Summary
이것은 상업적으로 이용 가능한 회전 세포 배양 시스템을 사용하여 특수 일회용 배양 용기를 사용하여 시뮬레이션된 미세 중력에서 림프구를 배양하기 위한 단계별 가이드입니다. 이러한 배양 방법은 모든 현탁형 세포 배양액에 적용될 수 있다.
Abstract
우주에서 생물학적 연구를 수행하는 현재의 한계를 감안할 때, 세포 배양을 지구의 모의 미세 중력 (SMG)에 적용하기위한 몇 가지 옵션이 있습니다. 이러한 옵션은 방법, 원리 및 현탁 세포 배양에 사용하기에 적합한지 여부에 따라 다릅니다. 여기서, 세포 배양 방법은 2D 클리노스타트 또는 회전 벽 용기(RWV) 장치라고도 하는 상업적으로 이용 가능한 회전 세포 배양 시스템을 사용하여 림프구를 시뮬레이션된 미세 중력에 노출시키는 방법을 설명합니다. 이 세포 배양 방법은 시간 평균 중력 벡터 무효화 원리를 활용하여 수평 축에서 세포를 회전시켜 미세 중력을 시뮬레이션합니다. 이 시스템에서 배양된 세포는 세포 기능 및 생리학에 대한 시뮬레이션된 미세중력의 영향을 평가하기 위해 다양한 실험 분석에서 수확 및 활용될 수 있습니다. 배양 기술은 사용되는 세포 유형 또는 계통에 따라 약간 다를 수 있지만 여기에 설명된 방법은 모든 현탁액 유형 세포 배양에 적용될 수 있습니다.
Introduction
우주 비행은 면역 체계를 포함한 인간 생리학의 여러 측면에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 많은 연구에서 생체 내 우주 비행 및 시험관 내 모의 미세 중력 (SMG)에 대한 노출로 인한 면역 조절 장애의 증거를 입증했습니다 1,2,3,4. 인간 생리학에 영향을 미치는 우주 환경의 주요 측면 중 하나는 미세 중력입니다. 미세중력은 우주 환경5에서 낮은 중력으로 인해 경험하는 "무중력"을 의미한다. 인류가 달과 화성에 대한 더 긴 우주 임무를 준비함에 따라 우주 비행사의 심각한 건강 위험을 완화하기 위해 더 많은 연구가 수행되어야 합니다.
과학 연구를위한 실제 미세 중력 조건은 국제 우주 정거장 (ISS)의 우주 또는 궤도에 진입 한 나노 위성에서 달성 할 수 있습니다. 그러나 이러한 옵션은 오케스트레이션하는 데 비용이 많이 들고 복잡할 수 있습니다. 우주에서 생물학적 연구를 수행하는 현재의 한계를 감안할 때 지구에서 실제 미세 중력과 SMG를 유도하기위한 몇 가지 옵션이 있습니다. 드롭 타워, 포물선 비행 및 사운딩 로켓을 포함하여 지구상에서 단기간의 실제 미세 중력을 생성할 수 있는 대규모 작업이 존재합니다. 그러나, 이들 방법들은 생물학적 시스템에 대한 미세중력의 영향을 연구하는 데 지나치게 적합하지 않은데, 이는 주로 이들의 짧은 기간의 미세중력 처리(즉, 몇 초 내지 20분)로 인한 것이다. 이러한 방법은 다른 곳에서 더 자세히 논의됩니다 5,6. 생물학적 세포 배양에 적합한 옵션에는 2D 클리노스타트 또는 회전 벽 용기(RWV) 장치와 같은 소규모 장치와 3D 클리노스타트 또는 랜덤 포지셔닝 머신(RPM)이 포함됩니다. 이 장치는 37°C 및 5%CO2로 유지되는 세포 배양 배양기 내부에 설치할 수 있으며 수평 축(2D) 또는 두 개의 수직 축(3D)에서 세포 배양을 회전시킵니다5. 그러나 이러한 배양 방법은 생물학적 연구 맥락을 위해 우주에서 가장 실현 가능하게 달성되는 실제 미세 중력과 달리 SMG를 생성한다는 점을 강조하는 것이 중요합니다.
현재 논문의 목표는 2D clinostat 분류에 속하는 상업적으로 이용 가능한 RWV 장치(Table of Materials)를 사용하여 림프구를 SMG에 적용하는 단계를 설명하는 것입니다. 이 장치를 작동하기 위해 제조업체에서 사용할 수 있는 일반 프로토콜이 있지만 현재 문서에서는 문제 해결 및 최적화 단계를 더 자세히 다루는 것을 목표로 합니다. 이 기사는 또한 이 장치가 현탁 세포 배양, 특히 림프구에서 SMG를 생산하기 위해 어떻게 작동하는지에 대한 이론을 다룹니다. 이러한 맥락에서 현탁 세포 배양은 추가 스캐폴딩을 부착하지 않고 보충된 배양 배지에서 자유롭게 성장하는 세포를 말합니다. 많은 세포 유형은 림프구를 포함한 현탁 세포 배양에서 성장합니다. 림프구는 T, B, 자연살해(Natural Killer, NK) 세포를 포함한 면역계의 세포로, 림프 기관과 혈류에 존재한다7.
여기에 설명된 RWV 2D 클리노스타트는 시간-평균 중력 벡터 무효화(5,6,8,9)의 원리에 따라 동작하며, 이에 의해 중력 벡터는 수평 축 상의 세포 배양물의 회전을 통해 무작위화된다. 이것은 배양 용기의 회전 속도를 세포의 침강 속도와 일치시킴으로써 달성됩니다. 배양 용기의 회전 속도가 세포의 침강 속도와 잘 일치하는 한, 세포는 자유 낙하 상태로 유지되며 우주 환경에서 경험하는 것처럼 침전될 수 없습니다. 초기 속도 향상 단계 후, 배양 용기의 배지는 결국 시간이 지남에 따라 "고체 회전"에 도달합니다. 이러한 수평 회전은 또한 세포 배양 용기 내의 층류를 유도한다. 이것은 층류에 의해 세포에 유도된 전단 응력이 난류의 전단 응력보다 훨씬 적다는 점을 감안할 때 "낮은 전단" 환경을 만듭니다. 그러나 클리노스타트가 완벽한 시스템이 아니라는 점을 감안할 때 세포에 최소한의 전단 응력을 가하는 작은 층류 유체 운동이 도입됩니다. 따라서 미디어에 부유하는 셀은 회전 중에 이 흐름에 의해 끌립니다. 수평 회전 중에 중력 벡터는 세포에 작용하여 그림 1에 시각화된 것처럼 세포를 진동 궤적으로 만듭니다. 전단 응력의 또 다른 작은 원인은 세포가 매체를 통해 "떨어지는" 세포로 인해 세포 주위에 층류를 일으키기 때문에 발생합니다. 배양 용기가 수평축을 중심으로 회전함에 따라 세포가 경험하는 중력 벡터도 회전합니다. 시간이 지남에 따라 이 회전하는 중력 벡터는 평균적으로 0에 접근합니다. 이 현상을 시간 평균 중력 벡터 무효화라고 하며 SMG 5,6,8,9의 상태를 유도합니다. 이 장치는 많은 유형의 세포에 대한 SMG의 효과를 연구하는 데 사용되었으며, 그 중 일부는 참고 문헌10,11,12에서 다룹니다. 더 많은 예는 장치 제조업체의 웹 사이트에서 찾을 수 있습니다.
이 RWV 장치는 장치 제조업체를 통해 사용할 수 있는 특수 "고종횡비 용기"(HARB)를 사용합니다. 이 HARV는 각각 10mL의 세포 배양을 보유합니다. 그러나 50mL HARV도 사용할 수 있습니다. 10mL 또는 50mL HARV는 다운스트림 실험 분석을 완료하는 데 필요한 세포 수에 따라 사용할 수 있으며, 이는 논의 섹션에서 자세히 설명합니다. HARV는 폴리카보네이트로 만들어졌으며 세포 배양 중에 가스 교환을 허용하기 위해 실리콘 산소화 멤브레인을 포함합니다. 이것은 세포 배지의 pH를 유지하고 효율적인 세포 호흡을 가능하게 합니다. 용기 표면에는 주 충전 포트와 두 개의 캡이 있는 주사기 포트가 있습니다(그림 2A). 주 충전 포트를 통해 세포 배양물을 적재한 후 기포 제거를 돕기 위해 두 개의 주사기를 용기에 적재합니다. 10mL 용기를 사용할 때 두 개의 3mL 주사기가 잘 작동합니다. 한 주사기는 주사기를 완전히 누른 상태에서 빈 상태로 장치에 부착되고 다른 주사기는 3mL의 세포 배양액으로 채워져 부착됩니다(그림 2E). 이들은 SMG 처리를 유지하는 데 중요한 혈관에서 기포를 제거하기 위해 조합하여 사용됩니다. 일반적으로 "플라스크" 대조군과 "1G" 대조군이라고 할 수 있는 두 개의 음성 대조군을 설정하는 것이 좋습니다. "플라스크" 대조군은 표준 T25 현탁액 세포 배양 플라스크에서 성장되는 세포에 상응한다. 1G 대조군은 특수 10mL 배양 용기에서 성장한 세포에 해당하며, 이는 단순히 인큐베이터에 배치됩니다(즉, SMG 처리를 거치지 않고). 컨트롤에 대한 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하세요.
여기에 설명된 방법은 NK92 세포주13을 사용하여 NK 세포에 특히 중점을 두고 림프구에 대한 SMG의 효과를 연구하려는 모든 연구자에게 적합합니다. 이러한 연구의 결과는 우주 비행이 인간 면역 체계에 미치는 악영향을 더 잘 이해하고 완화하는 데 도움이 될 수 있습니다.
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Protocol
알림: 다음 단계는 멸균된 생물학적 안전 캐비닛 내부에서 완료해야 합니다.
1. 세포 배양용 용기의 제조
- 플라스틱 포장에서 배양 용기를 꺼냅니다. 사용 중인 세포 유형/라인, 대조군(1G) 또는 처리(SMG) 여부 및 기타 관련 정보에 따라 테두리의 각 용기에 라벨을 붙입니다.
- 용기를 안정화하고 충전 포트 캡 페그/O-링을 건드리지 않고 충전 포트를 조심스럽게 엽니다. 용기가 채워지는 동안 페그/O-링이 위를 향하도록 캡을 에탄올 패드에 놓습니다. 주사기 포트에서 캡을 제거하지 마십시오.
알림: 페그/O-링을 실수로 만진 경우 캡 페그에 70% 에탄올을 뿌리고 용기를 채우는 동안 잠시 동안 그대로 두십시오(위쪽을 향함). 주입 포트를 다시 닫을 준비가 되면 새 종이 천으로 캡을 들어 캡을 완전히 건조시킨 후 용기에 다시 놓습니다. - 멸균 혈청학적 피펫을 사용하여 세포 배양에 적합한 전체 배지 10mL를 용기에 넣고 캡을 충전 포트에 다시 조심스럽게 놓습니다.
참고: 여기서는 NK92 세포를 세포 치료제로 사용한 임상 시험에서 이전에 검증된 바와 같이 GM1 배지에서 배양한 NK92 NK 세포주를 사용했습니다14. 사용되는 배양 배지는 배양되는 세포주 또는 세포 유형에 따라 다릅니다. 공급업체의 웹사이트에서 사용 중인 세포주 또는 세포 유형에 대한 올바른 배지 레시피를 확인하십시오. - 주사기 포트 캡 및 충전 포트가 단단히 닫혀 있는지 확인하고, 세포 배양을 위해 용기를 프라이밍하기 위한 후속 단계를 수행하는 동안 채워진 용기를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에 배치합니다.
알림: 이 프라이밍 단계는 큰 기포 형성을 최소화하여 나중에 6단계에서 기포를 더 쉽게 배출할 수 있도록 도와줍니다.
2. SMG 처리 셋업을 위한 원유 세포 배양액의 제조
- 사용하지 않을 때는 관심 있는 셀을 -130°C 미만의 온도 또는 이상적으로는 액체 질소 증기상에 보관하십시오.
- 계획된 처리를 설정하기 최소 1주일 전에 세포를 해동하고 공급업체 웹사이트에 있는 적절한 세포 배양 배지 레시피를 사용하여 배양합니다. 처리를 설정하는 데 필요한 세포 수를 계획하고(자세한 내용은 아래 후속 단계에서) 배양에 대한 충분한 증식 및 적응을 허용할 수 있을 만큼 충분히 일찍 배양을 시작하도록 합니다.
- 세포 배양액을 37°C, 5%CO2 배양기에 보관한다. 표준 세포 배양 관행에 대한 자세한 내용은 다른 곳에서 다룹니다15.
- 계획된 SMG 처리 설정 당일에 초기 세포 배양의 시작 농도와 생존율을 결정합니다.
- 초기 세포 배양물의 농도를 결정하기 위해 바람직한 방법(예를 들어, 혈구분석기, ViCell, 유세포 분석기 등)을 사용한다. 세포의 생존 가능한 세포 농도(mL당 세포)와 생존율(%)을 기록하여 생존율이 이상적으로 85% 이상인지 확인합니다. 혈구계를 사용하기 위한 프로토콜은 다른 곳에서 찾을 수 있다16.
- 특정 세포 유형/계통의 최적 세포 농도 범위, 배가 시간 및 SMG 처리 기간을 고려하여 SMG 처리를 위한 세포 배양의 적절한 세포 파종 밀도/농도를 결정합니다. 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하십시오.
참고: 경험에 따르면 NK92 세포의 최적 농도 범위는 0.3 x 10 6-1.2 x 106 cells/mL입니다. 일반적으로 이러한 세포는 48-72시간의 배가 시간을 가지며 2-3일마다 공급됩니다. 처리 길이가 72시간이라는 점을 감안할 때, 세포는 0.4-0.5 x 106 cells/mL에서 최적 범위의 하단에 시딩되었습니다. 공급업체는 또한 NK92 세포의 새로운 바이알에서 초기 세포 배양을 시작할 때 이 파종 밀도를 권장합니다. - 처리 및 대조군을 설정하는 데 필요한 스톡 세포 배양의 양을 결정합니다.
참고: 실험군당 10mL의 세포 배양이 필요합니다. 3개의 실험 그룹이 설정된 경우(즉, 1개의 처리: "SMG" 및 2개의 음성 대조군: "플라스크" 및 "1G"), 또 다른 10mL의 세포 배양은 HARV 주사기를 로드하는 데 사용되는 15mL 튜브에 분취하기에 충분합니다. 총 40mL이며 특정 실험 설계에 따라 변동될 수 있습니다. - 치료를 설정하는 데 필요한 세포 수를 결정합니다.
- 선택한 파종 밀도(cells/mL)에 필요한 총 부피(mL)를 곱하여 필요한 총 세포 수를 계산합니다.
참고: NK92에 대한 경험에 비추어 볼 때, 40mL의 스톡 세포 배양액은 0.4-0.5 x 106 cells/mL의 파종 농도로 위에서 설명한 대로 준비됩니다. 따라서 일반적인 치료 설정을 완료하려면 16-20 x 106 NK92 세포가 필요합니다. NK92 세포주의 경우, 치료 기간 동안 높은 생존력을 유지하기 위해 약간 더 적은 수의 세포를 사용하는 것이 약간 더 적은 세포보다 낫습니다.
- 선택한 파종 밀도(cells/mL)에 필요한 총 부피(mL)를 곱하여 필요한 총 세포 수를 계산합니다.
- 스핀다운할 초기 세포 배양의 부피를 결정합니다.
- 세포 농도가 cells/mL로 표시되는 경우 실험에 필요한 총 세포(세포) 수를 측정된 세포 배양 시작 농도(cells/mL)로 나눕니다.
참고: 예를 들어ample, 16 x 10 6 세포가 필요하고 배양 시작 농도가 0.8 x 106 cells/mL인 경우 배양 20mL를 회전시켜야 합니다.
- 세포 농도가 cells/mL로 표시되는 경우 실험에 필요한 총 세포(세포) 수를 측정된 세포 배양 시작 농도(cells/mL)로 나눕니다.
- 최종 스톡 세포 배양을 만듭니다.
- 50mL 원뿔형 튜브에서 8분 동안 300 x g 에서 적절한 수의 세포를 원심분리합니다.
- 상층액을 폐기물 용기에 조심스럽게 붓고 튜브를 부드럽게 튕겨 남은 작은 부피에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.
- 적절한 부피의 가온된(37°C) 완전 배지에서 세포를 재현탁하여 배양물을 원하는 파종 밀도로 가져옵니다. 이 부피는 단계 2.6에서 계산되었습니다.
- 50mL 튜브의 뚜껑을 단단히 덮고 부드럽게 몇 번 뒤집어 세포 현탁액을 완전히 혼합합니다.
참고: 전체 실험을 설정하는 데 50mL 이상이 필요한 경우 50mL 원뿔형 튜브에 필요한 총 세포 수를 원심분리하고 필요한 부피의 절반으로 다시 현탁하는 것이 가장 좋습니다. 그런 다음 잘 섞어 별도의 50mL 원뿔형 튜브에 1:2로 희석합니다. 예를 들어, 0.4 x 10 6 cells/mL에서 100mL가 필요한 경우 50mL 튜브에서 40 x 106 세포를 스핀다운하고, 50mL의 배지에서 재현탁하고, 25mL를 다른 50mL 튜브로 옮긴 다음, 25mL의 새로운 배지로 둘 다 보충합니다.
3. 저장 세포 배양을 담은 용기 적재
- 인큐베이터에서 배지 프라이밍 용기를 회수합니다.
- "플라스크" 대조군을 사용하는 경우 T25 현탁 배양 플라스크에 위에서 제조된 스톡의 세포 배양물 10mL를 적재합니다. 또한 주사기를 로드하는 데 사용할 별도의 15mL 원뿔형 튜브에 10mL의 스톡 세포 배양액을 추가합니다.
- 주사기 포트 캡의 나사를 풀어 용기에서 제거하고 스톱콕이 열린 위치에 있는지 확인합니다(그림 2C).
- 용기를 안정화하고 충전 포트 캡 페그/O-링을 건드리지 않고 충전 포트를 조심스럽게 엽니다. 용기가 채워지는 동안 페그/O-링이 위를 향하도록 캡을 에탄올 패드에 놓습니다. 주사기 포트에서 캡을 조심스럽게 풉니다.
- 스톱콕이 열린 위치에 있는지 확인합니다(그림 2C). 용기에서 폐기물 용기에 매체를 조심스럽게 붓거나, 혈청학적 피펫을 사용하여 배지를 제거하거나, 산소화 멤브레인을 건드리지 않고 진공 시스템에 부착된 멸균 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 흡입합니다.
- 스톡 세포 배양액이 들어 있는 50mL 원뿔형 튜브를 단단히 닫고 부드럽게 몇 번 뒤집어 내용물을 완전히 혼합합니다.
- 신선한 멸균 혈청학적 피펫을 사용하여 50mL 튜브에서 10mL의 세포 배양 스톡을 채취합니다. 용기를 들어 올려 충전 포트가 위쪽을 향하도록 기울인 다음 충전 포트를 통해 세포 배양 스톡을 용기에 조심스럽게 분배합니다.
알림: 용기를 기울이는 동안 배양액이 주사기 포트를 통해 쏟아지지 않도록 주의하고 볼륨을 관찰하십시오. - 흘리지 않고 채우기 포트의 가장자리 상단까지 용기를 채우는 것을 목표로 하십시오. 엎질러지지 않도록 용기가 채워질 때 용기를 다시 아래로 기울이십시오. 피펫으로 산소화 멤브레인은 매우 약하므로 만지지 않도록 주의하십시오.
알림: 용기 충전 과정에는 약간의 연습이 필요할 수 있습니다. 인내심을 갖고 천천히 가십시오. 충전 포트의 개구부에 기포 필름이 형성되면 용기를 적재하는 데 방해가 됩니다. 이 경우 용기를 부드럽게 두드려 기포 필름에 의해 생성된 밀봉을 깨십시오. - 용기에 짐을 싣고 나면 페그/O-링에 닿지 않도록 조심스럽게 충전 포트 캡을 다시 씌웁니다.
- 주사기에 놓습니다.
알림: 용기 표면에는 두 개의 주사기 포트가 있습니다(그림 2A). 하나는 빈 주사기를 들고 다른 하나는 세포 배양으로 가득 찬 주사기를 보유합니다(그림 2E).- 먼저 3mL 빈 주사기를 주사기 포트 중 하나에 부착하여 주사기가 완전히 눌려졌는지 확인합니다.
알림: 주사기는 처음에는 약간 빡빡하므로 용기에 부착하기 전에 주사기를 몇 번 펌핑하십시오. 무균 상태를 유지하기 위해 생물학적 안전 캐비닛 내부에서 이 작업을 수행합니다. - 10mL의 분취 세포 배양액이 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브를 단단히 닫고 내용물을 완전히 혼합하기 위해 몇 번 부드럽게 뒤집습니다.
- 다음으로, 두 번째 3mL 주사기를 세포 배양액에 조심스럽게 반침지하고 배양액을 끌어냅니다. 주사기 상단의 기포를 최소화하려면 이를 다시 튜브에 완전히 분배한 다음 배양액 3mL를 끌어냅니다.
- 채워진 주사기를 나머지 주사기 포트에 부착하고 에탄올 패드로 주사기와 주입구 주변을 조심스럽게 소독합니다. 산소 공급 멤브레인에 에탄올을 묻히지 마십시오. 이제 선박은 거품을 제거 할 준비가되었습니다.
참고: 두 번째 용기의 두 번째 채워진 주사기는 15mL 튜브의 깊이를 감안할 때 로드하기가 더 어렵습니다. 주입되는 주사기와 세포 배양 사이의 밀봉을 유지하기 위해 주사기를 채우는 동안 튜브를 기울이는 것이 도움이 됩니다. - 나머지 용기에 대해 3.3-3.10단계를 반복합니다. 마지막 용기용 50mL 코니컬 튜브에 약간 부족한 양의 세포 배양액이 남아 있는 경우(예: 10mL 대신 9.5mL) 주사기를 로드하는 데 사용된 15mL 코니컬 튜브에서 남은 양을 회수합니다.
알림: 다음 단계는 이제 용기가 폐쇄된 멸균 시스템이므로 멸균 생물학적 안전 캐비닛 내에서 수행할 필요가 없습니다.
- 먼저 3mL 빈 주사기를 주사기 포트 중 하나에 부착하여 주사기가 완전히 눌려졌는지 확인합니다.
4. 혈관에서 기포 제거
참고: 이 설정에서는 기포가 불가피하며 치료 내내 일관되게 제거해야 합니다(그림 3). 이에 대한 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하십시오.
- 주사기 포트 스톱콕이 닫힌 위치에 있는지 확인하십시오(그림 2D) 주사기에서 용기로 세포와 기포의 이동을 제한합니다. 이것은 나중에 치료하는 동안 특히 중요합니다 (아래에서 논의 됨). 초기 거품을 모으려면 용기를 거꾸로 뒤집고 측면을 몇 번 치십시오.
- 용기를 다시 위쪽을 향하도록 빠르게 뒤집은 다음 반대쪽을 향하도록 약간 비스듬히 뒤집어 기포가 모두 용기의 위쪽으로 뜨도록 합니다(그림 3B).
- 빈 주사기로 포트 아래의 거품을 조작하고 포트로 들어가기 시작하는 것을 지켜보십시오. 두 주사기 포트 스톱콕을 모두 엽니다(그림 2C).
- 거품이 빈 주사기로 떠오르도록 용기를 부드럽게 치십시오. 빈 주사기로 더 큰 기포를 천천히 빨아들이고 전체 주사기를 조심스럽게 눌러 혈관의 압력을 유지하여 산소 공급 막이 파열되지 않도록 합니다.
알림: 큰 기포는 빨아들여야 하는 반면, 작은 기포와 미세 기포는 주사기 포트로 이동하고 용기에 부드럽게 부딪혀 주사기로 떠오르도록 권장할 수 있습니다. 몇 시간의 처리 후 주사기의 세포와 배양 용기의 세포 사이의 "교차 오염"을 최소화하는 것이 매우 중요합니다. 이는 주사기의 세포가 혈관의 세포와 동일한 양의 산소를 공급받거나 SMG에 노출되지 않기 때문입니다. - 4.2-4.4단계를 몇 번 반복하여 모든 기포가 제거되었는지 확인합니다. 용기에서 미세 기포를 포함한 모든 기포를 제거합니다.
알림: 기포는 용기가 광원(창, 빛 등)을 겨냥할 때 산소화 막(용기 후면)을 통해 쉽게 볼 수 있습니다. 4.2단계와 4.3단계를 수행할 때 용기 뒤쪽에서 움직이는 기포를 보면 보기 힘든 기포를 시각화하는 데 도움이 됩니다. - 기포가 효과적으로 제거되면 주사기 포트 마개를 닫습니다. 후속 기포 제거를 위해 치료 중에 주사기를 계속 착용하고 두 주사기의 부피가 거의 같도록 합니다.
5. 회전베이스에 용기 부착
- 회전하는 베이스와 리본 케이블의 표면을 70% 에탄올로 조심스럽게 닦습니다.
- 포함된 리본 케이블이 전원 공급 장치에 연결되어 있는지 확인합니다. 회전베이스를 인큐베이터에 놓고 리본 케이블을 받침대에 부착합니다. 전원 공급 장치가 인큐베이터 근처에 있지만 외부에 있는지 확인하십시오. 그림 4 는 상황에 맞는 회전 베이스와 전원 공급 장치를 보여줍니다.
- 용기 나사산을 회전 페그에 정렬하고 베이스의 회전 페그를 시계 반대 방향으로 부드럽게 돌려 SMG 처리 용기를 부착합니다. 용기가 단단히 부착되었는지 확인하십시오. 인큐베이터가 충분한 오토클레이브 역삼투압(RO) 물로 물 트레이를 채워 100%에 가까운 습도를 유지하도록 합니다.
- 적절한 회전 속도(rpm)를 선택합니다. 세포의 침강 속도와 일치하도록 회전 속도를 조정하여 세포가 "매체를 통해 떨어지지" 않고 작은 궤도 경로에서 회전하도록 합니다. 이 현상은 그림 1의 개략도로 시각화됩니다.
알림: 회사는 림프구의 경우 8-10rpm에서 회전을 시작할 것을 권장합니다. 이때, NK92 세포는 이전 논문 17에서 입증된 바와 같이11 rpm으로 회전하였다. 셀 크기에 따라 rpm은 큰 셀의 경우 증가하고 작은 셀의 경우 감소해야 합니다. 사용된 세포가 배양 중에 뭉치는 경향이 있는 경우에도 동일한 패턴이 적용됩니다. 이에 대한 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하십시오.
6. 치료
- 연구 응용 분야에 적합한 치료 기간을 선택하십시오., 이는 분석되는 세포 기능/생리학의 매개변수에 따라 달라질 수 있습니다. 이에 대한 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하십시오.
참고: 이 경우 NK92 세포는 이전 연구18,19의 결과에 따라 72시간 SMG 처리를 받았습니다. 기포는 치료 내내 필연적으로 형성되며 제거해야합니다. 이를 용이하게 하기 위해 회전을 잠시 중지했다가 다시 시작할 수 있습니다. SMG 선박을 안전하게 제거하는 방법은 7.1단계를 참조하십시오. - 치료 첫날에 4.2-4.6단계를 반복하여 몇 시간마다 기포 형성을 확인합니다. 첫날 이후, 치료가 끝날 때까지 4.2-4.6 단계를 반복하면서 필요에 따라 (적어도 하루에 한 번) 혈관을 점검하십시오.
7. 혈관에서 세포 수확
- 계획된 치료 기간이 경과하면 회전을 멈추고 장치를 분해하십시오. 장치의 회전하는 페그를 시계 방향으로 돌리면서 용기를 고정된 상태로 부드럽게 잡고 SMG 처리 용기를 제거합니다.
- 제어 플라스크, 제어 1G 용기 및 처리된 SMG 용기를 멸균 생물학적 안전 캐비닛에 넣습니다.
- 각 용기(플라스크가 아닌 1G 및 SMG만 해당)를 가져다가 거꾸로 뒤집어 아래를 향하게 하고 부드럽게 두드려 모든 세포를 현탁액으로 만듭니다. 그런 다음 충전 포트가 바닥을 향하도록 용기를 옆으로 돌리고 용기를 다시 쳐서 효율적인 흡인을 위해 셀이 충전 포트 쪽으로 향하도록 합니다.
- 각 용기를 개별적으로 취급하십시오. 두 포트에서 주사기의 나사를 풀고 생물학적 위험 폐기물에 폐기하십시오. 주사기 포트의 마개를 엽니다.
- 충전 포트 캡을 조심스럽게 제거하고 멸균된 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 내용물을 끌어올리고 용기를 비울 때 기울입니다. "Flask", "1G" 및 "SMG" 그룹의 내용물을 개별적으로 레이블이 지정된 15mL 원뿔형 튜브에 분주합니다.
- 각 튜브를 닫고 부드럽게 몇 번 뒤집어 제대로 혼합되도록 합니다. 생성된 세포 배양물의 농도 및 생존율을 결정하기 위한 바람직한 방법을 사용하여 후속 실험 분석에 사용하기 위해 준비한다.
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Representative Results
이 배양 방법은 1) 세포의 증식이 대조군(이상적으로는 모든 실험군)에 걸쳐 거의 일관되고, 2) 파종 밀도, 처리 기간 및 세포 유형/계통의 배가 시간을 고려할 때 증식이 적절하고, 3) 수확된 세포의 생존율이 85% 이상인 경우 성공적인 것으로 간주됩니다(표 1 ). 이상적으로, 생성된 세포는 특히 후속 실험 및 분석에 사용하기 위해 표준 세포 배양에서와 같이 건강해야 합니다(즉, 생존율 85% 이상). 이 배양 방법은 그 반대의 경우 실패한 것으로 간주되며, 이에 따라 생성된 세포는 죽거나, 대조군에 걸쳐 증식이 크게 다르거나, 약 70% 이하의 최적이 아닌 생존율을 갖습니다(표 1). SMG 처리군에서의 증식은 SMG 처리가 세포 생리학에 미치는 영향에 따라 대조군과 비교하여 다를 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 그러나 이것은 현재까지 문제가 되지 않았으며 세포 증식은 대조군과 처리군에서 거의 동일했습니다(표 1). 앞서 언급했듯이 이러한 매개변수는 다운스트림 분석 및 실험의 성공에 중요하며 두 대조군의 결과 세포는 비교적 유사하게 수행되어야 합니다.
그림 1: 작동 중 시뮬레이션된 미세중력(SMG) 용기 내에서 배양된 세포의 국부적 궤도 경로 개략도. 여기에 설명된 RWV 2D 클리노스타트는 시간-평균 중력 벡터 무효화(5,6,8,9)의 원리에 따라 동작하며, 이에 의해 중력 벡터는 수평 축 상의 세포 배양물의 회전을 통해 무작위화된다. 이것은 배양 용기의 회전 속도를 세포의 침강 속도와 일치시킴으로써 달성됩니다. 초기 속도 향상 단계 후, 배양 용기의 배지는 결국 시간이 지남에 따라 "고체 회전"에 도달합니다. 이러한 수평 회전은 또한 세포 배양 용기 내의 층류를 유도한다. 이것은 층류에 의해 세포에 유도된 전단 응력이 난류의 전단 응력보다 훨씬 적다는 점을 감안할 때 "낮은 전단" 환경을 만듭니다. 그러나 클리노스타트가 완벽한 시스템이 아니라는 점을 감안할 때 세포에 최소한의 전단 응력을 가하는 작은 층류 유체 운동이 도입됩니다. 따라서 미디어에 부유하는 셀은 회전 중에 이 흐름에 의해 끌립니다. 수평 회전 중에 중력 벡터는 세포에 작용하여 여기에서 시각화되는 진동 궤적으로 가져옵니다. 배양 용기가 수평축을 중심으로 회전함에 따라 세포가 경험하는 중력 벡터도 회전합니다. 시간이 지남에 따라 이 회전하는 중력 벡터는 평균적으로 0에 접근합니다. 이 현상을 "시간 평균 중력 벡터 무효화"라고 하며 SMG 5,6,8,9의 상태를 유도합니다. 이 그림은 Castro et al., 201120에서 수정되었습니다. BioRender.com 로 만들었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 10mL 고종횡비 용기(HARV). (A) HARV의 조감도, 주 충전 포트와 두 개의 주사기 포트를 보여줍니다. (B) HARV를 회전식 베이스와 산소화 멤브레인에 연결하기 위한 나사식 포트를 보여주는 HARV의 뒷면. (C) 열린 주사기 포트(캡핑)를 보여주는 HARV의 측면도. (D) 닫힌 주사기 포트(캡핑)를 보여주는 HARV의 측면도. (e) 부착된 2개의 3 mL 주사기를 보여주는 HARV의 측면도; 왼쪽 주사기는 세포 배양으로 채워지고 오른쪽 주사기는 비어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: HARV의 기포. (A) 세포 배양에서 제거될 기포를 보여주는 HARV의 조감도. (B) 동일한 거품을 보여주는 HARV의 측면도. 거품의 크기가 어떻게 다른지 확인하십시오. 미세 기포도 제거해야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: RWV 장치의 회전 베이스 및 전원 공급 장치. (A) 최대 4개의 배양 용기를 수용할 수 있는 4개의 회전 못을 보여주는 회전 베이스의 전면 모습. (B) 후면 view 베이스와 전원 공급 장치를 연결하는 리본 케이블(사진에 없음)의 입력을 보여주는 회전 베이스. (C) 인큐베이터 상단에 보관된 전원 공급 장치의 전면 모습. 왼쪽의 켜기/끄기 스위치와 오른쪽의 rpm 조정 다이얼에 유의하십시오. 전원 공급 장치는 가장 가까운 콘센트(일반적으로 인큐베이터 뒷면에 있음)에 꽂혀 있으며 회전 베이스에 연결하기 위한 리본 케이블용 입력이 포함되어 있습니다. 전원 공급 장치는 인큐베이터 외부에 있습니다. 베이스는 작동 중에 인큐베이터(37°C, 5%CO2) 내부에 배치되고 리본 케이블은 인큐베이터 도어를 통해 공급되고 전원 공급 장치에 연결됩니다. 리본 케이블은 인큐베이터 씰을 방해하지 않습니다. 회전베이스를 사용하지 않을 때는 인큐베이터 외부에 보관하고 실험실 벤치 또는 선반에 안전하게 보관해야합니다. 사용되는 상용 장치에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| # | 생존력 시작 | 파종 밀도 세포/mL | 최종 생존율 (F) | 최종 생존율(1G) | 최종 생존 가능성 (SMG) | 말단 농도(F) 세포/mL | 말단 농도(1G) 세포/mL | End Conc(SMG) 세포/mL | 노트 | |||||
| 최적이 아닌 시작 생존력 및 파종 밀도(부정적인 결과) | 1 | 79% | 0.2 x 106 | 67% | 60% | 60% | 0.10 x 106 | 0.075 x 106 | 0.071 x 106 | 낮은 파종 밀도 및 차선의 시작 생존력은 치료 기간 동안 세포 사멸을 초래했습니다 | ||||
| 2 | 73% | 0.2 x 106 | 43% | 63% | 70% | 0.071 x 106 | 0.081 x 106 | 0.085 x 106 | ||||||
| 최적의 시작 생존력 및 파종 밀도 (긍정적 인 결과) | 3 | 93% | 0.4 x 106 | 93% | 93% | 96% | 1.2 x 106 | 1.1 엑스 106 | 1.5 x 106 | 적절한 파종 밀도와 최적의 시작 생존력은 치료 전반에 걸쳐 건강한 세포 성장과 생존력으로 이어졌습니다 | ||||
| 4 | 92% | 0.4 x 106 | 92% | 92% | 94% | 0.81 x 106 | 0.80 x 106 | 0.70 x 106 | ||||||
표 1: 실패한 시뮬레이션된 미세중력(SMG) 처리와 성공적인 시뮬레이션된 미세중력(SMG) 처리를 보여주는 비교 차트. NK92 개시 생존율 및 파종 밀도는 5% CO2로 보충된 37°C 세포 배양 배양기에서72시간 SMG 처리 후 생성된 최종 생존율 및 말단 농도와 비교하였다. 부정적인 결과의 두 사례와 긍정적인 결과의 두 사례를 비교했습니다. 비교를 위해 사용된 NK92 세포주의 최적 농도 범위는 0.3 x 10 6 cells/mL 및 1.2 x 106 cells/mL 사이였으며 배가 시간은 약 2-3일이었습니다.
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Discussion
인류가 달과 화성에 대한 더 긴 우주 임무를 준비함에 따라 우주 비행사의 심각한 건강 위험을 완화하기 위해 더 많은 연구가 수행되어야 합니다. 인간 생리학에 영향을 미치는 우주 환경의 주요 측면 중 하나는 미세 중력입니다. 여기서, 시판되는 회전세포 배양 시스템을 이용하여 림프구를 SMG에 투여하는 세포 배양 방법을 설명하였다.
이 프로토콜에는 사용되는 세포 유형 또는 계통에 따라 최적화해야 할 수 있는 몇 가지 중요한 단계가 포함되어 있습니다. 여기에는 1) 세포의 배가 시간과 SMG 처리 기간에 따라 적절한 파종 밀도 선택, 2) 최적의 처리 길이, 회전 속도 및 적절한 제어 결정이 포함됩니다. 연구 중인 세포 유형 또는 계통에 적합한 세포 농도의 중간 범위에 있는 파종 밀도를 선택하는 것으로 충분해야 합니다. 그러나 너무 낮은 파종 밀도를 선택하면 세포 증식 및 생존율이 낮아질 수 있으며(표 1), 너무 높은 밀도를 선택하면 영양소가 조기에 고갈되고 세포 생존율이 낮아질 수 있습니다. 선택된 파종 밀도는 또한 연구중인 세포의 배가 시간에 달려 있습니다. 배가 시간이 더 짧은 세포는 더 낮은 밀도로 시딩될 수 있고, 배가 시간이 더 긴 세포는 더 높은 밀도로 시딩해야 할 수 있습니다. 파종 밀도 및 처리 기간은 또한 후속 실험 분석을 완료하는 데 필요한 세포 수에 따라 달라집니다. 경험에 비추어 볼 때, 10mL 용기에서 0.4-0.5 x 10 6 cells/mL로 생존율이 높은(90%+) NK92 세포를 파종(즉, 실험군당 4-5백만 개의 세포, 세포주에 대한 최적 범위 = 0.3 x 10 6-1.2 x 106 cells/mL, 배가 시간 = 2-3일) 72시간 동안 처리하면 약 8-15백만 개의 세포가 생성되었습니다(표 1). 따라서 10mL 용기는 기능 분석(3 x 10 6 세포)을 위한 세포 수확 및 qPCR(1 x 10 6 세포) 및 웨스턴 블롯(2 x 10 6-6 x 10 6 세포)을 위한 세포 수집에 적합했습니다. 분비 성분의 분석을 위해 상청액을 수집 할 수도 있습니다. 그러나 50mL 용기도 사용할 수 있으며 더 높은 세포 수율이 필요할 때 사용할 수 있습니다. 50mL 용기를 사용할 때는 더 큰 주사기도 사용해야 합니다.
적절한 치료 기간을 결정하는 것은 사용되는 세포 유형/계통에 따라 달라집니다. 이전 연구가 있는 경우 시작하기에 적절한 치료 기간을 선택하기 위해 참조해야 합니다. 몇몇 연구들은 NK 세포를 배양하기 위해 RWV 장치를 사용하였고, 여기에 참조되어 있다17,18,19. 거기에서 치료 결과 또는 세포가 얼마나 잘 증식했는지, 생존력, 후속 실험 분석에서의 성능을 검사해야 합니다. 세포 배양물을 용기에서 튜브로 제거하고, 원심분리한 다음 10mL의 따뜻하고 신선하고 완전한 배양 배지에서 세포를 재현탁하고, 용기로 교체하고, 회전을 다시 시작하여 처리 길이를 72시간 이상 연장하는 것이 가능할 수 있습니다. 그러나 이것은 원심분리를 통한 과중력 노출로 인해 혼란을 야기할 수 있으며 세포가 최적의 농도 범위 내에서 유지되도록 하기 위해 세포 분할/희석이 필요할 수 있습니다. 자극 분자(예: LPS, 사이토카인 등)를 사용해야 하는 경우 SMG 처리를 설정하기 전에 전체 배지 레시피에 적절한 농도로 첨가하는 것이 좋습니다.
적절한 회전 속도(rpm)를 설정하는 것도 시뮬레이션된 미세 중력 처리를 유지하는 데 중요합니다. 회사는 림프구를 배양할 때 8rpm에서 10rpm 사이의 회전 속도로 시작할 것을 권장합니다. 경험에 비추어 볼 때, 11 rpm의 속도는 NK92 세포가 현탁 상태로 유지되도록 하는 데 효과적이었으며 과거 NK 세포 연구17에서 사용되었다. 사용 중인 세포 유형/계통의 성장 패턴에 따라 세포 덩어리를 설명하기 위해 회전 속도를 높여야 할 수도 있습니다. 이것은 증가된 질량으로 인해 세포의 침전을 증가시킬 것입니다. 최적의 SMG 처리를 위해서는 배양 용기의 회전 속도를 세포 5,6,8,9의 침강 속도와 일치하도록 조정해야 합니다. 즉, 세포나 세포 덩어리가 배지를 통해 떨어지는 것을 볼 수 없어야 하며 상대적으로 고정된 상태를 유지해야 합니다.
이러한 맥락에서 표준 T25 배양 플라스크("플라스크")에서 성장한 세포와 특수 HARV에서 성장했지만 SMG를 거치지 않은 세포(즉, 인큐베이터에 그냥 넣음)를 비교하여 두 가지 음성 대조군을 시도하는 것이 좋습니다. "1G")입니다. 이상적으로, 두 음성 대조군 사이의 다운스트림 실험 분석에서 세포 성능과 결과는 비교할 수 있어야 합니다. 불일치에 유의해야 합니다. 대부분의 분석에서 가장 좋은 비교는 "1G" 대조군과 SMG 처리 사이일 가능성이 높습니다. 그러나 "Flask" 및 "1G" 컨트롤을 모두 포함하면 충분한 비교 및 초기 최적화에 도움이 될 수 있습니다.
이 프로토콜의 주요 제한 사항에는 1) 세포 배양 중 기포 형성, 2) SMG의 범위 및 3) 가능한 처리 기간이 포함됩니다. SMG 처리 전반에 걸쳐 기포 형성을 모니터링하는 것이 중요합니다. 아주 작은 미세 기포도 축적되고 성장하여 매우 파괴적인 더 큰 기포를 형성할 수 있습니다. 이러한 더 큰 기포는 배양 용기 내의 저-전단 유체 역학을 방해하여, 유체 유동이 기포(21) 주위로 편향됨에 따라 난류를 증가시킨다. 궁극적으로 이것은 SMG 상태를 완전히 방해합니다. 이 현상은 Phelan etal 21에 의해 자세히 논의되고 시각화됩니다. 또한 이 장치는 ISS6에서 경험한 실제 미세 중력이 아닌 SMG를 생성한다는 점을 명심하는 것이 중요합니다. 그럼에도 불구하고 연구에 따르면 ISS 1,5,6에서 수행된 연구의 실제 미세중력 효과와 비교하여 이 장치에서 생성된 SMG의 유사한 효과가 나타났습니다.
세포 배양을 SMG에 적용하기 위한 대체 방법이 존재합니다. 여기에는 3D 클리노스타트 또는 RPM(Random Positioning Machine) 및 반자성 부상의 사용이 포함됩니다. 3D 클리노스타트는 동일한 속도로 두 개의 수직 축에서 세포 배양을 회전시키는 반면, RPM은 두 개의 수직 축에서 회전하므로 회전 속도와 방향성이 모두 무작위화됩니다 5,6. 따라서 2D 클리노스탯 또는 RWV 장치에 비해 RPM은 더 복잡하여 몇 가지 장점과 단점이 있습니다. 첫째, RPM에서 얻을 수 있는 미세 중력의 정도를 변조하여 달(0.16g)과 화성(0.33g)에서 경험하는 것과 같은 부분 중력을 시뮬레이션할 수 있습니다.6. 그러나 무작위 회전 방향과 속도의 복잡성이 추가되면 특히 배양 용기의 외부 영역을 향해 저크 운동과 가속력이 도입되어 잠재적으로 데이터가 혼란스러워질 수 있습니다. 반자성 부상은 중력에 대항하는 방법으로 생물학적 샘플의 물 무게를 상쇄하기 위해 샘플을 강한 반발 자기장에 노출시킵니다. 그러나, 그렇게 하기 위해 생성된 강한 자기장은 또한 세포에 부정적인 영향을 미칠 수 있고, 따라서 데이터(5,6)에 혼란을 야기할 수 있다. 이러한 방법들은 다른 곳(5,6)에서 보다 상세히 논의된다.
결론적으로, 여기에서 논의된 상업적으로 이용 가능한 로타리 세포 배양 시스템은 림프구에 대한 SMG의 영향을 연구하려는 과학자들에게 비교적 사용하기 쉽고 접근 가능한 플랫폼입니다. 이 세포 배양 방법에는 한계가 있지만 시뮬레이션된 미세 중력에서 림프구 및 잠재적으로 다른 현탁 세포 배양을 배양하기 위한 실행 가능한 옵션으로 남아 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 캐나다 우주국 (CSA), 연구 보조금 (17ILSRA3, Immuno Profile)의 지원을 받는다. 저자는 이 프로토콜의 초기 문제 해결에 도움을 준 Dr. Roxanne Fournier(토론토 대학교), Randal Gregg 박사(링컨 메모리얼 대학교) 및 Preteesh Mylabathula(애리조나 대학교)에게 감사를 표합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL) | Synthecon | D-410 | Gamma sterilized culture vessels (4/box) |
| Luer-Lok tip syringes (3 mL) | BD | 309657 | For attaching to the 10 mL HARVs |
| NK92 Cell-line | ATCC | CRL-2407 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4D | Rotating wall vessel device; 2D clinostat |
| Sarsedt 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-220 | |
| Sarsedt 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-218 | |
| Sarsedt sterile serological pipettes | Fisher Scientific | 86.1254.001 | |
| T25 suspension culture flasks | Sarsedt | 83.3910.502 | For flask control |
References
- ElGindi, M., et al. May the force be with you (or not): the immune system under microgravity. Cells. 10 (8), 1941 (2021).
- Choukèr, A., Ullrich, O. The Immune System in Space: Are we Prepared. , Springer International Publishing. Cham. (2016).
- Crucian, B. E., et al. Immune system dysregulation during spaceflight: potential countermeasures for deep space exploration missions. Frontiers in Immunology. 9, 1437 (2018).
- Crucian, B. E., et al. Countermeasures-based improvements in stress, immune system dysregulation and latent herpesvirus reactivation onboard the International Space Station - relevance for deep space missions and terrestrial medicine. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 115, 68-76 (2020).
- Herranz, R., et al. Ground-based facilities for simulation of microgravity: organism-specific recommendations for their use, and recommended terminology. Astrobiology. 13 (1), 1-17 (2013).
- Ferranti, F., Del Bianco, M., Pacelli, C. Advantages and limitations of current microgravity platforms for space biology research. Applied Sciences. 11 (1), 68 (2020).
- Murphy, K., Weaver, C. Janeway's Immunobiology 9th Edition. , Garland Science/Taylor & Francis Group LLC. New York, NY. (2016).
- Dedolph, R. R., Dipert, M. H. The physical basis of gravity stimulus nullification by clinostat rotation. Plant Physiology. 47 (6), 756-764 (1971).
- Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), 12-25 (2001).
- Crabbé, A. Transcriptional and proteomic responses of Pseudomonas aeruginosa PAO1 to spaceflight conditions involve Hfq regulation and reveal a role for oxygen. Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1221-1230 (2011).
- Ulbrich, C., et al. The impact of simulated and real microgravity on bone cells and mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2014, 1-15 (2014).
- Martinez, E. M., Yoshida, M. C., Candelario, T. L. T., Hughes-Fulford, M. Spaceflight and simulated microgravity cause a significant reduction of key gene expression in early T-cell activation. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), 480-488 (2015).
- Jong, J., Maki, G., Klingemann, H. Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).
- Williams, B. A., et al. A phase I trial of NK-92 cells for refractory hematological malignancies relapsing after autologous hematopoietic cell. Oncotarget. 8 (51), 89256-89268 (2017).
- Cryopreservation of mammalian cell lines video protocol. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol (2022).
- Counting cells using a hemocytometer. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2022).
- Mylabathula, P. L., et al. Simulated microgravity disarms human NK-cells and inhibits anti-tumor cytotoxicity in vitro. Acta Astronautica. 174, 32-40 (2020).
- Li, Q., et al. Effects of simulated microgravity on primary human NK cells. Astrobiology. 13 (8), 703-714 (2013).
- Shao, D., et al. Mechanisms of the effect of simulated microgravity on the cytotoxicity of NK cells following the DNA methylation of NKG2D and the expression of DAP10. Microgravity Science and Technology. 33 (1), 6 (2021).
- Castro, S. L., Nelman-Gonzalez, M., Nickerson, C. A., Ott, C. M. Induction of attachment-independent biofilm formation and repression of hfq expression by low-fluid-shear culture of Staphylococcus aureus. Applied and Environmental Microbiology. 77 (18), 6368-6378 (2011).
- Phelan, M. A., Gianforcaro, A. L., Gerstenhaber, J. A., Lelkes, P. I. An air bubble-isolating rotating wall vessel bioreactor for improved spheroid/organoid formation. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (8), 479-488 (2019).
