित / पतला करना यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हो सकता है कि कोशिकाओं को उनकी इष्टतम एकाग्रता सीमा के भीतर रखा जाए। यदि किसी भी उत्तेजक अणुओं (जैसे, एलपीएस, साइटोकिन्स, आदि) का उपयोग किया जाना है, तो यह अनुशंसा की जाती है कि एसएमजी उपचार स्थापित करने से पहले इन्हें पूर्ण मीडिया नुस्खा में उचित एकाग्रता पर जोड़ा जाए।
एक उपयुक्त रोटेशन गति (आरपीएम) सेट करना भी सिम्युलेटेड माइक्रोग्रैविटी उपचार को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। कंपनी लिम्फोसाइटों की खेती करते समय 8 से 10 आरपीएम के बीच रोटेशन गति से शुरू करने की सलाह देती है। अनुभव से, 11 आरपीएम की गति ने यह सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से काम किया है कि एनके 92 कोशिकाओं को निलंबन में रखा जाता है और पिछले एनके सेल अध्ययन17 में इसका उपयोग किया गया है। उपयोग किए जा रहे सेल प्रकार / लाइन के विकास पैटर्न के आधार पर, सेल क्लंपिंग के लिए रोटेशन की गति बढ़ाने की आवश्यकता हो सकती है। इससे द्रव्यमान में वृद्धि के कारण कोशिकाओं के अवसादन में वृद्धि होगी। एक इष्टतम एसएमजी उपचार के लिए, कल्चर पोत की रोटेशन गति को कोशिकाओं के अवसादन वेग 5,6,8,9 से मेल खाने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए। दूसरे शब्दों में, कोशिकाओं या सेल क्लंप को मीडिया के माध्यम से गिरते हुए नहीं देखा जाना चाहिए, और उन्हें अपेक्षाकृत स्थिर रहना चाहिए।
इस संदर्भ में, एक मानक टी 25 कल्चर फ्लास्क ("फ्लास्क") में उगाई गई कोशिकाओं और विशेष एचएआरवी में उगाई गई कोशिकाओं की तुलना करके दो नकारात्मक नियंत्रणों की कोशिश करना अच्छा अभ्यास है, लेकिन एसएमजी के अधीन नहीं है (यानी, सिर्फ इनक्यूबेटर में रखा गया है; "1 जी")। आदर्श रूप से, दो नकारात्मक नियंत्रणों के बीच डाउनस्ट्रीम प्रयोगात्मक परख में सेल प्रदर्शन और परिणाम तुलनीय होना चाहिए। किसी भी विसंगतियों पर ध्यान दिया जाना चाहिए। अधिकांश परखों के लिए, "1 जी" नियंत्रण और एसएमजी उपचार के बीच सबसे अच्छी तुलना की संभावना है; हालांकि, "फ्लास्क" और "1 जी" नियंत्रण दोनों को शामिल करना पर्याप्त तुलना और प्रारंभिक अनुकूलन के लिए फायदेमंद हो सकता है।
इस प्रोटोकॉल की प्रमुख सीमाओं में 1) सेल संस्कृति के दौरान बुलबुला गठन, 2) एसएमजी की सीमा, और 3) उपचार की संभावित अवधि शामिल है। एसएमजी उपचार के दौरान बुलबुला गठन की निगरानी करना महत्वपूर्ण है। यहां तक कि मामूली माइक्रोबबल जमा हो सकते हैं, बढ़ सकते हैं, और अत्यधिक विघटनकारी बड़े बुलबुले के गठन का कारण बन सकते हैं। ये बड़े बुलबुले संस्कृति पोत के भीतर कम-कतरनी द्रव गतिशीलता को बाधित करते हैं, जिससे अशांति बढ़ जाती है क्योंकि द्रव प्रवाह बुलबुला21 के चारों ओर विक्षेपित होता है। अंततः, यह एसएमजी स्थिति को पूरी तरह से बाधित करता है। इस घटना पर विस्तार से चर्चा की गई है और फेलन एट अल21 द्वारा कल्पना की गई है। इसके अतिरिक्त, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यह डिवाइस एसएमजी का उत्पादन करता है न कि आईएसएस6 पर अनुभव किए गए वास्तविक माइक्रोग्रैविटी का। बहरहाल, अध्ययनों ने आईएसएस 1,5,6 पर किए गए अध्ययनों से वास्तविक माइक्रोग्रैविटी के प्रभावों की तुलना में इस उपकरण द्वारा उत्पादित एसएमजी के समान प्रभाव दिखाए हैं।
सेल संस्कृति को एसएमजी के अधीन करने के लिए वैकल्पिक तरीके मौजूद हैं। इनमें 3 डी क्लिनोस्टैट्स या रैंडम पोजिशनिंग मशीन (आरपीएम) और डायमैग्नेटिक लेविटेशन का उपयोग शामिल है। 3 डी क्लिनोस्टैट्स सेल कल्चर को एक ही वेग पर दो लंबवत अक्षों पर घुमाते हैं, जबकि आरपीएम दो लंबवत अक्षों पर घूमते हैं, जिससे रोटेशन के वेग और दिशात्मकता दोनों को यादृच्छिक 5,6 किया जाता है। इसलिए, 2 डी क्लिनोस्टैट्स या आरडब्ल्यूवी उपकरणों की तुलना में, आरपीएम अधिक जटिल हैं, जो कई लाभों और कमियों का परिचय देता है। सबसे पहले, आरपीएम में प्राप्त की जा सकने वाली माइक्रोग्रैविटी की डिग्री को आंशिक गुरुत्वाकर्षण का अनुकरण करने के लिए संशोधित किया जा सकता है, जैसे कि चंद्रमा (0.16 ग्राम) और मंगल (0.33 ग्राम)6 पर अनुभव किया जाता है। हालांकि, यादृच्छिक घूर्णी दिशाओं और वेगों की अतिरिक्त जटिलता झटके की गति और त्वरक बलों को पेश कर सकती है, विशेष रूप से संस्कृति पोत के बाहरी क्षेत्रों की ओर, संभावित रूप से डेटा में भ्रम पैदा कर सकती है। डायमैग्नेटिक लेविटेशन गुरुत्वाकर्षण का मुकाबला करने के तरीके के रूप में जैविक नमूनों में पानी के वजन का मुकाबला करने के लिए नमूनों को मजबूत प्रतिकारक चुंबकीय क्षेत्रों में उजागर करता है। हालांकि, ऐसा करने के लिए उत्पन्न मजबूत चुंबकीय क्षेत्र भी कोशिकाओं को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है, इसलिए डेटा 5,6 में भ्रम पैदा करता है। इन विधियों पर कहीं और अधिक विस्तार से चर्चा की गईहै 5,6.
अंत में, यहां चर्चा की गई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रोटरी सेल कल्चर सिस्टम लिम्फोसाइटों पर एसएमजी के प्रभावों का अध्ययन करने के इच्छुक वैज्ञानिकों के लिए अपेक्षाकृत आसान-से-उपयोग, सुलभ मंच है। हालांकि इस सेल कल्चर विधि की सीमाएं हैं, यह सिम्युलेटेड माइक्रोग्रैविटी में लिम्फोसाइटों और संभावित रूप से अन्य निलंबन सेल संस्कृतियों की खेती के लिए एक व्यवहार्य विकल्प बना हुआ है।
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Disclosures
लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
यह काम कनाडाई अंतरिक्ष एजेंसी (सीएसए), अनुसंधान अनुदान (17ILSRA3, इम्यूनो प्रोफाइल) द्वारा समर्थित है। रॉक्साने फोरनियर (टोरंटो विश्वविद्यालय), डॉ रैंडल ग्रेग (लिंकन मेमोरियल विश्वविद्यालय), और प्रितेश मायलाबाथुला (एरिज़ोना विश्वविद्यालय) को इस प्रोटोकॉल के प्रारंभिक समस्या निवारण में उनकी मदद के लिए स्वीकार करना और धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL) | Synthecon | D-410 | Gamma sterilized culture vessels (4/box) |
| Luer-Lok tip syringes (3 mL) | BD | 309657 | For attaching to the 10 mL HARVs |
| NK92 Cell-line | ATCC | CRL-2407 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4D | Rotating wall vessel device; 2D clinostat |
| Sarsedt 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-220 | |
| Sarsedt 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-218 | |
| Sarsedt sterile serological pipettes | Fisher Scientific | 86.1254.001 | |
| T25 suspension culture flasks | Sarsedt | 83.3910.502 | For flask control |
References
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