Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Dyrking av lymfocytter i simulert mikrogravitasjon ved hjelp av et roterende cellekultursystem

Published: August 25, 2022 doi: 10.3791/63296
Automatic Translation
1,2, 1,2,4, 1,3
1Laboratory Medicine and Pathobiology, Temerty Faculty of Medicine, University of Toronto, 2Krembil Research Institute, Toronto Western Hospital, University Health Network, 3Pathology and Lab Medicine, Hematopathology, Mount Sinai Hospital, Sinai Health Systems, 4Medical Oncology and Hematology, Princess Margaret Cancer Centre

Summary

Dette er en trinnvis veiledning for bruk av et kommersielt tilgjengelig roterende cellekultursystem for å dyrke lymfocytter i simulert mikrogravitasjon ved bruk av spesialiserte engangskulturbeholdere. Denne dyrkingsmetoden kan anvendes på enhver suspensjon-type cellekultur.

Abstract

Gitt de nåværende begrensningene ved å utføre biologisk forskning i rommet, finnes det noen alternativer for å utsette cellekultur for simulert mikrogravitasjon (SMG) på jorden. Disse alternativene varierer i deres metoder, prinsipper og egnethet for bruk med suspensjonscellekultur. Her beskrives en cellekulturmetode for å utsette lymfocytter for simulert mikrogravitasjon ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig roterende cellekultursystem, også kjent som en 2D-klinostat eller en roterende veggbeholder (RWV) -enhet. Denne cellekulturmetoden benytter prinsippet om tidsgjennomsnittlig gravitasjonsvektornullifisering for å simulere mikrogravitasjon ved å rotere cellene på en horisontal akse. Cellene dyrket i dette systemet kan høstes og benyttes i mange forskjellige eksperimentelle analyser for å vurdere effekten av simulert mikrogravitasjon på cellulær funksjon og fysiologi. Dyrkingsteknikken kan variere noe avhengig av celletype eller linje som brukes, men metoden beskrevet her kan brukes på enhver suspensjonstype cellekultur.

Introduction

Romfart har vist seg å påvirke mange aspekter av menneskelig fysiologi, inkludert immunsystemet. Mange studier har vist bevis på immundysregulering som følge av romfart in vivo og eksponering for simulert mikrogravitasjon (SMG) in vitro 1,2,3,4. Et viktig aspekt av rommiljøet som påvirker menneskelig fysiologi er mikrogravitasjon. Mikrogravitasjon refererer til "vektløsheten" som oppleves på grunn av lave gravitasjonskrefter i rommiljøet5. Når menneskeheten forbereder seg på lengre romferder til månen og Mars, må det utføres mer forskning for å redusere alvorlige helserisiko hos astronauter.

Reelle mikrogravitasjonsforhold for vitenskapelig forskning kan oppnås i rommet ombord på Den internasjonale romstasjonen (ISS) eller i nanosatellitter lansert i bane; Imidlertid kan disse alternativene være utrolig kostbare og komplekse å orkestrere. Gitt de nåværende begrensningene ved å utføre biologisk forskning i rommet, finnes det flere alternativer for å indusere ekte mikrogravitasjon og SMG på jorden. Det finnes store operasjoner som kan produsere korte perioder med ekte mikrogravitasjon på jorden, inkludert falltårn, parabolsk flyging og lydende raketter. Imidlertid er disse metodene ikke altfor egnet for å studere effekten av mikrogravitasjon på biologiske systemer, hovedsakelig på grunn av deres korte perioder med mikrogravitasjonsbehandling (dvs. sekunder til 20 minutter). Disse metodene er nærmere omtalt andre steder 5,6. Alternativer som er egnet for biologisk cellekultur inkluderer småskala enheter som 2D klinostater eller roterende veggfartøy (RWV) enheter og 3D klinostater eller tilfeldige posisjoneringsmaskiner (RPM). Disse enhetene kan settes opp i cellekulturinkubatorer opprettholdt ved 37 ° C og 5% CO2, og de roterer cellekulturen enten på en horisontal akse (2D) eller på to vinkelrette akser (3D) 5. Det er imidlertid viktig å understreke at disse dyrkingsmetodene produserer SMG i motsetning til ekte mikrogravitasjon, som er mest mulig oppnådd i rommet for biologiske forskningssammenhenger.

Målet med det nåværende papiret er å skissere trinnene for å utsette lymfocytter til SMG ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig RWV-enhet (Table of Materials), som faller under 2D-klinostatklassifiseringen. Selv om det er en generell protokoll tilgjengelig fra produsenten for bruk av denne enheten, har den nåværende artikkelen som mål å dekke feilsøkings- og optimaliseringstrinnene mer detaljert. Denne artikkelen dekker også teorien bak hvordan denne enheten fungerer for å produsere SMG i suspensjonscellekultur, spesielt med lymfocytter. I denne sammenhengen refererer suspensjonscellekultur til celler som vokser fritt i supplerte kulturmedier, uten å feste seg til ytterligere stillas. Mange celletyper dyrkes i suspensjonscellekultur, inkludert lymfocytter. Lymfocytter er celler i immunsystemet, inkludert T, B og Natural Killer (NK) celler, som ligger i lymfoide organer og blodet7.

RWV 2D-klinostaten beskrevet her opererer på prinsippet om tidsgjennomsnittlig gravitasjonsvektornullifikasjon 5,6,8,9, hvorved tyngdevektoren randomiseres gjennom rotasjon av cellekulturen på en horisontal akse. Dette oppnås ved å matche rotasjonshastigheten til kulturbeholderen til cellens sedimentasjonshastighet. Så lenge rotasjonshastigheten til kulturbeholderen er godt tilpasset cellens sedimenteringshastighet, holdes cellene i fritt fall og ute av stand til å sedimentere, slik det oppleves i rommiljøet. Etter en innledende fartsfase når mediet i kulturbeholderen til slutt "solid kroppsrotasjon" over tid. Denne horisontale rotasjonen induserer også laminær strømning i cellekulturbeholderen. Dette skaper et "lavskjær" miljø, gitt at skjærspenningen indusert på cellene ved laminær strømning er mye mindre enn den turbulente strømningen. Men gitt at klinostaten ikke er et perfekt system, er det noen små, laminære væskebevegelser introdusert, noe som påfører minimal skjærspenning på cellene. Som sådan blir cellene suspendert i media dratt med av denne strømmen under rotasjon. Under horisontal rotasjon virker tyngdekraftvektoren på cellene og bringer dem inn i en oscillerende bane, som visualisert i figur 1. En annen liten kilde til skjærspenning er forårsaket av at cellene "faller" gjennom mediet, forårsaker laminær strøm rundt cellene. Når kulturbeholderen roterer på en horisontal akse, roterer tyngdekraftvektoren som cellene opplever, også. Over tid er denne roterende tyngdevektoren gjennomsnittlig for å nærme seg null; dette fenomenet kalles tidsgjennomsnittlig gravitasjonsvektornullifikasjon og induserer en tilstand på SMG 5,6,8,9. Denne enheten har blitt brukt til å studere effekten av SMG på mange typer celler, hvorav noen er dekket i referanser10,11,12. Du finner flere eksempler på enhetsprodusentens nettsted.

Denne RWV-enheten bruker spesialiserte "high aspect ratio vessels" (HARVs) tilgjengelig gjennom enhetsprodusenten. Disse HARVene holder 10 ml cellekultur hver; Imidlertid er 50 ml HARV også tilgjengelig. Enten 10 ml eller 50 ml HARV kan brukes, avhengig av hvor mange celler som trengs for å fullføre eventuelle nedstrøms eksperimentelle analyser, som er skissert nærmere i diskusjonsdelen. HARV-ene er laget av polykarbonat og inkluderer en silikonoksygeneringsmembran for å tillate gassutveksling under cellekultur. Dette opprettholder pH-verdien i cellemediet og muliggjør effektiv cellulær respirasjon. Det er en hovedfyllingsport og to kappede sprøyteporter på forsiden av fartøyet (figur 2A). Etter lasting av cellekulturen gjennom hovedfyllingsporten, lastes to sprøyter på fartøyet for å hjelpe til med boblefjerning. Ved bruk av 10 ml kar fungerer to 3 ml sprøyter godt. En sprøyte er festet til enheten tom, med sprøyten helt nedtrykt, og den andre er festet fylt med 3 ml cellekultur (figur 2E). Disse brukes i kombinasjon for å fjerne bobler fra karet, noe som er viktig for å opprettholde SMG-behandlingen. Generelt anbefales det å sette opp to negative kontroller, som kan refereres til som "Kolbe" -kontrollen og "1G" -kontrollen. "Kolbe" -kontrollen tilsvarer celler som dyrkes i en standard T25 suspensjonscellekulturkolbe. 1G-kontrollen tilsvarer celler som dyrkes i det spesialiserte 10 ml kulturfartøyet, som ganske enkelt plasseres i inkubatoren (dvs. uten å bli utsatt for SMG-behandlingen). Se diskusjonsdelen for mer informasjon om kontroller.

Metoden beskrevet her passer for enhver forsker som ønsker å studere effekten av SMG på lymfocytter, med et spesifikt fokus på NK-celler ved hjelp av NK92-cellelinjen13. Resultatene fra disse studiene kan hjelpe oss med å bedre forstå og redusere de negative effektene av romfart på det menneskelige immunsystemet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Følgende trinn skal fullføres inne i et sterilt biologisk sikkerhetsskap.

1. Fremstilling av fartøy for cellekultur

  1. Ta dyrkningskarene ut av plastemballasjen. Merk hvert fartøy på felgen etter hvilken celletype/linje som brukes, enten det er kontroll (1G) eller behandling (SMG), og eventuell annen relevant informasjon.
  2. Stabiliser beholderen og åpne påfyllingsporten forsiktig, uten å berøre påfyllingsportens pinne / O-ring. Plasser hetten på en etanolpute, med pinnen / O-ringen vendt opp, mens fartøyet fylles. Ikke fjern hettene fra sprøyteportene.
    MERK: Hvis pinnen/O-ringen berøres ved et uhell, spray hettepinnen med 70 % etanol og la den sitte (vendt oppover) en liten stund mens du fyller beholderen. Når du er klar til å lukke påfyllingsporten igjen, tar du opp lokket med en ny papirserviett for å tørke korken grundig før du legger den tilbake på beholderen.
  3. Legg beholderen med 10 ml av passende komplette medier for cellekulturen ved hjelp av en steril serologisk pipette, og sett lokket forsiktig tilbake på fyllporten.
    MERK: Her ble NK92 NK-cellelinjen brukt, som ble dyrket i GM1-medier, som tidligere validert i en klinisk studie med NK92-celler som celleterapi14. Kulturmediet som brukes, avhenger av cellelinjen eller celletypen som dyrkes. Vennligst sjekk leverandørens hjemmeside for riktig medieoppskrift for cellelinjen eller celletypen som brukes.
  4. Sørg for at sprøyteporthettene og påfyllingsporten er forsvarlig lukket, og plasser de fylte beholderne i en 37 °C, 5 % CO2 -inkubator mens du utfører de påfølgende trinnene for å klargjøre karene for cellekultur.
    MERK: Dette klargjøringstrinnet bidrar til å minimere dannelse av store bobler for å gjøre det enklere å drive ut bobler senere i trinn 6.

2. Klargjøring av stamcellekultur for SMG-behandlingsoppsettet

  1. Når de ikke er i bruk, oppbevar cellene av interesse ved en temperatur lavere enn -130 ° C eller, ideelt sett, i en flytende nitrogendampfase.
  2. Minst 1 uke før du setter opp den planlagte behandlingen, tine cellene og dyrke dem ved hjelp av riktig cellekulturmedieoppskrift som finnes på leverandørens nettsted. Planlegg hvor mange celler som trengs for å sette opp behandlingen (detaljer nedenfor i de påfølgende trinnene) og sørg for å starte kulturene tidlig nok til å tillate tilstrekkelig spredning og tilpasning til kultur.
  3. Oppbevar cellekulturen i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator. Ytterligere detaljer om standard cellekulturpraksis er dekket andre steder15.
  4. På dagen for det planlagte SMG-behandlingsoppsettet, bestem startkonsentrasjonen og levedyktigheten til den opprinnelige cellekulturen.
    1. Bruk den foretrukne metoden for å bestemme konsentrasjonen av den opprinnelige cellekulturen (f.eks. hemocytometer, ViCell, flowcytometri, etc.). Legg merke til levedyktig cellekonsentrasjon (celler per ml) og levedyktighet (%) av cellene, slik at levedyktigheten ideelt sett er større enn 85%. En protokoll for bruk av et hemocytometer finnes andre steder16.
  5. Bestem passende cellesåingstetthet / konsentrasjon av cellekulturen for SMG-behandling ved å vurdere det optimale cellekonsentrasjonsområdet for den aktuelle celletypen / linjen, deres doblingstid og lengden på SMG-behandling. Se diskusjonsdelen for ytterligere utdyping.
    MERK: Erfaringsmessig er det optimale konsentrasjonsområdet for NK92-celler mellom 0,3 x 10 6- 1,2 x 106 celler/ml. Vanligvis har disse cellene en doblingstid på 48-72 timer og blir matet hver 2-3 dager som sådan. Gitt at behandlingslengden var 72 timer, ble cellene sådd i den nedre enden av sitt optimale område ved 0,4-0,5 x 106 celler/ml. Leverandøren anbefaler også denne såingstettheten når den initiale cellekulturen startes fra et ferskt hetteglass med NK92-celler.
  6. Bestem volumet av lagercellekultur som er nødvendig for å sette opp behandlingen og kontrollene.
    MERK: 10 ml cellekultur er nødvendig per eksperimentell gruppe. Hvis tre eksperimentelle grupper er satt opp (dvs. en behandling: "SMG" og to negative kontroller: "Kolbe" og "1G"), er ytterligere 10 ml cellekultur tilstrekkelig til å alikote inn i et 15 ml rør som brukes til å laste HARV-sprøytene. Dette er 40 ml totalt, noe som kan variere avhengig av den spesifikke eksperimentelle designen.
  7. Bestem antall celler som trengs for å sette opp behandlingen.
    1. Beregn det totale antall celler som trengs ved å multiplisere den valgte såtettheten (celler / ml) med det totale volumet som trengs (ml).
      MERK: Fra erfaring med NK92 fremstilles 40 ml stamcellekultur som beskrevet ovenfor ved en såkonsentrasjon på 0,4-0,5 x 106 celler/ml. Som sådan er det nødvendig med 16-20 x 106 NK92-celler for å fullføre det typiske behandlingsoppsettet. For NK92-cellelinjen er bruk av litt flere celler bedre enn litt færre celler for å opprettholde høy levedyktighet gjennom hele behandlingen.
  8. Bestem volumet av innledende cellekultur for å spinne ned.
    1. Gitt at cellekonsentrasjon er representert som celler / ml, del det totale antall celler (celler) som trengs for eksperimentet med den målte startkonsentrasjonen av cellekulturen (celler / ml).
      MERK: For eksempel, hvis 16 x 10 6 celler er nødvendig og startkonsentrasjonen av kulturen er 0,8 x 106 celler / ml, bør 20 ml av kulturen bli spunnet ned.
  9. Lag den endelige stamcellekulturen.
    1. Sentrifuger riktig antall celler ved 300 x g i 8 minutter i et 50 ml konisk rør.
    2. Hell forsiktig av supernatanten i en avfallsbeholder, og knips forsiktig på røret for å resuspendere pelleten i det lille gjenværende volumet.
    3. Resuspender cellene i passende volum oppvarmet (37 °C) komplette medier for å bringe kulturen til ønsket såtetthet. Dette volumet ble beregnet i trinn 2.6.
    4. Sett lokk på 50 ml slangen forsvarlig, og snu den forsiktig opp ned noen ganger for å blande cellesuspensjonen grundig.
      MERK: Hvis mer enn 50 ml er nødvendig for å sette opp hele eksperimentet, er det best å sentrifugere det totale antall celler som trengs i et 50 ml konisk rør og resuspendere dette i halvparten av volumet som trengs. Bland deretter godt og gjør en 1: 2 fortynning i et separat 50 ml konisk rør. For eksempel, hvis 100 ml er nødvendig ved 0,4 x 10 6 celler / ml, spinn ned 40 x 106 celler i et 50 ml rør, resuspender i 50 ml media, overfør 25 ml til et annet 50 ml rør, og fyll deretter opp begge med 25 ml ferske medier.

3. Lasting av fartøy med lagercellekultur

  1. Hent de medieprimede fartøyene fra inkubatoren.
  2. Hvis en "Flask" -kontroll brukes, laster du en T25 suspensjonskulturflaske med 10 ml cellekultur fra lageret som er utarbeidet ovenfor. Tilsett også 10 ml lagercellekultur til et separat 15 ml konisk rør, som vil bli brukt til å laste sprøytene.
  3. Skru av sprøyteporthettene for å fjerne dem fra beholderen og sørg for at stoppekranene er i åpen stilling (figur 2C).
  4. Stabiliser beholderen og åpne påfyllingsporten forsiktig, uten å berøre påfyllingsportens pinne / O-ring. Plasser hetten på en etanolpute, med pinnen / O-ringen vendt opp, mens fartøyet fylles. Skru forsiktig av hettene fra sprøyteportene.
  5. Forsikre deg om at stoppekranene er i åpen stilling (figur 2C). Hell forsiktig mediet fra beholderen i en avfallsbeholder, fjern mediet ved hjelp av en serologisk pipette, eller aspirer det med en steril glass Pasteur-pipette festet til vakuumsystemet uten å berøre oksygeneringsmembranen.
  6. Lukk det 50 ml koniske røret som inneholder stamcellekulturen tett, og snu det forsiktig opp ned noen ganger for å blande innholdet grundig.
  7. Trekk opp 10 ml cellekulturlager fra 50 ml røret med en ny, steril serologisk pipette. Plukk opp fartøyet og vipp det slik at fyllingsporten er mot toppen, og dispenser deretter cellekulturbeholdningen forsiktig inn i fartøyet gjennom fyllingsporten.
    MERK: Vær forsiktig og se på volumet slik at kulturen ikke søler gjennom sprøyteportene mens du vipper fartøyet.
  8. Ta sikte på å fylle fartøyet helt til toppen av leppen på fyllingsporten uten å søle; Vipp fartøyet ned igjen mens det fylles for å unngå søl. Vær forsiktig så du ikke berører oksygeneringsmembranen med pipetten, da den er svært skjør.
    MERK: Fartøyets fyllingsprosess kan ta litt øvelse; Vær tålmodig og gå sakte. Hvis det dannes en boblefilm ved åpningen av fyllingsporten, vil dette forstyrre lasting av fartøyet. Hvis dette skjer, trykk forsiktig på fartøyet for å bryte forseglingen skapt av boblefilmen.
  9. Når fartøyet er lastet, setter du forsiktig på påfyllingsporthetten igjen, og sørger for at du ikke berører pinnen/O-ringen.
  10. Plasser på sprøytene.
    MERK: Det er to sprøyteporter på forsiden av fartøyet (figur 2A). Den ene holder en tom sprøyte, og den andre holder en sprøyte full av cellekultur (figur 2E).
    1. Fest først den tomme sprøyten på 3 ml til en av sprøyteportene, og pass på at sprøyten trykkes helt inn.
      MERK: Pump sprøytene et par ganger før du fester dem til beholderen, da de er litt stramme i begynnelsen. Gjør dette inne i det biologiske sikkerhetsskapet for å opprettholde steriliteten.
    2. Lukk det koniske røret på 15 ml tett med 10 ml cellekultur og snu det forsiktig opp ned noen ganger for å blande innholdet grundig.
    3. Deretter senker du forsiktig den andre 3 ml sprøyten i cellekulturen og trekker opp litt kultur. For å minimere luftboblen i toppen av sprøyten, dispenser dette helt tilbake i røret, og trekk deretter opp 3 ml av kulturen.
    4. Fest den fylte sprøyten til den gjenværende sprøyteporten, og desinfiser sprøytene forsiktig og rundt fylleporten med en etanolpute. Ikke få etanol på oksygeneringsmembranen. Nå er fartøyet klart for å bli kvitt bobler.
      MERK: Den andre fylte sprøyten for det andre fartøyet er vanskeligere å laste gitt dybden på 15 ml røret. Det hjelper å vippe røret mens du fyller sprøyten for å opprettholde forseglingen mellom sprøyten som fylles og cellekulturen.
    5. Gjenta trinn 3.3-3.10 for de gjenværende fartøyene. Hvis det er litt utilstrekkelig mengde cellekultur igjen i 50 ml konisk rør for det siste karet (f.eks. 9,5 ml i stedet for 10 ml), gjenvinn den gjenværende mengden fra det 15 ml koniske røret som brukes til å laste sprøytene.
      MERK: Følgende trinn trenger ikke å finne sted i et sterilt biologisk sikkerhetsskap, da fartøyet nå er et lukket, sterilt system.

4. Fjerne bobler fra fartøyene

MERK: Bobler er uunngåelige i dette oppsettet og må fjernes konsekvent gjennom hele behandlingen (figur 3). Se diskusjonsdelen for mer informasjon om dette.

  1. Pass på at sprøyteportstoppekranene er i lukket stilling (figur 2D) for å begrense migrasjonen av celler og bobler fra sprøytene inn i karene. Dette er spesielt viktig senere under behandlingen (omtalt nedenfor). For å samle de første boblene, snu fartøyet opp ned og treff siden av det noen ganger.
  2. Vend fartøyet raskt tilbake til ansiktet oppover og deretter i en svak vinkel vendt bort slik at boblene flyter til oppsiden av fartøyet (figur 3B).
  3. Manøvrer boblene under porten med den tomme sprøyten og se dem begynne å komme inn i havnen. Åpne begge sprøyteportstoppekranene (figur 2C).
  4. Slå forsiktig på beholderen for å oppmuntre boblene til å flyte opp i den tomme sprøyten. Sug sakte opp de større boblene med den tomme sprøyten, mens du trykker forsiktig ned hele sprøyten, for å opprettholde trykket i karet slik at oksygeneringsmembranen ikke sprekker.
    MERK: Større bobler må suges opp, mens små bobler og mikrobobler kan oppmuntres til å flyte opp i sprøyten ved å manøvrere dem inn i sprøyteportene og forsiktig treffe beholderen. Etter noen timers behandling er det svært viktig å minimere "krysskontamineringen" mellom cellene i sprøytene og cellene i dyrkningsbeholderen. Dette skyldes at cellene i sprøytene ikke mottar samme mengde oksygenering eller eksponering for SMG som cellene i karet gjør.
  5. Gjenta trinn 4.2-4.4 noen ganger for å sikre at alle boblene er fjernet. Fjern alle bobler, inkludert mikrobobler, fra karene.
    MERK: Boblene kan lett ses gjennom oksygeneringsmembranen (baksiden av fartøyet) når fartøyet er rettet mot en lyskilde (vindu, lys, etc.). Når du utfører trinn 4.2 og 4.3, se på boblene som beveger seg fra baksiden av fartøyet for å visualisere boblene som er vanskeligere å se.
  6. Når boblene er effektivt fjernet, lukker du sprøyteportstoppekranene. Behold sprøytene på under behandlingen for å muliggjøre påfølgende boblefjerning, slik at volumet i begge sprøytene er omtrent likt.

5. Fest fartøyet til den roterende basen

  1. Tørk forsiktig overflaten av den roterende basen og båndkabelen med 70% etanol.
  2. Kontroller at den medfølgende båndkabelen er koblet til strømforsyningen. Plasser den roterende basen i inkubatoren og fest båndkabelen til basen. Sørg for at strømforsyningen holdes nær, men utenfor inkubatoren. Figur 4 viser den roterende basen og strømforsyningen for kontekst.
  3. Fest SMG-behandlingsbeholderen ved å stille opp fartøyets gjenger til den roterende pinnen og forsiktig vri den roterende pinnen på basen i retning mot urviseren. Forsikre deg om at fartøyet er festet sikkert. Sørg for at inkubatoren opprettholder nær 100% fuktighet ved å fylle vannbrettet med tilstrekkelig autoklavert, omvendt osmose (RO) vann.
  4. Velg en passende rotasjonshastighet (rpm). Juster rotasjonshastigheten for å matche sedimentasjonshastigheten til cellene, slik at cellene ikke "faller gjennom media" i det hele tatt, men ender opp med å rotere i en liten bane. Dette fenomenet er visualisert som et skjematisk diagram i figur 1.
    MERK: Selskapet anbefaler å starte rotasjonen ved 8-10 o / min for lymfocytter. I dette tilfellet ble NK92-celler rotert ved 11 o / min, som vist i en tidligere artikkel17. Avhengig av cellestørrelsen, bør rpm økes for større celler og reduseres for mindre celler. Det samme mønsteret gjelder hvis cellene som brukes har en tendens til å klumpe seg under dyrking. Se diskusjonsdelen for ytterligere detaljer om dette.

6. Behandling

  1. Velg en passende behandlingslengde for forskningsapplikasjonen, som kan avhenge av hvilke parametere for cellefunksjon / fysiologi som blir analysert. Se diskusjonsdelen for ytterligere detaljer om dette.
    MERK: I dette tilfellet ble NK92-celler utsatt for en 72 timers SMG-behandling, basert på resultater fra tidligere studier18,19. Bobler vil uunngåelig dannes gjennom hele behandlingen og må fjernes. Rotasjonen kan stoppes kort og startes på nytt for å lette dette. Se trinn 7.1 for hvordan du trygt fjerner SMG-fartøyet.
  2. På den første dagen for å sette opp behandlingen, sjekk for bobledannelse med noen timers mellomrom ved å gjenta trinn 4.2-4.6. Etter den første dagen, kontroller fartøyene etter behov (minst en gang per dag), gjenta trinn 4.2-4.6, til slutten av behandlingen.

7. Høsting av celler fra karene

  1. Når den planlagte behandlingslengden er gått, stopp rotasjonen og demonter apparatet. Fjern SMG-behandlingsbeholderen ved å holde fartøyet forsiktig i ro mens du dreier den roterende pinnen på enheten med urviseren.
  2. Ta kontrollkolben, kontroller 1G-fartøyet og det behandlede SMG-fartøyet inn i et sterilt biologisk sikkerhetsskap.
  3. Ta hvert fartøy (kun 1G og SMG, ikke kolben) og snu det opp ned slik at det vender nedover og treff det forsiktig for å bringe alle cellene i suspensjon. Snu deretter fartøyet på siden med fylleporten mot bunnen og treff fartøyet igjen for å oppmuntre cellene mot fyllingsporten for effektiv aspirasjon.
  4. Håndter hvert fartøy individuelt. Skru av sprøytene fra de to portene og kast dem i biologisk farlig avfall. Åpne stoppekranene på sprøyteportene.
  5. Fjern forsiktig påfyllingsporthetten og trekk opp innholdet med en steril 10 ml serologisk pipette, og vipp beholderen mens den tømmes. Dispenser innholdet i gruppene "Kolbe", "1G" og "SMG" i individuelt merkede 15 ml koniske rør.
  6. Lukk hvert rør og snu dem forsiktig et par ganger for å sikre at de er riktig blandet. Bruk den foretrukne metoden for å bestemme konsentrasjonen og levedyktigheten til den resulterende cellekulturen for å forberede for bruk i påfølgende eksperimentelle analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne dyrkingsmetoden anses som vellykket hvis 1) spredningen av cellene er omtrent konsistent på tvers av kontrollgruppene (og ideelt sett alle eksperimentelle grupper), 2) spredningen er hensiktsmessig gitt såtettheten, behandlingslengden og doblingstiden til celletypen / linjen, og 3) levedyktigheten til de høstede cellene er 85% eller høyere (tabell 1 ). Ideelt sett bør de resulterende cellene være så sunne som de ville være i standard cellekultur, spesielt for bruk i etterfølgende eksperimenter og analyser (dvs. levedyktighet 85% eller høyere). Denne dyrkingsmetoden anses som mislykket hvis det motsatte er tilfelle, hvorved de resulterende cellene enten dør, avviker vesentlig i spredning på tvers av kontrollgruppene, eller har suboptimal levedyktighet rundt 70% eller lavere (tabell 1). Spredning i SMG-behandlingsgruppen kan eller ikke kan avvike sammenlignet med kontrollene, avhengig av hvordan SMG-behandlingen påvirker cellulær fysiologi. Dette har imidlertid hittil ikke vært et problem, og celleproliferasjonen var tilnærmet lik på tvers av kontroll- og behandlingsgruppene (tab 1). Som nevnt tidligere er disse parametrene viktige for suksessen til nedstrømsanalyser og eksperimenter, og de resulterende cellene fra de to kontrollgruppene skal utføre relativt likt.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk diagram over den lokaliserte banebanen til cellene dyrket i simulert mikrogravitasjon (SMG) fartøy under drift. RWV 2D-klinostaten beskrevet her opererer på prinsippet om tidsgjennomsnittlig gravitasjonsvektornullifikasjon 5,6,8,9, hvorved tyngdevektoren randomiseres gjennom rotasjon av cellekulturen på en horisontal akse. Dette oppnås ved å matche rotasjonshastigheten til kulturbeholderen til cellens sedimentasjonshastighet. Etter en innledende fartsfase når mediet i kulturbeholderen til slutt "solid kroppsrotasjon" over tid. Denne horisontale rotasjonen induserer også laminær strømning i cellekulturbeholderen. Dette skaper et "lavskjær" miljø, gitt at skjærspenningen indusert på cellene ved laminær strømning er mye mindre enn den turbulente strømningen. Men gitt at klinostaten ikke er et perfekt system, er det noen små, laminære væskebevegelser introdusert, noe som påfører minimal skjærspenning på cellene. Som sådan blir cellene suspendert i media dratt med av denne strømmen under rotasjon. Under horisontal rotasjon virker tyngdekraftvektoren på cellene og bringer dem inn i en oscillerende bane, som visualiseres her. Når kulturbeholderen roterer på en horisontal akse, roterer tyngdekraftvektoren som cellene opplever, også. Over tid er denne roterende tyngdevektoren gjennomsnittlig for å nærme seg null; dette fenomenet kalles "time-averaged gravity vector nullification", og induserer en tilstand på SMG 5,6,8,9. Denne figuren er modifisert fra Castro et al., 201120. Laget med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: 10 ml fartøy med høyt sideforhold (HARV). (A) Fugleperspektiv av HARV, som viser hovedfyllingsporten og to sprøyteporter. (B) Baksiden av HARV som viser skrueporten for tilkobling av HARV til rotasjonsbasen og oksygeneringsmembranen. (C) Sidevisning av HARV som viser åpne sprøyteporter (kappet). (D) Sidevisning av HARV som viser lukkede sprøyteporter (avkortet). (E) Sidevisning av HARV som viser de to 3 ml sprøytene som er festet; Den venstre sprøyten er fylt med cellekultur og den høyre sprøyten er tom. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Bobler i HARV . (A) Fugleperspektiv av HARV, som viser bobler som skal elimineres fra cellekulturen. (B) Sidevisning av HARV, som viser de samme boblene. Legg merke til hvordan boblene varierer i størrelse; Mikrobobler må også fjernes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Roterende base og strømforsyning på RWV-enheten . (A) Sett forfra av den roterende basen, som viser fire roterende pinner som har plass til opptil fire kulturfartøy. (B) Sett fra baksiden av den roterende basen, som viser inngangen for båndkabelen (ikke avbildet) som kobler basen og strømforsyningen. (C) Sett forfra av strømforsyningen holdt på toppen av inkubatoren. Legg merke til av / på-bryteren til venstre og turtallsjusteringshjulet til høyre. Strømforsyningen er koblet til nærmeste stikkontakt (vanligvis på baksiden av inkubatoren) og inkluderer en inngang for båndkabelen for å koble til den roterende basen. Strømforsyningen forblir utenfor inkubatoren. Basen er plassert inne i inkubatoren (37 ° C, 5% CO2) under drift, og båndkabelen mates gjennom inkubatordøren og kobles til strømforsyningen. Båndkabelen forstyrrer ikke inkubatorforseglingen. Når den roterende basen ikke er i bruk, bør den holdes utenfor inkubatoren, trygt lagret på en laboratoriebenk eller hylle. Se materialfortegnelsen for detaljer om den kommersielle enheten som brukes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

# Starter levedyktighet Såing Tetthet celler / ml Slutt levedyktighet (F) Slutt levedyktighet (1G) Slutt levedyktighet (SMG) End Conc (F) celler/ml End Conc (1G) celler/ml End Conc (SMG) celler/ml Notater
Suboptimal startlevedyktighet og såtetthet (negativt utfall) 1 79% 0,2 x 106 67% 60% 60% 0,10 x 106 0,075 x 106 0,071 x 106 Lav såtetthet og suboptimal startlevedyktighet førte til celledød i løpet av behandlingsperioden
2 73% 0,2 x 106 43% 63% 70% 0,071 x 106 0,081 x 106 0,085 x 106
Optimal startlevedyktighet og såtetthet (positivt utfall) 3 93% 0,4 x 106 93% 93% 96% 1,2 x 106 1,1 x 106 1,5 x 106 Riktig såtetthet og optimal startlevedyktighet førte til sunn cellevekst og levedyktighet gjennom hele behandlingen
4 92% 0,4 x 106 92% 92% 94% 0,81 x 106 0,80 x 106 0,70 x 106

Tabell 1: Sammenligningsdiagram som viser mislykkede og vellykkede simulerte mikrogravitasjonsbehandlinger (SMG). NK92 startlevedyktighet og såtetthet ble sammenlignet med den resulterende sluttlevedyktigheten og sluttkonsentrasjonene etter en 72 timers SMG-behandling i en 37 °C cellekulturinkubator supplert med 5% CO2. To forekomster av negative utfall og to tilfeller av positive utfall ble sammenlignet. Til sammenligning, merk at det optimale konsentrasjonsområdet for NK92-cellelinjen som ble brukt var mellom 0,3 x 106 celler / ml og 1,2 x 106 celler / ml, med en doblingstid på rundt 2-3 dager.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Når menneskeheten forbereder seg på lengre romferder til månen og Mars, må det utføres mer forskning for å redusere alvorlige helserisiko hos astronauter. Et viktig aspekt av rommiljøet som påvirker menneskelig fysiologi er mikrogravitasjon. Her er det beskrevet en cellekulturmetode for å utsette lymfocytter for SMG ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig roterende cellekultursystem.

Denne protokollen inneholder noen kritiske trinn som kanskje må optimaliseres, avhengig av celletypen eller linjen som brukes. Disse inkluderer 1) å velge en passende såtetthet avhengig av cellens doblingstid og lengde på SMG-behandling, og 2) bestemme en optimal behandlingslengde, rotasjonshastighet og passende kontroller. Å velge en såtetthet som ligger i midten av passende cellekonsentrasjoner for celletypen eller linjen som studeres, bør være tilstrekkelig. Å velge en såtetthet som er for lav kan imidlertid føre til lav celleproliferasjon og levedyktighet (tabell 1), og å velge en tetthet som er for høy kan føre til for tidlig utarming av næringsstoffer og lav cellelevedyktighet. Den valgte såtettheten avhenger også av doblingstiden til cellene som studeres; Celler med kortere doblingstid kan sås med lavere tetthet, og de med lengre doblingstid må kanskje sås med høyere tetthet. Såtettheten og lengden på behandlingen avhenger også av hvor mange celler som trengs for å fullføre de påfølgende eksperimentelle analysene. Erfaringsmessig har såing av svært levedyktige (90%+) NK92-celler ved 0,4-0,5 x 10 6 celler/ml i 10 ml kar (dvs. 4-5 millioner celler per eksperimentell gruppe; optimalt område for cellelinjen = 0,3 x 10 6-1,2 x 106 celler/ml, doblingstid = 2-3 dager) og behandling av dem i 72 timer gitt omtrent 8-15 millioner celler (tabell 1). Som sådan var 10 ml karene egnet for høsting av celler for både funksjonelle analyser (3 x 10 6 celler) og innsamling av celler for qPCR (1 x 10 6 celler) og western blot (2 x 10 6-6 x 10 6 celler). Supernatanter kan også samles for analyse av sekretoriske komponenter. Imidlertid er 50 ml fartøy også tilgjengelige og kan brukes når større celleutbytte er nødvendig. Ved bruk av 50 ml kar må det også brukes større sprøyter.

Fastsettelse av passende behandlingslengde vil også avhenge av celletype/linje som benyttes. Hvis tidligere studier eksisterer, bør de henvises til for å velge en passende behandlingslengde til å begynne med. Noen få studier har brukt RWV-enheter til å dyrke NK-celler, og er referert her17,18,19. Derfra bør behandlingsresultatene eller hvor godt cellene prolifererte og deres levedyktighet, og deres ytelse i påfølgende eksperimentelle analyser, undersøkes. Det kan være mulig å forlenge behandlingslengden utover 72 timer ved å fjerne cellekulturen fra karene inn i et rør, sentrifugere og deretter resuspendere cellene i 10 ml varme, friske komplette kulturmedier, erstatte dem i karene og starte rotasjonen på nytt. Dette kan imidlertid introdusere forstyrrelser på grunn av eksponering for hypergravitasjon gjennom sentrifugering, og splitting / fortynning av cellene kan være nødvendig for å sikre at cellene holdes innenfor sitt optimale konsentrasjonsområde. Hvis noen stimulerende molekyler (f.eks. LPS, cytokiner, etc.) skal brukes, anbefales det at disse tilsettes i en passende konsentrasjon til den komplette medieoppskriften før du setter opp SMG-behandlingen.

Innstilling av passende rotasjonshastighet (rpm) er også nøkkelen til å opprettholde den simulerte mikrogravitasjonsbehandlingen. Selskapet anbefaler å starte med en rotasjonshastighet mellom 8 og 10 o / min når du dyrker lymfocytter. Erfaringsmessig har en hastighet på 11 o/min fungert godt for å sikre at NK92-celler holdes i suspensjon og har blitt brukt i en tidligere NK-cellestudie17. Avhengig av vekstmønstrene til celletypen / linjen som brukes, kan det hende at rotasjonshastigheten må økes for å ta hensyn til celleklumping. Dette ville føre til økt sedimentering av cellene på grunn av økt masse. For en optimal SMG-behandling må rotasjonshastigheten til kulturbeholderen justeres for å matche sedimentasjonshastigheten til cellene 5,6,8,9. Med andre ord, celler eller celleklumper bør ikke sees falle gjennom media, og de bør forbli relativt stasjonære.

I denne sammenheng er det god praksis å prøve to negative kontroller ved å sammenligne celler dyrket i en standard T25-kulturkolbe ("Kolbe") og celler dyrket i den spesialiserte HARV, men ikke utsatt for SMG (dvs. bare plassert i inkubatoren; "1G"). Ideelt sett bør celleytelsen og resultatene i nedstrøms eksperimentelle analyser mellom de to negative kontrollene være sammenlignbare. Eventuelle uoverensstemmelser bør noteres. For de fleste analyser er den beste sammenligningen sannsynligvis mellom "1G" -kontrollen og SMG-behandlingen; Imidlertid kan det være gunstig å inkludere både "Flask" og "1G" -kontrollene for tilstrekkelig sammenligning og innledende optimalisering.

De største begrensningene i denne protokollen inkluderer 1) bobledannelse under cellekultur, 2) omfanget av SMG og 3) mulig behandlingsvarighet. Det er avgjørende å overvåke bobledannelsen gjennom hele SMG-behandlingen. Selv ørsmå mikrobobler kan akkumuleres, vokse og føre til dannelse av svært forstyrrende større bobler. Disse større boblene avbryter væskedynamikken med lavt skjær i kulturbeholderen, noe som forårsaker økt turbulens når væskestrømmen avbøyes rundt boblen21. Til syvende og sist forstyrrer dette SMG-tilstanden fullstendig. Dette fenomenet diskuteres utførlig og visualiseres av Phelan et al21. I tillegg er det viktig å huske på at denne enheten produserer SMG og ikke ekte mikrogravitasjon som opplevd ombord på ISS6. Ikke desto mindre har studier vist lignende effekter av SMG produsert av denne enheten sammenlignet med effekter av ekte mikrogravitasjon fra studier utført på ISS 1,5,6.

Alternative metoder for å utsette cellekultur for SMG eksisterer. Disse inkluderer bruk av 3D-klinostater eller tilfeldige posisjoneringsmaskiner (RPM) og diamagnetisk levitasjon. 3D-klinostater roterer cellekultur på to vinkelrette akser med samme hastighet, mens RPM roterer på to vinkelrette akser, hvorved både hastigheten og retningen av rotasjonen er randomisert 5,6. Derfor, sammenlignet med 2D-klinostater eller RWV-enheter, er RPM mer komplekse, noe som introduserer flere fordeler og ulemper. For det første kan graden av mikrogravitasjon som kan oppnås i en RPM moduleres for å simulere delvis tyngdekraft, slik som den som oppleves på månen (0,16 g) og Mars (0,33 g)6. Imidlertid kan den ekstra kompleksiteten av randomiserte rotasjonsretninger og hastigheter introdusere rykkbevegelse og akselerative krefter, spesielt mot de ytre områdene av kulturfartøyet, noe som potensielt fører til forstyrrelser i dataene. Diamagnetisk levitasjon utsetter prøver for sterke frastøtende magnetfelt for å motvirke vekten av vann i biologiske prøver, som en måte å motvirke tyngdekraften på. Imidlertid kan det sterke magnetfeltet som genereres for å gjøre det, også påvirke cellene negativt, og derfor introdusere forstyrrelser til dataene 5,6. Disse metodene er nærmere omtalt andre steder 5,6.

Avslutningsvis er det kommersielt tilgjengelige roterende cellekultursystemet diskutert her en relativt brukervennlig, tilgjengelig plattform for forskere som ønsker å studere effekten av SMG på lymfocytter. Selv om det er begrensninger i denne cellekulturmetoden, er det fortsatt et levedyktig alternativ for dyrking av lymfocytter og potensielt andre suspensjonscellekulturer i simulert mikrogravitasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet støttes av Canadian Space Agency (CSA), forskningsstipend (17ILSRA3, Immuno Profile). Forfattere vil gjerne anerkjenne og takke Dr. Roxanne Fournier (University of Toronto), Dr. Randal Gregg (Lincoln Memorial University) og Preteesh Mylabathula (University of Arizona) for deres hjelp med den første feilsøkingen av denne protokollen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL) Synthecon D-410 Gamma sterilized culture vessels (4/box)
Luer-Lok tip syringes (3 mL) BD 309657 For attaching to the 10 mL HARVs
NK92 Cell-line ATCC CRL-2407
Rotary Cell Culture System (RCCS) Synthecon RCCS-4D Rotating wall vessel device; 2D clinostat
Sarsedt 15 mL conical tubes Fisher Scientific 50-809-220
Sarsedt 50 mL conical tubes Fisher Scientific 50-809-218
Sarsedt sterile serological pipettes Fisher Scientific 86.1254.001
T25 suspension culture flasks Sarsedt 83.3910.502 For flask control

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. ElGindi, M., et al. May the force be with you (or not): the immune system under microgravity. Cells. 10 (8), 1941 (2021).
  2. Choukèr, A., Ullrich, O. The Immune System in Space: Are we Prepared. , Springer International Publishing. Cham. (2016).
  3. Crucian, B. E., et al. Immune system dysregulation during spaceflight: potential countermeasures for deep space exploration missions. Frontiers in Immunology. 9, 1437 (2018).
  4. Crucian, B. E., et al. Countermeasures-based improvements in stress, immune system dysregulation and latent herpesvirus reactivation onboard the International Space Station - relevance for deep space missions and terrestrial medicine. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 115, 68-76 (2020).
  5. Herranz, R., et al. Ground-based facilities for simulation of microgravity: organism-specific recommendations for their use, and recommended terminology. Astrobiology. 13 (1), 1-17 (2013).
  6. Ferranti, F., Del Bianco, M., Pacelli, C. Advantages and limitations of current microgravity platforms for space biology research. Applied Sciences. 11 (1), 68 (2020).
  7. Murphy, K., Weaver, C. Janeway's Immunobiology 9th Edition. , Garland Science/Taylor & Francis Group LLC. New York, NY. (2016).
  8. Dedolph, R. R., Dipert, M. H. The physical basis of gravity stimulus nullification by clinostat rotation. Plant Physiology. 47 (6), 756-764 (1971).
  9. Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), 12-25 (2001).
  10. Crabbé, A. Transcriptional and proteomic responses of Pseudomonas aeruginosa PAO1 to spaceflight conditions involve Hfq regulation and reveal a role for oxygen. Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1221-1230 (2011).
  11. Ulbrich, C., et al. The impact of simulated and real microgravity on bone cells and mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2014, 1-15 (2014).
  12. Martinez, E. M., Yoshida, M. C., Candelario, T. L. T., Hughes-Fulford, M. Spaceflight and simulated microgravity cause a significant reduction of key gene expression in early T-cell activation. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), 480-488 (2015).
  13. Jong, J., Maki, G., Klingemann, H. Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).
  14. Williams, B. A., et al. A phase I trial of NK-92 cells for refractory hematological malignancies relapsing after autologous hematopoietic cell. Oncotarget. 8 (51), 89256-89268 (2017).
  15. Cryopreservation of mammalian cell lines video protocol. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol (2022).
  16. Counting cells using a hemocytometer. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2022).
  17. Mylabathula, P. L., et al. Simulated microgravity disarms human NK-cells and inhibits anti-tumor cytotoxicity in vitro. Acta Astronautica. 174, 32-40 (2020).
  18. Li, Q., et al. Effects of simulated microgravity on primary human NK cells. Astrobiology. 13 (8), 703-714 (2013).
  19. Shao, D., et al. Mechanisms of the effect of simulated microgravity on the cytotoxicity of NK cells following the DNA methylation of NKG2D and the expression of DAP10. Microgravity Science and Technology. 33 (1), 6 (2021).
  20. Castro, S. L., Nelman-Gonzalez, M., Nickerson, C. A., Ott, C. M. Induction of attachment-independent biofilm formation and repression of hfq expression by low-fluid-shear culture of Staphylococcus aureus. Applied and Environmental Microbiology. 77 (18), 6368-6378 (2011).
  21. Phelan, M. A., Gianforcaro, A. L., Gerstenhaber, J. A., Lelkes, P. I. An air bubble-isolating rotating wall vessel bioreactor for improved spheroid/organoid formation. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (8), 479-488 (2019).

Tags

Retraksjon utgave 186 suspensjonscellekultur lymfocytter simulert mikrogravitasjon tidsgjennomsnittlig gravitasjonsvektornullifikasjon 2D-klinostat roterende cellekultursystem roterende veggbeholderanordning
Dyrking av lymfocytter i simulert mikrogravitasjon ved hjelp av et roterende cellekultursystem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de Korte, M., Keating, A., Wang, C.… More

de Korte, M., Keating, A., Wang, C. Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System. J. Vis. Exp. (186), e63296, doi:10.3791/63296 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter