Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Dyrkning af lymfocytter i simuleret mikrogravitation ved hjælp af et roterende cellekultursystem

Published: August 25, 2022 doi: 10.3791/63296
Automatic Translation
1,2, 1,2,4, 1,3
1Laboratory Medicine and Pathobiology, Temerty Faculty of Medicine, University of Toronto, 2Krembil Research Institute, Toronto Western Hospital, University Health Network, 3Pathology and Lab Medicine, Hematopathology, Mount Sinai Hospital, Sinai Health Systems, 4Medical Oncology and Hematology, Princess Margaret Cancer Centre

Summary

Dette er en trinvis vejledning til brug af et kommercielt tilgængeligt roterende cellekultursystem til dyrkning af lymfocytter i simuleret mikrogravitation ved hjælp af specialiserede engangskulturbeholdere. Denne dyrkningsmetode kan anvendes på enhver cellekultur af suspensionstypen.

Abstract

I betragtning af de nuværende begrænsninger ved at udføre biologisk forskning i rummet findes der nogle få muligheder for at udsætte cellekultur for simuleret mikrogravitation (SMG) på Jorden. Disse muligheder varierer i deres metoder, principper og egnethed til brug med suspensionscellekultur. Her beskrives en cellekulturmetode til at udsætte lymfocytter for simuleret mikrogravitation ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt roterende cellekultursystem, også kendt som en 2D clinostat eller en roterende vægbeholder (RWV) enhed. Denne cellekulturmetode anvender princippet om tidsgennemsnitlig gravitationsvektorannullering til at simulere mikrogravitation ved at rotere cellerne på en vandret akse. De celler, der dyrkes i dette system, kan høstes og anvendes i mange forskellige eksperimentelle assays for at vurdere virkningerne af simuleret mikrogravitation på cellulær funktion og fysiologi. Dyrkningsteknikken kan variere lidt afhængigt af den celletype eller linje, der anvendes, men metoden beskrevet her kan anvendes på enhver suspensionscellekultur.

Introduction

Rumflyvning har vist sig at påvirke mange aspekter af menneskelig fysiologi, herunder immunsystemet. Mange undersøgelser har vist tegn på immundysregulering som følge af rumflyvning in vivo og eksponering for simuleret mikrogravitation (SMG) in vitro 1,2,3,4. Et vigtigt aspekt af rummiljøet, der påvirker menneskelig fysiologi, er mikrogravity. Mikrogravitation refererer til den "vægtløshed", der opleves på grund af lave tyngdekræfter i rummiljøet5. Da menneskeheden forbereder sig på længere rummissioner til Månen og Mars, skal der udføres mere forskning for at afbøde alvorlige sundhedsrisici hos astronauter.

Der kan opnås reelle betingelser for mikrotyngdekraft for videnskabelig forskning i rummet ombord på Den Internationale Rumstation (ISS) eller i nanosatellitter, der sendes i kredsløb; Disse muligheder kan dog være utroligt dyre og komplekse at orkestrere. I betragtning af de nuværende begrænsninger ved at udføre biologisk forskning i rummet findes der flere muligheder for at fremkalde reel mikrogravitation og SMG på Jorden. Der findes store operationer, der kan producere korte perioder med reel mikrogravitation på Jorden, herunder droptårne, parabolflyvning og lydende raketter. Disse metoder er imidlertid ikke alt for egnede til at studere virkningerne af mikrogravitation på biologiske systemer, hovedsageligt på grund af deres korte perioder med mikrogravitybehandling (dvs. sekunder til 20 minutter). Disse metoder behandles mere detaljeret andetsteds 5,6. Valgmuligheder, der er egnede til biologisk cellekultur, omfatter små enheder såsom 2D-klinostater eller roterende vægbeholder (RWV) enheder og 3D-klinostater eller tilfældige positioneringsmaskiner (RPM). Disse enheder kan opstilles inde i cellekulturinkubatorer, der opretholdes ved 37 °C og 5% CO2, og de roterer cellekulturen enten på en vandret akse (2D) eller på to vinkelrette akser (3D)5. Det er dog vigtigt at understrege, at disse dyrkningsmetoder producerer SMG i modsætning til reel mikrogravitation, som mest gennemførligt opnås i rum til biologiske forskningssammenhænge.

Målet med det nuværende papir er at skitsere trinene til at udsætte lymfocytter for SMG ved hjælp af en kommercielt tilgængelig RWV-enhed (materialetabel), der falder ind under 2D-clinostatklassifikationen. Selvom der er en generel protokol tilgængelig fra producenten til betjening af denne enhed, har den aktuelle artikel til formål at dække fejlfindings- og optimeringstrinnene mere detaljeret. Denne artikel dækker også teorien bag, hvordan denne enhed fungerer til at producere SMG i suspensionscellekultur, specifikt med lymfocytter. I denne sammenhæng henviser suspensionscellekultur til celler, der vokser frit i supplerede kulturmedier uden at klæbe til yderligere stilladser. Mange celletyper dyrkes i suspensionscellekultur, herunder lymfocytter. Lymfocytter er celler i immunsystemet, herunder T, B og Natural Killer (NK) celler, der befinder sig i lymfoide organer og blodbanen7.

RWV 2D clinostaten beskrevet her fungerer på princippet om tidsgennemsnitlig gravitationsvektor nullificering 5,6,8,9, hvorved tyngdekraftsvektoren randomiseres gennem rotation af cellekulturen på en vandret akse. Dette opnås ved at matche kulturbeholderens rotationshastighed med cellernes sedimentationshastighed. Så længe kulturbeholderens rotationshastighed er godt tilpasset cellernes sedimentationshastighed, opretholdes cellerne i frit fald og er ude af stand til at sedimentere, som det opleves i rummiljøet. Efter en indledende hastighedsfase når mediet i kulturbeholderen til sidst "solid kropsrotation" over tid. Denne vandrette rotation inducerer også laminær strømning i cellekulturbeholderen. Dette skaber et "lavt forskydningsmiljø", da forskydningsspændingen induceret på cellerne af laminær strømning er meget mindre end den turbulente strømning. Men da clinostaten ikke er et perfekt system, introduceres der nogle små, laminære væskebevægelser, som påfører cellerne minimal forskydningsbelastning. Som sådan trækkes cellerne, der er suspenderet i mediet, med af denne strøm under rotation. Under vandret rotation virker tyngdekraftsvektoren på cellerne og bringer dem ind i en oscillerende bane, som visualiseret i figur 1. En anden lille kilde til forskydningsstress er forårsaget af, at cellerne "falder" gennem medierne, hvilket forårsager laminær strømning omkring cellerne. Når kulturbeholderen roterer på en vandret akse, roterer tyngdekraftsvektoren, som cellerne oplever, også. Over tid nærmer denne roterende tyngdekraftsvektor sig i gennemsnit nul; dette fænomen kaldes tidsgennemsnitlig gravitationsvektor nullificering og inducerer en tilstand af SMG 5,6,8,9. Denne enhed er blevet brugt til at studere virkningerne af SMG på mange typer celler, hvoraf nogle er dækket af referencer10,11,12. Du kan finde flere eksempler på enhedsproducentens websted.

Denne RWV-enhed bruger specialiserede "high aspect ratio vessels" (HARVs), der er tilgængelige via enhedsproducenten. Disse HARV'er indeholder 10 ml cellekultur hver; dog er 50 ml HARV'er også tilgængelige. Enten 10 ml eller 50 ml HARV'er kan bruges afhængigt af hvor mange celler der er nødvendige for at fuldføre eventuelle downstream eksperimentelle assays, som er skitseret yderligere i diskussionsafsnittet. HARV'erne er lavet af polycarbonat og inkluderer en silikoneoxygeneringsmembran for at muliggøre gasudveksling under cellekultur. Dette opretholder cellemediets pH og giver mulighed for effektiv cellulær respiration. Der er en hovedpåfyldningsport og to sprøjteporte med låg på beholderens overflade (figur 2A). Efter lastning af cellekulturen gennem hovedpåfyldningsporten lægges to sprøjter på beholderen for at hjælpe med fjernelse af bobler. Når du bruger beholderne på 10 ml, fungerer to 3 ml sprøjter godt. Den ene sprøjte er fastgjort til enheden tom, med sprøjten helt trykket ned, og den anden er fastgjort fyldt med 3 ml cellekultur (figur 2E). Disse bruges i kombination til at fjerne bobler fra beholderen, hvilket er vigtigt for at opretholde SMG-behandlingen. Generelt anbefales det at oprette to negative kontroller, der kan betegnes som "Flask" -kontrollen og "1G" -kontrollen. "Kolbekontrollen" svarer til celler, der dyrkes i en standard T25-suspensionscellekulturkolbe. 1G-kontrollen svarer til celler, der dyrkes i den specialiserede 10 ml kulturbeholder, som simpelthen placeres i inkubatoren (dvs. uden at blive udsat for SMG-behandlingen). Se afsnittet Diskussion for at få flere oplysninger om kontrolelementer.

Metoden beskrevet her er passende for enhver forsker, der ønsker at studere virkningerne af SMG på lymfocytter, med et specifikt fokus på NK-celler ved hjælp af NK92-cellelinje13. Resultaterne fra disse undersøgelser kan hjælpe os med bedre at forstå og afbøde de negative virkninger af rumflyvning på det menneskelige immunsystem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Følgende trin skal udføres inde i et sterilt biologisk sikkerhedsskab.

1. Forberedelse af skibe til cellekultur

  1. Tag kulturbeholderne ud af plastemballagen. Mærk hvert fartøj på kanten i henhold til hvilken celletype/linje der bruges, om det er kontrol (1G) eller behandling (SMG) og andre relevante oplysninger.
  2. Stabiliser beholderen, og åbn påfyldningsporten forsigtigt uden at røre ved påfyldningsportens hættepløk/O-ring. Placer hætten på en ethanolpude med pløk/O-ringen opad, mens beholderen fyldes. Fjern ikke hætterne fra sprøjteportene.
    BEMÆRK: Hvis pløkken/O-ringen berøres ved et uheld, sprøjtes hættestiften med 70% ethanol og lades sidde (opad) et øjeblik, mens beholderen fyldes. Når du er klar til at lukke påfyldningsporten igen, skal du tage hætten op med en frisk papirserviet for at tørre hætten grundigt, før du sætter den tilbage på beholderen.
  3. Beholderen fyldes med 10 ml af det korrekte komplette medie til cellekulturen ved hjælp af en steril serologisk pipette, og hætten sættes forsigtigt tilbage på påfyldningsporten.
    BEMÆRK: Her blev NK92 NK-cellelinjen brugt, som blev dyrket i GM1-medier, som tidligere valideret i et klinisk forsøg med NK92-celler som celleterapi14. Det anvendte kulturmedie afhænger af den cellelinje eller celletype, der dyrkes. Tjek leverandørens hjemmeside for den korrekte medieopskrift for den cellelinje eller celletype, der bruges.
  4. Sørg for, at sprøjteporthætterne og påfyldningsporten er forsvarligt lukket, og anbring de fyldte beholdere i en 37 °C, 5% CO2 -inkubator, mens du udfører de efterfølgende trin for at klargøre beholderne til cellekultur.
    BEMÆRK: Dette primingtrin hjælper med at minimere dannelse af store bobler for at gøre det lettere at udstøde bobler senere i trin 6.

2. Forberedelse af stamcellekultur til SMG-behandlingsopsætningen

  1. Når de ikke er i brug, opbevares de pågældende celler ved en temperatur, der er lavere end -130 °C eller ideelt set i en flydende nitrogendampfase.
  2. Mindst 1 uge før den planlagte behandling optøes cellerne og dyrkes ved hjælp af den passende cellekulturmedieopskrift, der findes på leverandørens hjemmeside. Planlæg hvor mange celler der er nødvendige for at oprette behandlingen (detaljer nedenfor i de efterfølgende trin), og sørg for at starte kulturerne tidligt nok til at muliggøre tilstrækkelig spredning og tilpasning til kultur.
  3. Opbevar cellekulturen i en 37 °C, 5% CO2 inkubator. Yderligere oplysninger om standardcellekulturpraksis behandles andetsteds15.
  4. På dagen for den planlagte SMG-behandlingsopsætning bestemmes startkoncentrationen og levedygtigheden af den indledende cellekultur.
    1. Brug den foretrukne metode til bestemmelse af koncentrationen af den oprindelige cellekultur (f.eks. Hæmocytometer, ViCell, flowcytometri osv.). Vær opmærksom på cellernes levedygtige cellekoncentration (celler pr. ml) og levedygtighed (%), hvilket sikrer, at levedygtigheden ideelt set er større end 85%. En protokol til brug af et hæmocytometer findes andetsteds16.
  5. Bestem den passende cellesåningstæthed / koncentration af cellekulturen til SMG-behandling ved at overveje det optimale cellekoncentrationsområde for den bestemte celletype / linje, deres fordoblingstid og længden af SMG-behandlingen. Se venligst diskussionsafsnittet for yderligere uddybning.
    BEMÆRK: Erfaringsmæssigt er det optimale koncentrationsområde for NK92-celler mellem 0,3 x 10 6-1,2 x 106 celler/ml. Generelt har disse celler en fordoblingstid på 48-72 timer og fodres hver 2-3 dage som sådan. Da behandlingslængden var 72 timer, blev cellerne podet i den nedre ende af deres optimale interval ved 0,4-0,5 x 106 celler / ml. Leverandøren anbefaler også denne såtæthed, når den indledende cellekultur startes fra et frisk hætteglas med NK92-celler.
  6. Bestem mængden af stamcellekultur, der er nødvendig for at oprette behandlingen og kontrollerne.
    BEMÆRK: Der kræves 10 ml cellekultur pr. eksperimentel gruppe. Hvis der oprettes tre forsøgsgrupper (dvs. en behandling: "SMG" og to negative kontroller: "Kolbe" og "1G"), er yderligere 10 ml cellekultur tilstrækkelig til at blive alikvote i et 15 ml rør, der bruges til at fylde HARV-sprøjterne. Dette er 40 ml i alt, hvilket kan svinge afhængigt af det specifikke eksperimentelle design.
  7. Bestem antallet af celler, der er nødvendige for at oprette behandlingen.
    1. Beregn det samlede antal celler, der er nødvendige, ved at gange den valgte såtæthed (celler / ml) med det samlede nødvendige volumen (ml).
      BEMÆRK: Fra erfaring med NK92 fremstilles 40 ml stamcellekultur som beskrevet ovenfor ved en såkoncentration på 0,4-0,5 x 106 celler / ml. Som sådan er 16-20 x 106 NK92-celler nødvendige for at fuldføre den typiske behandlingsopsætning. For NK92-cellelinjen er det bedre at bruge lidt flere celler end lidt færre celler for at opretholde høj levedygtighed under hele behandlingen.
  8. Bestem volumenet af indledende cellekultur for at dreje ned.
    1. Da cellekoncentrationen er repræsenteret som celler/ml, divideres det samlede antal celler (celler), der er nødvendige til eksperimentet, med den målte startkoncentration af cellekulturen (celler/ml).
      BEMÆRK: For eksempel, hvis der er behov for 16 x 10 6 celler, og kulturens startkoncentration er 0,8 x 106 celler / ml, skal 20 ml af kulturen spindes ned.
  9. Lav den endelige stamcellekultur.
    1. Der centrifugeres et passende antal celler ved 300 x g i 8 minutter i et 50 ml konisk rør.
    2. Supernatanten hældes forsigtigt af i en affaldsbeholder, og knips forsigtigt med tuben for at opslæmme pillen i den lille resterende mængde.
    3. Cellerne resuspenderes i et passende volumen opvarmet (37 °C) komplet medie for at bringe kulturen til den ønskede såtæthed. Denne diskenhed blev beregnet i trin 2.6.
    4. Sæt låget på 50 ml røret på en sikker måde, og vend det forsigtigt på hovedet et par gange for at blande cellesuspensionen grundigt.
      BEMÆRK: Hvis der kræves mere end 50 ml for at oprette det fulde eksperiment, er det bedst at centrifugere det samlede antal celler, der er nødvendige i et 50 ml konisk rør og resuspendere dette i halvdelen af det nødvendige volumen. Bland derefter godt og lav en 1: 2 fortynding i et separat 50 ml konisk rør. For eksempel, hvis der er behov for 100 ml ved 0,4 x 10 6 celler / ml, drej 40 x 106 celler ned i et 50 ml rør, resuspender i 50 ml medier, overfør 25 ml til et andet 50 ml rør og fyld derefter begge op med 25 ml friske medier.

3. Lastning af fartøjer med stamcellekultur

  1. Hent de mediegrundede kar fra inkubatoren.
  2. Hvis der anvendes en "kolbekontrol", fyldes en T25-suspensionskolbe med 10 ml cellekultur fra ovennævnte lager. Tilsæt også 10 ml stamcellekultur til et separat 15 ml konisk rør, som vil blive brugt til at fylde sprøjterne.
  3. Skru hætterne til sprøjteporten af for at fjerne dem fra beholderen, og sørg for, at stophanerne er i åben position (figur 2C).
  4. Stabiliser beholderen, og åbn påfyldningsporten forsigtigt uden at røre ved påfyldningsportens hættepløk/O-ring. Placer hætten på en ethanolpude med pløk/O-ringen opad, mens beholderen fyldes. Skru forsigtigt hætterne ud af sprøjteportene.
  5. Sørg for, at stophanerne er i åben position (figur 2C). Hæld forsigtigt mediet ud af beholderen i en affaldsbeholder, fjern mediet ved hjælp af en serologisk pipette eller aspirer det ved hjælp af en steril glas Pasteur-pipette fastgjort til vakuumsystemet uden at røre iltningsmembranen.
  6. Luk det 50 ml koniske rør, der indeholder stamcellekulturen, tæt, og vend det forsigtigt et par gange for at blande indholdet grundigt.
  7. Der trækkes 10 ml cellekulturmateriale op af 50 ml glasset med en frisk steril serologisk pipette. Tag beholderen op, og vip den, så påfyldningsporten er mod toppen, og fordel derefter forsigtigt cellekulturstammen i beholderen gennem påfyldningsporten.
    BEMÆRK: Vær forsigtig og hold øje med lydstyrken, så kulturen ikke spildes gennem sprøjteportene, mens beholderen vippes.
  8. Målet er at fylde beholderen helt til toppen af påfyldningsportens kant uden at spilde; Vip beholderen ned igen, når den fyldes for at undgå spild. Pas på ikke at røre iltningsmembranen med pipetten, da den er meget skrøbelig.
    BEMÆRK: Beholderfyldningsprocessen kan tage lidt øvelse; Vær tålmodig og gå langsomt. Hvis der dannes en boblefilm ved åbningen af påfyldningsporten, vil dette forstyrre lastningen af fartøjet. Hvis dette sker, skal du forsigtigt ramme beholderen for at bryde forseglingen skabt af boblefilmen.
  9. Når fartøjet er lastet, skal du forsigtigt sætte påfyldningsportens hætte på igen, så du ikke rører ved pløkken/O-ringen.
  10. Placer på sprøjterne.
    BEMÆRK: Der er to sprøjteporte på beholderens overflade (figur 2A). Den ene holder en tom sprøjte, og den anden holder en sprøjte fuld af cellekultur (figur 2E).
    1. Sæt først den 3 ml tomme sprøjte på en af sprøjteportene, og sørg for, at sprøjten er trykket helt ned.
      BEMÆRK: Pump sprøjterne et par gange, før du sætter dem på beholderen, da de er lidt stramme i starten. Gør dette inde i det biologiske sikkerhedsskab for at opretholde sterilitet.
    2. Luk det 15 ml koniske rør tæt med 10 ml aliquoteret cellekultur og vend det forsigtigt et par gange for at blande indholdet grundigt.
    3. Derefter nedsænkes forsigtigt den anden 3 ml sprøjte i cellekulturen og tegner en vis kultur. For at minimere luftboblen i toppen af sprøjten skal du dispensere dette helt tilbage i røret og derefter trække 3 ml af kulturen op.
    4. Fastgør den fyldte sprøjte til den resterende sprøjteport, og desinficer forsigtigt sprøjterne og omkring påfyldningsporten med en ethanolpude. Få ikke ethanol på iltningsmembranen. Nu er fartøjet klar til at slippe af med bobler.
      BEMÆRK: Den anden fyldte sprøjte til den anden beholder er vanskeligere at fylde på grund af dybden af 15 ml røret. Det hjælper med at vippe røret, mens sprøjten fyldes for at opretholde forseglingen mellem sprøjten, der fyldes, og cellekulturen.
    5. Gentag trin 3.3-3.10 for de resterende beholdere. Hvis der er en lidt utilstrækkelig mængde cellekultur tilbage i det 50 ml koniske rør til den sidste beholder (f.eks. 9,5 ml i stedet for 10 ml), genvindes den resterende mængde fra det 15 ml koniske rør, der bruges til at fylde sprøjterne.
      BEMÆRK: Følgende trin behøver ikke at finde sted i et sterilt biologisk sikkerhedsskab, da beholderen nu er et lukket, sterilt system.

4. Fjernelse af bobler fra karrene

BEMÆRK: Bobler er uundgåelige inden for denne opsætning og skal fjernes konsekvent under hele behandlingen (figur 3). Se venligst diskussionsafsnittet for flere detaljer om dette.

  1. Sørg for, at stophanerne til sprøjteporten er i lukket position (figur 2D) for at begrænse migrationen af celler og bobler fra sprøjterne til beholderne. Dette er især vigtigt senere under behandlingen (diskuteret nedenfor). For at samle de indledende bobler skal du vende fartøjet på hovedet og ramme siden af det et par gange.
  2. Vend hurtigt beholderen tilbage, så den vender opad og derefter i en let vinkel, der vender væk, så boblerne alle flyder til beholderens opadgående side (figur 3B).
  3. Manøvrer boblerne under porten med den tomme sprøjte og se dem begynde at komme op i havnen. Åbn begge stophaner til sprøjteporten (figur 2C).
  4. Slå forsigtigt på beholderen for at tilskynde boblerne til at flyde op i den tomme sprøjte. Sug langsomt de større bobler op med den tomme sprøjte, mens du forsigtigt trykker den fulde sprøjte ned for at opretholde trykket i beholderen, så iltningsmembranen ikke brister.
    BEMÆRK: Større bobler skal suges op, mens små bobler og mikrobobler kan tilskyndes til at flyde op i sprøjten ved at manøvrere dem ind i sprøjteportene og forsigtigt ramme beholderen. Efter et par timers behandling er det meget vigtigt at minimere "krydskontaminering" mellem cellerne i sprøjterne og cellerne i dyrkningsbeholderen. Dette skyldes, at cellerne i sprøjterne ikke modtager den samme mængde iltning eller eksponering for SMG, som cellerne i beholderen gør.
  5. Gentag trin 4.2-4.4 et par gange for at sikre, at alle bobler fjernes. Fjern alle bobler inklusive mikrobobler fra karrene.
    BEMÆRK: Boblerne kan let ses gennem iltningsmembranen (bagsiden af beholderen), når beholderen er rettet mod en lyskilde (vindue, lys osv.). Når du udfører trin 4.2 og 4.3, skal du se på boblerne, der bevæger sig fra bagsiden af beholderen for at hjælpe med at visualisere de bobler, der er sværere at se.
  6. Når boblerne er fjernet effektivt, lukkes stophanerne til sprøjteporten. Hold sprøjterne tændt under behandlingen for at muliggøre efterfølgende fjernelse af bobler, og sørg for, at volumen i begge sprøjter er omtrent ens.

5. Fastgørelse af fartøjet til den roterende base

  1. Tør forsigtigt overfladen af den roterende base og båndkablet ned med 70% ethanol.
  2. Sørg for, at det medfølgende båndkabel er tilsluttet strømforsyningen. Placer den roterende base i inkubatoren og fastgør båndkablet til bunden. Sørg for, at strømforsyningen holdes i nærheden af, men uden for inkubatoren. Figur 4 viser den roterende base og strømforsyning til kontekst.
  3. Fastgør SMG-behandlingsbeholderen ved at stille beholderens gevind op til den roterende pind og forsigtigt dreje den roterende pind på basen mod uret. Sørg for, at fartøjet er fastgjort sikkert. Sørg for, at inkubatoren opretholder tæt på 100% fugtighed ved at fylde vandbakken med tilstrækkeligt autoklaveret, omvendt osmose (RO) vand.
  4. Vælg en passende rotationshastighed (o / min). Juster rotationshastigheden, så den passer til cellernes sedimentationshastighed, således at cellerne slet ikke "falder gennem medierne", men ender med at rotere i en lille kredsløbsbane. Dette fænomen visualiseres som et skematisk diagram i figur 1.
    BEMÆRK: Virksomheden anbefaler at starte rotationen ved 8-10 o / min for lymfocytter. I dette tilfælde blev NK92-celler roteret ved 11 o / min, som vist i et tidligere papir17. Afhængigt af cellestørrelsen skal omdrejningstallet øges for større celler og formindskes for mindre celler. Det samme mønster gælder, hvis de anvendte celler har tendens til at klumpe sig sammen under dyrkning. Se venligst diskussionsafsnittet for yderligere detaljer om dette.

6. Behandling

  1. Vælg en passende behandlingslængde til forskningsapplikationen, som kan afhænge af, hvilke parametre for cellefunktion / fysiologi der analyseres. Se venligst diskussionsafsnittet for yderligere detaljer om dette.
    BEMÆRK: I dette tilfælde blev NK92-celler udsat for en 72 timers SMG-behandling, baseret på resultater fra tidligere undersøgelser18,19. Bobler vil uundgåeligt dannes under hele behandlingen og skal fjernes. Rotationen kan kortvarigt stoppes og genstartes for at lette dette. Se trin 7.1 for, hvordan du fjerner SMG-beholderen sikkert.
  2. På den første dag med opsætning af behandlingen skal du kontrollere for bobledannelse hvert par timer ved at gentage trin 4.2-4.6. Efter den første dag skal du kontrollere karrene efter behov (mindst en gang om dagen) og gentage trin 4.2-4.6, indtil behandlingen er afsluttet.

7. Høstning af celler fra karrene

  1. Når den planlagte behandlingslængde er gået, skal du stoppe rotationen og adskille apparatet. Fjern SMG-behandlingsbeholderen ved forsigtigt at holde beholderen stille, mens du drejer enhedens roterende pind med uret.
  2. Bring kontrolkolben, kontroller 1G-beholderen og den behandlede SMG-beholder ind i et sterilt biologisk sikkerhedsskab.
  3. Tag hvert fartøj (kun 1G og SMG; ikke kolben) og vend det på hovedet, så det vender nedad og tryk forsigtigt på det for at bringe alle cellerne i suspension. Drej derefter beholderen på siden med påfyldningsporten mod bunden, og slå beholderen igen for at opmuntre cellerne mod påfyldningsporten for effektiv aspiration.
  4. Håndter hvert fartøj individuelt. Skru sprøjterne af fra de to porte, og bortskaf dem i det biofarlige affald. Åbn stophanerne på sprøjteportene.
  5. Fjern forsigtigt påfyldningsportens hætte, og træk indholdet op ved hjælp af en steril 10 ml serologisk pipette, og vip beholderen, mens den tømmes. Dispenser indholdet af grupperne "Kolbe", "1G" og "SMG" i individuelt mærkede 15 ml koniske rør.
  6. Luk hvert rør og vend dem forsigtigt et par gange for at sikre, at de blandes korrekt. Anvend den foretrukne metode til bestemmelse af koncentrationen og levedygtigheden af den resulterende cellekultur til forberedelse til brug i efterfølgende eksperimentelle assays.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne dyrkningsmetode betragtes som vellykket, hvis 1) spredningen af cellerne er omtrent konsistent på tværs af kontrolgrupperne (og ideelt set alle eksperimentelle grupper), 2) spredningen er passende i betragtning af såtætheden, behandlingslængden og fordoblingstiden for celletypen / linjen og 3) levedygtigheden af de høstede celler er 85% eller højere (tabel 1 ). Ideelt set bør de resulterende celler være lige så sunde, som de ville være i standardcellekultur, især til brug i efterfølgende eksperimenter og assays (dvs. levedygtighed 85% eller højere). Denne dyrkningsmetode anses for mislykket, hvis det modsatte er tilfældet, hvorved de resulterende celler enten dør, afviger væsentligt i proliferation på tværs af kontrolgrupperne eller har suboptimal levedygtighed omkring 70% eller lavere (tabel 1). Spredning i SMG-behandlingsgruppen kan eller måske ikke afvige i forhold til kontrollerne, afhængigt af hvordan SMG-behandlingen påvirker den cellulære fysiologi. Dette har imidlertid ikke været et problem til dato, og celleproliferation var omtrent ens på tværs af kontrol- og behandlingsgrupperne (tabel 1). Som tidligere nævnt er disse parametre vigtige for succesen med downstream-assays og eksperimenter, og de resulterende celler fra de to kontrolgrupper skal fungere relativt ens.

Figure 1
Figur 1: Skematisk diagram over den lokaliserede kredsløbsbane for cellerne dyrket inden for den simulerede mikrogravitationsbeholder (SMG) under drift. RWV 2D clinostaten beskrevet her fungerer på princippet om tidsgennemsnitlig gravitationsvektor nullificering 5,6,8,9, hvorved tyngdekraftsvektoren randomiseres gennem rotation af cellekulturen på en vandret akse. Dette opnås ved at matche kulturbeholderens rotationshastighed med cellernes sedimentationshastighed. Efter en indledende hastighedsfase når mediet i kulturbeholderen til sidst "solid kropsrotation" over tid. Denne vandrette rotation inducerer også laminær strømning i cellekulturbeholderen. Dette skaber et "lavt forskydningsmiljø", da forskydningsspændingen induceret på cellerne af laminær strømning er meget mindre end den turbulente strømning. Men da clinostaten ikke er et perfekt system, introduceres der nogle små, laminære væskebevægelser, som påfører cellerne minimal forskydningsbelastning. Som sådan trækkes cellerne, der er suspenderet i mediet, med af denne strøm under rotation. Under vandret rotation virker tyngdekraftsvektoren på cellerne og bringer dem ind i en oscillerende bane, som visualiseres her. Når kulturbeholderen roterer på en vandret akse, roterer tyngdekraftsvektoren, som cellerne oplever, også. Over tid nærmer denne roterende tyngdekraftsvektor sig i gennemsnit nul; dette fænomen kaldes "tidsgennemsnitlig gravitationsvektor nullification" og inducerer en tilstand af SMG 5,6,8,9. Dette tal er blevet ændret fra Castro et al., 201120. Oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: 10 ml beholder med højt højde-bredde-forhold ( HARV). A) Fugleperspektiv af HARV, der viser hovedpåfyldningsporten og to sprøjteporte. (B) Bagsiden af HARV'en, der viser skrueporten til tilslutning af HARV til rotationsbasen og iltningsmembranen. C) Set fra siden af HARV med åbne sprøjteporte (med låg). D) Set fra siden af HARV med lukkede sprøjteporte (låg). E) Set fra siden af HARV, der viser de to 3 ml sprøjter, der er påsat. Den venstre sprøjte er fyldt med cellekultur, og den højre sprøjte er tom. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Bobler i HARV. (A) Fugleperspektiv af HARV, der viser bobler, der skal fjernes fra cellekulturen. B) Set fra siden af HARV'en, der viser de samme bobler. Bemærk, hvordan boblerne varierer i størrelse; Mikrobobler skal også fjernes. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: RWV-enhedens roterende base og strømforsyning . (A) Set forfra af den roterende base, der viser fire roterende pinde, der kan rumme op til fire kulturbeholdere. (B) Set bagfra af den roterende base, der viser indgangen til båndkablet (ikke afbildet), der forbinder basen og strømforsyningen. (C) Set forfra af strømforsyningen oven på inkubatoren. Bemærk tænd / sluk-kontakten til venstre og rpm-justeringshjulet til højre. Strømforsyningen er tilsluttet nærmeste stikkontakt (normalt på bagsiden af inkubatoren) og indeholder en indgang til båndkablet for at forbinde til den roterende base. Strømforsyningen forbliver uden for inkubatoren. Basen placeres inde i inkubatoren (37 °C, 5% CO2) under drift, og båndkablet føres gennem inkubatordøren og tilsluttes strømforsyningen. Båndkablet forstyrrer ikke inkubatorforseglingen. Når den roterende base ikke er i brug, skal den opbevares uden for inkubatoren, opbevares sikkert på en laboratoriebænk eller hylde. Se materialefortegnelsen for detaljer om den anvendte kommercielle enhed. Klik her for at se en større version af denne figur.

# Start levedygtighed Såning tæthed celler / ml Slutlevedygtighed (F) Slutlevedygtighed (1G) Slutlevedygtighed (SMG) Afslut konc (F) celler/ml Afslut konc-celler (1G)/ml End Conc (SMG) celler/ml Noter
Suboptimal startlevedygtighed og såtæthed (negativt resultat) 1 79% 0,2 x 106 67% 60% 60% 0,10 x 106 0,075 x 106 0,071 x 106 Lav såtæthed og suboptimal startlevedygtighed førte til celledød i løbet af behandlingsperioden
2 73% 0,2 x 106 43% 63% 70% 0,071 x 106 0,081 x 106 0,085 x 106
Optimal startlevedygtighed og såtæthed (positivt resultat) 3 93% 0,4 x 106 93% 93% 96% 1,2 x 106 1,1 x 106 1,5 x 106 Passende såtæthed og optimal startlevedygtighed førte til sund cellevækst og levedygtighed under hele behandlingen
4 92% 0,4 x 106 92% 92% 94% 0,81 x 106 0,80 x 106 0,70 x 106

Tabel 1: Sammenligningsdiagram, der viser mislykkede og vellykkede simulerede mikrogravitationsbehandlinger (SMG). NK92 startlevedygtighed og såtæthed blev sammenlignet med den resulterende slutlevedygtighed og slutkoncentrationer efter en 72 timers SMG-behandling i en 37 °C cellekulturinkubator suppleret med 5% CO2. To tilfælde af negative resultater og to tilfælde af positive resultater blev sammenlignet. Til sammenligning skal du bemærke, at det optimale koncentrationsområde for den anvendte NK92-cellelinje var mellem 0,3 x 10 6 celler / ml og 1,2 x 106 celler / ml med en fordoblingstid på omkring 2-3 dage.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Da menneskeheden forbereder sig på længere rummissioner til Månen og Mars, skal der udføres mere forskning for at afbøde alvorlige sundhedsrisici hos astronauter. Et vigtigt aspekt af rummiljøet, der påvirker menneskelig fysiologi, er mikrogravity. Her er der beskrevet en cellekulturmetode til at udsætte lymfocytter for SMG ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt roterende cellekultursystem.

Denne protokol indeholder et par kritiske trin, der muligvis skal optimeres afhængigt af den celletype eller linje, der bruges. Disse omfatter 1) valg af en passende såtæthed afhængigt af cellernes fordoblingstid og længde af SMG-behandling og 2) bestemmelse af en optimal behandlingslængde, rotationshastighed og passende kontroller. Det bør være tilstrækkeligt at vælge en såtæthed, der ligger i mellemområdet for passende cellekoncentrationer for den celletype eller linje, der undersøges. Valg af en såtæthed, der er for lav, kan imidlertid føre til lav celleproliferation og levedygtighed (tabel 1), og valg af en tæthed, der er for høj, kan føre til for tidlig næringsstofudtømning og lav cellelevedygtighed. Den valgte såtæthed afhænger også af fordoblingstiden for de celler, der undersøges; Celler med en kortere fordoblingstid kan blive podet ved en lavere densitet, og dem med en længere fordoblingstid skal muligvis podes ved en højere densitet. Såtætheden og længden af behandlingen afhænger også af, hvor mange celler der er nødvendige for at fuldføre de efterfølgende eksperimentelle assays. Erfaringsmæssigt har såning af meget levedygtige (90%+) NK92-celler ved 0,4-0,5 x 10 6 celler/ml i 10 ml beholdere (dvs. 4-5 millioner celler pr. forsøgsgruppe; optimalt område for cellelinjen = 0,3 x 10 6-1,2 x 106 celler/ml, fordoblingstid = 2-3 dage) og behandling af dem i 72 timer givet ca. 8-15 millioner celler (tabel 1). Som sådan var de 10 ml beholdere egnede til høst af celler til både funktionelle assays (3 x 10 6 celler) og opsamling af celler til qPCR (1 x 10 6 celler) og western blot (2 x 10 6-6 x 10 6 celler). Supernatanter kan også indsamles til analyse af sekretoriske komponenter. Imidlertid er 50 ml beholdere også tilgængelige og kan bruges, når der kræves større celleudbytte. Ved brug af 50 ml beholdere skal der også bruges større sprøjter.

Bestemmelse af en passende behandlingslængde afhænger også af den celletype / linje, der anvendes. Hvis der findes tidligere undersøgelser, bør de henvises til for at vælge en passende behandlingslængde til at begynde med. Nogle få undersøgelser har brugt RWV-enheder til dyrkning af NK-celler og refereres her17,18,19. Derefter skal behandlingsresultaterne eller hvor godt cellerne spredte sig og deres levedygtighed og deres ydeevne i efterfølgende eksperimentelle assays undersøges. Det kan være muligt at forlænge behandlingslængden ud over 72 timer ved at fjerne cellekulturen fra karrene ind i et rør, centrifugere og derefter resuspendere cellerne i 10 ml varme, friske komplette kulturmedier, erstatte dem i karrene og genstarte rotationen. Dette kan dog introducere confounds på grund af eksponering for hypergravitation gennem centrifugering, og opdeling / fortynding af cellerne kan være nødvendig for at sikre, at cellerne holdes inden for deres optimale koncentrationsområde. Hvis der skal anvendes stimulerende molekyler (f.eks. LPS, cytokiner osv.), anbefales det, at disse tilsættes i en passende koncentration til den komplette medieopskrift, inden SMG-behandlingen påbegyndes.

Indstilling af en passende rotationshastighed (rpm) er også nøglen til at opretholde den simulerede mikrogravitybehandling. Virksomheden anbefaler at starte med en rotationshastighed mellem 8 og 10 o / min, når man dyrker lymfocytter. Erfaringsmæssigt har en hastighed på 11 omdr./min. fungeret godt for at sikre, at NK92-celler holdes i suspension og er blevet brugt i et tidligere NK-cellestudie17. Afhængigt af vækstmønstrene for den celletype/linje, der anvendes, kan det være nødvendigt at øge rotationshastigheden for at tage højde for celleklumpning. Dette ville føre til øget sedimentering af cellerne på grund af øget masse. For at opnå en optimal SMG-behandling skal dyrkningsbeholderens rotationshastighed justeres, så den svarer til sedimentationshastigheden for cellerne 5,6,8,9. Med andre ord bør celler eller celleklumper ikke ses falde gennem medierne, og de bør forblive relativt stationære.

I denne sammenhæng er det god praksis at prøve to negative kontroller ved at sammenligne celler dyrket i en standard T25-kulturkolbe ("kolbe") og celler dyrket i den specialiserede HARV, men ikke udsat for SMG (dvs. bare placeret i inkubatoren; "1G"). Ideelt set bør celleydelsen og resultaterne i downstream eksperimentelle assays mellem de to negative kontroller være sammenlignelige. Eventuelle uoverensstemmelser bør bemærkes. For de fleste analyser er den bedste sammenligning sandsynligvis mellem "1G" -kontrollen og SMG-behandlingen; Inkludering af både "Flask" og "1G" -kontrollerne kan dog være gavnligt for tilstrækkelig sammenligning og indledende optimering.

De største begrænsninger i denne protokol inkluderer 1) bobledannelse under cellekultur, 2) omfanget af SMG og 3) den mulige behandlingsvarighed. Det er afgørende at overvåge bobledannelse gennem hele SMG-behandlingen. Selv små mikrobobler kan akkumulere, vokse og føre til dannelse af meget forstyrrende større bobler. Disse større bobler afbryder lavforskydningsvæskedynamikken i kulturbeholderen, hvilket forårsager øget turbulens, da væskestrømmen afbøjes omkring boblen21. I sidste ende forstyrrer dette SMG-tilstanden fuldstændigt. Dette fænomen diskuteres udførligt og visualiseres af Phelan et al21. Derudover er det vigtigt at huske på, at denne enhed producerer SMG og ikke reel mikrogravitation som oplevet ombord på ISS6. Ikke desto mindre har undersøgelser vist lignende virkninger af SMG produceret af denne enhed sammenlignet med effekter af reel mikrogravitation fra undersøgelser udført på ISS 1,5,6.

Der findes alternative metoder til at udsætte cellekultur for SMG. Disse omfatter brugen af 3D-klinostater eller tilfældige positioneringsmaskiner (RPM) og diamagnetisk levitation. 3D-klinostater roterer cellekultur på to vinkelrette akser med samme hastighed, mens RPM'er roterer på to vinkelrette akser, hvorved både rotationshastigheden og retningsvirkningen randomiseres 5,6. Derfor er RPM'er sammenlignet med 2D-klinostater eller RWV-enheder mere komplekse, hvilket introducerer flere fordele og ulemper. For det første kan graden af mikrogravitation, der kan opnås i et RPM, moduleres for at simulere delvis tyngdekraft, som den, der opleves på Månen (0,16 g) og Mars (0,33 g)6. Den ekstra kompleksitet af randomiserede rotationsretninger og hastigheder kan imidlertid introducere rykbevægelse og accelererende kræfter, især mod de ydre områder af kulturfartøjet, hvilket potentielt kan føre til forvirringer i dataene. Diamagnetisk levitation udsætter prøver for stærke frastødende magnetfelter for at modvirke vægten af vand i biologiske prøver som en måde at modvirke tyngdekraften på. Imidlertid kan det stærke magnetfelt, der genereres for at gøre det, også påvirke cellerne negativt og derfor indføre confounds til dataene 5,6. Disse metoder behandles mere detaljeret andetsteds 5,6.

Afslutningsvis er det kommercielt tilgængelige roterende cellekultursystem, der diskuteres her, en relativt brugervenlig, tilgængelig platform for forskere, der ønsker at studere virkningerne af SMG på lymfocytter. Selvom der er begrænsninger for denne cellekulturmetode, forbliver den en levedygtig mulighed for dyrkning af lymfocytter og potentielt andre suspensionscellekulturer i simuleret mikrogravity.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde er støttet af Canadian Space Agency (CSA), forskningsbevilling (17ILSRA3, Immuno Profile). Forfattere vil gerne anerkende og takke Dr. Roxanne Fournier (University of Toronto), Dr. Randal Gregg (Lincoln Memorial University) og Preteesh Mylabathula (University of Arizona) for deres hjælp med den indledende fejlfinding af denne protokol.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL) Synthecon D-410 Gamma sterilized culture vessels (4/box)
Luer-Lok tip syringes (3 mL) BD 309657 For attaching to the 10 mL HARVs
NK92 Cell-line ATCC CRL-2407
Rotary Cell Culture System (RCCS) Synthecon RCCS-4D Rotating wall vessel device; 2D clinostat
Sarsedt 15 mL conical tubes Fisher Scientific 50-809-220
Sarsedt 50 mL conical tubes Fisher Scientific 50-809-218
Sarsedt sterile serological pipettes Fisher Scientific 86.1254.001
T25 suspension culture flasks Sarsedt 83.3910.502 For flask control

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. ElGindi, M., et al. May the force be with you (or not): the immune system under microgravity. Cells. 10 (8), 1941 (2021).
  2. Choukèr, A., Ullrich, O. The Immune System in Space: Are we Prepared. , Springer International Publishing. Cham. (2016).
  3. Crucian, B. E., et al. Immune system dysregulation during spaceflight: potential countermeasures for deep space exploration missions. Frontiers in Immunology. 9, 1437 (2018).
  4. Crucian, B. E., et al. Countermeasures-based improvements in stress, immune system dysregulation and latent herpesvirus reactivation onboard the International Space Station - relevance for deep space missions and terrestrial medicine. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 115, 68-76 (2020).
  5. Herranz, R., et al. Ground-based facilities for simulation of microgravity: organism-specific recommendations for their use, and recommended terminology. Astrobiology. 13 (1), 1-17 (2013).
  6. Ferranti, F., Del Bianco, M., Pacelli, C. Advantages and limitations of current microgravity platforms for space biology research. Applied Sciences. 11 (1), 68 (2020).
  7. Murphy, K., Weaver, C. Janeway's Immunobiology 9th Edition. , Garland Science/Taylor & Francis Group LLC. New York, NY. (2016).
  8. Dedolph, R. R., Dipert, M. H. The physical basis of gravity stimulus nullification by clinostat rotation. Plant Physiology. 47 (6), 756-764 (1971).
  9. Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), 12-25 (2001).
  10. Crabbé, A. Transcriptional and proteomic responses of Pseudomonas aeruginosa PAO1 to spaceflight conditions involve Hfq regulation and reveal a role for oxygen. Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1221-1230 (2011).
  11. Ulbrich, C., et al. The impact of simulated and real microgravity on bone cells and mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2014, 1-15 (2014).
  12. Martinez, E. M., Yoshida, M. C., Candelario, T. L. T., Hughes-Fulford, M. Spaceflight and simulated microgravity cause a significant reduction of key gene expression in early T-cell activation. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), 480-488 (2015).
  13. Jong, J., Maki, G., Klingemann, H. Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).
  14. Williams, B. A., et al. A phase I trial of NK-92 cells for refractory hematological malignancies relapsing after autologous hematopoietic cell. Oncotarget. 8 (51), 89256-89268 (2017).
  15. Cryopreservation of mammalian cell lines video protocol. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol (2022).
  16. Counting cells using a hemocytometer. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2022).
  17. Mylabathula, P. L., et al. Simulated microgravity disarms human NK-cells and inhibits anti-tumor cytotoxicity in vitro. Acta Astronautica. 174, 32-40 (2020).
  18. Li, Q., et al. Effects of simulated microgravity on primary human NK cells. Astrobiology. 13 (8), 703-714 (2013).
  19. Shao, D., et al. Mechanisms of the effect of simulated microgravity on the cytotoxicity of NK cells following the DNA methylation of NKG2D and the expression of DAP10. Microgravity Science and Technology. 33 (1), 6 (2021).
  20. Castro, S. L., Nelman-Gonzalez, M., Nickerson, C. A., Ott, C. M. Induction of attachment-independent biofilm formation and repression of hfq expression by low-fluid-shear culture of Staphylococcus aureus. Applied and Environmental Microbiology. 77 (18), 6368-6378 (2011).
  21. Phelan, M. A., Gianforcaro, A. L., Gerstenhaber, J. A., Lelkes, P. I. An air bubble-isolating rotating wall vessel bioreactor for improved spheroid/organoid formation. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (8), 479-488 (2019).

Tags

Tilbagetrækning udgave 186 Suspensionscellekultur lymfocytter simuleret mikrogravitation tidsgennemsnitlig tyngdekraftsvektorannullering 2D-klinostat roterende cellekultursystem roterende vægbeholderenhed
Dyrkning af lymfocytter i simuleret mikrogravitation ved hjælp af et roterende cellekultursystem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de Korte, M., Keating, A., Wang, C.… More

de Korte, M., Keating, A., Wang, C. Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System. J. Vis. Exp. (186), e63296, doi:10.3791/63296 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter