Summary
Это пошаговое руководство по использованию коммерчески доступной ротационной системы культивирования клеток для культивирования лимфоцитов в условиях имитации микрогравитации с использованием специализированных одноразовых сосудов для культивирования. Этот метод культивирования может быть применен к любой культуре клеток суспензионного типа.
Abstract
Учитывая текущие ограничения проведения биологических исследований в космосе, существует несколько вариантов воздействия на клеточную культуру смоделированной микрогравитации (SMG) на Земле. Эти варианты различаются по своим методам, принципам и пригодности для использования с культурой суспензионных клеток. Здесь описан метод культивирования клеток для воздействия на лимфоциты смоделированной микрогравитации с использованием коммерчески доступной ротационной системы культивирования клеток, также известной как 2D-клиностат или устройство с вращающейся стенкой (RWV). Этот метод культивирования клеток использует принцип усредненного по времени обнуления вектора гравитации для имитации микрогравитации путем вращения клеток вокруг горизонтальной оси. Клетки, культивируемые в этой системе, могут быть собраны и использованы во многих различных экспериментальных анализах для оценки влияния моделируемой микрогравитации на клеточную функцию и физиологию. Метод культивирования может незначительно варьироваться в зависимости от используемого типа клеток или линии, но описанный здесь способ может быть применен к любой культуре клеток суспензионного типа.
Introduction
Было показано, что космический полет влияет на многие аспекты физиологии человека, включая иммунную систему. Многие исследования продемонстрировали доказательства иммунной дисрегуляции в результате космического полета in vivo и воздействия моделируемой микрогравитации (SMG) in vitro1,2,3,4. Одним из основных аспектов космической среды, влияющих на физиологию человека, является микрогравитация. Микрогравитация относится к «невесомости», испытываемой из-за низких гравитационных сил в космической среде5. По мере того, как человечество готовится к более длительным космическим миссиям на Луну и Марс, необходимо провести дополнительные исследования, чтобы снизить серьезные риски для здоровья астронавтов.
Реальные условия микрогравитации для научных исследований могут быть достигнуты в космосе на борту Международной космической станции (МКС) или в наноспутниках, выводимых на орбиту; Однако эти варианты могут быть невероятно дорогостоящими и сложными в управлении. Учитывая текущие ограничения проведения биологических исследований в космосе, существует несколько вариантов индуцирования реальной микрогравитации и SMG на Земле. Существуют крупномасштабные операции, которые могут создавать короткие периоды реальной микрогравитации на Земле, включая падающие башни, параболический полет и зондирующие ракеты. Однако эти методы не слишком подходят для изучения воздействия микрогравитации на биологические системы, в основном из-за их коротких периодов обработки в условиях микрогравитации (т.е. от секунд до 20 минут). Эти методы более подробно обсуждаются в другом месте 5,6. Варианты, которые подходят для биологической культуры клеток, включают в себя небольшие устройства, такие как 2D-клиностаты или устройства с вращающимися стенками (RWV), а также 3D-клиностаты или машины случайного позиционирования (RPM). Эти устройства могут быть установлены внутри инкубаторов клеточных культур, поддерживаемых при температуре 37 °C и 5% CO2, и они вращают клеточную культуру либо по горизонтальной оси (2D), либо по двум перпендикулярным осям (3D)5. Тем не менее, важно подчеркнуть, что эти методы культивирования производят SMG в отличие от реальной микрогравитации, которая наиболее реально достигается в космосе для биологических исследований.
Цель настоящей статьи состоит в том, чтобы описать этапы воздействия на лимфоциты SMG с использованием коммерчески доступного устройства RWV (таблица материалов), которое подпадает под классификацию 2D-клиностата. Несмотря на то, что от производителя доступен общий протокол для работы с этим устройством, текущая статья направлена на более подробное рассмотрение шагов по устранению неполадок и оптимизации. В этой статье также рассматривается теория, лежащая в основе того, как это устройство работает для производства SMG в культуре суспензионных клеток, особенно с лимфоцитами. В этом контексте суспензионная клеточная культура относится к клеткам, свободно растущим в добавленных питательных средах, без прилипания к каким-либо дополнительным каркасам. Многие типы клеток выращиваются в культуре суспензионных клеток, включая лимфоциты. Лимфоциты - это клетки иммунной системы, включая Т, В и естественные клетки-киллеры (NK), которые находятся в лимфоидных органах и кровотоке7.
Описанный здесь клиностат RWV 2D работает по принципу усредненного по времени обнуления вектора гравитации 5,6,8,9, при котором вектор силы тяжести рандомизируется путем вращения культуры клеток вокруг горизонтальной оси. Это достигается путем согласования скорости вращения культивального сосуда со скоростью осаждения клеток. До тех пор, пока скорость вращения культурального сосуда хорошо согласуется со скоростью осаждения клеток, клетки находятся в свободном падении и не могут осаждаться, как это происходит в космической среде. После начальной фазы ускорения среда в сосуде для культивирования со временем достигает «вращения твердого тела». Это горизонтальное вращение также индуцирует ламинарный поток в сосуде клеточной культуры. Это создает среду «с низким сдвигом», учитывая, что напряжение сдвига, индуцированное на ячейки ламинарным потоком, намного меньше, чем у турбулентного потока. Однако, учитывая, что клиностат не является идеальной системой, вводятся небольшие движения ламинарной жидкости, которые оказывают минимальное напряжение сдвига на клетки. Таким образом, клетки, взвешенные в среде, увлекаются этим потоком во время вращения. Во время горизонтального вращения вектор силы тяжести воздействует на клетки и выводит их на колеблющуюся траекторию, как показано на рисунке 1. Другой небольшой источник напряжения сдвига вызван тем, что клетки «падают» через среду, вызывая ламинарный поток вокруг клеток. Когда культуральный сосуд вращается вокруг горизонтальной оси, вектор тяжести, испытываемый клетками, также вращается. Со временем этот вращающийся вектор гравитации в среднем приближается к нулю; это явление называется усредненным по времени обнулением вектора гравитации и индуцирует состояние SMG 5,6,8,9. Это устройство использовалось для изучения воздействия SMG на многие типы клеток, некоторые из которых описаны в ссылках10,11,12. Больше примеров можно найти на сайте производителя устройства.
В этом устройстве RWV используются специализированные «сосуды с высоким соотношением сторон» (HARV), доступные у производителя устройства. Каждый из этих HARV содержит 10 мл клеточной культуры; тем не менее, 50 мл HARV также доступны. Можно использовать либо 10 мл, либо 50 мл HARV в зависимости от того, сколько клеток необходимо для завершения любых последующих экспериментальных анализов, которые описаны далее в разделе обсуждения. HARV изготовлены из поликарбоната и включают силиконовую мембрану оксигенации, обеспечивающую газообмен во время культивирования клеток. Это поддерживает рН клеточной среды и обеспечивает эффективное клеточное дыхание. На лицевой стороне сосуда имеется основное заливное отверстие и два закрытых отверстия для шприцев (рис. 2A). После загрузки клеточной культуры через основное заливное отверстие в сосуд загружаются два шприца, чтобы помочь в удалении пузырьков. При использовании сосудов объемом 10 мл хорошо работают два шприца по 3 мл. Один шприц прикрепляется к устройству пустым, при этом шприц полностью нажат, а другой прикрепляется заполненным 3 мл клеточной культуры (рис. 2E). Они используются в комбинации для удаления пузырьков из сосуда, что важно для поддержания лечения SMG. Как правило, рекомендуется установить два отрицательных элемента управления, которые можно назвать контролем «Колба» и контролем «1G». Контроль «Колба» соответствует клеткам, которые выращиваются в стандартной колбе для культуры суспензионных клеток T25. Контроль 1G соответствует клеткам, которые выращиваются в специализированном сосуде для культивирования объемом 10 мл, который просто помещается в инкубатор (т.е. без обработки SMG). Дополнительные сведения об элементах управления см. в разделе «Обсуждение».
Описанный здесь метод подходит для любого исследователя, желающего изучить влияние SMG на лимфоциты, с особым акцентом на NK-клетки с использованием клеточной линииNK92 13. Результаты этих исследований могут помочь нам лучше понять и смягчить неблагоприятное воздействие космического полета на иммунную систему человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги должны быть выполнены внутри стерильного шкафа биологической безопасности.
1. Подготовка сосудов для культивирования клеток
- Достаньте сосуды для культивирования из пластиковой упаковки. Маркируйте каждый сосуд на ободе в соответствии с тем, какой тип/линия клеток используется, будь то контроль (1G) или обработка (SMG), а также любая другая соответствующая информация.
- Стабилизируйте сосуд и осторожно откройте заливное отверстие, не касаясь колышка/уплотнительного кольца крышки заливного порта. Поместите колпачок на прокладку для этанола колышком / уплотнительным кольцом вверх, пока сосуд наполняется. Не снимайте колпачки с портов шприца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если к колышку / уплотнительному кольцу случайно прикоснулись, сбрызните колпачок 70% этанолом и оставьте его (лицом вверх) на несколько секунд, пока он наполняет сосуд. Когда будете готовы снова закрыть заливное отверстие, поднимите крышку свежей бумажной салфеткой, чтобы тщательно высушить крышку, прежде чем снова положить ее на сосуд. - Загрузите в сосуд 10 мл соответствующей полной среды для клеточной культуры с помощью стерильной серологической пипетки и осторожно поместите крышку обратно на заливное отверстие.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь была использована линия NK-клеток NK92, которая культивировалась в среде GM1, как ранее было подтверждено в клиническом исследовании с использованием клеток NK92 в качестве клеточной терапии14. Используемая питательная среда зависит от культивируемой клеточной линии или типа клеток. Пожалуйста, проверьте веб-сайт поставщика, чтобы найти правильный рецепт носителя для используемой клеточной линии или типа ячейки. - Убедитесь, что крышки порта шприца и заливной порт надежно закрыты, и поместите заполненные сосуды в инкубатор с температурой 37 °C, 5% CO2 , выполняя последующие шаги по подготовке сосудов для культивирования клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап грунтовки помогает свести к минимуму образование крупных пузырьков, чтобы облегчить удаление пузырьков позже на шаге 6.
2. Подготовка культуры исходных клеток к установке обработки SMG
- Когда они не используются, храните интересующие элементы при температуре ниже -130 °C или, в идеале, в фазе паров жидкого азота.
- По крайней мере, за 1 неделю до начала запланированной обработки разморозьте клетки и культивируйте их, используя соответствующий рецепт среды для культивирования клеток, который можно найти на веб-сайте поставщика. Спланируйте, сколько клеток необходимо для организации лечения (подробности ниже в последующих шагах), и убедитесь, что культуры начали достаточно рано, чтобы обеспечить достаточную пролиферацию и адаптацию к культуре.
- Храните клеточную культуру в инкубаторе с 5%СО2 при температуре 37 °C. Более подробная информация о стандартной практике культивирования клеток рассматривается в другом месте15.
- В день плановой установки SMG определите начальную концентрацию и жизнеспособность исходной клеточной культуры.
- Используйте предпочтительный метод определения концентрации исходной культуры клеток (например, гемоцитометр, ViCell, проточная цитометрия и т.д.). Обратите внимание на концентрацию жизнеспособных клеток (клеток на мл) и жизнеспособность (%) клеток, гарантируя, что жизнеспособность в идеале превышает 85%. Протокол использования гемоцитометра можно найти в другом месте16.
- Определите подходящую плотность засева клеток/концентрацию клеточной культуры для обработки SMG, учитывая оптимальный диапазон концентраций клеток конкретного типа/линии клеток, время их удвоения и продолжительность обработки SMG. Пожалуйста, обратитесь к разделу «Обсуждение» для дальнейшей проработки.
ПРИМЕЧАНИЕ: По опыту, оптимальный диапазон концентраций для клеток NK92 составляет от 0,3 x 10 6 до 1,2 x 106 клеток / мл. Как правило, эти клетки имеют время удвоения 48-72 часа и питаются каждые 2-3 дня как таковые. Учитывая, что продолжительность лечения составляла 72 часа, клетки засевали в нижней границе их оптимального диапазона в количестве 0,4-0,5 х 10,6 клеток/мл. Поставщик также рекомендует такую плотность посева при запуске исходной культивирования клеток из свежего флакона с клетками NK92. - Определите объем культуры исходных клеток, необходимый для настройки лечения и контроля.
ПРИМЕЧАНИЕ: На каждую экспериментальную группу необходимо 10 мл клеточной культуры. Если созданы три экспериментальные группы (т.е. одна обработка: «SMG» и два отрицательных контроля: «Колба» и «1G»), еще 10 мл клеточной культуры достаточно для аликвоты в пробирку объемом 15 мл, используемую для загрузки шприцев HARV. В общей сложности это 40 мл, который может колебаться в зависимости от конкретного плана эксперимента. - Определите количество клеток, необходимых для настройки лечения.
- Рассчитайте общее количество необходимых клеток, умножив выбранную плотность посева (клетки / мл) на общий необходимый объем (мл).
ПРИМЕЧАНИЕ: Исходя из опыта работы с NK92, 40 мл исходной клеточной культуры готовят, как описано выше, при концентрации посева 0,4-0,5 х 106 клеток/мл. Таким образом, 16-20 x 106 клеток NK92 необходимы для завершения типичной схемы лечения. Для клеточной линии NK92 использование немного большего количества клеток лучше, чем немного меньшего количества клеток, для поддержания высокой жизнеспособности на протяжении всего лечения.
- Рассчитайте общее количество необходимых клеток, умножив выбранную плотность посева (клетки / мл) на общий необходимый объем (мл).
- Определите объем исходной клеточной культуры для отжима.
- Учитывая, что концентрация клеток представлена в виде клеток/мл, разделите общее количество клеток (клеток), необходимых для эксперимента, на измеренную начальную концентрацию клеточной культуры (клеток/мл).
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если необходимо 16 х 10 6 клеток, а начальная концентрация культуры составляет 0,8 х 106 клеток/мл, 20 мл культуры следует раскрутить.
- Учитывая, что концентрация клеток представлена в виде клеток/мл, разделите общее количество клеток (клеток), необходимых для эксперимента, на измеренную начальную концентрацию клеточной культуры (клеток/мл).
- Сделайте конечную исходную культуру клеток.
- Центрифугируют соответствующее количество клеток в дозе 300 x g в течение 8 мин в конической пробирке объемом 50 мл.
- Осторожно слейте надосадочную жидкость в контейнер для отходов и осторожно переверните трубку, чтобы ресуспендировать гранулы в небольшом оставшемся объеме.
- Ресуспендируют клетки в соответствующем объеме нагретой (37 °C) полной среды, чтобы довести культуру до желаемой плотности посева. Этот объем был рассчитан на шаге 2.6.
- Надежно закройте пробирку объемом 50 мл и осторожно переверните ее несколько раз, чтобы тщательно перемешать клеточную суспензию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если для проведения полного эксперимента требуется более 50 мл, лучше всего центрифугировать общее количество клеток, необходимых в конической пробирке объемом 50 мл, и ресуспендировать ее в половине необходимого объема. Затем хорошо перемешайте и сделайте разведение 1:2 в отдельной конической пробирке объемом 50 мл. Например, если требуется 100 мл при 0,4 x 10 6 клеток/мл, открутите 40 x 106 клеток в пробирке объемом 50 мл, ресуспендируйте в 50 мл среды, перенесите 25 мл в другую пробирку объемом 50 мл, а затем долейте обе по 25 мл свежей среды.
3. Погрузка сосудов с культивированием клеток
- Извлеките из инкубатора сосуды, заполненные средой.
- Если используется контроль «Колба», загрузите колбу для культуры суспензии T25 10 мл клеточной культуры из приготовленного выше запаса. Кроме того, добавьте 10 мл исходной клеточной культуры в отдельную коническую пробирку объемом 15 мл, которая будет использоваться для загрузки шприцев.
- Отвинтите крышки портов шприца, чтобы извлечь их из сосуда, и убедитесь, что запорные краны находятся в открытом положении (рис. 2C).
- Стабилизируйте сосуд и осторожно откройте заливное отверстие, не касаясь колышка/уплотнительного кольца крышки заливного порта. Поместите колпачок на прокладку для этанола колышком / уплотнительным кольцом вверх, пока сосуд наполняется. Аккуратно открутите колпачки от портов шприца.
- Убедитесь, что запорные краны находятся в открытом положении (рис. 2C). Осторожно вылейте среду из сосуда в контейнер для отходов, удалите среду с помощью серологической пипетки или аспирируйте ее с помощью стерильной стеклянной пипетки Пастера, прикрепленной к вакуумной системе, не касаясь мембраны оксигенации.
- Плотно закройте коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую исходную клеточную культуру, и осторожно переверните ее несколько раз, чтобы тщательно перемешать содержимое.
- Извлеките 10 мл сырья для клеточных культур из пробирки объемом 50 мл свежей стерильной серологической пипеткой. Поднимите сосуд и наклоните его так, чтобы заливное отверстие было направлено вверх, а затем осторожно распределите запас клеточной культуры в сосуд через заливное отверстие.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте внимательны и следите за объемом, чтобы культура не пролилась через порты шприца при наклоне сосуда. - Стремитесь наполнить сосуд прямо до верхней части кромки заливного отверстия, не проливая; Наклоняйте сосуд обратно вниз по мере наполнения, чтобы избежать просыпания. Будьте осторожны, чтобы не прикоснуться пипеткой к мембране оксигенации, так как она очень хрупкая.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс наполнения сосуда может потребовать некоторой практики; Наберитесь терпения и идите медленно. Если при открытии заливного отверстия образуется пузырчатая пленка, это будет мешать загрузке сосуда. Если это произошло, аккуратно ударьте по сосуду, чтобы разорвать уплотнение, созданное пузырьковой пленкой. - После загрузки судна осторожно наденьте крышку заливного порта, стараясь не касаться штифта/уплотнительного кольца.
- Разместите на шприцах.
ПРИМЕЧАНИЕ: На лицевой стороне сосуда есть два отверстия для шприцев (рис. 2A). Один будет держать пустой шприц, а другой будет держать шприц, полный клеточной культуры (рис. 2E).- Сначала прикрепите пустой шприц объемом 3 мл к одному из портов шприца, убедившись, что шприц полностью нажат.
ПРИМЕЧАНИЕ: Прокачайте шприцы несколько раз, прежде чем прикреплять их к сосуду, так как сначала они немного тугие. Делайте это внутри шкафа биологической безопасности, чтобы сохранить стерильность. - Плотно закройте коническую пробирку объемом 15 мл с 10 мл аликвотированной клеточной культуры и осторожно переверните ее несколько раз, чтобы тщательно перемешать содержимое.
- Затем осторожно полупогрузите второй шприц объемом 3 мл в культуру клеток и нарисуйте немного культуры. Чтобы свести к минимуму пузырьки воздуха в верхней части шприца, полностью выдавите его обратно в пробирку, а затем наберите 3 мл культуры.
- Прикрепите наполненный шприц к оставшемуся порту шприца и тщательно продезинфицируйте шприцы и вокруг заливного отверстия прокладкой для этанола. Не допускайте попадания этанола на оксигенационную мембрану. Теперь сосуд готов к избавлению от пузырьков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Второй заполненный шприц для второго сосуда труднее загрузить, учитывая глубину пробирки 15 мл. Это помогает наклонять пробирку при заполнении шприца, чтобы поддерживать уплотнение между заполняемым шприцем и культурой клеток. - Повторите шаги 3.3-3.10 для остальных судов. Если в конической пробирке объемом 50 мл для последнего сосуда осталось немного недостаточно клеточной культуры (например, 9,5 мл вместо 10 мл), извлеките оставшееся количество из конической трубки объемом 15 мл, используемой для загрузки шприцев.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги не обязательно должны выполняться в стерильном шкафу биологической безопасности, так как сосуд теперь представляет собой закрытую стерильную систему.
- Сначала прикрепите пустой шприц объемом 3 мл к одному из портов шприца, убедившись, что шприц полностью нажат.
4. Удаление пузырьков из сосудов
ПРИМЕЧАНИЕ: Пузырьки неизбежны в этой установке и должны последовательно удаляться на протяжении всего лечения (рис. 3). Пожалуйста, обратитесь к разделу «Обсуждение» для получения более подробной информации об этом.
- Убедитесь, что запорные краны порта шприца находятся в закрытом положении (рис. 2D), чтобы ограничить миграцию клеток и пузырьков из шприцев в сосуды. Это особенно важно в дальнейшем, во время лечения (обсуждается ниже). Чтобы собрать начальные пузырьки, переверните сосуд вверх дном и несколько раз ударьте его по стенке.
- Быстро переверните сосуд лицом вверх, а затем под небольшим углом в сторону, чтобы все пузырьки всплыли к восходящей стороне сосуда (рис. 3B).
- Маневрируйте пузырьками под портом с помощью пустого шприца и наблюдайте, как они начинают входить в порт. Откройте оба запорных крана порта шприца (рис. 2C).
- Осторожно ударьте по сосуду, чтобы пузырьки всплыли в пустой шприц. Медленно всасывайте более крупные пузырьки пустым шприцем, осторожно нажимая на полный шприц, чтобы поддерживать давление в сосуде, чтобы мембрана оксигенации не лопнула.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более крупные пузырьки необходимо будет всасывать, в то время как маленькие пузырьки и микропузырьки можно поощрять всплывать в шприц, вставляя их в отверстия шприца и осторожно ударяя по сосуду. После нескольких часов лечения очень важно свести к минимуму «перекрестное загрязнение» между клетками в шприцах и клетками в сосуде культуры. Это связано с тем, что клетки в шприцах не получают такого же количества оксигенации или воздействия SMG, как клетки в сосуде. - Повторите шаги 4.2-4.4 несколько раз, чтобы убедиться, что все пузырьки удалены. Удалите из сосудов все пузырьки, в том числе микропузырьки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пузырьки можно легко увидеть через оксигенационную мембрану (заднюю часть сосуда), когда сосуд направлен на источник света (окно, свет и т. Д.). При выполнении шагов 4.2 и 4.3 обратите внимание на пузырьки, движущиеся из задней части сосуда, чтобы визуализировать более трудновидимые пузырьки. - Когда пузырьки будут эффективно удалены, закройте запорные краны порта шприца. Не снимайте шприцы во время лечения, чтобы обеспечить последующее удаление пузырьков, убедившись, что объем в обоих шприцах примерно одинаков.
5. Крепление сосуда к вращающемуся основанию
- Тщательно протрите поверхность вращающегося основания и ленточного кабеля 70% этанолом.
- Убедитесь, что прилагаемый ленточный кабель подключен к источнику питания. Поместите вращающееся основание в инкубатор и прикрепите ленточный кабель к основанию. Убедитесь, что блок питания находится рядом, но снаружи инкубатора. На рисунке 4 показано вращающееся основание и блок питания для контекста.
- Прикрепите лечебный сосуд SMG, выровняв резьбу сосуда с вращающимся штифтом и осторожно повернув вращающийся штифт на основании против часовой стрелки. Убедитесь, что сосуд надежно закреплен. Убедитесь, что влажность инкубатора близка к 100%, заполнив поддон для воды достаточным количеством воды обратного осмоса (RO).
- Выберите подходящую скорость вращения (об/мин). Отрегулируйте скорость вращения в соответствии со скоростью осаждения клеток, чтобы клетки вообще не «проваливались сквозь среду», а в конечном итоге вращались по небольшой орбитальной траектории. Это явление визуализируется в виде принципиальной схемы на рисунке 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Компания рекомендует начинать вращение с 8-10 оборотов в минуту для лимфоцитов. В этом случае ячейки NK92 вращались со скоростью 11 об / мин, как показано в предыдущей статье17. В зависимости от размера ячейки частота вращения должна быть увеличена для больших ячеек и уменьшена для меньших ячеек. Та же картина применяется, если используемые клетки имеют тенденцию слипаться во время культивирования. Более подробную информацию об этом см. в разделе «Обсуждение».
6. Лечение
- Выберите подходящую продолжительность лечения для исследовательской заявки, которая может зависеть от того, какие параметры функции / физиологии клеток анализируются. Более подробную информацию об этом см. в разделе «Обсуждение».
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае клетки NK92 были подвергнуты 72-часовой обработке SMG, основываясь на результатах предыдущих исследований18,19. Пузырьки неизбежно будут образовываться на протяжении всего лечения, и их необходимо будет удалить. Вращение можно ненадолго остановить и перезапустить, чтобы облегчить это. Смотрите шаг 7.1, чтобы узнать, как безопасно снять сосуд SMG. - В первый день лечения проверяйте образование пузырьков каждые несколько часов, повторяя шаги 4.2-4.6. После первого дня проверяйте сосуды по мере необходимости (не реже одного раза в день), повторяя шаги 4.2-4.6, до конца лечения.
7. Забор клеток из сосудов
- По истечении запланированной продолжительности лечения остановите вращение и разберите аппарат. Снимите сосуд для обработки SMG, осторожно удерживая сосуд в неподвижном положении, поворачивая вращающийся штифт устройства по часовой стрелке.
- Перенесите контрольную колбу, контрольный сосуд 1G и обработанный сосуд SMG в стерильный шкаф биологической безопасности.
- Возьмите каждый сосуд (только 1G и SMG; не колбу) и переверните его вверх дном, чтобы он был обращен вниз, и осторожно ударьте по нему, чтобы привести все клетки в суспензию. Затем переверните сосуд на бок так, чтобы заливное отверстие было направлено ко дну, и снова ударьте по сосуду, чтобы побудить клетки двигаться к заливному отверстию для эффективной аспирации.
- Обрабатывайте каждое судно индивидуально. Открутите шприцы от двух портов и выбросьте их вместе с биологически опасными отходами. Откройте запорные краны на портах шприца.
- Осторожно снимите крышку заливного порта и вытащите содержимое стерильной серологической пипеткой объемом 10 мл, наклоняя сосуд по мере его опорожнения. Распределите содержимое групп «Колба», «1G» и «SMG» в конические пробирки объемом 15 мл с индивидуальной маркировкой.
- Закройте каждую пробирку и аккуратно переверните их несколько раз, чтобы убедиться, что они правильно перемешаны. Используйте предпочтительный метод определения концентрации и жизнеспособности полученной клеточной культуры для подготовки к использованию в последующих экспериментальных анализах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот метод культивирования считается успешным, если: 1) пролиферация клеток приблизительно одинакова в контрольных группах (и в идеале во всех экспериментальных группах), 2) пролиферация подходящая, учитывая плотность посева, продолжительность обработки и время удвоения типа/линии клеток, и 3) жизнеспособность собранных клеток составляет 85% или выше (таблица 1 ). В идеале полученные клетки должны быть такими же здоровыми, как и в стандартной клеточной культуре, особенно для использования в последующих экспериментах и анализах (т.е. жизнеспособность 85% или выше). Этот метод культивирования считается неудачным, если верно обратное, в результате чего полученные клетки либо умирают, либо существенно различаются по пролиферации в контрольных группах, либо имеют неоптимальную жизнеспособность около 70% или ниже (таблица 1). Пролиферация в группе лечения SMG может отличаться или не отличаться по сравнению с контрольной группой, в зависимости от того, как лечение SMG влияет на клеточную физиологию. Однако до настоящего времени это не было проблемой, и пролиферация клеток была примерно одинаковой в контрольной и лечебной группах (таблица 1). Как упоминалось ранее, эти параметры важны для успеха последующих анализов и экспериментов, и полученные клетки из двух контрольных групп должны работать относительно одинаково.
Рисунок 1: Принципиальная схема локализованной орбитальной траектории клеток, культивируемых в имитируемом сосуде микрогравитации (SMG) во время работы. Описанный здесь клиностат RWV 2D работает по принципу усредненного по времени обнуления вектора гравитации 5,6,8,9, при котором вектор силы тяжести рандомизируется путем вращения культуры клеток вокруг горизонтальной оси. Это достигается путем согласования скорости вращения культивального сосуда со скоростью осаждения клеток. После начальной фазы ускорения среда в сосуде для культивирования со временем достигает «вращения твердого тела». Это горизонтальное вращение также индуцирует ламинарный поток в сосуде клеточной культуры. Это создает среду «с низким сдвигом», учитывая, что напряжение сдвига, индуцированное на ячейки ламинарным потоком, намного меньше, чем у турбулентного потока. Однако, учитывая, что клиностат не является идеальной системой, вводятся небольшие движения ламинарной жидкости, которые оказывают минимальное напряжение сдвига на клетки. Таким образом, клетки, взвешенные в среде, увлекаются этим потоком во время вращения. При горизонтальном вращении вектор силы тяжести воздействует на клетки и выводит их на колебательную траекторию, что здесь и визуализируется. Когда культуральный сосуд вращается вокруг горизонтальной оси, вектор тяжести, испытываемый клетками, также вращается. Со временем этот вращающийся вектор гравитации в среднем приближается к нулю; это явление называется «усредненным по времени обнулением вектора гравитации» и индуцирует состояние SMG 5,6,8,9. Эта цифра была изменена из Castro et al., 201120. Создано с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Сосуд с высоким соотношением сторон (HARV) объемом 10 мл. (A) Вид HARV с высоты птичьего полета, показывающий основное заливное отверстие и два порта для шприцев. (B) На задней панели HARV показан навинчивающийся порт для подключения HARV к вращающемуся основанию и оксигенационной мембране. (C) Вид сбоку на HARV, показывающий открытые отверстия шприца (закрытые). (D) Вид сбоку на HARV, показывающий закрытые отверстия шприца (закрытые). (E) Вид сбоку на HARV, показывающий два прикрепленных шприца по 3 мл; Левый шприц заполнен клеточной культурой, а правый шприц пуст. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Пузырьки в HARV . (A) Вид HARV с высоты птичьего полета, показывающий пузырьки, которые должны быть удалены из клеточной культуры. (B) Вид сбоку на HARV, показывающий те же пузырьки. Обратите внимание, как пузырьки различаются по размеру; Микропузырьки также должны быть удалены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Вращающееся основание и источник питания устройства RWV . (A) Вид спереди вращающегося основания, показывающий четыре вращающихся колышка, которые могут вместить до четырех культуральных сосудов. (B) Вид сзади вращающегося основания, показывающий вход для ленточного кабеля (не изображен), который соединяет базу и источник питания. (C) Вид спереди источника питания, хранящегося в верхней части инкубатора. Обратите внимание на переключатель включения/выключения слева и диск регулировки оборотов справа. Блок питания подключается к ближайшей розетке (обычно на задней панели инкубатора) и включает в себя вход для подключения ленточного кабеля к вращающемуся основанию. Блок питания остается снаружи инкубатора. Основание помещается внутрь инкубатора (37 °C, 5% CO2) во время работы, а ленточный кабель подается через дверцу инкубатора и подключается к источнику питания. Ленточный кабель не мешает уплотнению инкубатора. Когда вращающееся основание не используется, его следует хранить вне инкубатора, безопасно хранить на лабораторном столе или полке. Обратитесь к Таблице материалов для получения подробной информации об используемом коммерческом устройстве. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| # | Начальная жизнеспособность | Плотность посева клеток/мл | Конечная жизнеспособность (F) | Конечная жизнеспособность (1G) | Конечная жизнеспособность (SMG) | Конечные Conc (F) клетки/мл | Конечные концевые клетки Conc (1G) / мл | Конечные клетки Conc (SMG) / мл | Примечания | |||||
| Неоптимальная стартовая жизнеспособность и плотность посева (отрицательный результат) | 1 | 79% | 0,2 х 106 | 67% | 60% | 60% | 0,10 х 106 | 0,075 х 106 | 0,071 х 106 | Низкая плотность посева и неоптимальная стартовая жизнеспособность приводили к гибели клеток в течение периода лечения | ||||
| 2 | 73% | 0,2 х 106 | 43% | 63% | 70% | 0,071 х 106 | 0,081 х 106 | 0,085 х 106 | ||||||
| Оптимальная стартовая жизнеспособность и плотность посева (положительный результат) | 3 | 93% | 0,4 х 106 | 93% | 93% | 96% | 1,2 х 106 | 1,1 х 106 | 1,5 х 106 | Соответствующая плотность посева и оптимальная стартовая жизнеспособность привели к росту здоровых клеток и жизнеспособности на протяжении всего лечения | ||||
| 4 | 92% | 0,4 х 106 | 92% | 92% | 94% | 0,81 х 106 | 0,80 х 106 | 0,70 х 106 | ||||||
Таблица 1: Сравнительная таблица, показывающая неудачные и успешные методы имитации микрогравитации (SMG). Начальную жизнеспособность NK92 и плотность посева сравнивали с результирующей конечной жизнеспособностью и конечными концентрациями после 72-часовой обработки SMG в инкубаторе клеточных культур с температурой 37 °C с добавлением 5% CO2. Были сопоставлены два случая отрицательных результатов и два случая положительных результатов. Для сравнения обратите внимание, что оптимальный диапазон концентраций используемой клеточной линии NK92 составлял от 0,3 x 10 6 клеток / мл до 1,2 x 106 клеток / мл с временем удвоения около 2-3 дней.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
По мере того, как человечество готовится к более длительным космическим миссиям на Луну и Марс, необходимо провести дополнительные исследования, чтобы снизить серьезные риски для здоровья астронавтов. Одним из основных аспектов космической среды, влияющих на физиологию человека, является микрогравитация. Здесь был описан метод культивирования клеток для подвергания лимфоцитов SMG с использованием коммерчески доступной системы ротационных клеточных культур.
Этот протокол содержит несколько важных шагов, которые может потребоваться оптимизировать в зависимости от типа ячейки или используемой линии. К ним относятся: 1) выбор подходящей плотности посева в зависимости от времени удвоения клеток и продолжительности обработки SMG, и 2) определение оптимальной длины обработки, скорости вращения и соответствующего контроля. Выбор плотности посева, которая находится в среднем диапазоне соответствующих концентраций клеток для исследуемого типа клеток или линии, должен быть достаточным. Однако выбор слишком низкой плотности посева может привести к низкой пролиферации и жизнеспособности клеток (таблица 1), а выбор слишком высокой плотности может привести к преждевременному истощению питательных веществ и низкой жизнеспособности клеток. Выбранная плотность посева также зависит от времени удвоения исследуемых клеток; Клетки с более коротким временем удвоения могут быть засеяны с более низкой плотностью, а клетки с более длительным временем удвоения, возможно, придется сеять с более высокой плотностью. Плотность посева и продолжительность лечения также зависят от того, сколько клеток необходимо для завершения последующих экспериментальных анализов. По опыту, посев высокожизнеспособных (90%+) клеток NK92 в дозе 0,4-0,5 x 106 клеток/мл в сосуды объемом 10 мл (т.е. 4-5 миллионов клеток на экспериментальную группу; оптимальный диапазон для клеточной линии = 0,3 x 10 6-1,2 x 106 клеток/мл, время удвоения = 2-3 дня) и обработка их в течение 72 часов дали примерно 8-15 миллионов клеток (таблица 1). Таким образом, сосуды объемом 10 мл подходили для сбора клеток как для функциональных анализов (3 x 10 6 клеток), так и для сбора клеток для кПЦР (1 x 10 6 клеток) и вестерн-блоттинга (2 x 10 6-6 x 10 6 клеток). Супернатанты также могут быть собраны для анализа секреторных компонентов. Тем не менее, сосуды объемом 50 мл также доступны и могут использоваться, когда требуется больший выход клеток. При использовании сосудов объемом 50 мл также необходимо использовать шприцы большего размера.
Определение подходящей продолжительности лечения также будет зависеть от типа / линии клеток, которые используются. Если существуют предыдущие исследования, на них следует сослаться, чтобы выбрать подходящую продолжительность лечения для начала. В нескольких исследованиях использовались устройства RWV для культивирования NK-клеток, и здесь упоминаются17,18,19. Исходя из этого, следует изучить результаты лечения или то, насколько хорошо клетки размножались, их жизнеспособность, а также их эффективность в последующих экспериментальных анализах. Можно продлить продолжительность лечения до 72 часов путем удаления клеточной культуры из сосудов в пробирку, центрифугирования, а затем ресуспендирования клеток в 10 мл теплых, свежих полных питательных сред, замены их в сосудах и возобновления вращения. Однако это может привести к путанице из-за воздействия гипергравитации через центрифугирование, и может потребоваться расщепление / разбавление клеток, чтобы гарантировать, что клетки удерживаются в пределах их оптимального диапазона концентрации. Если необходимо использовать какие-либо стимулирующие молекулы (например, ЛПС, цитокины и т.д.), рекомендуется добавлять их в соответствующей концентрации в полный рецепт среды перед началом обработки SMG.
Установка соответствующей скорости вращения (об/мин) также является ключом к поддержанию моделируемой микрогравитации. Компания рекомендует начинать со скорости вращения от 8 до 10 оборотов в минуту при культивировании лимфоцитов. По опыту, скорость 11 об / мин хорошо работала для обеспечения того, чтобы клетки NK92 оставались во взвешенном состоянии, и использовалась в прошлом исследованииNK-клеток 17. В зависимости от характера роста используемого типа/линии клеток, скорость вращения может потребоваться увеличить, чтобы учесть слипание клеток. Это привело бы к увеличению оседания клеток из-за увеличения массы. Для оптимальной обработки SMG скорость вращения питательного сосуда должна быть отрегулирована в соответствии со скоростью осаждения клеток 5,6,8,9. Другими словами, клетки или клеточные скопления не должны падать через среду, и они должны оставаться относительно неподвижными.
В этом контексте хорошей практикой является опробование двух отрицательных контрольных элементов путем сравнения клеток, выращенных в стандартной колбе для культивирования T25 («Колба»), и клеток, выращенных в специализированном HARV, но не подвергнутых SMG (т. е. просто помещенных в инкубатор; «1Г»). В идеале производительность клеток и результаты последующих экспериментальных анализов между двумя отрицательными контрольными группами должны быть сопоставимы. Следует отметить любые несоответствия. Для большинства анализов наилучшее сравнение, вероятно, между контролем «1G» и лечением SMG; однако включение элементов управления «Колба» и «1G» может быть полезным для достаточного сравнения и первоначальной оптимизации.
Основные ограничения этого протокола включают 1) образование пузырьков во время культивирования клеток, 2) степень SMG и 3) возможную продолжительность лечения. Крайне важно контролировать образование пузырьков на протяжении всей обработки SMG. Даже крошечные микропузырьки могут накапливаться, расти и приводить к образованию очень разрушительных более крупных пузырьков. Эти более крупные пузырьки прерывают динамику жидкости с низким сдвигом внутри сосуда культуры, вызывая повышенную турбулентность, поскольку поток жидкости отклоняется вокруг пузырька21. В конечном счете, это полностью нарушает состояние SMG. Это явление подробно обсуждается и визуализируется Феланом и др.21. Кроме того, важно иметь в виду, что это устройство производит пистолет-пулемет, а не реальную микрогравитацию, как это происходит на борту МКС-6. Тем не менее, исследования показали аналогичные эффекты SMG, производимые этим устройством, по сравнению с эффектами реальной микрогравитации из исследований, проведенных на МКС 1,5,6.
Существуют альтернативные методы воздействия SMG на клеточную культуру. К ним относятся использование 3D-клиностатов или машин случайного позиционирования (RPM) и диамагнитная левитация. 3D-клиностаты вращают клеточную культуру по двум перпендикулярным осям с одинаковой скоростью, в то время как RPM вращаются по двум перпендикулярным осям, в результате чего и скорость, и направленность вращения рандомизированы 5,6. Таким образом, по сравнению с 2D-клиностатами или устройствами RWV, RPM более сложны, что дает ряд преимуществ и недостатков. Во-первых, степень микрогравитации, которая может быть достигнута в RPM, может быть модулирована для имитации частичной гравитации, такой как та, которая наблюдается на Луне (0,16 g) и Марсе (0,33 g)6. Однако дополнительная сложность рандомизированных направлений и скоростей вращения может привести к рывковому движению и ускоряющим силам, особенно к внешним областям сосуда культуры, что может привести к путанице в данных. Диамагнитная левитация подвергает образцы воздействию сильных отталкивающих магнитных полей, чтобы противодействовать весу воды в биологических образцах, как способ противодействия гравитации. Однако сильное магнитное поле, генерируемое для этого, также может отрицательно влиять на клетки, что вносит путаницу в данные 5,6. Эти методы более подробно обсуждаются в другом месте 5,6.
В заключение, коммерчески доступная система ротационных клеточных культур, обсуждаемая здесь, является относительно простой в использовании и доступной платформой для ученых, желающих изучить влияние SMG на лимфоциты. Несмотря на то, что у этого метода культивирования клеток существуют ограничения, он остается жизнеспособным вариантом для культивирования лимфоцитов и, возможно, других суспензионных клеточных культур в условиях имитации микрогравитации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Конфликт интересов у авторов отсутствует.
Acknowledgments
Эта работа поддержана Канадским космическим агентством (CSA), исследовательский грант (17ILSRA3, Immuno Profile). Авторы выражают признательность и благодарность доктору Роксане Фурнье (Университет Торонто), доктору Рэндалу Греггу (Мемориальный университет Линкольна) и Претишу Милабатуле (Университет Аризоны) за их помощь в первоначальном устранении неполадок этого протокола.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL) | Synthecon | D-410 | Gamma sterilized culture vessels (4/box) |
| Luer-Lok tip syringes (3 mL) | BD | 309657 | For attaching to the 10 mL HARVs |
| NK92 Cell-line | ATCC | CRL-2407 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4D | Rotating wall vessel device; 2D clinostat |
| Sarsedt 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-220 | |
| Sarsedt 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-218 | |
| Sarsedt sterile serological pipettes | Fisher Scientific | 86.1254.001 | |
| T25 suspension culture flasks | Sarsedt | 83.3910.502 | For flask control |
References
- ElGindi, M., et al. May the force be with you (or not): the immune system under microgravity. Cells. 10 (8), 1941 (2021).
- Choukèr, A., Ullrich, O. The Immune System in Space: Are we Prepared. , Springer International Publishing. Cham. (2016).
- Crucian, B. E., et al. Immune system dysregulation during spaceflight: potential countermeasures for deep space exploration missions. Frontiers in Immunology. 9, 1437 (2018).
- Crucian, B. E., et al. Countermeasures-based improvements in stress, immune system dysregulation and latent herpesvirus reactivation onboard the International Space Station - relevance for deep space missions and terrestrial medicine. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 115, 68-76 (2020).
- Herranz, R., et al. Ground-based facilities for simulation of microgravity: organism-specific recommendations for their use, and recommended terminology. Astrobiology. 13 (1), 1-17 (2013).
- Ferranti, F., Del Bianco, M., Pacelli, C. Advantages and limitations of current microgravity platforms for space biology research. Applied Sciences. 11 (1), 68 (2020).
- Murphy, K., Weaver, C. Janeway's Immunobiology 9th Edition. , Garland Science/Taylor & Francis Group LLC. New York, NY. (2016).
- Dedolph, R. R., Dipert, M. H. The physical basis of gravity stimulus nullification by clinostat rotation. Plant Physiology. 47 (6), 756-764 (1971).
- Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), 12-25 (2001).
- Crabbé, A. Transcriptional and proteomic responses of Pseudomonas aeruginosa PAO1 to spaceflight conditions involve Hfq regulation and reveal a role for oxygen. Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1221-1230 (2011).
- Ulbrich, C., et al. The impact of simulated and real microgravity on bone cells and mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2014, 1-15 (2014).
- Martinez, E. M., Yoshida, M. C., Candelario, T. L. T., Hughes-Fulford, M. Spaceflight and simulated microgravity cause a significant reduction of key gene expression in early T-cell activation. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), 480-488 (2015).
- Jong, J., Maki, G., Klingemann, H. Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).
- Williams, B. A., et al. A phase I trial of NK-92 cells for refractory hematological malignancies relapsing after autologous hematopoietic cell. Oncotarget. 8 (51), 89256-89268 (2017).
- Cryopreservation of mammalian cell lines video protocol. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol (2022).
- Counting cells using a hemocytometer. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2022).
- Mylabathula, P. L., et al. Simulated microgravity disarms human NK-cells and inhibits anti-tumor cytotoxicity in vitro. Acta Astronautica. 174, 32-40 (2020).
- Li, Q., et al. Effects of simulated microgravity on primary human NK cells. Astrobiology. 13 (8), 703-714 (2013).
- Shao, D., et al. Mechanisms of the effect of simulated microgravity on the cytotoxicity of NK cells following the DNA methylation of NKG2D and the expression of DAP10. Microgravity Science and Technology. 33 (1), 6 (2021).
- Castro, S. L., Nelman-Gonzalez, M., Nickerson, C. A., Ott, C. M. Induction of attachment-independent biofilm formation and repression of hfq expression by low-fluid-shear culture of Staphylococcus aureus. Applied and Environmental Microbiology. 77 (18), 6368-6378 (2011).
- Phelan, M. A., Gianforcaro, A. L., Gerstenhaber, J. A., Lelkes, P. I. An air bubble-isolating rotating wall vessel bioreactor for improved spheroid/organoid formation. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (8), 479-488 (2019).
