Summary
Bu, özel tek kullanımlık kültür kapları kullanarak simüle edilmiş mikro yerçekiminde lenfositleri kültürlemek için ticari olarak temin edilebilen bir döner hücre kültürü sistemi kullanmak için adım adım bir kılavuzdur. Bu kültürleme yöntemi herhangi bir süspansiyon tipi hücre kültürüne uygulanabilir.
Abstract
Uzayda biyolojik araştırma yapmanın mevcut sınırlamaları göz önüne alındığında, hücre kültürünü Dünya'daki simüle edilmiş mikro yerçekimine (SMG) maruz bırakmak için birkaç seçenek vardır. Bu seçenekler yöntemlerine, prensiplerine ve süspansiyon hücre kültürü ile kullanıma uygunluklarına göre değişir. Burada, lenfositleri, 2D klinostat veya dönen duvar kabı (RWV) cihazı olarak da bilinen, ticari olarak temin edilebilen bir döner hücre kültürü sistemi kullanarak simüle edilmiş mikro yerçekimine maruz bırakmak için bir hücre kültürü yöntemi açıklanmaktadır. Bu hücre kültürü yöntemi, hücreleri yatay bir eksende döndürerek mikro yerçekimini simüle etmek için zaman ortalamalı yerçekimi vektörü nullifikasyonu prensibini kullanır. Bu sistemde kültürlenen hücreler, simüle edilmiş mikro yerçekiminin hücresel fonksiyon ve fizyoloji üzerindeki etkilerini değerlendirmek için birçok farklı deneysel tahlilde toplanabilir ve kullanılabilir. Kültürleme tekniği, kullanılan hücre tipine veya çizgisine bağlı olarak biraz değişebilir, ancak burada açıklanan yöntem herhangi bir süspansiyon tipi hücre kültürüne uygulanabilir.
Introduction
Uzay uçuşunun, bağışıklık sistemi de dahil olmak üzere insan fizyolojisinin birçok yönünü etkilediği gösterilmiştir. Birçok çalışma, in vivo uzay uçuşu ve in vitro 1,2,3,4 simüle edilmiş mikro yerçekimine (SMG) maruz kalmanın bir sonucu olarak immün disregülasyonun kanıtlarını göstermiştir. İnsan fizyolojisini etkileyen uzay ortamının önemli bir yönü mikro yerçekimidir. Mikro yerçekimi, uzay ortamındaki düşük yerçekimi kuvvetleri nedeniyle yaşanan "ağırlıksızlığı" ifade eder5. İnsanlık Ay ve Mars'a daha uzun uzay görevlerine hazırlanırken, astronotlardaki ciddi sağlık risklerini azaltmak için daha fazla araştırma yapılması gerekiyor.
Bilimsel araştırmalar için gerçek mikro yerçekimi koşulları, Uluslararası Uzay İstasyonu'ndaki (ISS) uzayda veya yörüngeye fırlatılan nanouydularda elde edilebilir; ancak, bu seçeneklerin düzenlenmesi inanılmaz derecede maliyetli ve karmaşık olabilir. Uzayda biyolojik araştırma yapmanın mevcut sınırlamaları göz önüne alındığında, Dünya'da gerçek mikro yerçekimi ve SMG'yi indüklemek için çeşitli seçenekler mevcuttur. Düşme kuleleri, parabolik uçuş ve sondaj roketleri de dahil olmak üzere Dünya'da kısa süreli gerçek mikro yerçekimi üretebilen büyük ölçekli operasyonlar mevcuttur. Bununla birlikte, bu yöntemler, büyük ölçüde kısa süreli mikro yerçekimi muamelesi (yani, saniyeler ila 20 dakika) nedeniyle, mikro yerçekiminin biyolojik sistemler üzerindeki etkilerini incelemek için aşırı derecede uygun değildir. Bu yöntemler başka yerlerde daha ayrıntılı olarak tartışılmıştır 5,6. Biyolojik hücre kültürü için uygun olan seçenekler arasında 2D klinostatlar veya döner duvar kabı (RWV) cihazları ve 3D klinostatlar veya rastgele konumlandırma makineleri (RPM) gibi küçük ölçekli cihazlar bulunur. Bu cihazlar, 37 ° C ve% 5 CO2'de tutulan hücre kültürü inkübatörlerinin içine kurulabilir ve hücre kültürünü yatay bir eksende (2D) veya iki dikey eksende (3D)5 döndürürler. Bununla birlikte, bu kültürleme yöntemlerinin, biyolojik araştırma bağlamları için uzayda en uygun şekilde elde edilen gerçek mikro yerçekiminin aksine SMG ürettiğini vurgulamak önemlidir.
Bu makalenin amacı, 2D klinostat sınıflandırmasına giren ticari olarak temin edilebilen bir RWV cihazı (Malzeme Tablosu) kullanarak lenfositleri SMG'ye maruz bırakma adımlarını özetlemektir. Bu cihazı çalıştırmak için üreticiden genel bir protokol mevcut olsa da, mevcut makale sorun giderme ve optimizasyon adımlarını daha ayrıntılı olarak ele almayı amaçlamaktadır. Bu makale ayrıca, bu cihazın süspansiyon hücre kültüründe, özellikle lenfositlerle SMG üretmek için nasıl çalıştığının arkasındaki teoriyi de kapsamaktadır. Bu bağlamda, süspansiyon hücre kültürü, herhangi bir ek iskeleye bağlı kalmadan, takviye edilmiş kültür ortamında serbestçe büyüyen hücreleri ifade eder. Birçok hücre tipi, lenfositler de dahil olmak üzere süspansiyon hücre kültüründe yetiştirilir. Lenfositler, lenfoid organlarda ve kan dolaşımında bulunan T, B ve Doğal Öldürücü (NK) hücreleri de dahil olmak üzere bağışıklık sisteminin hücreleridir7.
Burada tarif edilen RWV 2D klinostat, zaman ortalamalı yerçekimi vektörü nullification 5,6,8,9 prensibi üzerinde çalışır, bu sayede yerçekimi vektörü, hücre kültürünün yatay bir eksen üzerinde dönmesiyle randomize edilir. Bu, kültür kabının dönme hızını hücrelerin çökeltme hızıyla eşleştirerek elde edilir. Kültür kabının dönme hızı, hücrelerin çökelme hızıyla iyi eşleştiği sürece, hücreler serbest düşüşte tutulur ve uzay ortamında yaşandığı gibi çökelemez. İlk hızlanma aşamasından sonra, kültür kabındaki ortam zamanla "katı vücut rotasyonuna" ulaşır. Bu yatay rotasyon aynı zamanda hücre kültürü damarında laminer akışı indükler. Bu, laminer akışla hücreler üzerinde indüklenen kayma stresinin türbülanslı akıştan çok daha az olduğu göz önüne alındığında, "düşük kesme" ortamı yaratır. Bununla birlikte, klinostatın mükemmel bir sistem olmadığı göz önüne alındığında, hücreler üzerinde minimum kayma stresi yaratan bazı küçük, laminer sıvı hareketleri vardır. Bu nedenle, medyada asılı kalan hücreler, dönme sırasında bu akış tarafından sürüklenir. Yatay dönme sırasında, yerçekimi vektörü hücrelere etki eder ve onları Şekil 1'de görselleştirildiği gibi salınımlı bir yörüngeye getirir. Bir başka küçük kayma stresi kaynağı, hücrelerin ortamdan "düşmesi" ve hücrelerin etrafında laminer akışa neden olmasından kaynaklanır. Kültür kabı yatay bir eksen üzerinde dönerken, hücrelerin deneyimlediği yerçekimi vektörü de döner. Zamanla, bu dönen yerçekimi vektörü sıfıra yaklaşmak için ortalamaya ulaşır; Bu fenomene zaman ortalamalı yerçekimi vektörü nullifikasyonu denir ve SMG 5,6,8,9 durumunu indükler. Bu cihaz, SMG'nin bazıları10,11,12 referanslarında ele alınan birçok hücre tipi üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılmıştır. Daha fazla örnek, cihaz üreticisinin web sitesinde bulunabilir.
Bu RWV cihazı, cihaz üreticisi tarafından sunulan özel "yüksek en boy oranlı kaplar" (HARV'ler) kullanır. Bu HARR'ların her biri 10 mL hücre kültürü tutar; ancak 50 mL HARV'ler de mevcuttur. 10 mL veya 50 mL HARV'ler, tartışma bölümünde daha ayrıntılı olarak özetlenen herhangi bir aşağı akış deneysel tahlilini tamamlamak için kaç hücreye ihtiyaç duyulduğuna bağlı olarak kullanılabilir. HARV'ler polikarbonattan yapılmıştır ve hücre kültürü sırasında gaz değişimine izin vermek için bir silikon oksijenasyon membranı içerir. Bu, hücre ortamının pH'ını korur ve verimli hücresel solunuma izin verir. Kabın yüzünde bir ana dolum portu ve iki adet kapaklı şırınga portu bulunmaktadır (Şekil 2A). Hücre kültürünü ana dolum portundan yükledikten sonra, kabarcığın çıkarılmasına yardımcı olmak için kaba iki şırınga yüklenir. 10 mL'lik damarları kullanırken, iki adet 3 mL'lik şırınga iyi çalışır. Bir şırınga cihaza boş olarak bağlanır, şırınga tamamen bastırılır ve diğeri 3 mL hücre kültürü ile doldurulur (Şekil 2E). Bunlar, SMG tedavisini sürdürmek için önemli olan kabarcıkları damardan çıkarmak için kombinasyon halinde kullanılır. Genel olarak, "Flask" kontrolü ve "1G" kontrolü olarak adlandırılabilecek iki negatif kontrolün kurulması önerilir. "Flask" kontrolü, standart bir T25 süspansiyon hücre kültürü şişesinde yetiştirilen hücrelere karşılık gelir. 1G kontrolü, inkübatöre basitçe yerleştirilen (yani, SMG işlemine tabi tutulmadan) özel 10 mL kültür kabında yetiştirilen hücrelere karşılık gelir. Denetimler hakkında daha fazla ayrıntı için lütfen Tartışma bölümüne bakın.
Burada açıklanan yöntem, SMG'nin lenfositler üzerindeki etkilerini incelemek isteyen herhangi bir araştırmacı için, NK92 hücre hattı13'ü kullanarak NK hücrelerine özel bir odaklanma ile uygundur. Bu çalışmalardan elde edilen sonuçlar, uzay uçuşunun insan bağışıklık sistemi üzerindeki olumsuz etkilerini daha iyi anlamamıza ve hafifletmemize yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Aşağıdaki adımlar steril bir biyolojik güvenlik kabini içinde tamamlanmalıdır.
1. Hücre kültürü için damarların hazırlanması
- Kültür kaplarını plastik ambalajdan çıkarın. Janttaki her bir damarı, hangi hücre tipinin / hattının kullanıldığına, kontrol (1G) veya tedavi (SMG) olup olmadığına ve diğer ilgili bilgilere göre etiketleyin.
- Kabı stabilize edin ve dolum portu kapağı mandalına/O-ringine dokunmadan dolum portunu dikkatlice açın. Kapağı, kap doldurulurken mandal / O-ring yukarı bakacak şekilde bir etanol pedi üzerine yerleştirin. Kapakları şırınga bağlantı noktalarından çıkarmayın.
NOT: Mandal/O-ringe yanlışlıkla dokunulursa, kapak mandalına %70 etanol püskürtün ve kabı doldururken birkaç dakika bekletin (yukarı bakacak şekilde). Dolum portunu tekrar kapatmaya hazır olduğunuzda, kapağı tekrar kaba yerleştirmeden önce iyice kurutmak için kapağı taze bir kağıt mendille alın. - Steril bir serolojik pipet kullanarak kabı hücre kültürü için 10 mL'lik uygun komple ortamla yükleyin ve kapağı dikkatlice dolum portuna geri yerleştirin.
NOT: Burada, daha önce NK92 hücrelerini hücre terapisi14 olarak kullanan bir klinik çalışmada doğrulandığı gibi, GM1 ortamında kültürlenen NK92 NK hücre hattı kullanılmıştır. Kullanılan kültür ortamı, kültürlenen hücre hattına veya hücre tipine bağlıdır. Kullanılan hücre hattı veya hücre tipi için doğru medya tarifi için lütfen tedarikçinin web sitesini kontrol edin. - Şırınga port kapaklarının ve dolum portunun güvenli bir şekilde kapatıldığından emin olun ve doldurulmuş kapları 37 ° C, % 5 CO2 inkübatöre yerleştirin ve kapları hücre kültürüne hazırlamak için sonraki adımları uygulayın.
NOT: Bu hazırlama adımı, daha sonra Adım 6'da kabarcıkların atılmasını kolaylaştırmak için büyük kabarcık oluşumunu en aza indirmeye yardımcı olur.
2. SMG tedavi kurulumu için stok hücre kültürünün hazırlanması
- Kullanılmadığında, ilgilenilen hücreleri -130 ° C'den daha düşük bir sıcaklıkta veya ideal olarak sıvı azot buharı fazında saklayın.
- Planlanan tedaviyi kurmadan en az 1 hafta önce, hücreleri çözün ve tedarikçinin web sitesinde bulunan uygun hücre kültürü medya tarifini kullanarak kültürleyin. Tedaviyi kurmak için kaç hücreye ihtiyaç duyulduğunu planlayın (sonraki adımlarda ayrıntılar aşağıdadır) ve kültürlerin yeterli çoğalmaya ve kültüre adaptasyona izin verecek kadar erken başladığından emin olun.
- Hücre kültürünü 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörde saklayın. Standart hücre kültürü uygulaması hakkında daha fazla ayrıntı başka bir yerde ele alınmıştır15.
- Planlanan SMG tedavisinin yapıldığı gün, başlangıç hücre kültürünün başlangıç konsantrasyonunu ve canlılığını belirleyin.
- İlk hücre kültürünün konsantrasyonunu belirlemek için tercih edilen yöntemi kullanın (örneğin, hemositometre, ViCell, akış sitometrisi, vb.). Hücrelerin canlı hücre konsantrasyonunu (mL başına hücreler) ve canlılığını (%) not edin, canlılığın ideal olarak% 85'ten büyük olmasını sağlayın. Hemositometre kullanmak için bir protokol başka bir yerde bulunabilir16.
- Belirli bir hücre tipinin / hattının optimal hücre konsantrasyon aralığını, iki katına çıkma sürelerini ve SMG tedavisinin uzunluğunu göz önünde bulundurarak SMG tedavisi için hücre kültürünün uygun hücre tohumlama yoğunluğunu / konsantrasyonunu belirleyin. Daha fazla ayrıntı için lütfen Tartışma bölümüne bakın.
NOT: Deneyimlere göre, NK92 hücreleri için optimum konsantrasyon aralığı 0,3 x 10 6- 1,2 x 106 hücre/mL arasındadır. Genel olarak, bu hücreler 48-72 saatlik bir iki katına çıkma süresine sahiptir ve bu nedenle her 2-3 günde bir beslenir. Tedavi uzunluğunun 72 saat olduğu göz önüne alındığında, hücreler optimal aralıklarının alt ucunda 0.4-0.5 x 106 hücre / mL'de tohumlandı. Tedarikçi ayrıca, ilk hücre kültürünü taze bir NK92 hücresi şişesinden başlatırken bu tohumlama yoğunluğunu önermektedir. - Tedaviyi ve kontrolleri ayarlamak için gereken stok hücre kültürünün hacmini belirleyin.
NOT: Deney grubu başına 10 mL hücre kültürüne ihtiyaç vardır. Üç deney grubu oluşturulursa (yani, bir tedavi: "SMG" ve iki negatif kontrol: "Flask" ve "1G"), HARV şırıngalarını yüklemek için kullanılan 15 mL'lik bir tüpe aliquot yapmak için başka bir 10 mL hücre kültürü yeterlidir. Bu, toplamda 40 mL'dir ve belirli deneysel tasarıma bağlı olarak dalgalanabilir. - Tedaviyi kurmak için gereken hücre sayısını belirleyin.
- Seçilen tohumlama yoğunluğunu (hücre/mL) gereken toplam hacimle (mL) çarparak gereken toplam hücre sayısını hesaplayın.
NOT: NK92 ile ilgili deneyimlere göre, 40 mL stok hücre kültürü, yukarıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, 0.4-0.5 x 106 hücreli / mL'lik bir tohumlama konsantrasyonunda hazırlanmıştır. Bu nedenle, tipik tedavi kurulumunu tamamlamak için 16-20 x 106 NK92 hücrelerine ihtiyaç vardır. NK92 hücre hattı için, tedavi boyunca yüksek canlılığı korumak için biraz daha fazla hücre kullanmak, biraz daha az hücreden daha iyidir.
- Seçilen tohumlama yoğunluğunu (hücre/mL) gereken toplam hacimle (mL) çarparak gereken toplam hücre sayısını hesaplayın.
- Aşağı doğru dönecek ilk hücre kültürünün hacmini belirleyin.
- Hücre konsantrasyonunun hücreler / mL olarak temsil edildiği göz önüne alındığında, deney için gereken toplam hücre sayısını (hücreler) hücre kültürünün ölçülen başlangıç konsantrasyonuna (hücreler / mL) bölün.
NOT: Örneğin, 16 x 10 6 hücreye ihtiyaç duyulursa ve kültürün başlangıç konsantrasyonu 0,8 x 106 hücre/mL ise, kültürün 20 mL'si aşağı doğru döndürülmelidir.
- Hücre konsantrasyonunun hücreler / mL olarak temsil edildiği göz önüne alındığında, deney için gereken toplam hücre sayısını (hücreler) hücre kültürünün ölçülen başlangıç konsantrasyonuna (hücreler / mL) bölün.
- Son stok hücre kültürünü yapın.
- Uygun sayıda hücreyi 300 x g'de 50 mL'lik bir konik tüpte 8 dakika boyunca santrifüj edin.
- Supernatant'ı dikkatlice bir atık kabına dökün ve peleti küçük artık hacimde yeniden askıya almak için tüpü hafifçe hareket ettirin.
- Kültürü istenen tohumlama yoğunluğuna getirmek için hücreleri uygun hacimde ısıtılmış (37 ° C) komple ortamda yeniden askıya alın. Bu birim Adım 2.6'da hesaplanmıştır.
- 50 mL'lik tüpü güvenli bir şekilde kapatın ve hücre süspansiyonunu iyice karıştırmak için birkaç kez yavaşça ters çevirin.
NOT: Tam deneyi kurmak için 50 mL'den fazla gereksinim varsa, 50 mL'lik bir konik tüpte gereken toplam hücre sayısını santrifüj etmek ve bunu gereken hacmin yarısında yeniden askıya almak en iyisidir. Daha sonra iyice karıştırın ve ayrı bir 50 mL konik tüpte 1: 2 seyreltme yapın. Örneğin, 0,4 x 10 6 hücre/mL'de 100 mL'ye ihtiyaç duyulursa, 50 mL'lik bir tüpte 40 x 106 hücreyi döndürün, 50 mL'lik bir ortamda yeniden askıya alın, 25 mL'yi başka bir 50 mL'lik tüpe aktarın ve ardından her ikisini de 25 mL'lik taze ortamla doldurun.
3. Stok hücre kültürü ile yükleme gemileri
- Medya astarlı kapları inkübatörden alın.
- Bir "Flask" kontrolü kullanılıyorsa, yukarıda hazırlanan stoktan 10 mL hücre kültürüne sahip bir T25 süspansiyon kültürü şişesi yükleyin. Ayrıca, şırıngaları yüklemek için kullanılacak ayrı bir 15 mL konik tüpe 10 mL stok hücre kültürü ekleyin.
- Şırınga port kapaklarını sökerek kaptan çıkarın ve stopcock'ların açık konumda olduğundan emin olun (Şekil 2C).
- Kabı stabilize edin ve dolum portu kapağı mandalına/O-ringine dokunmadan dolum portunu dikkatlice açın. Kapağı, kap doldurulurken mandal / O-ring yukarı bakacak şekilde bir etanol pedi üzerine yerleştirin. Kapakları şırınga portlarından dikkatlice sökün.
- Durdurucuların açık konumda olduğundan emin olun (Şekil 2C). Ortamı kaptan dikkatlice bir atık kabına dökün, ortamı serolojik bir pipet kullanarak çıkarın veya oksijenasyon membranına dokunmadan vakum sistemine bağlı steril bir cam Pasteur pipet kullanarak aspire edin.
- Stok hücre kültürünü içeren 50 mL'lik konik tüpü sıkıca kapatın ve içeriği iyice karıştırmak için birkaç kez hafifçe ters çevirin.
- Taze steril serolojik pipetle 50 mL'lik tüpten 10 mL hücre kültürü stoğu hazırlayın. Kabı alın ve dolum portu üste doğru olacak şekilde eğin ve ardından hücre kültürü stoğunu dolum portundan kabın içine dikkatlice dağıtın.
NOT: Dikkatli olun ve gemiyi eğerken kültürün şırınga portlarından dökülmemesi için ses seviyesini izleyin. - Kabı doldurma portunun dudağının tepesine kadar dökülmeden doldurmayı hedefleyin; Dökülmeyi önlemek için gemiyi doldurulurken tekrar aşağı doğru eğin. Çok kırılgan olduğu için oksijenasyon membranına pipetle dokunmamaya dikkat edin.
NOT: Kap doldurma işlemi biraz pratik gerektirebilir; sabırlı olun ve yavaş gidin. Dolum portunun açılışında bir kabarcık filmi oluşursa, bu geminin yüklenmesini engelleyecektir. Bu durumda, kabarcık filmi tarafından oluşturulan contayı kırmak için gemiye hafifçe vurun. - Gemi yüklendikten sonra, mandal / O-ring'e dokunmadığınızdan emin olmak için dolum portu kapağını dikkatlice tekrar takın.
- Şırıngaların üzerine yerleştirin.
NOT: Geminin yüzünde iki şırınga portu bulunmaktadır (Şekil 2A). Biri boş bir şırınga, diğeri hücre kültürü ile dolu bir şırınga tutacaktır (Şekil 2E).- İlk olarak, 3 mL boş şırıngayı şırınga portlarından birine takın ve şırınganın tamamen bastırıldığından emin olun.
NOT: Şırıngaları kaba takmadan önce birkaç kez pompalayın, çünkü ilk başta biraz sıkıdırlar. Steriliteyi korumak için bunu biyolojik güvenlik kabininin içinde yapın. - 15 mL konik tüpü 10 mL aliquoted hücre kültürü ile sıkıca kapatın ve içeriği iyice karıştırmak için birkaç kez hafifçe ters çevirin.
- Daha sonra, ikinci 3 mL şırıngayı hücre kültürüne dikkatlice yarı batırın ve bir miktar kültür hazırlayın. Şırınganın üstündeki hava kabarcığını en aza indirmek için, bunu tamamen tüpe geri dağıtın ve ardından 3 mL kültür çekin.
- Doldurulmuş şırıngayı kalan şırınga portuna takın ve şırıngaları ve dolum portunun etrafını bir etanol pedi ile dikkatlice sterilize edin. Oksijenasyon membranına etanol almayın. Şimdi gemi kabarcıklardan kurtulmaya hazır.
NOT: İkinci kap için ikinci doldurulmuş şırınganın yüklenmesi, 15 mL tüpün derinliği göz önüne alındığında daha zordur. Doldurulan şırınga ile hücre kültürü arasındaki contayı korumak için şırıngayı doldururken tüpün eğilmesine yardımcı olur. - Kalan kaplar için 3.3-3.10 arasındaki adımları tekrarlayın. Son damar için 50 mL konik tüpte biraz yetersiz miktarda hücre kültürü kalırsa (örneğin, 10 mL yerine 9,5 mL), kalan miktarı şırıngaları yüklemek için kullanılan 15 mL konik tüpten geri kazanın.
NOT: Aşağıdaki adımların steril bir biyolojik güvenlik kabini içinde gerçekleşmesi gerekmez, çünkü gemi artık kapalı, steril bir sistemdir.
- İlk olarak, 3 mL boş şırıngayı şırınga portlarından birine takın ve şırınganın tamamen bastırıldığından emin olun.
4. Kabarcıkların gemilerden çıkarılması
NOT: Bu kurulumda kabarcıklar kaçınılmazdır ve tedavi boyunca sürekli olarak çıkarılmalıdır (Şekil 3). Bu konuda daha fazla ayrıntı için lütfen Tartışma bölümüne bakın.
- Hücrelerin ve kabarcıkların şırıngalardan damarlara göçünü sınırlamak için şırınga port stopcocklarının kapalı konumda olduğundan emin olun (Şekil 2D). Bu özellikle tedavi sırasında daha sonra önemlidir (aşağıda tartışılmıştır). İlk kabarcıkları toplamak için, gemiyi baş aşağı çevirin ve yan tarafına birkaç kez vurun.
- Kabı yukarı bakacak şekilde hızlı bir şekilde geriye doğru çevirin ve daha sonra hafif bir açıyla uzağa doğru çevirin, böylece kabarcıkların tümü kabın yukarı tarafına doğru yüzer (Şekil 3B).
- Limanın altındaki kabarcıkları boş şırıngayla manevra yapın ve limana girmeye başlamalarını izleyin. Şırınga portu stopcock'larının her ikisini de açın (Şekil 2C).
- Kabarcıkları boş şırıngaya doğru yüzmeye teşvik etmek için gemiye yavaşça vurun. Oksijenasyon zarının patlamaması için kaptaki basıncı korumak için tam şırıngayı dikkatlice bastırırken, boş şırınga ile daha büyük kabarcıkları yavaşça emer.
NOT: Daha büyük kabarcıkların emilmesi gerekirken, küçük kabarcıklar ve mikro kabarcıklar, şırınga portlarına manevra yaparak ve yavaşça kaba çarparak şırıngaya doğru yüzmeye teşvik edilebilir. Birkaç saatlik tedaviden sonra, şırıngalardaki hücreler ile kültür kabındaki hücreler arasındaki "çapraz kontaminasyonu" en aza indirmek son derece önemlidir. Bunun nedeni, şırıngalardaki hücrelerin, damardaki hücrelerle aynı miktarda oksijenasyon veya SMG'ye maruz kalmamasıdır. - Tüm baloncukların kaldırıldığından emin olmak için 4.2-4.4 arasındaki adımları birkaç kez tekrarlayın. Mikro kabarcıklar da dahil olmak üzere tüm kabarcıkları gemilerden çıkarın.
NOT: Kabarcıklar, kap bir ışık kaynağına (pencere, ışık vb.) yöneldiğinde oksijenasyon membranından (kabın arkasından) kolayca görülebilir. Adım 4.2 ve 4.3'ü uygularken, görülmesi daha zor kabarcıkları görselleştirmeye yardımcı olmak için kabın arkasından hareket eden kabarcıklara bakın. - Kabarcıklar etkili bir şekilde çıkarıldığında, şırınga portu stopcock'larını kapatın. Daha sonra kabarcıkların çıkarılmasına izin vermek için tedavi sırasında şırıngaları açık tutun ve her iki şırıngadaki hacmin yaklaşık olarak eşit olmasını sağlayın.
5. Kabın döner tabana bağlanması
- Dönen tabanın ve şerit kablonun yüzeyini %70 etanol ile dikkatlice silin.
- Birlikte verilen şerit kablosunun güç kaynağına takılı olduğundan emin olun. Dönen tabanı inkübatöre yerleştirin ve şerit kablosunu tabana takın. Güç kaynağının inkübatörün yakınında ancak dışında tutulduğundan emin olun. Şekil 4 , bağlam için dönen tabanı ve güç kaynağını göstermektedir.
- SMG arıtma kabını, kap dişlerini dönen mandala dizerek ve dönen mandalı tabanda saat yönünün tersine çevirerek hafifçe takın. Geminin güvenli bir şekilde takıldığından emin olun. Su tepsisini yeterli otoklavlanmış, ters ozmoz (RO) suyuyla doldurarak inkübatörün %100'e yakın nemi koruduğundan emin olun.
- Uygun bir dönüş hızı (rpm) seçin. Dönme hızını, hücrelerin çökeltme hızına uyacak şekilde ayarlayın, böylece hücreler "ortamdan hiç düşmez", ancak küçük bir yörünge yolunda dönerler. Bu fenomen Şekil 1'de şematik bir diyagram olarak görselleştirilmiştir.
NOT: Şirket, lenfositler için rotasyonun 8-10 rpm'de başlatılmasını önerir. Bu durumda, NK92 hücreleri, önceki bir makale17'de gösterildiği gibi, 11 rpm'de döndürüldü. Hücre boyutuna bağlı olarak, rpm daha büyük hücreler için arttırılmalı ve daha küçük hücreler için azaltılmalıdır. Aynı model, kullanılan hücreler kültürleme sırasında kümelenme eğiliminde olduğunda da geçerlidir. Bu konuda daha fazla ayrıntı için lütfen Tartışma bölümüne bakın.
6. Tedavi
- Araştırma uygulaması için, hangi hücre fonksiyonu / fizyoloji parametrelerinin test edildiğine bağlı olabilecek uygun bir tedavi uzunluğu seçin. Bu konuda daha fazla ayrıntı için lütfen Tartışma bölümüne bakın.
NOT: Bu durumda, NK92 hücreleri, önceki çalışmaların sonuçlarına dayanarak 72 saatlik bir SMG tedavisine tabi tutuldu18,19. Kabarcıklar tedavi boyunca kaçınılmaz olarak oluşacak ve çıkarılması gerekecektir. Bunu kolaylaştırmak için rotasyon kısa bir süre durdurulabilir ve yeniden başlatılabilir. SMG kabının güvenli bir şekilde nasıl çıkarılacağını öğrenmek için Adım 7.1'e bakın. - Tedaviyi kurmanın ilk gününde, Adım 4.2-4.6'yı tekrarlayarak birkaç saatte bir kabarcık oluşumunu kontrol edin. İlk günden sonra, damarları gerektiği gibi kontrol edin (günde en az bir kez), tedavinin sonuna kadar Adım 4.2-4.6'yı tekrarlayın.
7. Damarlardan hücrelerin toplanması
- Planlanan işlem süresi geçtikten sonra, dönüşü durdurun ve aparatı sökün. Cihazın dönen mandalını saat yönünde çevirirken kabı yavaşça sabit tutarak SMG arıtma kabını çıkarın.
- Kontrol şişesini, kontrol 1G kabını ve işlenmiş SMG kabını steril bir biyolojik güvenlik kabinine getirin.
- Her bir kabı alın (yalnızca 1G ve SMG; Flask değil) ve baş aşağı çevirin, böylece aşağı doğru bakacak ve tüm hücreleri süspansiyona sokmak için hafifçe vurun. Ardından, kabı dolum portu ile dibe doğru kendi tarafına çevirin ve etkili aspirasyon için hücreleri dolum portuna doğru teşvik etmek için kabı tekrar vurun.
- Her gemiyi ayrı ayrı tutun. Şırıngaları iki porttan sökün ve biyolojik tehlike atıklarına atın. Şırınga portlarındaki tapaları açın.
- Dolum portu kapağını dikkatlice çıkarın ve steril 10 mL serolojik pipet kullanarak içeriği çizin ve kabı boşaltılırken eğin. "Flask", "1G" ve "SMG" gruplarının içeriğini ayrı ayrı etiketlenmiş 15 mL konik tüplere dağıtın.
- Her tüpü kapatın ve düzgün bir şekilde karıştırıldıklarından emin olmak için birkaç kez yavaşça ters çevirin. Sonraki deneysel tahlillerde kullanıma hazırlanmak için elde edilen hücre kültürünün konsantrasyonunu ve canlılığını belirlemek için tercih edilen yöntemi kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu kültürleme yöntemi, 1) hücrelerin çoğalması kontrol grupları (ve ideal olarak tüm deney grupları) arasında yaklaşık olarak tutarlıysa, 2) tohumlama yoğunluğu, tedavinin uzunluğu ve hücre tipinin / hattının iki katına çıkma süresi göz önüne alındığında çoğalma uygunsa ve 3) hasat edilen hücrelerin yaşayabilirliği% 85 veya daha yüksekse başarılı kabul edilir (Tablo 1 ). İdeal olarak, elde edilen hücreler, özellikle sonraki deneylerde ve tahlillerde kullanılmak üzere standart hücre kültüründe olduğu kadar sağlıklı olmalıdır (yani, canlılık% 85 veya daha yüksek). Bu kültürleme yöntemi, eğer tersi doğruysa, sonuçta ortaya çıkan hücrelerin öldüğü, kontrol grupları arasında proliferasyonda önemli ölçüde farklılık gösterdiği veya % 70 veya daha düşük bir oranda optimal olmayan canlılığa sahip olduğu durumlarda başarısız olarak kabul edilir (Tablo 1). SMG tedavi grubundaki proliferasyon, SMG tedavisinin hücresel fizyolojiyi nasıl etkilediğine bağlı olarak kontrollere kıyasla farklılık gösterebilir veya olmayabilir. Bununla birlikte, bu bugüne kadar bir sorun olmamıştır ve hücre proliferasyonu kontrol ve tedavi grupları arasında yaklaşık olarak eşittir (Tablo 1). Daha önce de belirtildiği gibi, bu parametreler aşağı akış tahlillerinin ve deneylerinin başarısı için önemlidir ve iki kontrol grubundan elde edilen hücreler nispeten benzer şekilde performans göstermelidir.
Şekil 1: Çalışma sırasında simüle edilmiş mikro yerçekimi (SMG) kabı içinde kültürlenen hücrelerin lokalize yörünge yolunun şematik diyagramı. Burada tarif edilen RWV 2D klinostat, zaman ortalamalı yerçekimi vektörü nullification 5,6,8,9 prensibi üzerinde çalışır, bu sayede yerçekimi vektörü, hücre kültürünün yatay bir eksen üzerinde dönmesiyle randomize edilir. Bu, kültür kabının dönme hızını hücrelerin çökeltme hızıyla eşleştirerek elde edilir. İlk hızlanma aşamasından sonra, kültür kabındaki ortam zamanla "katı vücut rotasyonuna" ulaşır. Bu yatay rotasyon aynı zamanda hücre kültürü damarında laminer akışı indükler. Bu, laminer akışla hücreler üzerinde indüklenen kayma stresinin türbülanslı akıştan çok daha az olduğu göz önüne alındığında, "düşük kesme" ortamı yaratır. Bununla birlikte, klinostatın mükemmel bir sistem olmadığı göz önüne alındığında, hücreler üzerinde minimum kayma stresi yaratan bazı küçük, laminer sıvı hareketleri vardır. Bu nedenle, medyada asılı kalan hücreler, dönme sırasında bu akış tarafından sürüklenir. Yatay dönme sırasında, yerçekimi vektörü hücrelere etki eder ve onları burada görselleştirilen salınımlı bir yörüngeye getirir. Kültür kabı yatay bir eksen üzerinde dönerken, hücrelerin deneyimlediği yerçekimi vektörü de döner. Zamanla, bu dönen yerçekimi vektörü sıfıra yaklaşmak için ortalamaya ulaşır; Bu fenomene "zaman ortalamalı yerçekimi vektörü nullifikasyonu" denir ve SMG 5,6,8,9 durumunu indükler. Bu Şekil Castro ve ark., 201120'den değiştirilmiştir. BioRender.com ile oluşturuldu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: 10 mL yüksek en-boy oranlı kap (HARV). (A) Ana dolum portunu ve iki şırınga portunu gösteren HARV'nin kuşbakışı görünümü. (B) HARV'yi döner tabana ve oksijenasyon membranına bağlamak için vidalı portu gösteren HARV'nin arkası. (C) Açık şırınga portlarını gösteren HARV'nin yandan görünümü (kapaklı). (D) Kapalı şırınga portlarını gösteren HARV'nin yandan görünümü (kapaklı). (E) Takılı iki adet 3 mL şırıngayı gösteren HARV'nin yandan görünümü; Sol şırınga hücre kültürü ile doldurulur ve sağ şırınga boştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: HARV'daki kabarcıklar . (A) HARV'ın kuş bakışı görünümü, hücre kültüründen elimine edilecek kabarcıkları gösterir. (B) HARV'ın aynı kabarcıkları gösteren yandan görünümü. Kabarcıkların boyut olarak nasıl değiştiğine dikkat edin; mikro kabarcıklar da çıkarılmalıdır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 4: RWV cihazının dönen tabanı ve güç kaynağı . (A) Dönen tabanın önden görünümü, dört adede kadar kültür kabını barındırabilen dört döner mandalı gösterir. (B) Tabanı ve güç kaynağını birbirine bağlayan şerit kablonun (resimde gösterilmemiş) girişini gösteren, dönen tabanın arkadan görünümü. (C) İnkübatörün üstünde tutulan güç kaynağının önden görünümü. Soldaki açma/kapama düğmesine ve sağdaki rpm ayar kadranına dikkat edin. Güç kaynağı en yakın prize (genellikle inkübatörün arkasında) takılır ve şerit kablonun dönen tabana bağlanması için bir giriş içerir. Güç kaynağı inkübatörün dışında kalır. Taban, çalışma sırasında inkübatörün içine (37 ° C,% 5 CO2) yerleştirilir ve şerit kablo inkübatör kapısından beslenir ve güç kaynağına bağlanır. Şerit kablo, inkübatör contasına müdahale etmez. Döner taban kullanılmadığında, inkübatörün dışında tutulmalı, bir laboratuvar tezgahında veya rafta güvenli bir şekilde saklanmalıdır. Kullanılan ticari cihazın ayrıntıları için Malzeme Tablosuna bakın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| # | Başlangıç Canlılığı | Tohumlama Yoğunluğu hücreleri/mL | Son Canlılık (F) | Son Canlılık (1G) | Son Canlılık (SMG) | Uç Conc (F) hücreleri/mL | Uç Conc (1G) hücreleri/mL | Uç Conc (SMG) hücreleri/mL | Notlar | |||||
| Optimal olmayan başlangıç canlılığı ve tohumlama yoğunluğu (olumsuz sonuç) | 1 | 79% | 0,2 x 106 | 67% | 60% | 60% | 0,10 x 106 | 0,075 x 106 | 0,071 x 106 | Düşük tohumlama yoğunluğu ve yetersiz başlangıç canlılığı, tedavi süresi boyunca hücre ölümüne yol açtı | ||||
| 2 | 73% | 0,2 x 106 | 43% | 63% | 70% | 0,071 x 106 | 0,081 x 106 | 0,085 x 106 | ||||||
| Optimum başlangıç canlılığı ve tohumlama yoğunluğu (olumlu sonuç) | 3 | 93% | 0,4 x 106 | 93% | 93% | 96% | 1.2 x 106 | 1.1 x 106 | 1,5 x 106 | Uygun tohumlama yoğunluğu ve optimum başlangıç canlılığı, tedavi boyunca sağlıklı hücre büyümesine ve canlılığına yol açtı | ||||
| 4 | 92% | 0,4 x 106 | 92% | 92% | 94% | 0,81 x 106 | 0,80 x 106 | 0,70 x 106 | ||||||
Tablo 1: Başarısız ve başarılı simüle edilmiş mikrogravite (SMG) tedavilerini gösteren karşılaştırma tablosu. NK92 başlangıç canlılığı ve tohumlama yoğunlukları,% 5 CO2 ile desteklenmiş 37 ° C'lik bir hücre kültürü inkübatöründe 72 saatlik bir SMG işleminden sonra ortaya çıkan son canlılık ve son konsantrasyonlarla karşılaştırıldı. İki olumsuz sonuç örneği ve iki olumlu sonuç örneği karşılaştırıldı. Karşılaştırma için, kullanılan NK92 hücre hattının optimal konsantrasyon aralığının 0.3 x 10 6 hücre / mL ile 1.2 x 106 hücre / mL arasında olduğunu ve yaklaşık 2-3 günlük bir iki katına çıkma süresi olduğunu unutmayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İnsanlık Ay ve Mars'a daha uzun uzay görevlerine hazırlanırken, astronotlardaki ciddi sağlık risklerini azaltmak için daha fazla araştırma yapılması gerekiyor. İnsan fizyolojisini etkileyen uzay ortamının önemli bir yönü mikro yerçekimidir. Burada, ticari olarak temin edilebilen bir döner hücre kültürü sistemi kullanılarak lenfositleri SMG'ye maruz bırakmak için bir hücre kültürü yöntemi tanımlanmıştır.
Bu protokol, kullanılan hücre türüne veya satıra bağlı olarak en iyi duruma getirilmesi gerekebilecek birkaç kritik adım içerir. Bunlar arasında 1) hücrelerin SMG tedavisinin iki katına çıkma süresine ve uzunluğuna bağlı olarak uygun bir tohumlama yoğunluğu seçilmesi ve 2) optimal bir tedavi uzunluğunun, dönme hızının ve uygun kontrollerin belirlenmesi yer almaktadır. İncelenen hücre tipi veya çizgisi için uygun hücre konsantrasyonlarının orta aralığında olan bir tohumlama yoğunluğu seçmek yeterli olmalıdır. Bununla birlikte, çok düşük bir tohumlama yoğunluğu seçmek, düşük hücre çoğalmasına ve canlılığına yol açabilir (Tablo 1) ve çok yüksek bir yoğunluk seçmek, erken besin tükenmesine ve düşük hücre canlılığına yol açabilir. Seçilen tohumlama yoğunluğu aynı zamanda incelenen hücrelerin iki katına çıkma süresine de bağlıdır; Daha kısa bir iki katına çıkma süresine sahip hücreler daha düşük bir yoğunlukta tohumlanabilir ve daha uzun bir iki katına çıkma süresine sahip olanların daha yüksek bir yoğunlukta tohumlanması gerekebilir. Tohumlama yoğunluğu ve tedavinin uzunluğu, sonraki deneysel tahlilleri tamamlamak için kaç hücreye ihtiyaç duyulduğuna da bağlıdır. Deneyimlere göre, 10 mL kaplarda 0.4-0.5 x 10 6 hücre / mL'de yüksek oranda canlı (% 90 +) NK92 hücrelerinin tohumlanması (yani, deney grubu başına 4-5 milyon hücre; hücre hattı için optimal aralık = 0.3 x 10 6-1.2 x 106 hücre / mL, iki katına çıkma süresi = 2-3 gün) ve bunları 72 saat boyunca tedavi etmek kabaca 8-15 milyon hücre vermiştir (Tablo 1). Bu nedenle, 10 mL damarlar hem fonksiyonel tahliller (3 x 10 6 hücre) hem de qPCR (1 x 10 6 hücre) ve batı lekesi (2 x 10 6-6 x 10 6 hücre) için hücre toplamak için uygundur. Süpernatantlar ayrıca salgı bileşenlerinin analizi için de toplanabilir. Bununla birlikte, 50 mL'lik kaplar da mevcuttur ve daha fazla hücre verimi gerektiğinde kullanılabilir. 50 mL'lik kaplar kullanıldığında, daha büyük şırıngaların da kullanılması gerekir.
Uygun bir tedavi uzunluğunun belirlenmesi, kullanılan hücre tipine / hattına da bağlı olacaktır. Daha önceki çalışmalar varsa, başlamak için uygun bir tedavi uzunluğu seçmek için bunlara başvurulmalıdır. Birkaç çalışma, NK hücrelerini kültürlemek için RWV cihazlarını kullanmıştır ve burada17,18,19'a atıfta bulunulmuştur. Oradan, tedavi sonuçları veya hücrelerin ne kadar iyi çoğaldığı ve canlılıkları ve sonraki deneysel tahlillerdeki performansları incelenmelidir. Hücre kültürünü damarlardan bir tüpe çıkararak, santrifüj ederek ve daha sonra hücreleri 10 mL sıcak, taze tam kültür ortamında yeniden askıya alarak, damarlara yerleştirerek ve rotasyonu yeniden başlatarak tedavi süresini 72 saatten fazla uzatmak mümkün olabilir. Bununla birlikte, bu, santrifüjleme yoluyla hipergraviteye maruz kalma nedeniyle karışıklıklara neden olabilir ve hücrelerin optimal konsantrasyon aralıklarında tutulmasını sağlamak için hücrelerin bölünmesi / seyreltilmesi gerekebilir. Herhangi bir uyarıcı molekül (örneğin, LPS, sitokinler, vb.) kullanılacaksa, SMG tedavisini kurmadan önce bunların tam medya tarifine uygun bir konsantrasyonda eklenmesi önerilir.
Uygun bir dönüş hızı (rpm) ayarlamak, simüle edilmiş mikro yerçekimi tedavisini sürdürmek için de anahtardır. Şirket, lenfositleri kültüre alırken 8 ila 10 rpm arasında bir dönme hızı ile başlamanızı önerir. Deneyimlere göre, 11 rpm'lik bir hız, NK92 hücrelerinin süspansiyonda tutulmasını sağlamak için iyi çalıştı ve geçmiş bir NK hücre çalışmasındakullanıldı 17. Kullanılan hücre tipinin / hattının büyüme modellerine bağlı olarak, hücre kümelenmesini hesaba katmak için dönme hızının arttırılması gerekebilir. Bu, artan kütle nedeniyle hücrelerin çökelmesinin artmasına neden olacaktır. Optimal bir SMG tedavisi için, kültür damarının dönme hızı, hücrelerin çökeltme hızınauyacak şekilde ayarlanmalıdır 5,6,8,9. Başka bir deyişle, hücreler veya hücre kümeleri ortamdan düşerken görülmemeli ve nispeten sabit kalmalıdır.
Bu bağlamda, standart bir T25 kültür şişesinde ("Flask") yetiştirilen hücreler ile özel HARV'de yetiştirilen ancak SMG'ye tabi tutulmayan (yani, sadece inkübatöre yerleştirilen; "1G"). İdeal olarak, iki negatif kontrol arasındaki aşağı akış deneysel tahlillerindeki hücre performansı ve sonuçları karşılaştırılabilir olmalıdır. Herhangi bir tutarsızlık not edilmelidir. Çoğu tahlil için, en iyi karşılaştırma muhtemelen "1G" kontrolü ve SMG tedavisi arasındadır; Bununla birlikte, hem "Flask" hem de "1G" kontrollerini dahil etmek, yeterli karşılaştırma ve ilk optimizasyon için yararlı olabilir.
Bu protokolün başlıca sınırlamaları arasında 1) hücre kültürü sırasında kabarcık oluşumu, 2) SMG'nin kapsamı ve 3) olası tedavi süresi sayılabilir. SMG tedavisi boyunca kabarcık oluşumunu izlemek çok önemlidir. Küçük mikro kabarcıklar bile birikebilir, büyüyebilir ve son derece yıkıcı daha büyük kabarcıkların oluşumuna yol açabilir. Bu daha büyük kabarcıklar, kültür kabı içindeki düşük parçalayıcı akışkan dinamiklerini keser ve sıvı akışı kabarcık21'in etrafında saptıkça türbülansın artmasına neden olur. Sonuçta, bu SMG durumunu tamamen bozar. Bu fenomen uzun uzadıya tartışılmış ve Phelan ve ark.21 tarafından görselleştirilmiştir. Ek olarak, bu cihazın ISS6'da yaşandığı gibi SMG ürettiğini ve gerçek mikro yerçekimi üretmediğini akılda tutmak önemlidir. Bununla birlikte, çalışmalar, bu cihaz tarafından üretilen SMG'nin, ISS1,5,6 üzerinde yapılan çalışmalardan elde edilen gerçek mikro yerçekiminin etkilerine kıyasla benzer etkilerini göstermiştir.
Hücre kültürünü SMG'ye maruz bırakmak için alternatif yöntemler mevcuttur. Bunlar arasında 3D klinostatların veya Rastgele Konumlandırma Makinelerinin (RPM) kullanımı ve diyamanyetik kaldırma bulunur. 3D klinostatlar hücre kültürünü iki dikey eksen üzerinde aynı hızda döndürürken, RPM'ler iki dikey eksen üzerinde döner, böylece dönüşün hem hızı hem de yönü rastgele 5,6 olur. Bu nedenle, 2D klinostatlar veya RWV cihazlarıyla karşılaştırıldığında, RPM'ler daha karmaşıktır ve bu da çeşitli avantajlar ve dezavantajlar sunar. İlk olarak, bir RPM'de elde edilebilecek mikro yerçekimi derecesi, Ay'da (0,16 g) ve Mars'ta (0,33 g)6 yaşananlar gibi kısmi yerçekimini simüle etmek için modüle edilebilir. Bununla birlikte, rastgele dönme yönlerinin ve hızlarının ek karmaşıklığı, özellikle kültür kabının dış alanlarına doğru sarsıntılı hareket ve hızlandırıcı kuvvetler getirebilir ve potansiyel olarak verilerde karışıklıklara yol açabilir. Diamanyetik levitasyon, yerçekimine karşı koymanın bir yolu olarak, biyolojik numunelerdeki suyun ağırlığına karşı koymak için numuneleri güçlü itici manyetik alanlara maruz bırakır. Bununla birlikte, bunu yapmak için üretilen güçlü manyetik alan da hücreleri olumsuz yönde etkileyebilir, bu nedenle verilere karışıklıklar getirebilir 5,6. Bu yöntemler başka bir yerde daha ayrıntılı olarak tartışılmıştır 5,6.
Sonuç olarak, burada tartışılan ticari olarak temin edilebilen döner hücre kültürü sistemi, SMG'nin lenfositler üzerindeki etkilerini incelemek isteyen bilim adamları için nispeten kullanımı kolay, erişilebilir bir platformdur. Bu hücre kültürü yönteminde sınırlamalar olsa da, simüle edilmiş mikrogravitede lenfositleri ve potansiyel olarak diğer süspansiyon hücre kültürlerini kültürlemek için uygun bir seçenek olmaya devam etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma Kanada Uzay Ajansı (CSA), araştırma hibesi (17ILSRA3, İmmüno Profil) tarafından desteklenmektedir. Yazarlar, Dr. Roxanne Fournier (Toronto Üniversitesi), Dr. Randal Gregg (Lincoln Memorial Üniversitesi) ve Preteesh Mylabathula'ya (Arizona Üniversitesi) bu protokolün ilk sorun giderme konusundaki yardımları için teşekkür etmek ve teşekkür etmek ister.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL) | Synthecon | D-410 | Gamma sterilized culture vessels (4/box) |
| Luer-Lok tip syringes (3 mL) | BD | 309657 | For attaching to the 10 mL HARVs |
| NK92 Cell-line | ATCC | CRL-2407 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4D | Rotating wall vessel device; 2D clinostat |
| Sarsedt 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-220 | |
| Sarsedt 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-218 | |
| Sarsedt sterile serological pipettes | Fisher Scientific | 86.1254.001 | |
| T25 suspension culture flasks | Sarsedt | 83.3910.502 | For flask control |
References
- ElGindi, M., et al. May the force be with you (or not): the immune system under microgravity. Cells. 10 (8), 1941 (2021).
- Choukèr, A., Ullrich, O. The Immune System in Space: Are we Prepared. , Springer International Publishing. Cham. (2016).
- Crucian, B. E., et al. Immune system dysregulation during spaceflight: potential countermeasures for deep space exploration missions. Frontiers in Immunology. 9, 1437 (2018).
- Crucian, B. E., et al. Countermeasures-based improvements in stress, immune system dysregulation and latent herpesvirus reactivation onboard the International Space Station - relevance for deep space missions and terrestrial medicine. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 115, 68-76 (2020).
- Herranz, R., et al. Ground-based facilities for simulation of microgravity: organism-specific recommendations for their use, and recommended terminology. Astrobiology. 13 (1), 1-17 (2013).
- Ferranti, F., Del Bianco, M., Pacelli, C. Advantages and limitations of current microgravity platforms for space biology research. Applied Sciences. 11 (1), 68 (2020).
- Murphy, K., Weaver, C. Janeway's Immunobiology 9th Edition. , Garland Science/Taylor & Francis Group LLC. New York, NY. (2016).
- Dedolph, R. R., Dipert, M. H. The physical basis of gravity stimulus nullification by clinostat rotation. Plant Physiology. 47 (6), 756-764 (1971).
- Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), 12-25 (2001).
- Crabbé, A. Transcriptional and proteomic responses of Pseudomonas aeruginosa PAO1 to spaceflight conditions involve Hfq regulation and reveal a role for oxygen. Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1221-1230 (2011).
- Ulbrich, C., et al. The impact of simulated and real microgravity on bone cells and mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2014, 1-15 (2014).
- Martinez, E. M., Yoshida, M. C., Candelario, T. L. T., Hughes-Fulford, M. Spaceflight and simulated microgravity cause a significant reduction of key gene expression in early T-cell activation. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), 480-488 (2015).
- Jong, J., Maki, G., Klingemann, H. Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).
- Williams, B. A., et al. A phase I trial of NK-92 cells for refractory hematological malignancies relapsing after autologous hematopoietic cell. Oncotarget. 8 (51), 89256-89268 (2017).
- Cryopreservation of mammalian cell lines video protocol. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol (2022).
- Counting cells using a hemocytometer. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2022).
- Mylabathula, P. L., et al. Simulated microgravity disarms human NK-cells and inhibits anti-tumor cytotoxicity in vitro. Acta Astronautica. 174, 32-40 (2020).
- Li, Q., et al. Effects of simulated microgravity on primary human NK cells. Astrobiology. 13 (8), 703-714 (2013).
- Shao, D., et al. Mechanisms of the effect of simulated microgravity on the cytotoxicity of NK cells following the DNA methylation of NKG2D and the expression of DAP10. Microgravity Science and Technology. 33 (1), 6 (2021).
- Castro, S. L., Nelman-Gonzalez, M., Nickerson, C. A., Ott, C. M. Induction of attachment-independent biofilm formation and repression of hfq expression by low-fluid-shear culture of Staphylococcus aureus. Applied and Environmental Microbiology. 77 (18), 6368-6378 (2011).
- Phelan, M. A., Gianforcaro, A. L., Gerstenhaber, J. A., Lelkes, P. I. An air bubble-isolating rotating wall vessel bioreactor for improved spheroid/organoid formation. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (8), 479-488 (2019).
