Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Het kweken van lymfocyten in gesimuleerde microzwaartekracht met behulp van een roterend celkweeksysteem

Published: August 25, 2022 doi: 10.3791/63296
Automatic Translation
1,2, 1,2,4, 1,3
1Laboratory Medicine and Pathobiology, Temerty Faculty of Medicine, University of Toronto, 2Krembil Research Institute, Toronto Western Hospital, University Health Network, 3Pathology and Lab Medicine, Hematopathology, Mount Sinai Hospital, Sinai Health Systems, 4Medical Oncology and Hematology, Princess Margaret Cancer Centre

Summary

Dit is een stapsgewijze handleiding voor het gebruik van een in de handel verkrijgbaar roterend celkweeksysteem om lymfocyten te kweken in gesimuleerde microzwaartekracht met behulp van gespecialiseerde wegwerpkweekvaten. Deze kweekmethode kan worden toegepast op elke celcultuur van het suspensietype.

Abstract

Gezien de huidige beperkingen van het uitvoeren van biologisch onderzoek in de ruimte, bestaan er een paar opties voor het onderwerpen van celcultuur aan gesimuleerde microzwaartekracht (SMG) op aarde. Deze opties variëren in hun methoden, principes en geschiktheid voor gebruik met suspensiecelcultuur. Hier wordt een celkweekmethode beschreven voor het onderwerpen van lymfocyten aan gesimuleerde microzwaartekracht met behulp van een in de handel verkrijgbaar roterend celkweeksysteem, ook bekend als een 2D-clinostaat of een rotating wall vessel (RWV) -apparaat. Deze celkweekmethode maakt gebruik van het principe van tijdgemiddelde zwaartekrachtvector-nullificatie om microzwaartekracht te simuleren door de cellen op een horizontale as te roteren. De cellen die in dit systeem worden gekweekt, kunnen worden geoogst en gebruikt in veel verschillende experimentele testen om de effecten van gesimuleerde microzwaartekracht op de cellulaire functie en fysiologie te beoordelen. De kweektechniek kan enigszins variëren, afhankelijk van het celtype of de lijn die wordt gebruikt, maar de hier beschreven methode kan worden toegepast op elke celcultuur van het suspensietype.

Introduction

Van ruimtevaart is aangetoond dat het vele aspecten van de menselijke fysiologie beïnvloedt, waaronder het immuunsysteem. Veel studies hebben bewijs aangetoond van immuunontregeling als gevolg van ruimtevluchten in vivo en blootstelling aan gesimuleerde microzwaartekracht (SMG) in vitro 1,2,3,4. Een belangrijk aspect van de ruimteomgeving dat de menselijke fysiologie beïnvloedt, is microzwaartekracht. Microzwaartekracht verwijst naar de "gewichtloosheid" die wordt ervaren als gevolg van lage zwaartekrachten in de ruimteomgeving5. Terwijl de mensheid zich voorbereidt op langere ruimtemissies naar de maan en Mars, moet er meer onderzoek worden gedaan om ernstige gezondheidsrisico's bij astronauten te beperken.

Echte microzwaartekrachtcondities voor wetenschappelijk onderzoek kunnen worden bereikt in de ruimte aan boord van het International Space Station (ISS) of in nanosatellieten die in een baan om de aarde worden gelanceerd; Deze opties kunnen echter ongelooflijk duur en complex zijn om te orkestreren. Gezien de huidige beperkingen van het uitvoeren van biologisch onderzoek in de ruimte, bestaan er verschillende opties voor het induceren van echte microzwaartekracht en SMG op aarde. Er bestaan grootschalige operaties die korte perioden van echte microzwaartekracht op aarde kunnen produceren, waaronder valtorens, parabolische vluchten en klinkende raketten. Deze methoden zijn echter niet overdreven geschikt voor het bestuderen van de effecten van microzwaartekracht op biologische systemen, grotendeels vanwege hun korte perioden van microzwaartekrachtbehandeling (d.w.z. seconden tot 20 minuten). Deze methoden worden elders nader besproken 5,6. Opties die geschikt zijn voor biologische celkweek zijn kleinschalige apparaten zoals 2D-clinostaten of rwv-apparaten (rotating wall vat) en 3D-clinostaten of random positioning machines (RPM). Deze apparaten kunnen worden opgesteld in celkweekincubatoren die op 37 °C en 5% CO2 worden gehouden, en ze roteren de celcultuur op een horizontale as (2D) of op twee loodrechte assen (3D)5. Het is echter belangrijk om te benadrukken dat deze kweekmethoden SMG produceren in tegenstelling tot echte microzwaartekracht, die het meest haalbaar is in de ruimte voor biologische onderzoekscontexten.

Het doel van dit artikel is om de stappen te schetsen voor het onderwerpen van lymfocyten aan SMG met behulp van een in de handel verkrijgbaar RWV-apparaat (Table of Materials), dat onder de 2D-clinostatclassificatie valt. Hoewel er een algemeen protocol beschikbaar is van de fabrikant voor het gebruik van dit apparaat, is het huidige artikel bedoeld om de stappen voor probleemoplossing en optimalisatie in meer detail te behandelen. Dit artikel behandelt ook de theorie achter hoe dit apparaat werkt om SMG te produceren in suspensiecelcultuur, met name met lymfocyten. In deze context verwijst suspensiecelcultuur naar cellen die vrij groeien in aangevulde kweekmedia, zonder zich te hechten aan extra steigers. Veel celtypen worden gekweekt in suspensiecelcultuur, waaronder lymfocyten. Lymfocyten zijn cellen van het immuunsysteem, waaronder T-, B- en Natural Killer (NK) -cellen, die zich in lymfoïde organen en de bloedbaan bevinden7.

De hier beschreven RWV 2D-clinostaat werkt volgens het principe van tijdgemiddelde zwaartekrachtvector-nullificatie 5,6,8,9, waarbij de zwaartekrachtvector wordt gerandomiseerd door rotatie van de celcultuur op een horizontale as. Dit wordt bereikt door de rotatiesnelheid van het kweekvat af te stemmen op de sedimentatiesnelheid van de cellen. Zolang de rotatiesnelheid van het kweekvat goed is afgestemd op de sedimentatiesnelheid van de cellen, worden de cellen in vrije val gehouden en kunnen ze niet bezinken, zoals ervaren in de ruimteomgeving. Na een eerste versnellingsfase bereiken de media in het kweekvat uiteindelijk na verloop van tijd "vaste lichaamsrotatie". Deze horizontale rotatie induceert ook laminaire stroming in het celkweekvat. Dit creëert een "low shear" -omgeving, aangezien de schuifspanning die door laminaire stroming op de cellen wordt veroorzaakt, veel minder is dan die van turbulente stroming. Aangezien de clinostaat echter geen perfect systeem is, zijn er enkele kleine, laminaire vloeistofbewegingen geïntroduceerd, die minimale schuifspanning op de cellen veroorzaken. Als zodanig worden de cellen die in de media zweven tijdens de rotatie door deze stroom meegesleurd. Tijdens horizontale rotatie werkt de zwaartekrachtvector op de cellen en brengt ze in een oscillerende baan, zoals gevisualiseerd in figuur 1. Een andere kleine bron van schuifspanning wordt veroorzaakt doordat de cellen door de media "vallen", waardoor laminaire stroming rond de cellen ontstaat. Terwijl het kweekvat om een horizontale as draait, roteert ook de zwaartekrachtvector die de cellen ervaren. Na verloop van tijd nadert deze roterende zwaartekrachtvector gemiddeld nul; dit fenomeen wordt tijdgemiddelde zwaartekrachtvector-nullificatie genoemd en induceert een toestand van SMG 5,6,8,9. Dit apparaat is gebruikt om de effecten van SMG op vele soorten cellen te bestuderen, waarvan sommige worden behandeld in referenties10,11,12. Meer voorbeelden zijn te vinden op de website van de fabrikant van het apparaat.

Dit RWV-apparaat maakt gebruik van gespecialiseerde "high aspect ratio vessels" (HARV's) die beschikbaar zijn via de fabrikant van het apparaat. Deze HARV's bevatten elk 10 ml celkweek; er zijn echter ook 50 ml HARV's beschikbaar. 10 ml of 50 ml HARV's kunnen worden gebruikt, afhankelijk van het aantal cellen dat nodig is om eventuele downstream experimentele assays te voltooien, wat verder wordt beschreven in de discussiesectie. De HARV's zijn gemaakt van polycarbonaat en bevatten een siliconen oxygenatiemembraan om gasuitwisseling tijdens celkweek mogelijk te maken. Dit handhaaft de pH van de celmedia en zorgt voor een efficiënte cellulaire ademhaling. Er is een hoofdvulpoort en twee afgedekte spuitpoorten aan de voorkant van het vat (figuur 2A). Na het laden van de celcultuur door de hoofdvulpoort, worden twee spuiten op het vat geladen om te helpen bij het verwijderen van de luchtbel. Bij gebruik van de vaten van 10 ml werken twee spuiten van 3 ml goed. Eén spuit is leeg aan het apparaat bevestigd, met de spuit volledig ingedrukt, en de andere is gevuld met 3 ml celkweek (figuur 2E). Deze worden in combinatie gebruikt om bubbels uit het vat te verwijderen, wat belangrijk is voor het behoud van de SMG-behandeling. Over het algemeen wordt geadviseerd om twee negatieve controles in te stellen, die kunnen worden aangeduid als de "Flask" -controle en de "1G" -controle. De "Kolf"-regeling komt overeen met cellen die worden gekweekt in een standaard T25-suspensiecelkweekkolf. De 1G-controle komt overeen met cellen die worden gekweekt in het gespecialiseerde kweekvat van 10 ml, dat eenvoudig in de couveuse wordt geplaatst (d.w.z. zonder te worden onderworpen aan de SMG-behandeling). Zie het gedeelte Discussie voor meer informatie over besturingselementen.

De hier beschreven methode is geschikt voor elke onderzoeker die de effecten van SMG op lymfocyten wil bestuderen, met een specifieke focus op NK-cellen met behulp van de NK92-cellijn13. De resultaten van deze studies kunnen ons helpen de nadelige effecten van ruimtevaart op het menselijk immuunsysteem beter te begrijpen en te verzachten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OPMERKING: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een steriele biologische veiligheidskast.

1. Voorbereiding van vaten voor celkweek

  1. Haal de kweekvaten uit de plastic verpakking. Label elk vat op de rand op basis van welk celtype/lijn wordt gebruikt, of het nu gaat om de controle (1G) of behandeling (SMG) en alle andere relevante informatie.
  2. Stabiliseer het vat en open de vulpoort voorzichtig, zonder de doppen/O-ring van de vulpoort aan te raken. Plaats de dop op een ethanolpad, met de pen/O-ring naar boven gericht, terwijl het vat wordt gevuld. Verwijder de doppen niet van de spuitpoorten.
    OPMERKING: Als de pen /O-ring per ongeluk wordt aangeraakt, spuit u de doppen in met 70% ethanol en laat u deze enkele ogenblikken (naar boven gericht) zitten terwijl u het vat vult. Wanneer u klaar bent om de vulpoort weer te sluiten, pakt u de dop op met een vers papieren doekje om de dop grondig te drogen voordat u deze weer op het vat plaatst.
  3. Laad het vat met 10 ml van het juiste volledige medium voor de celkweek met behulp van een steriele serologische pipet en plaats de dop voorzichtig terug op de vulpoort.
    OPMERKING: Hier werd de NK92 NK-cellijn gebruikt, die werd gekweekt in GM1-media, zoals eerder gevalideerd in een klinisch onderzoek met NK92-cellen als celtherapie14. De gebruikte kweekmedia zijn afhankelijk van de cellijn of het celtype dat wordt gekweekt. Kijk op de website van de leverancier voor het juiste mediarecept voor de gebruikte cellijn of celtype.
  4. Zorg ervoor dat de doppen van de spuitpoort en de vulpoort goed gesloten zijn en plaats de gevulde vaten in een 37 °C, 5% CO 2-incubator terwijl u de volgende stappen uitvoert om de vaten voor te bereiden op celkweek.
    OPMERKING: Deze primingstap helpt om de vorming van grote bubbels te minimaliseren om het uitstoten van bubbels later in stap 6 gemakkelijker te maken.

2. Voorbereiding van stamcelkweek voor de SMG-behandelingsopstelling

  1. Wanneer ze niet in gebruik zijn, bewaar de cellen van belang bij een temperatuur lager dan -130 °C of, idealiter, in een vloeibare stikstofdampfase.
  2. Ten minste 1 week voordat u de geplande behandeling opzet, ontdooit u de cellen en kweekt u ze met behulp van het juiste celkweekmediarecept op de website van de leverancier. Plan hoeveel cellen nodig zijn om de behandeling op te zetten (details hieronder in de volgende stappen) en zorg ervoor dat de culturen vroeg genoeg worden gestart om voldoende proliferatie en aanpassing aan de cultuur mogelijk te maken.
  3. Bewaar de celcultuur in een 37 °C, 5% CO2 incubator. Verdere details over de standaardcelkweekpraktijk worden elders behandeld15.
  4. Bepaal op de dag van de geplande SMG-behandelingsopstelling de startconcentratie en levensvatbaarheid van de initiële celkweek.
    1. Gebruik de voorkeursmethode voor het bepalen van de concentratie van de initiële celcultuur (bijv. Hemocytometer, ViCell, flowcytometrie, enz.). Let op de levensvatbare celconcentratie (cellen per ml) en levensvatbaarheid (%) van de cellen, zodat de levensvatbaarheid idealiter groter is dan 85%. Een protocol voor het gebruik van een hemocytometer is elders te vinden16.
  5. Bepaal de juiste celzaaidichtheid/concentratie van de celcultuur voor SMG-behandeling door rekening te houden met het optimale celconcentratiebereik van het specifieke celtype/de specifieke cellijn, hun verdubbelingstijd en de duur van de SMG-behandeling. Raadpleeg de sectie Discussie voor verdere uitwerking.
    OPMERKING: Uit ervaring is het optimale concentratiebereik voor NK92-cellen tussen 0,3 x 106- 1,2 x 106 cellen / ml. Over het algemeen hebben deze cellen een verdubbelingstijd van 48-72 uur en worden ze als zodanig om de 2-3 dagen gevoerd. Aangezien de behandelingsduur 72 uur was, werden de cellen aan de onderkant van hun optimale bereik gezaaid bij 0,4-0,5 x 106 cellen / ml. De leverancier beveelt deze zaaidichtheid ook aan bij het starten van de eerste celkweek uit een verse injectieflacon met NK92-cellen.
  6. Bepaal het volume van de stamcelcultuur dat nodig is om de behandeling en de controles op te zetten.
    OPMERKING: Per experimentele groep is 10 ml celkweek nodig. Als er drie experimentele groepen worden opgezet (d.w.z. één behandeling: "SMG" en twee negatieve controles: "Kolf" en "1G"), is nog eens 10 ml celkweek voldoende om in een buis van 15 ml te aliquoteren die wordt gebruikt om de HARV-spuiten te laden. Dit is in totaal 40 ml, wat kan fluctueren afhankelijk van het specifieke experimentele ontwerp.
  7. Bepaal het aantal cellen dat nodig is om de behandeling op te zetten.
    1. Bereken het totale aantal cellen dat nodig is door de gekozen zaaidichtheid (cellen / ml) te vermenigvuldigen met het totale benodigde volume (ml).
      OPMERKING: Uit ervaring met NK92 wordt 40 ml stamcelcultuur bereid zoals hierboven beschreven in een zaaiconcentratie van 0,4-0,5 x 106 cellen/ml. Als zodanig zijn 16-20 x 106 NK92-cellen nodig om de typische behandelingsopstelling te voltooien. Voor de NK92-cellijn is het gebruik van iets meer cellen beter dan iets minder cellen om een hoge levensvatbaarheid tijdens de behandeling te behouden.
  8. Bepaal het volume van de initiële celcultuur om te spinnen.
    1. Aangezien de celconcentratie wordt weergegeven als cellen/ml, deelt u het totale aantal cellen (cellen) dat nodig is voor het experiment door de gemeten beginconcentratie van de celcultuur (cellen/ml).
      OPMERKING: Als er bijvoorbeeld 16 x 10 6 cellen nodig zijn en de startconcentratie van de cultuur 0,8 x 106 cellen / ml is, moet 20 ml van de cultuur worden gesponnen.
  9. Maak de uiteindelijke stamcelcultuur.
    1. Centrifugeer het juiste aantal cellen bij 300 x g gedurende 8 minuten in een conische buis van 50 ml.
    2. Giet het supernatant voorzichtig af in een afvalcontainer en veeg voorzichtig over de buis om de pellet in het kleine overgebleven volume te resuspenderen.
    3. Suspendeerde de cellen in het juiste volume verwarmde (37 °C) volledige media om de cultuur op de gewenste zaaidichtheid te brengen. Dit volume is berekend in stap 2.6.
    4. Sluit de buis van 50 ml stevig af en keer deze een paar keer voorzichtig om om de celsuspensie grondig te mengen.
      OPMERKING: Als er meer dan 50 ml nodig is om het volledige experiment op te zetten, is het het beste om het totale aantal cellen dat nodig is in een conische buis van 50 ml te centrifugeren en dit in de helft van het benodigde volume te resuspenderen. Meng vervolgens goed en maak een 1:2 verdunning in een aparte conische buis van 50 ml. Als bijvoorbeeld 100 ml nodig is bij 0,4 x 10 6 cellen / ml, spin dan 40 x 106 cellen in een buis van 50 ml, resuspenda in 50 ml media, breng 25 ml over naar een andere buis van 50 ml en vul beide vervolgens aan met 25 ml verse media.

3. Laden van vaten met stamcelcultuur

  1. Haal de media-geprimeerde vaten uit de incubator.
  2. Als een "Kolf"-regeling wordt gebruikt, laadt u een T25-suspensiekweekkolf met 10 ml celkweek uit de hierboven bereide voorraad. Voeg ook 10 ml stamcelcultuur toe aan een aparte conische buis van 15 ml, die zal worden gebruikt om de spuiten te laden.
  3. Schroef de doppen van de spuitpoort los om ze uit het vat te verwijderen en zorg ervoor dat de stopkranen zich in de open stand bevinden (figuur 2C).
  4. Stabiliseer het vat en open de vulpoort voorzichtig, zonder de doppen/O-ring van de vulpoort aan te raken. Plaats de dop op een ethanolpad, met de pen/O-ring naar boven gericht, terwijl het vat wordt gevuld. Schroef de doppen voorzichtig los van de spuitpoorten.
  5. Zorg ervoor dat de stopkranen zich in de open stand bevinden (figuur 2C). Giet de media voorzichtig uit het vat in een afvalcontainer, verwijder de media met een serologische pipet of zuig deze op met een steriele glazen Pasteurpipet die aan het vacuümsysteem is bevestigd, zonder het oxygenatiemembraan aan te raken.
  6. Sluit de conische buis van 50 ml die de stamcelcultuur bevat goed af en keer deze een paar keer voorzichtig om om de inhoud grondig te mengen.
  7. Trek 10 ml celkweekmateriaal uit de buis van 50 ml met een verse steriele serologische pipet. Pak het vat op en kantel het zodat de vulpoort naar boven is gericht en doseer vervolgens voorzichtig de celkweekvoorraad in het vat via de vulpoort.
    OPMERKING: Wees voorzichtig en let op het volume zodat de cultuur niet door de spuitpoorten stroomt terwijl u het vat kantelt.
  8. Probeer het vat tot aan de bovenkant van de lip van de vulpoort te vullen zonder te morsen; Kantel het vat terug naar beneden terwijl het wordt gevuld om morsen te voorkomen. Zorg ervoor dat u het oxygenatiemembraan niet aanraakt met de pipet, omdat deze erg kwetsbaar is.
    OPMERKING: Het vulproces van het vat kan enige oefening vergen; Wees geduldig en ga langzaam. Als zich een bellenfilm vormt bij de opening van de vulpoort, zal dit het laden van het schip verstoren. Als dit gebeurt, raak dan voorzichtig op het vat om de verzegeling te verbreken die door de bellenfilm is ontstaan.
  9. Zodra het schip is geladen, plaatst u de dop van de vulpoort voorzichtig terug en zorgt u ervoor dat u de pen / O-ring niet raakt.
  10. Plaats op de spuiten.
    OPMERKING: Er zijn twee spuitpoorten aan de voorkant van het vat (figuur 2A). De ene houdt een lege spuit vast en de andere een spuit vol celkweek (figuur 2E).
    1. Bevestig eerst de lege spuit van 3 ml aan een van de spuitpoorten en zorg ervoor dat de spuit volledig wordt ingedrukt.
      OPMERKING: Pomp de spuiten een paar keer voordat u ze aan het vat bevestigt, omdat ze in het begin een beetje krap zijn. Doe dit in de biologische veiligheidskast om de steriliteit te behouden.
    2. Sluit de conische buis van 15 ml goed af met 10 ml gealiquoted celcultuur en keer deze een paar keer voorzichtig om om de inhoud grondig te mengen.
    3. Dompel vervolgens de tweede spuit van 3 ml voorzichtig half onder in de celkweek en trek wat cultuur op. Om de luchtbel in de bovenkant van de spuit te minimaliseren, doseert u deze volledig terug in de buis en zuigt u vervolgens 3 ml van de cultuur op.
    4. Bevestig de gevulde spuit aan de resterende spuitpoort en ontsmet de spuiten en rond de vulpoort zorgvuldig met een ethanolpad. Krijg geen ethanol op het oxygenatiemembraan. Nu is het vat klaar om van bubbels af te komen.
      OPMERKING: De tweede gevulde spuit voor het tweede vat is moeilijker te laden gezien de diepte van de buis van 15 ml. Het helpt om de buis te kantelen tijdens het vullen van de spuit om de verzegeling tussen de spuit die wordt gevuld en de celkweek te behouden.
    5. Herhaal stap 3.3-3.10 voor de overige vaten. Als er nog iets onvoldoende celcultuur over is in de conische buis van 50 ml voor het laatste vat (bijvoorbeeld 9,5 ml in plaats van 10 ml), haalt u de resterende hoeveelheid terug uit de conische buis van 15 ml die wordt gebruikt om de spuiten te laden.
      OPMERKING: De volgende stappen hoeven niet plaats te vinden in een steriele biologische veiligheidskast, omdat het vat nu een gesloten, steriel systeem is.

4. Bellen uit de vaten verwijderen

OPMERKING: Bubbels zijn onvermijdelijk binnen deze opstelling en moeten consequent worden verwijderd tijdens de behandeling (figuur 3). Raadpleeg het gedeelte Discussie voor meer informatie hierover.

  1. Zorg ervoor dat de stopkranen van de spuitpoort zich in de gesloten positie bevinden (figuur 2D) om de migratie van cellen en bubbels van de spuiten naar de vaten te beperken. Dit is vooral belangrijk later tijdens de behandeling (hieronder besproken). Om de eerste bubbels te verzamelen, draait u het vat ondersteboven en raakt u de zijkant ervan een paar keer.
  2. Draai het vat snel terug naar boven en dan in een lichte hoek naar buiten gericht, zodat de bellen allemaal naar de opwaartse kant van het vat drijven (figuur 3B).
  3. Manoeuvreer de bubbels onder de poort met de lege spuit en kijk hoe ze de poort beginnen binnen te komen. Open beide stopkranen van de spuitpoort (figuur 2C).
  4. Druk voorzichtig op het vat om de bubbels aan te moedigen om omhoog te drijven in de lege spuit. Zuig langzaam de grotere bubbels op met de lege spuit, terwijl u de volle spuit voorzichtig indrukt, om de druk in het vat te behouden, zodat het oxygenatiemembraan niet barst.
    OPMERKING: Grotere bubbels moeten worden opgezogen, terwijl kleine bubbels en microbubbels kunnen worden aangemoedigd om in de spuit te drijven door ze in de spuitpoorten te manoeuvreren en het vat voorzichtig te raken. Na een paar uur behandeling is het zeer belangrijk om de "kruisbesmetting" tussen de cellen in de spuiten en de cellen in het kweekvat te minimaliseren. Dit komt omdat de cellen in de spuiten niet dezelfde hoeveelheid oxygenatie of blootstelling aan SMG ontvangen als de cellen in het vat.
  5. Herhaal stap 4.2-4.4 een paar keer om ervoor te zorgen dat alle bubbels worden verwijderd. Verwijder alle bubbels inclusief microbubbels uit de vaten.
    OPMERKING: De bellen kunnen gemakkelijk worden gezien door het oxygenatiemembraan (achterkant van het vat) wanneer het vat is gericht op een lichtbron (raam, licht, enz.). Kijk bij het uitvoeren van stap 4.2 en 4.3 naar de bellen die vanaf de achterkant van het vat bewegen om de moeilijker te zien bubbels te visualiseren.
  6. Wanneer de bubbels effectief zijn verwijderd, sluit u de stopkranen van de spuitpoort. Houd de spuiten tijdens de behandeling aan om de daaropvolgende bubbel te verwijderen en zorg ervoor dat het volume in beide spuiten ongeveer gelijk is.

5. Het vat aan de roterende basis bevestigen

  1. Veeg het oppervlak van de roterende basis- en lintkabel voorzichtig af met 70% ethanol.
  2. Zorg ervoor dat de meegeleverde lintkabel is aangesloten op de voeding. Plaats de roterende basis in de incubator en bevestig de lintkabel aan de basis. Zorg ervoor dat de voeding in de buurt van maar buiten de incubator wordt gehouden. Figuur 4 toont de roterende basis en voeding voor context.
  3. Bevestig het SMG-behandelingsvat door de vaatdraden op de roterende pen te zetten en de roterende pen op de basis voorzichtig tegen de klok in te draaien. Zorg ervoor dat het vat stevig is bevestigd. Zorg ervoor dat de incubator dicht bij 100% vochtigheid blijft door de waterbak te vullen met voldoende geautoclaveerd, omgekeerde osmose (RO) water.
  4. Kies een geschikte rotatiesnelheid (rpm). Pas de rotatiesnelheid aan om overeen te komen met de sedimentatiesnelheid van de cellen, zodat de cellen helemaal niet "door de media vallen" maar uiteindelijk in een klein baanpad roteren. Dit fenomeen wordt gevisualiseerd als een schematisch diagram in figuur 1.
    OPMERKING: Het bedrijf raadt aan om de rotatie te starten bij 8-10 rpm voor lymfocyten. In dit geval werden NK92-cellen met 11 tpm gedraaid, zoals aangetoond in een eerder artikel17. Afhankelijk van de celgrootte moet het toerental worden verhoogd voor grotere cellen en verlaagd voor kleinere cellen. Hetzelfde patroon is van toepassing als de gebruikte cellen de neiging hebben om samen te klonteren tijdens het kweken. Zie het gedeelte Discussie voor meer informatie hierover.

6. Behandeling

  1. Kies een geschikte behandelingslengte voor de onderzoekstoepassing, die kan afhangen van welke parameters van celfunctie / fysiologie worden getest. Zie het gedeelte Discussie voor meer informatie hierover.
    OPMERKING: In dit geval werden NK92-cellen onderworpen aan een SMG-behandeling van 72 uur, gebaseerd op resultaten van eerdere studies18,19. Bubbels zullen zich onvermijdelijk vormen tijdens de behandeling en moeten worden verwijderd. De rotatie kan kort worden gestopt en opnieuw worden gestart om dit te vergemakkelijken. Zie stap 7.1 voor informatie over het veilig verwijderen van het SMG-vat.
  2. Controleer op de eerste dag van het opzetten van de behandeling om de paar uur op bubbelvorming door stap 4.2-4.6 te herhalen. Controleer na de eerste dag de bloedvaten indien nodig (ten minste eenmaal per dag), herhaal stap 4.2-4.6 tot het einde van de behandeling.

7. Cellen uit de vaten oogsten

  1. Zodra de geplande behandelingslengte is verstreken, stopt u de rotatie en demonteert u het apparaat. Verwijder het SMG-behandelingsvat door het vat voorzichtig stationair te houden terwijl u de roterende pen van het apparaat met de klok mee draait.
  2. Breng de regelkolf, het controlevat 1G en het behandelde SMG-vat in een steriele biologische veiligheidskast.
  3. Neem elk vat (alleen 1G en SMG; niet de kolf) en draai het ondersteboven zodat het naar beneden is gericht en druk het zachtjes aan om alle cellen in suspensie te brengen. Draai vervolgens het vat op zijn kant met de vulpoort naar de bodem en raak het vat opnieuw om de cellen naar de vulpoort te stimuleren voor efficiënte aspiratie.
  4. Behandel elk schip afzonderlijk. Schroef de spuiten los van de twee poorten en gooi ze in het biogevaarlijke afval. Open de stopkranen op de spuitpoorten.
  5. Verwijder voorzichtig de dop van de vulpoort en zuig de inhoud op met behulp van een steriele serologische pipet van 10 ml, waarbij u het vat kantelt terwijl het wordt geleegd. Doseer de inhoud van de groepen "Kolf", "1G" en "SMG" in afzonderlijk gelabelde conische buizen van 15 ml.
  6. Sluit elke buis en keer ze een paar keer voorzichtig om om ervoor te zorgen dat ze goed gemengd zijn. Gebruik de voorkeursmethode voor het bepalen van de concentratie en levensvatbaarheid van de resulterende celcultuur om zich voor te bereiden op gebruik in latere experimentele tests.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Deze kweekmethode wordt als succesvol beschouwd als 1) de proliferatie van de cellen ongeveer consistent is tussen de controlegroepen (en idealiter alle experimentele groepen), 2) de proliferatie geschikt is gezien de zaaidichtheid, de duur van de behandeling en de verdubbelingstijd van het celtype / de lijn, en 3) de levensvatbaarheid van de geoogste cellen 85% of hoger is (tabel 1 ). Idealiter zouden de resulterende cellen net zo gezond moeten zijn als in standaard celcultuur, vooral voor gebruik in latere experimenten en testen (d.w.z. levensvatbaarheid 85% of hoger). Deze kweekmethode wordt als niet succesvol beschouwd als het tegenovergestelde waar is, waarbij de resulterende cellen ofwel afsterven, aanzienlijk verschillen in proliferatie tussen de controlegroepen, of een suboptimale levensvatbaarheid hebben van ongeveer 70% of lager (tabel 1). Proliferatie in de SMG-behandelingsgroep kan al dan niet verschillen in vergelijking met de controles, afhankelijk van hoe de SMG-behandeling de cellulaire fysiologie beïnvloedt. Dit is tot op heden echter geen probleem geweest en de celproliferatie was ongeveer gelijk in de controle- en behandelingsgroepen (tabel 1). Zoals eerder vermeld, zijn deze parameters belangrijk voor het succes van downstream-assays en experimenten, en de resulterende cellen uit de twee controlegroepen zouden relatief vergelijkbaar moeten presteren.

Figure 1
Figuur 1: Schematisch diagram van het gelokaliseerde baanpad van de cellen gekweekt in het gesimuleerde microzwaartekracht (SMG) vat tijdens bedrijf. De hier beschreven RWV 2D-clinostaat werkt volgens het principe van tijdgemiddelde zwaartekrachtvector-nullificatie 5,6,8,9, waarbij de zwaartekrachtvector wordt gerandomiseerd door rotatie van de celcultuur op een horizontale as. Dit wordt bereikt door de rotatiesnelheid van het kweekvat af te stemmen op de sedimentatiesnelheid van de cellen. Na een eerste versnellingsfase bereiken de media in het kweekvat uiteindelijk na verloop van tijd "vaste lichaamsrotatie". Deze horizontale rotatie induceert ook laminaire stroming in het celkweekvat. Dit creëert een "low shear" -omgeving, aangezien de schuifspanning die door laminaire stroming op de cellen wordt veroorzaakt, veel minder is dan die van turbulente stroming. Aangezien de clinostaat echter geen perfect systeem is, zijn er enkele kleine, laminaire vloeistofbewegingen geïntroduceerd, die minimale schuifspanning op de cellen veroorzaken. Als zodanig worden de cellen die in de media zweven tijdens de rotatie door deze stroom meegesleurd. Tijdens horizontale rotatie werkt de zwaartekrachtvector in op de cellen en brengt ze in een oscillerende baan, die hier wordt gevisualiseerd. Terwijl het kweekvat om een horizontale as draait, roteert ook de zwaartekrachtvector die de cellen ervaren. Na verloop van tijd nadert deze roterende zwaartekrachtvector gemiddeld nul; dit fenomeen wordt "time-averaged gravity vector nullification" genoemd en induceert een toestand van SMG 5,6,8,9. Deze figuur is gewijzigd van Castro et al., 201120. Gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: 10 ml vat met hoge beeldverhouding (HARV). (A) Vogelvlucht van de HARV, met de hoofdvulpoort en twee spuitpoorten. (B) Achterkant van de HARV met de schroefpoort voor het aansluiten van de HARV op de roterende basis en het oxygenatiemembraan. (C) Zijaanzicht van de HARV met open spuitpoorten (afgedekt). (D) Zijaanzicht van de HARV met gesloten spuitpoorten (afgedekt). (E) zijaanzicht van de HARV met de twee spuiten van 3 ml bevestigd; De linkerspuit is gevuld met celkweek en de rechter spuit is leeg. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Bellen in de HARV. (A) Vogelvlucht van de HARV, met bubbels die uit de celcultuur moeten worden verwijderd. (B) Zijaanzicht van de HARV, met dezelfde bubbels. Merk op hoe de bubbels variëren in grootte; Microbubbels moeten ook worden verwijderd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Roterende basis en voeding van het RWV-apparaat . (A) Vooraanzicht van de roterende basis, met vier roterende haringen die plaats bieden aan maximaal vier kweekvaten. (B) Achteraanzicht van de roterende basis, met de ingang voor de lintkabel (niet afgebeeld) die de basis en de voeding verbindt. (C) Vooraanzicht van de voeding die bovenop de incubator wordt gehouden. Let op de aan/uit-schakelaar aan de linkerkant en de rpm-instelknop aan de rechterkant. De voeding wordt aangesloten op het dichtstbijzijnde stopcontact (meestal aan de achterkant van de incubator) en bevat een ingang voor de lintkabel om verbinding te maken met de roterende basis. De voeding blijft buiten de couveuse. De basis wordt tijdens bedrijf in de incubator geplaatst (37 °C, 5% CO2) en de lintkabel wordt door de incubatordeur gevoerd en op de voeding aangesloten. De lintkabel interfereert niet met de afdichting van de incubator. Wanneer de roterende basis niet in gebruik is, moet deze buiten de couveuse worden gehouden en veilig worden opgeslagen op een laboratoriumbank of -plank. Raadpleeg de materiaaltabel voor de details van het gebruikte commerciële apparaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

# Levensvatbaarheid starten Zaaidichtheidscellen/ml Einde levensvatbaarheid (F) Einde levensvatbaarheid (1G) Einde levensvatbaarheid (SMG) Einde Conc (F) cellen / ml Einde Conc (1G) cellen/ml End Conc (SMG) cellen / ml Notities
Suboptimale startbaarheid en zaaidichtheid (negatieve uitkomst) 1 79% 0,2 x 106 67% 60% 60% 0,10 x 106 0,075 x 106 0,071 x 106 Lage zaaidichtheid en suboptimale start-levensvatbaarheid leidden tot celdood in de loop van de behandelingsperiode
2 73% 0,2 x 106 43% 63% 70% 0,071 x 106 0,081 x 106 0,085 x 106
Optimale startbaarheid en zaaidichtheid (positief resultaat) 3 93% 0,4 x 106 93% 93% 96% 1,2 x 106 1,1 x 106 1,5 x 106 De juiste zaaidichtheid en optimale start-levensvatbaarheid leidden tot gezonde celgroei en levensvatbaarheid gedurende de behandeling
4 92% 0,4 x 106 92% 92% 94% 0,81 x 106 0,80 x 106 0,70 x 106

Tabel 1: Vergelijkingstabel met onsuccesvolle en succesvolle gesimuleerde microzwaartekracht (SMG) behandelingen. NK92 start-levensvatbaarheid en zaaidichtheden werden vergeleken met de resulterende eind-levensvatbaarheid en eindconcentraties na een 72 h SMG-behandeling in een 37 °C celkweekincubator aangevuld met 5% CO2. Twee gevallen van negatieve uitkomsten en twee gevallen van positieve uitkomsten werden vergeleken. Ter vergelijking, merk op dat het optimale concentratiebereik van de gebruikte NK92-cellijn tussen 0,3 x 10 6 cellen / ml en 1,2 x 106 cellen / ml lag, met een verdubbelingstijd van ongeveer 2-3 dagen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Terwijl de mensheid zich voorbereidt op langere ruimtemissies naar de maan en Mars, moet er meer onderzoek worden gedaan om ernstige gezondheidsrisico's bij astronauten te beperken. Een belangrijk aspect van de ruimteomgeving dat de menselijke fysiologie beïnvloedt, is microzwaartekracht. Hier is een celkweekmethode beschreven voor het onderwerpen van lymfocyten aan SMG met behulp van een in de handel verkrijgbaar roterend celkweeksysteem.

Dit protocol bevat een paar kritieke stappen die mogelijk moeten worden geoptimaliseerd, afhankelijk van het celtype of de lijn die wordt gebruikt. Deze omvatten 1) het kiezen van een geschikte zaaidichtheid, afhankelijk van de verdubbelingstijd van de cellen en de duur van de SMG-behandeling, en 2) het bepalen van een optimale behandelingslengte, rotatiesnelheid en geschikte controles. Het kiezen van een zaaidichtheid die zich in het middenbereik van de juiste celconcentraties bevindt voor het celtype of de lijn die wordt bestudeerd, moet voldoende zijn. Het kiezen van een te lage zaaidichtheid kan echter leiden tot een lage celproliferatie en levensvatbaarheid (tabel 1), en het kiezen van een te hoge dichtheid kan leiden tot voortijdige uitputting van voedingsstoffen en een lage levensvatbaarheid van cellen. De gekozen zaaidichtheid hangt ook af van de verdubbelingstijd van de cellen die worden bestudeerd; Cellen met een kortere verdubbelingstijd kunnen met een lagere dichtheid worden gezaaid en cellen met een langere verdubbelingstijd moeten mogelijk met een hogere dichtheid worden gezaaid. De zaaidichtheid en lengte van de behandeling zijn ook afhankelijk van het aantal cellen dat nodig is om de daaropvolgende experimentele testen te voltooien. Uit ervaring heeft het zaaien van zeer levensvatbare (90% +) NK92-cellen bij 0,4-0,5 x 10 6 cellen / ml in vaten van 10 ml (d.w.z. 4-5 miljoen cellen per experimentele groep; optimaal bereik voor de cellijn = 0,3 x 10 6-1,2 x 106 cellen / ml, verdubbelingstijd = 2-3 dagen) en behandeling gedurende 72 uur ongeveer 8-15 miljoen cellen opgeleverd (tabel 1). Als zodanig waren de vaten van 10 ml geschikt voor het oogsten van cellen voor zowel functionele testen (3 x 10 6 cellen) als verzamelcellen voor qPCR (1 x 10 6 cellen) en western blot (2 x 10 6-6 x 10 6 cellen). Supernatanten kunnen ook worden verzameld voor analyse van secretoire componenten. Er zijn echter ook vaten van 50 ml beschikbaar en deze kunnen worden gebruikt wanneer een grotere celopbrengst vereist is. Bij gebruik van vaten van 50 ml moeten ook grotere spuiten worden gebruikt.

Het bepalen van een geschikte behandelingslengte hangt ook af van het celtype / de lijn die wordt gebruikt. Als er eerdere onderzoeken bestaan, moeten ze worden verwezen om een geschikte behandelingsduur te kiezen om mee te beginnen. Een paar studies hebben RWV-apparaten gebruikt om NK-cellen te kweken en worden hier genoemd17,18,19. Van daaruit moeten de behandelingsresultaten of hoe goed de cellen zich vermenigvuldigden en hun levensvatbaarheid, en hun prestaties in daaropvolgende experimentele testen, worden onderzocht. Het kan mogelijk zijn om de behandelingsduur na 72 uur te verlengen door de celcultuur uit de vaten in een buis te verwijderen, de cellen te centrifugeren en vervolgens opnieuw te suspenderen in 10 ml warme, verse complete kweekmedia, ze in de vaten te vervangen en de rotatie opnieuw te starten. Dit kan echter confounds veroorzaken als gevolg van blootstelling aan hyperzwaartekracht door centrifugatie, en het splitsen / verdunnen van de cellen kan nodig zijn om ervoor te zorgen dat de cellen binnen hun optimale concentratiebereik worden gehouden. Als stimulerende moleculen (bijv. LPS, cytokines, enz.) moeten worden gebruikt, wordt aanbevolen deze in een geschikte concentratie aan het volledige mediarecept toe te voegen voordat de SMG-behandeling wordt opgezet.

Het instellen van een geschikte rotatiesnelheid (rpm) is ook de sleutel tot het handhaven van de gesimuleerde microzwaartekrachtbehandeling. Het bedrijf raadt aan om te beginnen met een rotatiesnelheid tussen 8 en 10 tpm bij het kweken van lymfocyten. Uit ervaring is gebleken dat een snelheid van 11 rpm goed heeft gewerkt om ervoor te zorgen dat NK92-cellen in suspensie worden gehouden en is gebruikt in een eerdere NK-celstudie17. Afhankelijk van de groeipatronen van het gebruikte celtype/de gebruikte lijn, moet de rotatiesnelheid mogelijk worden verhoogd om rekening te houden met celklontering. Dit zou leiden tot verhoogde sedimentatie van de cellen als gevolg van verhoogde massa. Voor een optimale SMG-behandeling moet de rotatiesnelheid van het kweekvat worden aangepast aan de sedimentatiesnelheid van de cellen 5,6,8,9. Met andere woorden, cellen of celklonten mogen niet door de media vallen en ze moeten relatief stationair blijven.

In dit verband is het een goede gewoonte om twee negatieve controles uit te proberen door cellen te vergelijken die in een standaard T25-kweekkolf ("Kolf") zijn gekweekt en cellen die in de gespecialiseerde HARV zijn gekweekt maar niet aan SMG zijn onderworpen (d.w.z. gewoon in de couveuse zijn geplaatst; "1G"). Idealiter zouden de celprestaties en uitkomsten in downstream experimentele assays tussen de twee negatieve controles vergelijkbaar moeten zijn. Eventuele inconsistenties moeten worden opgemerkt. Voor de meeste testen is de beste vergelijking waarschijnlijk tussen de "1G" -controle en SMG-behandeling; het opnemen van zowel de "Flask" als de "1G" controles kan echter nuttig zijn voor voldoende vergelijking en initiële optimalisatie.

De belangrijkste beperkingen van dit protocol zijn 1) bellenvorming tijdens celkweek, 2) de mate van SMG en 3) de mogelijke duur van de behandeling. Het is van cruciaal belang om de vorming van bubbels tijdens de SMG-behandeling te controleren. Zelfs minuscule microbubbels kunnen zich ophopen, groeien en leiden tot de vorming van zeer verstorende grotere bubbels. Deze grotere bellen onderbreken de low-shear vloeistofdynamica in het kweekvat, waardoor de turbulentie toeneemt omdat de vloeistofstroom rond de bel21 wordt afgebogen. Uiteindelijk verstoort dit de SMG-conditie volledig. Dit fenomeen wordt uitvoerig besproken en gevisualiseerd door Phelan et al21. Daarnaast is het belangrijk om in gedachten te houden dat dit apparaat SMG produceert en geen echte microzwaartekracht zoals ervaren aan boord van de ISS6. Niettemin hebben studies vergelijkbare effecten van SMG aangetoond die door dit apparaat worden geproduceerd in vergelijking met effecten van echte microzwaartekracht uit studies uitgevoerd op het ISS 1,5,6.

Er bestaan alternatieve methoden om celkweek aan SMG te onderwerpen. Deze omvatten het gebruik van 3D-clinostaten of Random Positioning Machines (RPM) en diamagnetische levitatie. 3D-clinostaten roteren de celcultuur op twee loodrechte assen met dezelfde snelheid, terwijl rpm's op twee loodrechte assen roteren, waarbij zowel de snelheid als de directionaliteit van de rotatie gerandomiseerd zijn 5,6. Daarom zijn RPM's in vergelijking met 2D-clinostaten of RWV-apparaten complexer, wat verschillende voor- en nadelen met zich meebrengt. Ten eerste kan de mate van microzwaartekracht die kan worden bereikt in een RPM worden gemoduleerd om gedeeltelijke zwaartekracht te simuleren, zoals die op de maan (0,16 g) en Mars (0,33 g)6. De toegevoegde complexiteit van gerandomiseerde rotatierichtingen en snelheden kan echter schokbeweging en acceleratieve krachten introduceren, vooral naar de buitenste gebieden van het kweekvat, wat mogelijk leidt tot verstoringen in de gegevens. Diamagnetische levitatie stelt monsters bloot aan sterke afstotende magnetische velden om het gewicht van water in biologische monsters tegen te gaan, als een manier om de zwaartekracht tegen te gaan. Het sterke magnetische veld dat hiervoor wordt gegenereerd, kan echter ook een negatieve invloed hebben op de cellen, waardoor de gegevens worden verstoord 5,6. Deze methoden worden elders nader besproken 5,6.

Kortom, het hier besproken commercieel beschikbare roterende celkweeksysteem is een relatief eenvoudig te gebruiken, toegankelijk platform voor wetenschappers die de effecten van SMG op lymfocyten willen bestuderen. Hoewel er beperkingen zijn aan deze celkweekmethode, blijft het een haalbare optie voor het kweken van lymfocyten en mogelijk andere suspensiecelculturen in gesimuleerde microzwaartekracht.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Acknowledgments

Dit werk wordt ondersteund door de Canadian Space Agency (CSA), onderzoeksbeurs (17ILSRA3, Immuno Profile). De auteurs willen Dr. Roxanne Fournier (University of Toronto), Dr. Randal Gregg (Lincoln Memorial University) en Preteesh Mylabathula (University of Arizona) bedanken voor hun hulp bij het oplossen van dit protocol.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL) Synthecon D-410 Gamma sterilized culture vessels (4/box)
Luer-Lok tip syringes (3 mL) BD 309657 For attaching to the 10 mL HARVs
NK92 Cell-line ATCC CRL-2407
Rotary Cell Culture System (RCCS) Synthecon RCCS-4D Rotating wall vessel device; 2D clinostat
Sarsedt 15 mL conical tubes Fisher Scientific 50-809-220
Sarsedt 50 mL conical tubes Fisher Scientific 50-809-218
Sarsedt sterile serological pipettes Fisher Scientific 86.1254.001
T25 suspension culture flasks Sarsedt 83.3910.502 For flask control

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. ElGindi, M., et al. May the force be with you (or not): the immune system under microgravity. Cells. 10 (8), 1941 (2021).
  2. Choukèr, A., Ullrich, O. The Immune System in Space: Are we Prepared. , Springer International Publishing. Cham. (2016).
  3. Crucian, B. E., et al. Immune system dysregulation during spaceflight: potential countermeasures for deep space exploration missions. Frontiers in Immunology. 9, 1437 (2018).
  4. Crucian, B. E., et al. Countermeasures-based improvements in stress, immune system dysregulation and latent herpesvirus reactivation onboard the International Space Station - relevance for deep space missions and terrestrial medicine. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 115, 68-76 (2020).
  5. Herranz, R., et al. Ground-based facilities for simulation of microgravity: organism-specific recommendations for their use, and recommended terminology. Astrobiology. 13 (1), 1-17 (2013).
  6. Ferranti, F., Del Bianco, M., Pacelli, C. Advantages and limitations of current microgravity platforms for space biology research. Applied Sciences. 11 (1), 68 (2020).
  7. Murphy, K., Weaver, C. Janeway's Immunobiology 9th Edition. , Garland Science/Taylor & Francis Group LLC. New York, NY. (2016).
  8. Dedolph, R. R., Dipert, M. H. The physical basis of gravity stimulus nullification by clinostat rotation. Plant Physiology. 47 (6), 756-764 (1971).
  9. Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), 12-25 (2001).
  10. Crabbé, A. Transcriptional and proteomic responses of Pseudomonas aeruginosa PAO1 to spaceflight conditions involve Hfq regulation and reveal a role for oxygen. Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1221-1230 (2011).
  11. Ulbrich, C., et al. The impact of simulated and real microgravity on bone cells and mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2014, 1-15 (2014).
  12. Martinez, E. M., Yoshida, M. C., Candelario, T. L. T., Hughes-Fulford, M. Spaceflight and simulated microgravity cause a significant reduction of key gene expression in early T-cell activation. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), 480-488 (2015).
  13. Jong, J., Maki, G., Klingemann, H. Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).
  14. Williams, B. A., et al. A phase I trial of NK-92 cells for refractory hematological malignancies relapsing after autologous hematopoietic cell. Oncotarget. 8 (51), 89256-89268 (2017).
  15. Cryopreservation of mammalian cell lines video protocol. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol (2022).
  16. Counting cells using a hemocytometer. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2022).
  17. Mylabathula, P. L., et al. Simulated microgravity disarms human NK-cells and inhibits anti-tumor cytotoxicity in vitro. Acta Astronautica. 174, 32-40 (2020).
  18. Li, Q., et al. Effects of simulated microgravity on primary human NK cells. Astrobiology. 13 (8), 703-714 (2013).
  19. Shao, D., et al. Mechanisms of the effect of simulated microgravity on the cytotoxicity of NK cells following the DNA methylation of NKG2D and the expression of DAP10. Microgravity Science and Technology. 33 (1), 6 (2021).
  20. Castro, S. L., Nelman-Gonzalez, M., Nickerson, C. A., Ott, C. M. Induction of attachment-independent biofilm formation and repression of hfq expression by low-fluid-shear culture of Staphylococcus aureus. Applied and Environmental Microbiology. 77 (18), 6368-6378 (2011).
  21. Phelan, M. A., Gianforcaro, A. L., Gerstenhaber, J. A., Lelkes, P. I. An air bubble-isolating rotating wall vessel bioreactor for improved spheroid/organoid formation. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (8), 479-488 (2019).

Tags

Retractie Suspensiecelcultuur lymfocyten gesimuleerde microzwaartekracht tijdgemiddelde zwaartekrachtvector nullificatie 2D-clinostaat roterend celkweeksysteem roterend wandvatapparaat
Het kweken van lymfocyten in gesimuleerde microzwaartekracht met behulp van een roterend celkweeksysteem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de Korte, M., Keating, A., Wang, C.… More

de Korte, M., Keating, A., Wang, C. Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System. J. Vis. Exp. (186), e63296, doi:10.3791/63296 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter