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Immunology and Infection

Kultivierung von Lymphozyten in simulierter Schwerelosigkeit mit einem rotierenden Zellkultursystem

Published: August 25, 2022 doi: 10.3791/63296
Automatic Translation
1,2, 1,2,4, 1,3
1Laboratory Medicine and Pathobiology, Temerty Faculty of Medicine, University of Toronto, 2Krembil Research Institute, Toronto Western Hospital, University Health Network, 3Pathology and Lab Medicine, Hematopathology, Mount Sinai Hospital, Sinai Health Systems, 4Medical Oncology and Hematology, Princess Margaret Cancer Centre

Summary

Dies ist eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Verwendung eines kommerziell erhältlichen rotierenden Zellkultursystems zur Kultivierung von Lymphozyten in simulierter Schwerelosigkeit mit speziellen Einweg-Kulturgefäßen. Diese Kultivierungsmethode kann auf jede Suspensionszellkultur angewendet werden.

Abstract

Angesichts der derzeitigen Einschränkungen der biologischen Forschung im Weltraum gibt es einige Möglichkeiten, Zellkulturen auf der Erde einer simulierten Schwerelosigkeit (SMG) auszusetzen. Diese Optionen unterscheiden sich in ihren Methoden, Prinzipien und ihrer Eignung für die Verwendung mit Suspensionszellkulturen. In dieser Arbeit wird ein Zellkulturverfahren beschrieben, bei dem Lymphozyten unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen rotierenden Zellkultursystems, auch bekannt als 2D-Klinostat oder Rotating Wall Vessel (RWV)-Gerät, einer simulierten Schwerelosigkeit ausgesetzt werden. Diese Zellkulturmethode nutzt das Prinzip der zeitgemittelten Gravitationsvektoraufhebung, um die Schwerelosigkeit zu simulieren, indem die Zellen um eine horizontale Achse gedreht werden. Die in diesem System kultivierten Zellen können geerntet und in vielen verschiedenen experimentellen Assays verwendet werden, um die Auswirkungen der simulierten Schwerelosigkeit auf die zelluläre Funktion und Physiologie zu bewerten. Die Kultivierungstechnik kann je nach verwendetem Zelltyp oder Zelllinie leicht variieren, aber die hier beschriebene Methode kann auf jede Suspensionszellkultur angewendet werden.

Introduction

Es hat sich gezeigt, dass die Raumfahrt viele Aspekte der menschlichen Physiologie beeinflusst, einschließlich des Immunsystems. Viele Studien haben Hinweise auf eine Fehlregulation des Immunsystems als Folge von Raumflügen in vivo und Exposition gegenüber simulierter Schwerelosigkeit (SMG) in vitro gezeigt 1,2,3,4. Ein wichtiger Aspekt der Weltraumumgebung, der sich auf die menschliche Physiologie auswirkt, ist die Schwerelosigkeit. Mikrogravitation bezieht sich auf die "Schwerelosigkeit", die aufgrund geringer Gravitationskräfte in der Weltraumumgebung erlebtwird 5. Während sich die Menschheit auf längere Weltraummissionen zu Mond und Mars vorbereitet, muss mehr Forschung betrieben werden, um ernsthafte Gesundheitsrisiken bei Astronauten zu mindern.

Echte Schwerelosigkeitsbedingungen für die wissenschaftliche Forschung können im Weltraum an Bord der Internationalen Raumstation (ISS) oder in Nanosatelliten, die in den Orbit gebracht werden, erreicht werden. Diese Optionen können jedoch unglaublich kostspielig und komplex in der Orchestrierung sein. Angesichts der derzeitigen Einschränkungen der biologischen Forschung im Weltraum gibt es mehrere Möglichkeiten, echte Schwerelosigkeit und SMG auf der Erde zu induzieren. Es gibt groß angelegte Operationen, die kurze Perioden echter Schwerelosigkeit auf der Erde erzeugen können, darunter Falltürme, Parabelflüge und Höhenforschungsraketen. Diese Methoden sind jedoch nicht übermäßig geeignet, um die Auswirkungen der Schwerelosigkeit auf biologische Systeme zu untersuchen, was vor allem auf ihre kurzen Zeiträume der Mikrogravitationsbehandlung (d. h. Sekunden bis 20 Minuten) zurückzuführen ist. Diese Methoden werden an anderer Stelle ausführlicher erörtert 5,6. Zu den Optionen, die für die biologische Zellkultur geeignet sind, gehören kleine Geräte wie 2D-Klinostate oder RWV-Geräte (Rotating Wall Vessel) und 3D-Klinostate oder Zufallspositioniermaschinen (RPM). Diese Geräte können in Zellkulturinkubatoren bei 37 °C und 5 % CO2 aufgestellt werden und drehen die Zellkultur entweder um eine horizontale Achse (2D) oder um zwei senkrechte Achsen (3D)5. Es ist jedoch wichtig zu betonen, dass diese Kultivierungsmethoden SMG erzeugen, im Gegensatz zur echten Schwerelosigkeit, die im Weltraum für biologische Forschungskontexte am besten erreicht werden kann.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Schritte zur Subvention von Lymphozyten mit SMG unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen RWV-Geräts (Table of Materials) zu skizzieren, das unter die 2D-Klinostat-Klassifikation fällt. Während es vom Hersteller ein allgemeines Protokoll für den Betrieb dieses Geräts gibt, zielt der aktuelle Artikel darauf ab, die Schritte zur Fehlerbehebung und Optimierung genauer zu behandeln. Dieser Artikel behandelt auch die Theorie hinter der Funktionsweise dieses Geräts zur Herstellung von SMG in Suspensionszellkultur, insbesondere mit Lymphozyten. Suspensionszellkultur bezieht sich in diesem Zusammenhang auf Zellen, die in supplementierten Nährmedien frei wachsen, ohne an einem zusätzlichen Gerüst zu haften. Viele Zelltypen werden in Suspensionszellkultur gezüchtet, darunter auch Lymphozyten. Lymphozyten sind Zellen des Immunsystems, einschließlich T-, B- und natürlicher Killerzellen (NK), die sich in lymphatischen Organen und im Blutkreislauf befinden7.

Der hier beschriebene RWV-2D-Klinostat arbeitet nach dem Prinzip der zeitlich gemittelten Gravitationsvektor-Nullifikation 5,6,8,9, wobei der Gravitationsvektor durch Rotation der Zellkultur um eine horizontale Achse randomisiert wird. Dies wird erreicht, indem die Rotationsgeschwindigkeit des Kulturgefäßes an die Sedimentationsgeschwindigkeit der Zellen angepasst wird. Solange die Rotationsgeschwindigkeit des Kulturgefäßes gut auf die Sedimentationsgeschwindigkeit der Zellen abgestimmt ist, bleiben die Zellen im freien Fall und können nicht sedimentieren, wie es in der Weltraumumgebung der Fall ist. Nach einer anfänglichen Beschleunigungsphase erreicht das Medium im Kulturgefäß schließlich mit der Zeit eine "Festkörperrotation". Diese horizontale Rotation induziert auch eine laminare Strömung im Zellkulturgefäß. Dadurch entsteht eine "scherarme" Umgebung, da die Scherspannung, die durch laminare Strömung auf die Zellen induziert wird, viel geringer ist als die der turbulenten Strömung. Da der Klinostat jedoch kein perfektes System ist, gibt es einige kleine, laminare Flüssigkeitsbewegungen, die eine minimale Scherspannung auf die Zellen ausüben. So werden die im Medium schwebenden Zellen bei der Rotation von dieser Strömung mitgerissen. Während der horizontalen Rotation wirkt der Schwerkraftvektor auf die Zellen und bringt sie in eine oszillierende Bahn, wie in Abbildung 1 dargestellt. Eine weitere kleine Quelle der Scherspannung wird dadurch verursacht, dass die Zellen durch das Medium "fallen" und eine laminare Strömung um die Zellen herum verursachen. Wenn sich das Kulturgefäß um eine horizontale Achse dreht, dreht sich auch der Schwerkraftvektor, den die Zellen erfahren. Im Laufe der Zeit wird dieser rotierende Schwerkraftvektor gemittelt, um gegen Null zu gehen. Dieses Phänomen wird als zeitgemittelte Gravitationsvektor-Nullifikation bezeichnet und induziert einen Zustand vonSMG 5,6,8,9. Dieses Gerät wurde verwendet, um die Auswirkungen von SMG auf viele Zelltypen zu untersuchen, von denen einige in den Referenzen10, 11, 12 behandelt werden. Weitere Beispiele finden Sie auf der Website des Geräteherstellers.

Dieses RWV-Gerät verwendet spezielle "High Aspect Ratio Vessels" (HARVs), die über den Gerätehersteller erhältlich sind. Diese HARVs fassen jeweils 10 ml Zellkultur; Es sind jedoch auch 50-ml-HARVs erhältlich. Es können entweder 10-ml- oder 50-ml-HARVs verwendet werden, je nachdem, wie viele Zellen benötigt werden, um nachgeschaltete experimentelle Assays durchzuführen, was im Abschnitt "Diskussion" näher erläutert wird. Die HARVs bestehen aus Polycarbonat und verfügen über eine Silikon-Oxygenierungsmembran, um den Gasaustausch während der Zellkultur zu ermöglichen. Dadurch wird der pH-Wert des Zellmediums aufrechterhalten und eine effiziente Zellatmung ermöglicht. An der Vorderseite des Gefäßes befinden sich eine Hauptfüllöffnung und zwei Spritzenöffnungen mit Verschluss (Abbildung 2A). Nachdem die Zellkultur durch die Hauptfüllöffnung geladen wurde, werden zwei Spritzen auf das Gefäß geladen, um die Blasenentfernung zu unterstützen. Bei Verwendung der 10-ml-Gefäße funktionieren zwei 3-ml-Spritzen gut. Eine Spritze wird leer auf das Gerät aufgesteckt, wobei die Spritze vollständig niedergedrückt ist, und die andere wird mit 3 ml Zellkultur gefüllt (Abbildung 2E). Diese werden in Kombination verwendet, um Blasen aus dem Gefäß zu entfernen, was für die Aufrechterhaltung der SMG-Behandlung wichtig ist. Im Allgemeinen wird empfohlen, zwei Negativkontrollen einzurichten, die als "Flask"-Kontrolle und "1G"-Kontrolle bezeichnet werden können. Die "Flask"-Kontrolle entspricht Zellen, die in einem Standard-T25-Suspensionszellkulturkolben gezüchtet werden. Die 1G-Kontrolle entspricht Zellen, die in dem speziellen 10-ml-Kulturgefäß gezüchtet werden, das einfach in den Inkubator gelegt wird (d. h. ohne SMG-Behandlung). Weitere Informationen zu den Steuerelementen finden Sie im Abschnitt "Diskussion".

Die hier beschriebene Methode eignet sich für jeden Forscher, der die Auswirkungen von SMG auf Lymphozyten untersuchen möchte, mit besonderem Fokus auf NK-Zellen unter Verwendung der NK92-Zelllinie13. Die Ergebnisse dieser Studien könnten uns helfen, die negativen Auswirkungen der Raumfahrt auf das menschliche Immunsystem besser zu verstehen und abzumildern.

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Protocol

Anmerkungen: Die folgenden Schritte sollten in einer sterilen biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden.

1. Vorbereitung von Gefäßen für die Zellkultur

  1. Nehmen Sie die Kulturgefäße aus der Plastikverpackung. Beschriften Sie jedes Gefäß am Rand entsprechend dem verwendeten Zelltyp/der Zelllinie, ob es sich um die Kontrolle (1G) oder die Behandlung (SMG) handelt, und alle anderen relevanten Informationen.
  2. Stabilisieren Sie das Gefäß und öffnen Sie die Einfüllöffnung vorsichtig, ohne den Zapfen/O-Ring der Einfüllöffnung zu berühren. Setzen Sie die Kappe mit dem Stift/O-Ring nach oben auf ein Ethanolpad, während das Gefäß gefüllt wird. Entfernen Sie die Kappen nicht von den Spritzenanschlüssen.
    Anmerkungen: Wenn der Stift/O-Ring versehentlich berührt wird, sprühen Sie den Kappenstift mit 70%igem Ethanol ein und lassen Sie ihn einige Augenblicke (nach oben) stehen, während Sie das Gefäß füllen. Wenn Sie bereit sind, die Einfüllöffnung wieder zu schließen, nehmen Sie die Kappe mit einem frischen Papiertuch auf, um die Kappe gründlich zu trocknen, bevor Sie sie wieder auf das Gefäß setzen.
  3. Befüllen Sie das Gefäß mit 10 ml des für die Zellkultur geeigneten Komplettmediums mit einer sterilen serologischen Pipette und setzen Sie die Kappe vorsichtig wieder auf die Einfüllöffnung.
    HINWEIS: Hier wurde die NK92 NK-Zelllinie verwendet, die in GM1-Medien kultiviert wurde, wie zuvor in einer klinischen Studie mit NK92-Zellen als Zelltherapie validiert wurde14. Welche Nährmedien verwendet werden, hängt von der zu kultivierenden Zelllinie oder dem Zelltyp ab. Bitte informieren Sie sich auf der Website des Anbieters über die richtige Medienrezeptur für die verwendete Zelllinie oder den verwendeten Zelltyp.
  4. Stellen Sie sicher, dass die Kappen der Spritzenöffnungen und die Einfüllöffnung sicher verschlossen sind, und stellen Sie die gefüllten Gefäße in einen Inkubator mit einer Temperatur von 37 °C und 5 % CO2, während Sie die nachfolgenden Schritte zur Vorbereitung der Gefäße für die Zellkultur durchführen.
    Anmerkungen: Dieser Vorbereitungsschritt hilft, die Bildung großer Blasen zu minimieren, um das Ausstoßen von Blasen später in Schritt 6 zu erleichtern.

2. Vorbereitung der Stammzellkultur für den SMG-Behandlungsaufbau

  1. Lagern Sie die interessierenden Zellen bei Nichtgebrauch bei einer Temperatur von weniger als -130 °C oder idealerweise in einer flüssigen Stickstoffdampfphase.
  2. Tauen Sie die Zellen mindestens 1 Woche vor dem Einrichten der geplanten Behandlung auf und kultivieren Sie sie mit dem entsprechenden Rezept für Zellkulturmedien, das Sie auf der Website des Anbieters finden. Planen Sie, wie viele Zellen benötigt werden, um die Behandlung einzurichten (Details unten in den folgenden Schritten), und stellen Sie sicher, dass Sie die Kulturen früh genug beginnen, um eine ausreichende Proliferation und Anpassung an die Kultur zu ermöglichen.
  3. Lagern Sie die Zellkultur in einem Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2 . Weitere Einzelheiten zur Standard-Zellkulturpraxis werden an anderer Stellebehandelt 15.
  4. Bestimmen Sie am Tag des geplanten SMG-Behandlungsaufbaus die Ausgangskonzentration und Lebensfähigkeit der ursprünglichen Zellkultur.
    1. Verwenden Sie die bevorzugte Methode zur Bestimmung der Konzentration der Ausgangszellkultur (z. B. Hämozytometer, ViCell, Durchflusszytometrie usw.). Achten Sie auf die lebensfähige Zellkonzentration (Zellen pro ml) und die Lebensfähigkeit (%) der Zellen, um sicherzustellen, dass die Lebensfähigkeit idealerweise größer als 85 % ist. Ein Protokoll für die Verwendung eines Hämozytometers findet sich an anderer Stelle16.
  5. Bestimmen Sie die geeignete Zellkeimdichte/-konzentration der Zellkultur für die SMG-Behandlung unter Berücksichtigung des optimalen Zellkonzentrationsbereichs des jeweiligen Zelltyps/der Zelllinie, ihrer Verdopplungszeit und der Dauer der SMG-Behandlung. Weitere Informationen finden Sie im Abschnitt "Diskussion".
    HINWEIS: Erfahrungsgemäß liegt der optimale Konzentrationsbereich für NK92-Zellen zwischen 0,3 x 106 - 1,2 x 106 Zellen/ml. In der Regel haben diese Zellen eine Verdopplungszeit von 48-72 h und werden als solche alle 2-3 Tage gefüttert. Da die Behandlungsdauer 72 h betrug, wurden die Zellen am unteren Ende ihres optimalen Bereichs bei 0,4-0,5 x 106 Zellen/ml ausgesät. Der Lieferant empfiehlt diese Aussaatdichte auch, wenn die erste Zellkultur aus einem frischen Fläschchen mit NK92-Zellen gestartet wird.
  6. Bestimmen Sie das Volumen der Stammzellkultur, das zum Einrichten der Behandlung und der Kontrollen benötigt wird.
    HINWEIS: Pro Versuchsgruppe werden 10 ml Zellkultur benötigt. Wenn drei Versuchsgruppen aufgebaut werden (d. h. eine Behandlung: "SMG" und zwei Negativkontrollen: "Flask" und "1G"), reichen weitere 10 ml Zellkultur aus, um in ein 15-ml-Röhrchen zu aliquotieren, das zum Laden der HAHR-Spritzen verwendet wird. Dies sind insgesamt 40 ml, die je nach spezifischem Versuchsaufbau schwanken können.
  7. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen, die zum Einrichten der Behandlung benötigt werden.
    1. Berechnen Sie die Gesamtzahl der benötigten Zellen, indem Sie die gewählte Seeding-Dichte (Zellen/ml) mit dem benötigten Gesamtvolumen (ml) multiplizieren.
      HINWEIS: Aus Erfahrung mit NK92 werden 40 ml Stammzellkultur wie oben beschrieben bei einer Seeding-Konzentration von 0,4-0,5 x 106 Zellen/ml hergestellt. Daher werden 16-20 x 106 NK92-Zellen benötigt, um den typischen Behandlungsaufbau abzuschließen. Für die NK92-Zelllinie ist es besser, etwas mehr Zellen zu verwenden als etwas weniger Zellen, um eine hohe Lebensfähigkeit während der gesamten Behandlung aufrechtzuerhalten.
  8. Bestimmen Sie das Volumen der anfänglichen Zellkultur, die heruntergedreht werden soll.
    1. Da die Zellkonzentration als Zellen/ml angegeben wird, teilen Sie die Gesamtzahl der für das Experiment benötigten Zellen (Zellen) durch die gemessene Startkonzentration der Zellkultur (Zellen/ml).
      Anmerkungen: Wenn z. B. 16 x 10 6 Zellen benötigt werden und die Anfangskonzentration der Kultur 0,8 x 106 Zellen/ml beträgt, sollten 20 ml der Kultur heruntergeschleudert werden.
  9. Stellen Sie die endgültige Zellkultur her.
    1. Zentrifugieren Sie die entsprechende Anzahl von Zellen bei 300 x g für 8 min in einem konischen 50-ml-Röhrchen.
    2. Gießen Sie den Überstand vorsichtig in einen Abfallbehälter und schnippen Sie vorsichtig mit dem Röhrchen, um das Pellet in dem kleinen Restvolumen wieder zu suspendieren.
    3. Resuspendieren Sie die Zellen in der entsprechenden Menge des erwärmten (37 °C) Komplettmediums, um die Kultur auf die gewünschte Samendichte zu bringen. Dieses Volumen wurde in Schritt 2.6 berechnet.
    4. Verschließen Sie das 50-ml-Röhrchen fest und drehen Sie es einige Male vorsichtig um, um die Zellsuspension gründlich zu mischen.
      HINWEIS: Wenn mehr als 50 ml benötigt werden, um das gesamte Experiment aufzubauen, ist es am besten, die Gesamtzahl der Zellen, die in einem konischen 50-ml-Röhrchen benötigt werden, zu zentrifugieren und diese in der Hälfte des benötigten Volumens zu resuspendieren. Dann gut mischen und 1:2 in einem separaten konischen 50-ml-Röhrchen verdünnen. Wenn z. B. 100 ml bei 0,4 x 10 6 Zellen/ml benötigt werden, drehen Sie 40 x 106 Zellen in einem 50-ml-Röhrchen herunter, resuspendieren Sie sie in 50 ml Medien, übertragen Sie 25 ml in ein anderes 50-ml-Röhrchen und füllen Sie dann beide mit 25 ml frischem Medium auf.

3. Beladung von Behältern mit Stammzellkultur

  1. Entnehmen Sie die mediengrundierten Gefäße aus dem Inkubator.
  2. Wenn eine "Flask"-Steuerung verwendet wird, laden Sie einen T25-Suspensionskulturkolben mit 10 ml Zellkultur aus dem oben vorbereiteten Bestand. Geben Sie außerdem 10 ml der Stammzellkultur in ein separates konisches 15-ml-Röhrchen, das zum Laden der Spritzen verwendet wird.
  3. Schrauben Sie die Spritzenanschlusskappen ab, um sie aus dem Gefäß zu entfernen, und stellen Sie sicher, dass sich die Absperrhähne in der geöffneten Position befinden (Abbildung 2C).
  4. Stabilisieren Sie das Gefäß und öffnen Sie die Einfüllöffnung vorsichtig, ohne den Zapfen/O-Ring der Einfüllöffnung zu berühren. Setzen Sie die Kappe mit dem Stift/O-Ring nach oben auf ein Ethanolpad, während das Gefäß gefüllt wird. Schrauben Sie die Kappen vorsichtig von den Spritzenöffnungen ab.
  5. Stellen Sie sicher, dass sich die Absperrhähne in der geöffneten Position befinden (Abbildung 2C). Gießen Sie das Medium vorsichtig aus dem Gefäß in einen Abfallbehälter, entfernen Sie das Medium mit einer serologischen Pipette oder saugen Sie es mit einer sterilen Pasteurpipette aus Glas ab, die am Vakuumsystem befestigt ist, ohne die Sauerstoffversorgungsmembran zu berühren.
  6. Verschließen Sie das konische 50-ml-Röhrchen, das die Stammzellkultur enthält, fest und drehen Sie es einige Male vorsichtig um, um den Inhalt gründlich zu mischen.
  7. Ziehen Sie 10 ml Zellkulturvorrat aus dem 50-ml-Röhrchen mit einer frischen, sterilen serologischen Pipette auf. Nehmen Sie das Gefäß auf und kippen Sie es so, dass die Einfüllöffnung nach oben zeigt, und geben Sie dann die Zellkulturbrühe vorsichtig durch die Einfüllöffnung in das Gefäß ab.
    Anmerkungen: Seien Sie vorsichtig und achten Sie auf das Volumen, damit die Kultur beim Kippen des Gefäßes nicht durch die Spritzenöffnungen verschüttet wird.
  8. Versuchen Sie, das Gefäß bis zum oberen Rand der Lippe der Einfüllöffnung zu füllen, ohne etwas zu verschütten. Kippen Sie das Gefäß während des Befüllens wieder nach unten, um ein Verschütten zu vermeiden. Achten Sie darauf, die Sauerstoffmembran nicht mit der Pipette zu berühren, da diese sehr zerbrechlich ist.
    Anmerkungen: Das Befüllen des Gefäßes kann etwas Übung erfordern. Seien Sie geduldig und gehen Sie langsam vor. Wenn sich an der Öffnung der Einfüllöffnung ein Luftpolsterfilm bildet, stört dies das Beladen des Behälters. Schlagen Sie in diesem Fall vorsichtig auf das Gefäß, um die durch die Luftpolsterfolie erzeugte Versiegelung zu brechen.
  9. Sobald das Gefäß beladen ist, setzen Sie die Kappe der Einfüllöffnung vorsichtig wieder auf und achten Sie darauf, dass Sie den Hering/O-Ring nicht berühren.
  10. Auf die Spritzen legen.
    Anmerkungen: An der Vorderseite des Gefäßes befinden sich zwei Spritzenanschlüsse (Abbildung 2A). Einer enthält eine leere Spritze und der andere eine Spritze voller Zellkulturen (Abbildung 2E).
    1. Befestigen Sie zunächst die leere 3-ml-Spritze an einem der Spritzenanschlüsse und stellen Sie sicher, dass die Spritze vollständig niedergedrückt ist.
      Anmerkungen: Pumpen Sie die Spritzen einige Male, bevor Sie sie am Gefäß befestigen, da sie anfangs etwas fest sitzen. Tun Sie dies in der biologischen Sicherheitswerkbank, um die Sterilität zu erhalten.
    2. Verschließen Sie das konische 15-ml-Röhrchen mit 10 ml aliquotierter Zellkultur fest und drehen Sie es einige Male vorsichtig um, um den Inhalt gründlich zu mischen.
    3. Tauchen Sie dann die zweite 3-ml-Spritze vorsichtig halb in die Zellkultur ein und ziehen Sie etwas Kultur auf. Um die Luftblase oben in der Spritze zu minimieren, geben Sie diese vollständig in das Röhrchen zurück und ziehen Sie dann 3 ml der Kultur auf.
    4. Befestigen Sie die gefüllte Spritze an der verbleibenden Spritzenöffnung und desinfizieren Sie die Spritzen vorsichtig und um die Füllöffnung herum mit einem Ethanolpad. Bringen Sie kein Ethanol auf die Sauerstoffversorgungsmembran. Jetzt ist das Gefäß bereit, um von Blasen befreit zu werden.
      Anmerkungen: Die zweite gefüllte Spritze für das zweite Gefäß ist aufgrund der Tiefe des 15-ml-Röhrchens schwieriger zu beladen. Es hilft, den Schlauch während des Befüllens der Spritze zu kippen, um die Abdichtung zwischen der zu füllenden Spritze und der Zellkultur aufrechtzuerhalten.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 3.3-3.10 für die restlichen Gefäße. Wenn im konischen 50-ml-Röhrchen für das letzte Gefäß nicht genügend Zellkultur vorhanden ist (z. B. 9,5 ml statt 10 ml), gewinnen Sie die verbleibende Menge aus dem konischen 15-ml-Röhrchen zurück, das zum Laden der Spritzen verwendet wurde.
      HINWEIS: Die folgenden Schritte müssen nicht in einer sterilen biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden, da das Gefäß jetzt ein geschlossenes, steriles System ist.

4. Blasen aus den Gefäßen entfernen

Anmerkungen: Blasen sind in diesem Aufbau unvermeidlich und müssen während der gesamten Behandlung konsequent entfernt werden (Abbildung 3). Weitere Informationen hierzu finden Sie im Abschnitt "Diskussion".

  1. Stellen Sie sicher, dass sich die Absperrhähne der Spritzenöffnungen in der geschlossenen Position befinden (Abbildung 2D), um die Migration von Zellen und Blasen aus den Spritzen in die Gefäße zu begrenzen. Dies ist besonders später während der Behandlung wichtig (siehe unten). Um die ersten Blasen aufzufangen, drehen Sie das Gefäß auf den Kopf und schlagen Sie ein paar Mal auf die Seite.
  2. Drehen Sie das Gefäß schnell wieder nach oben und dann in einem leichten Winkel nach oben, so dass die Blasen alle zur Oberseite des Gefäßes schwimmen (Abbildung 3B).
  3. Manövrieren Sie die Blasen mit der leeren Spritze unter den Anschluss und beobachten Sie, wie sie beginnen, in den Anschluss einzudringen. Öffnen Sie beide Absperrhähne der Spritzenöffnungen (Abbildung 2C).
  4. Schlagen Sie vorsichtig auf das Gefäß, damit die Blasen in die leere Spritze schwimmen können. Saugen Sie die größeren Blasen langsam mit der leeren Spritze auf, während Sie die volle Spritze vorsichtig nach unten drücken, um den Druck im Gefäß aufrechtzuerhalten, damit die Sauerstoffmembran nicht platzt.
    Anmerkungen: Größere Blasen müssen aufgesaugt werden, während kleine Blasen und Mikrobläschen dazu angeregt werden können, in die Spritze zu schwimmen, indem sie in die Spritzenöffnungen manövriert und sanft auf das Gefäß geschlagen werden. Nach einigen Stunden Behandlung ist es sehr wichtig, die "Kreuzkontamination" zwischen den Zellen in den Spritzen und den Zellen im Kulturgefäß zu minimieren. Dies liegt daran, dass die Zellen in den Spritzen nicht die gleiche Menge an Sauerstoff erhalten oder SMG ausgesetzt sind wie die Zellen im Gefäß.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 4.2-4.4 einige Male, um sicherzustellen, dass alle Blasen entfernt sind. Entfernen Sie alle Blasen, einschließlich Mikrobläschen, aus den Gefäßen.
    Anmerkungen: Die Blasen sind durch die Sauerstoffversorgungsmembran (Rückseite des Gefäßes) leicht zu sehen, wenn das Gefäß auf eine Lichtquelle (Fenster, Licht usw.) gerichtet ist. Wenn Sie die Schritte 4.2 und 4.3 ausführen, schauen Sie sich die Blasen an, die sich von der Rückseite des Gefäßes bewegen, um die schwerer zu sehenden Blasen zu visualisieren.
  6. Wenn die Blasen effektiv entfernt wurden, schließen Sie die Absperrhähne der Spritzenöffnungen. Lassen Sie die Spritzen während der Behandlung dran, um eine anschließende Blasenentfernung zu ermöglichen, und stellen Sie sicher, dass das Volumen in beiden Spritzen ungefähr gleich ist.

5. Befestigen des Gefäßes am drehbaren Sockel

  1. Wischen Sie die Oberfläche des rotierenden Sockels und des Flachbandkabels vorsichtig mit 70 % Ethanol ab.
  2. Stellen Sie sicher, dass das mitgelieferte Flachbandkabel an das Netzteil angeschlossen ist. Legen Sie den drehbaren Sockel in den Inkubator und befestigen Sie das Flachbandkabel am Sockel. Stellen Sie sicher, dass sich die Stromversorgung in der Nähe, aber außerhalb des Inkubators befindet. Abbildung 4 zeigt den rotierenden Sockel und die Stromversorgung für den Kontext.
  3. Befestigen Sie das SMG-Behandlungsgefäß, indem Sie die Gefäßgewinde am rotierenden Stift ausrichten und den rotierenden Stift an der Basis vorsichtig gegen den Uhrzeigersinn drehen. Stellen Sie sicher, dass das Gefäß sicher befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass der Inkubator eine Luftfeuchtigkeit von nahezu 100 % beibehält, indem Sie die Wasserschale mit ausreichend autoklaviertem Umkehrosmosewasser (RO) füllen.
  4. Wählen Sie eine geeignete Drehzahl (U/min). Passen Sie die Rotationsgeschwindigkeit an die Sedimentationsgeschwindigkeit der Zellen an, so dass die Zellen gar nicht erst "durch das Medium fallen", sondern sich in einer kleinen Umlaufbahn drehen. Dieses Phänomen ist in Abbildung 1 schematisch dargestellt.
    HINWEIS: Das Unternehmen empfiehlt, die Rotation bei 8-10 U/min für Lymphozyten zu beginnen. In diesem Fall wurden NK92-Zellen mit 11 U/min gedreht, wie in einer früheren Arbeit17 gezeigt wurde. Je nach Zellgröße sollte die Drehzahl bei größeren Zellen erhöht und bei kleineren Zellen verringert werden. Das gleiche Muster gilt, wenn die verwendeten Zellen während der Kultivierung zum Verklumpen neigen. Weitere Informationen hierzu finden Sie im Abschnitt "Diskussion".

6. Behandlung

  1. Wählen Sie eine geeignete Behandlungsdauer für die Forschungsanwendung, die davon abhängen kann, welche Parameter der Zellfunktion/-physiologie untersucht werden. Weitere Informationen hierzu finden Sie im Abschnitt "Diskussion".
    HINWEIS: In diesem Fall wurden die NK92-Zellen einer 72-stündigen SMG-Behandlung unterzogen, basierend auf den Ergebnissen früherer Studien18,19. Während der Behandlung bilden sich unweigerlich Blasen, die entfernt werden müssen. Um dies zu erleichtern, kann die Rotation kurzzeitig gestoppt und wieder gestartet werden. In Schritt 7.1 erfahren Sie, wie Sie das SMG-Gefäß sicher entfernen können.
  2. Überprüfen Sie am ersten Tag der Behandlung alle paar Stunden, ob sich Blasen bilden, indem Sie die Schritte 4.2-4.6 wiederholen. Überprüfen Sie nach dem ersten Tag die Gefäße nach Bedarf (mindestens einmal täglich) und wiederholen Sie die Schritte 4.2-4.6 bis zum Ende der Behandlung.

7. Entnahme von Zellen aus den Gefäßen

  1. Sobald die geplante Behandlungslänge abgelaufen ist, stoppen Sie die Rotation und zerlegen Sie das Gerät. Entfernen Sie das SMG-Behandlungsgefäß, indem Sie das Gefäß vorsichtig stationär halten, während Sie den Drehstift des Geräts im Uhrzeigersinn drehen.
  2. Bringen Sie den Kontrollkolben, das Kontrollgefäß 1G und das behandelte SMG-Gefäß in eine sterile biologische Sicherheitswerkbank.
  3. Nimm jedes Gefäß (nur 1G und MP, nicht die Flasche) und drehe es auf den Kopf, so dass es nach unten zeigt, und schlage vorsichtig darauf, um alle Zellen in Suspension zu bringen. Drehen Sie dann das Gefäß mit der Einfüllöffnung nach unten auf die Seite und schlagen Sie erneut auf das Gefäß, um die Zellen für eine effiziente Aspiration in Richtung der Einfüllöffnung zu ermutigen.
  4. Behandeln Sie jedes Gefäß einzeln. Schrauben Sie die Spritzen von den beiden Anschlüssen ab und entsorgen Sie sie im Bioabfall. Öffnen Sie die Absperrhähne an den Spritzenöffnungen.
  5. Entfernen Sie vorsichtig die Kappe der Einfüllöffnung und ziehen Sie den Inhalt mit einer sterilen serologischen 10-ml-Pipette auf, wobei Sie das Gefäß kippen, während es entleert wird. Geben Sie den Inhalt der Gruppen "Flask", "1G" und "SMG" in einzeln beschriftete konische 15-ml-Röhrchen ab.
  6. Schließen Sie jedes Röhrchen und drehen Sie es einige Male vorsichtig um, um sicherzustellen, dass sie richtig gemischt sind. Verwenden Sie die bevorzugte Methode zur Bestimmung der Konzentration und Lebensfähigkeit der resultierenden Zellkultur, um sie für die Verwendung in nachfolgenden experimentellen Assays vorzubereiten.

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Representative Results

Diese Kultivierungsmethode gilt als erfolgreich, wenn 1) die Proliferation der Zellen in allen Kontrollgruppen (und idealerweise in allen Versuchsgruppen) annähernd konsistent ist, 2) die Proliferation angesichts der Aussaatdichte, der Behandlungsdauer und der Verdopplungszeit des Zelltyps/der Zelllinie angemessen ist und 3) die Lebensfähigkeit der geernteten Zellen 85 % oder mehr beträgt (Tabelle 1 ). Idealerweise sollten die resultierenden Zellen so gesund sein wie in einer Standardzellkultur, insbesondere für die Verwendung in nachfolgenden Experimenten und Assays (d. h. Viabilität 85 % oder höher). Diese Kultivierungsmethode gilt als erfolglos, wenn das Gegenteil der Fall ist, wobei die resultierenden Zellen entweder absterben, sich in der Proliferation zwischen den Kontrollgruppen erheblich unterscheiden oder eine suboptimale Lebensfähigkeit von etwa 70 % oder weniger aufweisen (Tabelle 1). Die Proliferation in der SMG-Behandlungsgruppe kann sich im Vergleich zur Kontrollgruppe unterscheiden oder auch nicht, je nachdem, wie sich die SMG-Behandlung auf die Zellphysiologie auswirkt. Dies war jedoch bisher kein Problem, und die Zellproliferation war in den Kontroll- und Behandlungsgruppen ungefähr gleich hoch (Tabelle 1). Wie bereits erwähnt, sind diese Parameter wichtig für den Erfolg von Downstream-Assays und -Experimenten, und die resultierenden Zellen aus den beiden Kontrollgruppen sollten relativ ähnlich abschneiden.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der lokalisierten Orbitalbahn der Zellen, die während des Betriebs im simulierten Mikrogravitationsgefäß (SMG) kultiviert werden. Der hier beschriebene RWV-2D-Klinostat arbeitet nach dem Prinzip der zeitlich gemittelten Gravitationsvektor-Nullifikation 5,6,8,9, wobei der Gravitationsvektor durch Rotation der Zellkultur um eine horizontale Achse randomisiert wird. Dies wird erreicht, indem die Rotationsgeschwindigkeit des Kulturgefäßes an die Sedimentationsgeschwindigkeit der Zellen angepasst wird. Nach einer anfänglichen Beschleunigungsphase erreicht das Medium im Kulturgefäß schließlich mit der Zeit eine "Festkörperrotation". Diese horizontale Rotation induziert auch eine laminare Strömung im Zellkulturgefäß. Dadurch entsteht eine "scherarme" Umgebung, da die Scherspannung, die durch laminare Strömung auf die Zellen induziert wird, viel geringer ist als die der turbulenten Strömung. Da der Klinostat jedoch kein perfektes System ist, gibt es einige kleine, laminare Flüssigkeitsbewegungen, die eine minimale Scherspannung auf die Zellen ausüben. So werden die im Medium schwebenden Zellen bei der Rotation von dieser Strömung mitgerissen. Bei der horizontalen Rotation wirkt der Schwerkraftvektor auf die Zellen ein und bringt sie in eine oszillierende Bahn, die hier visualisiert wird. Wenn sich das Kulturgefäß um eine horizontale Achse dreht, dreht sich auch der Schwerkraftvektor, den die Zellen erfahren. Im Laufe der Zeit wird dieser rotierende Schwerkraftvektor gemittelt, um gegen Null zu gehen. Dieses Phänomen wird als "zeitgemittelte Gravitationsvektor-Nullifikation" bezeichnet und induziert einen Zustand vonSMG 5,6,8,9. Diese Abbildung wurde von Castro et al., 201120 modifiziert. Erstellt mit BioRender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: 10-ml-Gefäß mit hohem Aspektverhältnis (HARV). (A) Vogelperspektive des HARV, mit der Hauptfüllöffnung und zwei Spritzenöffnungen. (B) Rückseite des HARV mit dem Schraubanschluss zum Anschließen des HARV an die Drehbasis und die Sauerstoffversorgungsmembran. (C) Seitenansicht des HARV mit offenen Spritzenanschlüssen (verschlossen). (D) Seitenansicht des HARV mit geschlossenen Spritzenanschlüssen (verschlossen). (E) Seitenansicht des HARV mit den beiden angebrachten 3-ml-Spritzen; Die linke Spritze ist mit Zellkultur gefüllt und die rechte Spritze ist leer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Blasen im HARV. (A) Vogelperspektive des HARV, zeigt die Blasen, die aus der Zellkultur eliminiert werden sollen. (B) Seitenansicht des HARV, die die gleichen Blasen zeigt. Beachten Sie, wie die Blasen in der Größe variieren. Mikrobläschen müssen ebenfalls entfernt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Drehfuß und Stromversorgung des RWV-Gerätes . (A) Vorderansicht des Drehsockels mit vier rotierenden Stiften, die bis zu vier Kulturgefäße aufnehmen können. (B) Rückansicht des drehbaren Sockels, der den Eingang für das Flachbandkabel (nicht abgebildet) zeigt, das den Sockel und das Netzteil verbindet. (C) Vorderansicht des Netzteils auf dem Inkubator. Beachten Sie den Ein-/Ausschalter auf der linken Seite und das Drehzahleinstellrad auf der rechten Seite. Das Netzteil wird an die nächstgelegene Steckdose (normalerweise auf der Rückseite des Inkubators) angeschlossen und enthält einen Eingang für das Flachbandkabel zum Anschluss an den Drehsockel. Die Stromversorgung bleibt außerhalb des Inkubators. Der Sockel wird während des Betriebs in den Inkubator (37 °C, 5%CO 2) gelegt, das Flachbandkabel durch die Inkubatortür geführt und an die Stromversorgung angeschlossen. Das Flachbandkabel stört die Inkubatordichtung nicht. Wenn der Drehsockel nicht verwendet wird, sollte er außerhalb des Inkubators aufbewahrt und sicher auf einem Labortisch oder Regal aufbewahrt werden. In der Materialtabelle finden Sie die Details des verwendeten kommerziellen Geräts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

# Rentabilität des Starts Saatdichte-Zellen/ml Rentabilität des Endes (F) Endlebensfähigkeit (1G) Lebensfähigkeit beenden (SMG) Endkon (F) Zellen/ml Endkon (1G) Zellen/ml End Conc (SMG) Zellen/ml Notizen
Suboptimale Überlebensfähigkeit und Aussaatdichte (negatives Ergebnis) 1 79% 0,2 x 106 67% 60% 60% 0,10 x 106 0,075 x 106 0,071 x 106 Eine geringe Aussaatdichte und eine suboptimale Startviabilität führten im Verlauf der Behandlungszeit zum Zelltod
2 73% 0,2 x 106 43% 63% 70% 0,071 x 106 0,081 x 106 0,085 x 106
Optimale Keimfähigkeit und Aussaatdichte (positives Ergebnis) 3 93% 0,4 x 106 93% 93% 96% 1,2 x 106 1,1 x 106 1,5 x 106 Eine angemessene Saatdichte und eine optimale Lebensfähigkeit der Anfänge führten zu einem gesunden Zellwachstum und einer gesunden Lebensfähigkeit während der gesamten Behandlung
4 92% 0,4 x 106 92% 92% 94% 0,81 x 106 0,80 x 106 0,70 x 106

Tabelle 1: Vergleichstabelle mit erfolglosen und erfolgreichen simulierten Mikrogravitationsbehandlungen (SMG). Die Startviabilität und die Aussaatdichten von NK92 wurden nach einer 72-stündigen SMG-Behandlung in einem 37 °C heißen Zellkulturinkubator, der mit 5% CO2 supplementiert wurde, mit den resultierenden Endviabilitäts- und Endkonzentrationen verglichen. Es wurden zwei Fälle von negativen und zwei Fälle von positiven Ergebnissen verglichen. Zum Vergleich: Der optimale Konzentrationsbereich der verwendeten NK92-Zelllinie lag zwischen 0,3 x 10 6 Zellen/ml und 1,2 x 106 Zellen/ml, mit einer Verdopplungszeit von etwa 2-3 Tagen.

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Discussion

Während sich die Menschheit auf längere Weltraummissionen zu Mond und Mars vorbereitet, muss mehr Forschung betrieben werden, um ernsthafte Gesundheitsrisiken bei Astronauten zu mindern. Ein wichtiger Aspekt der Weltraumumgebung, der sich auf die menschliche Physiologie auswirkt, ist die Schwerelosigkeit. Hier wurde ein Zellkulturverfahren beschrieben, um Lymphozyten mit einem kommerziell erhältlichen rotierenden Zellkultursystem einem SMG zu unterziehen.

Dieses Protokoll enthält einige wichtige Schritte, die je nach verwendetem Zelltyp oder Linie optimiert werden müssen. Dazu gehören 1) die Wahl einer geeigneten Aussaatdichte in Abhängigkeit von der Verdopplungszeit der Zellen und der Dauer der SMG-Behandlung und 2) die Bestimmung einer optimalen Behandlungslänge, Rotationsgeschwindigkeit und geeigneter Kontrollen. Es sollte ausreichend sein, eine Aussaatdichte zu wählen, die im mittleren Bereich der geeigneten Zellkonzentrationen für den untersuchten Zelltyp oder die untersuchte Linie liegt. Die Wahl einer zu niedrigen Aussaatdichte kann jedoch zu einer geringen Zellproliferation und Lebensfähigkeit führen (Tabelle 1), und die Wahl einer zu hohen Dichte kann zu einer vorzeitigen Nährstofferschöpfung und einer geringen Zelllebensfähigkeit führen. Die gewählte Aussaatdichte hängt auch von der Verdopplungszeit der untersuchten Zellen ab. Zellen mit einer kürzeren Verdopplungszeit können mit einer geringeren Dichte ausgesät werden, und Zellen mit einer längeren Verdopplungszeit müssen möglicherweise mit einer höheren Dichte ausgesät werden. Die Aussaatdichte und die Dauer der Behandlung hängen auch davon ab, wie viele Zellen benötigt werden, um die anschließenden experimentellen Assays abzuschließen. Erfahrungsgemäß hat die Aussaat von hochlebensfähigen (90%+) NK92-Zellen mit 0,4-0,5 x 10 6 Zellen/ml in 10-ml-Gefäßen (d. h. 4-5 Millionen Zellen pro Versuchsgruppe; optimaler Bereich für die Zelllinie = 0,3 x 10 6-1,2 x 106 Zellen/ml, Verdopplungszeit = 2-3 Tage) und die Behandlung über 72 h etwa 8-15 Millionen Zellen ergeben (Tabelle 1). Daher waren die 10-ml-Gefäße sowohl für die Entnahme von Zellen für funktionelle Assays (3 x 10 6 Zellen) als auch für die Entnahme von Zellen für die qPCR (1 x 10 6 Zellen) und den Western Blot (2 x 10 6-6x 106 Zellen) geeignet. Überstände können auch für die Analyse sekretorischer Komponenten gesammelt werden. Es sind jedoch auch 50-ml-Gefäße erhältlich, die verwendet werden können, wenn eine höhere Zellausbeute erforderlich ist. Bei Verwendung von 50-ml-Gefäßen müssen auch größere Spritzen verwendet werden.

Die Bestimmung einer geeigneten Behandlungsdauer hängt auch vom verwendeten Zelltyp/der verwendeten Zelllinie ab. Liegen bereits Studien vor, sollten diese herangezogen werden, um zunächst eine geeignete Behandlungsdauer zu wählen. Einige Studien haben RWV-Geräte zur Kultivierung von NK-Zellen verwendet und sind hier referenziert17,18,19. Von dort aus sollten die Behandlungsergebnisse oder die Proliferation der Zellen und ihre Lebensfähigkeit sowie ihre Leistung in nachfolgenden experimentellen Assays untersucht werden. Es kann möglich sein, die Behandlungsdauer über 72 Stunden hinaus zu verlängern, indem die Zellkultur aus den Gefäßen in ein Röhrchen entnommen, die Zellen zentrifugiert und dann in 10 ml warmem, frischem Komplettnährmedium resuspendiert, in die Gefäße eingesetzt und die Rotation wieder aufgenommen wird. Dies kann jedoch zu Störfaktoren führen, da die Schwerkraft durch Zentrifugation der Schwerelosigkeit ausgesetzt ist, und eine Spaltung/Verdünnung der Zellen kann erforderlich sein, um sicherzustellen, dass die Zellen in ihrem optimalen Konzentrationsbereich gehalten werden. Wenn stimulierende Moleküle (z. B. LPS, Zytokine usw.) verwendet werden sollen, wird empfohlen, diese in einer geeigneten Konzentration dem gesamten Medienrezept zuzusetzen, bevor die SMG-Behandlung eingeleitet wird.

Die Einstellung einer geeigneten Drehzahl (U/min) ist ebenfalls der Schlüssel zur Aufrechterhaltung der simulierten Schwerelosigkeitsbehandlung. Das Unternehmen empfiehlt, bei der Kultivierung von Lymphozyten mit einer Rotationsgeschwindigkeit zwischen 8 und 10 U/min zu beginnen. Erfahrungsgemäß hat eine Drehzahl von 11 U/min gut funktioniert, um sicherzustellen, dass NK92-Zellen in Suspension gehalten werden, und wurde in einer früheren NK-Zellstudie verwendet17. Abhängig von den Wachstumsmustern des verwendeten Zelltyps/der verwendeten Zelllinie muss die Rotationsgeschwindigkeit möglicherweise erhöht werden, um die Zellverklumpung zu berücksichtigen. Dies würde zu einer erhöhten Sedimentation der Zellen aufgrund der erhöhten Masse führen. Für eine optimale SMG-Behandlung muss die Rotationsgeschwindigkeit des Kulturgefäßes an die Sedimentationsgeschwindigkeit der Zellen angepasst werden 5,6,8,9. Mit anderen Worten, Zellen oder Zellklumpen sollten nicht gesehen werden, wie sie durch das Medium fallen, und sie sollten relativ stationär bleiben.

In diesem Zusammenhang empfiehlt es sich, zwei Negativkontrollen auszuprobieren, indem Zellen, die in einem Standard-T25-Kulturkolben ("Flask") gezüchtet wurden, und Zellen, die in der spezialisierten HARV gezüchtet, aber nicht SMG unterzogen wurden (d. h. nur in den Inkubator gelegt wurden; "1G"). Idealerweise sollten die Zellleistung und die Ergebnisse in nachgeschalteten experimentellen Assays zwischen den beiden Negativkontrollen vergleichbar sein. Etwaige Ungereimtheiten sollten beachtet werden. Bei den meisten Assays ist der beste Vergleich wahrscheinlich zwischen der "1G"-Kontrolle und der SMG-Behandlung. Die Einbeziehung sowohl der "Flask"- als auch der "1G"-Steuerung kann jedoch für einen ausreichenden Vergleich und eine erste Optimierung von Vorteil sein.

Zu den wichtigsten Einschränkungen dieses Protokolls gehören 1) die Blasenbildung während der Zellkultur, 2) das Ausmaß der SMG und 3) die mögliche Dauer der Behandlung. Es ist wichtig, die Blasenbildung während der gesamten SMG-Behandlung zu überwachen. Selbst winzige Mikrobläschen können sich ansammeln, wachsen und zur Bildung von stark störenden größeren Blasen führen. Diese größeren Blasen unterbrechen die scherarme Fluiddynamik innerhalb des Kulturgefäßes und verursachen erhöhte Turbulenzen, wenn der Fluidstrom um die Blase21 umgelenkt wird. Letztendlich stört dies den Zustand der MP vollständig. Dieses Phänomen wird ausführlich diskutiert und von Phelan et al.21 visualisiert. Darüber hinaus ist es wichtig zu bedenken, dass dieses Gerät SMG produziert und nicht echte Schwerelosigkeit, wie sie an Bord der ISS6 erlebt wurde. Nichtsdestotrotz haben Studien ähnliche Effekte von SMG gezeigt, die von diesem Gerät erzeugt werden, verglichen mit den Effekten der realen Schwerelosigkeit aus Studien, die auf der ISSdurchgeführt wurden 1,5,6.

Es gibt alternative Methoden, um Zellkulturen SMG zu unterziehen. Dazu gehören der Einsatz von 3D-Klinostaten oder Random Positioning Machines (RPM) und diamagnetischer Levitation. 3D-Klinostate drehen die Zellkultur um zwei senkrechte Achsen mit der gleichen Geschwindigkeit, während RPMs um zwei senkrechte Achsen rotieren, wobei sowohl die Geschwindigkeit als auch die Richtung der Rotation randomisiert sind 5,6. Daher sind Drehzahlen im Vergleich zu 2D-Klinostaten oder RWV-Geräten komplexer, was mehrere Vor- und Nachteile mit sich bringt. Erstens kann der Grad der Mikrogravitation, der in einer Drehzahl erreicht werden kann, moduliert werden, um eine partielle Schwerkraft zu simulieren, wie sie auf dem Mond (0,16 g) und dem Mars (0,33 g) auftritt6. Die zusätzliche Komplexität zufälliger Rotationsrichtungen und -geschwindigkeiten kann jedoch zu ruckartigen Bewegungen und Beschleunigungskräften führen, insbesondere in Richtung der äußeren Bereiche des Kulturgefäßes, was möglicherweise zu Verwirrungen in den Daten führt. Bei der diamagnetischen Levitation werden Proben starken abstoßenden Magnetfeldern ausgesetzt, um dem Gewicht des Wassers in biologischen Proben entgegenzuwirken und der Schwerkraft entgegenzuwirken. Das starke Magnetfeld, das zu diesem Zweck erzeugt wird, kann sich jedoch auch negativ auf die Zellen auswirken und somit zu Verfälschungen der Daten führen 5,6. Auf diese Methoden wird an anderer Stelle näher eingegangen 5,6.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das hier diskutierte kommerziell erhältliche rotierende Zellkultursystem eine relativ einfach zu bedienende, zugängliche Plattform für Wissenschaftler ist, die die Auswirkungen von SMG auf Lymphozyten untersuchen möchten. Obwohl diese Zellkulturmethode Einschränkungen aufweist, bleibt sie eine praktikable Option für die Kultivierung von Lymphozyten und möglicherweise anderen Suspensionszellkulturen in simulierter Schwerelosigkeit.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Arbeit wird von der Canadian Space Agency (CSA) mit einem Forschungsstipendium (17ILSRA3, Immuno Profile) unterstützt. Die Autoren danken Dr. Roxanne Fournier (University of Toronto), Dr. Randal Gregg (Lincoln Memorial University) und Preteesh Mylabathula (University of Arizona) für ihre Hilfe bei der anfänglichen Fehlerbehebung dieses Protokolls.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL) Synthecon D-410 Gamma sterilized culture vessels (4/box)
Luer-Lok tip syringes (3 mL) BD 309657 For attaching to the 10 mL HARVs
NK92 Cell-line ATCC CRL-2407
Rotary Cell Culture System (RCCS) Synthecon RCCS-4D Rotating wall vessel device; 2D clinostat
Sarsedt 15 mL conical tubes Fisher Scientific 50-809-220
Sarsedt 50 mL conical tubes Fisher Scientific 50-809-218
Sarsedt sterile serological pipettes Fisher Scientific 86.1254.001
T25 suspension culture flasks Sarsedt 83.3910.502 For flask control

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References

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Retraktion Ausgabe 186 Suspensionszellkultur Lymphozyten simulierte Schwerelosigkeit zeitgemittelte Schwerkraftvektor-Nullifikation 2D-Klinostat rotierendes Zellkultursystem rotierende Wandgefäßvorrichtung
Kultivierung von Lymphozyten in simulierter Schwerelosigkeit mit einem rotierenden Zellkultursystem
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de Korte, M., Keating, A., Wang, C. Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System. J. Vis. Exp. (186), e63296, doi:10.3791/63296 (2022).

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