Summary
Protokol, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) saf bir adiposit popülasyonunun üretilmesine izin verir. Retinoik asit, iPSC'leri adiposit üretmek için kullanılan mezenkimal kök hücrelere (MSC'ler) ayırmak için kullanılır. Daha sonra, saf adipositler elde etmek için Nil kırmızısı boyamaya dayalı bir sıralama yaklaşımı kullanılır.
Abstract
İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojisindeki son gelişmeler, adipositler de dahil olmak üzere farklı hücre tiplerinin üretilmesine izin vermiştir. Bununla birlikte, mevcut farklılaşma yöntemleri düşük verimliliğe sahiptir ve homojen bir adiposit popülasyonu üretmemektedir. Burada, mezenkimal kök hücreleri (MSC'ler) yüksek verimde üretmek için all-trans retinoik bazlı bir yöntem kullanarak bu sorunu aşıyoruz. Hücre proliferasyonunu, hayatta kalmayı ve yapışmayı yöneten yolları düzenleyerek, farklılaşma stratejimiz, saf bir multipotent MSC popülasyonuna farklılaşan embriyonik cisimlerin (EB'ler) verimli bir şekilde üretilmesini sağlar. Bu yöntemle üretilen yüksek sayıda MSC, adiposit üretmek için ideal bir kaynak sağlar. Bununla birlikte, adiposit farklılaşmasından kaynaklanan örnek heterojenliği bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, FACS kullanarak lipit taşıyan olgun adipositleri saflaştırmak için Nil kırmızısı bazlı bir yöntem kullandık. Bu sıralama stratejisi, adipositle ilişkili metabolik bozuklukları, azaltılmış numune heterojenliği ve gelişmiş hücre işlevselliği ile bir adiposit havuzu kullanarak modellemek için güvenilir bir yol oluşturmamızı sağladı.
Introduction
Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), adipositler, osteositler ve kondrositler gibi mezodermal kökenli hücrelerin üretilmesi için etkili bir geçici kaynak görevi görür ve bu hücreler kendi genetik bozukluklarını modellemek için daha fazla kullanılabilir. Bununla birlikte, önceki yaklaşımlar, bu MSC'lerin yetişkin dokulardan elde edilmesine dayanıyordu 1, bu da onları donörlerden yüksek sayılarda elde etme zorluğunu ve onları suboptimal in vitro kültür koşullarında işlevsel olarak canlı tutmanın sınırlandırılmasını getirdi 1,2. Bu engeller, in vitro MSC'ler üretmek için bir protokole sahip olma konusunda büyük bir talep yaratmıştır. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSC'ler), MSC özelliklerini sergileyen değerli bir MSC kaynağı olarak kullanılabilir 3,4,5. iPSC'lerden türetilen MSC'ler çeşitli hastalıklarda terapötik bir seçenek olarak kullanılabilir. Ayrıca, iPSC'lerden türetilen MSC'lerin adiposit üretme yeteneği, onları insan adipogenezi, obezite ve adiposit ile ilişkili bozuklukları incelemek için değerli bir in vitro insan modeli haline getirir.
Adipositlerin mevcut farklılaşma protokolleri iki gruba ayrılabilir, bunlardan biri kimyasal veya protein bazlı kokteyller kullanılarak adipositlerin farklılaştırılmasını içerir ve sonuçta %30-%60 oranında 6,7,8,9 verim sağlarken, diğeri %80-%90 verim vermek üzere adipositlerin gelişimini yöneten anahtar transkripsiyon faktörlerinin sağlam indüksiyonu için genetik manipülasyonu içerir. 11. Bununla birlikte, genetik manipülasyon, adiposit farklılaşmasının doğal sürecini özetlemez ve genellikle adipogenez sırasında gelen ince paradigmaları maskeler, bu da hastalık modelleme amaçları için etkisiz hale getirir12,13. Bu nedenle, Nil kırmızısı kullanarak lipit taşıyan adipositleri floresan olarak etiketleyerek kimyasal olarak türetilmiş olgun adipositleri olgunlaşmamış olanlardan ayırmanın bir yolunu sunuyoruz.
Burada, iPSC'lerden türetilmiş embriyoid cisimlerin (EB'ler) all-trans retinoik asit ile geçici inkübasyonunu içeren bir protokol sunuyoruz ve bu da adipositlerin14 üretilmesinde daha fazla kullanılabilecek çok sayıda hızla çoğalan MSC'ler üretiyor. Ayrıca, kimyasal olarak türetilmiş olgun adipositleri, lipofilik bir boya kullanarak lipit damlacıklarını floresan olarak etiketleyerek heterojen farklılaşma havuzundan ayırmanın bir yolunu sunuyoruz; Nil kırmızısı. Bu, adipositle ilişkili metabolik bozuklukları doğru bir şekilde modellemek için gelişmiş işlevselliğe sahip saf bir olgun adiposit popülasyonunun oluşturulmasına izin verecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çalışma, ilgili kurumsal araştırma etik komitesi tarafından onaylanmış ve 1964 Helsinki Deklarasyonu'nda ve daha sonraki değişikliklerinde veya karşılaştırılabilir etik standartlarda belirtilen etik standartlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Protokol, HMC (no. 16260/16) ve QBRI (no. 2016-003) Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışma aynı zamanda H1 ve H9 gibi hESC'ler için de optimize edilmiştir. Sağlıklı bireylerden tam bilgilendirilmiş onam alınarak kan örnekleri alındı. iPSC'ler, sağlıklı bireylerin periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) üretilir.
1. iPSC'lerin kültürü ve bakımı
- Kaplama matrisini nakavt-DMEM'de 1:80 oranında yeniden yapılandırarak bazal membran matris kaplı plakalar hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.
- 500 mL kök hücre bazal ortamına 50 mL 10x kök hücre takviyesi ortamı ve 5 mL 100x penisilin-streptomisin (P / S) ekleyerek iPSC'lerin kültür ortamını hazırlayın ve kısa süreli kullanım için 4 ° C'de veya uzun süreli kullanım için -20 ° C'de saklayın.
- Plakaları 6 delikli bir plaka için kaplama matrisi-1 mL, 12 delikli bir plaka için 500 μL, 24 delikli bir plaka için 250 μL ile hizalayın ve plakayı 1-2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Bir parça iPSC'nin kültür ortamını çıkarın ve kullanmadan önce oda sıcaklığında önceden ısıtın.
- Bir şişe iPSC'yi (ESC'ler veya iPSC'ler) 37 °C'lik bir su banyosunda çözün ve 2-3 mL kültür ortamı içeren 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
- Tüpü oda sıcaklığında (RT-23 °C) 4 dakika boyunca 120 x g'de santrifüjleyin.
- Süpernatantı çıkarın ve 10 μM ROCK inhibitörü (Y-27632) ile desteklenmiş 2 mL taze kültür ortamı ekleyin. Hücreleri matris kaplı 6 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna yerleştirin ve plakayı 37 ° C'ye yerleştirin.
- 24 saat sonra, ortamı çıkarın ve taze kültür ortamıyla değiştirin.
- Hücreler% 80-90 akıcılığa ulaşana kadar medyayı her gün değiştirin.
- Akıcılığa ulaştıktan sonra, aşağıda özetlenen adımları izleyerek hücreleri geçin.
- Ortamı çıkarın ve hücreleri Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS) ile yıkayın.
- iPSC'lerin ayrışma reaktifini ekleyin (bakınız Malzeme Tablosu)-6 delikli bir plaka kuyusu için 500 μL, 24 delikli bir plaka kuyusu için 250 μL ve 37 ° C'de 1 dakika boyunca inkübe edin.
- Ayrışma reaktifini çıkarın ve hücreleri 37 ° C'de 1 dakika kuru inkübe edin.
- 6 delikli bir plaka kuyusu için 1 mL ve 24 delikli bir plaka kuyusu için 250 μL kültür ortamı kullanarak hücreleri 15 mL'lik bir konik tüpte toplayın ve 4 dakika boyunca 120 x g'de santrifüj.
- Hücreleri kültür ortamında-2 mL, 6 delikli bir plaka kuyucuğu için ve 500 μL, 10 μM ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 24 delikli bir plaka kuyucuğu için yeniden askıya alın ve bunları %40 akıcılıkta taze matris kaplı plakalara plakalayın.
2. iPSC'nin MSC'lere farklılaşması
- Düşük glukozlu DMEM + piruvata %15 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 P/S ekleyerek MSC diferansiyasyon ortamını hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.
- % 80 akıcılığa ulaştıktan sonra, aşağıda özetlenen adımları izleyerek embriyoid cisim (EB) oluşumu için iPSC'leri kullanın.
- Hücreleri DPBS ile yıkayın ve 6 delikli bir plaka kuyusu için ayrışma ortamı / EDTA-500 μL, 24 delikli bir plaka kuyusu için 250 μL ile inkübe edin.
- 1 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin, ayrışma reaktifini aspire edin ve hücreleri 1 dakika daha 37 ° C'de tutun. MSC farklılaşmasını başlatmak için ~ 10-12 x 106 hücre gereklidir.
- Hücreleri kültür ortamını kullanarak 15 mL'lik bir konik tüpte toplayın. Hücrelerin tekleşmesini önlemek ve EB oluşumuna izin vermek için toplarken çok nazik olduğunuzdan emin olun. Hücreleri 4 dakika boyunca 120 x g'de santrifüj edin.
- 10 μM ROCK inhibitörü içeren 3 mL MSC farklılaşma ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın.
- 0,5 mL/kuyuyu 24 delikli ultra düşük bir bağlantı plakasında karıştırın ve dağıtın.
NOT: Ultra düşük bağlantı plakasının kullanılması, hücrenin yüzeydeki bağlantılarından ziyade EB'lere toplanmasını teşvik edecektir. - Plakayı inkübatöre 37 ° C'de yerleştirin.
- 24 saat sonra, aşağıda belirtilen adımları izleyerek elde edilen EB'leri yüksek retinoik asit (RA) tedavisi ile indükleyin.
- 3 mL MSC farklılaştırma ortamına 10 μM RA ekleyin. EB'leri 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve 15 dakika boyunca yerleşmelerine izin verin.
- Süpernatantı EB'lerden çıkarın ve 10 μM RA ile desteklenmiş MSC farklılaştırma ortamı ekleyin.
- Yavaşça askıya alın ve aynı 24 delikli ultra düşük bağlantı plakasına 0,5 mL/kuyu dağıtın.
- Plakayı inkübatöre 37 ° C'de yerleştirin. EB'leri sonraki 48 saat boyunca rahatsız etmeyin.
- 48 saat sonra, EB'leri 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve 15 dakika boyunca yerleşmelerini sağlayın.
- Süpernatantı EB'lerden çıkarın ve 0,1 μM RA ile desteklenmiş MSC farklılaştırma ortamı ekleyin.
- Yavaşça askıya alın ve aynı 24 delikli ultra düşük bağlantı plakasına 0,5 mL/kuyu dağıtın.
- Plakayı inkübatöre 37 ° C'de yerleştirin. EB'leri sonraki 48 saat boyunca rahatsız etmeyin.
- Aşağıda özetlenen adımları izleyerek hücrelere eklenen RA'yı kaldırın.
- Son RA tedavisinden 48 saat sonra, EB'leri toplayın ve 15 dakika boyunca yerleşmelerine izin verin.
- Süpernatantı çıkarın ve sitokinler olmadan DMEM düşük glikozlu ortam ekleyin.
- Yavaşça yeniden askıya alın ve 24 delikli ultra düşük bir bağlantı plakasına 0,5 mL/kuyu dağıtın. Plakayı inkübatöre 37 ° C'de yerleştirin.
- Aşağıda özetlenen adımları izleyerek iPSC'lerden türetilmiş EB'leri plakalayın.
- Önceki adımdan 48 saat sonra (adım 2.4), EB'leri 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve 15 dakika boyunca yerleşmelerine izin verin.
- Süpernatantı çıkarın ve 2 mL'lik taze MSC farklılaştırma ortamında yeniden askıya alın.
- Bir bazal membran matris kaplı 6 delikli plakanın iki kuyucuğuna aktarın.
- Medyayı 5 gün daha ek olarak her gün değiştirin.
- 5 gün sonra, harcanan ortamı çıkarın ve 2.5 ng / mL bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF) içeren taze MSC farklılaşma ortamı ile değiştirin.
- Kaplamalı EB'leri% 80-90 akıcılığa ulaştıklarında, aşağıda özetlenen adımları izleyerek geçirin.
- Hücreleri DPBS ile yıkayın, 6 delikli bir plaka kuyucuğu için tripsin-EDTA-500 μL ekleyin ve hücreleri 3 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- MSC farklılaşma ortamını kullanarak hücreleri 15 mL'lik bir konik tüpte toplayın ve 4 dakika boyunca 750 x g'de döndürün.
- MSC farklılaşma ortamında 2,5 ng/mL bFGF ile yeniden askıya alın ve bazal membran matris kaplı plakalardaki hücreleri 1:3 oranında plakalayın.
- Hücreler% 70-80 akıcılığa ulaştığında geçişi tekrarlayın. 2-3 pasajla 3-6 milyon hücre kazanması beklenir.
3. iPSC'lerden türetilen MSC'lerin akış sitometrisi analizi
NOT: MSC farklılaşmasının etkinliği için 2-3 pasajdan geçtikten sonra hücrelere erişilmelidir. Hücreler MSC diferansiyasyon belirteçleri-CD44, CD73, CD90 ve CD105'i %90'dan fazla verimlilikle eksprese ederse ve yüksek düzeyde hematopoetik belirteçler-CD14, CD19, CD34 ve CD45 eksprese etmezlerse farklılaşma başarılı kabul edilecektir. Bu belirteçlerin verimliliğine aşağıdaki adımlar izlenerek erişilebilir.
- Yukarıda özetlenen adımları kullanarak hücreleri geçirin (adım 2.6) ve v tabanlı 96 delikli bir plakanın bir kuyucuğunda 1 x 105 hücre elde edin.
- Plakayı 375 x g'de 4 °C'de 4 dakika boyunca santrifüjleyin.
- 1 μL konjuge antikor (Ab) ile 100 μL soğuk DPBS'de 1 x 105 hücreyi yeniden askıya alın (bakınız Malzeme Tablosu) ve ışığa maruz kalmayı önleyerek 30-40 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- 100 μL soğuk DPBS'de başka bir 1 x 105 hücreyi, konjuge Ab'nin ilgili izotip kontrolü ile 1:100 ) konsantrasyonunda tekrar askıya alın ve ışığa maruz kalmayı önleyerek 30-40 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, plakayı 375 x g'de 4 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj edin. Plakayı lavabonun üzerinde sallayarak süpernatantı atın.
- Hücreleri 100 μL soğuk DPBS'de yeniden askıya alın.
- Hücreleri 375 x g'de 4 °C'de 4 dakika boyunca santrifüj edin. Supernatan'ı atın.
- Hücreleri 200 μL soğuk DPBS'de yeniden askıya alın ve karanlık, soğuk 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde toplayın ve floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) ile analiz edilene kadar buz üzerinde tutun.
- FACS analizi için, kalıntıları dışlamak için hücreleri yan saçılmış (SSC-A) ve ileri saçılmış (FSC-A) kullanarak dağıtın. Ayrıca, kapılı hücreleri, canlı hücre popülasyonundan çiftlerden teklileri ayırt etmek için ileri saçılma yüksekliğine (FSC-H) karşı ileri dağınık alana (FSC-A) karşı dağıtın.
NOT: Hücreler, her belirteç için izotip kontrolünün kaymasına göre kapılıydı ve analiz için her boyanmış numuneden en az 10.000 kapılı olay kullanıldı.
4. MSC'lerin adipositlere farklılaşması
- Minimum esansiyel ortam (MEM)-alfaya %10 nakavt serum replasmanı (KOSR), %1 Glutamin, %1 P/S, 4.5 ng/μL glikoz ekleyerek adiposit farklılaşma bazal ortamını hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.
- MSC'lerin %90'ın üzerinde akıcılığa ulaşmasına izin verin. Bir büyüme durması dönemine girmelerine izin vermek için onları 48 saat daha kültürlemeye devam edin.
- Bazal ortama 100 μg / mL 3-İzobütil-1-metilksantin (IBMX), 1 μM deksametazon, 0.2 U / mL insülin, 100 μM indometasin ve 10 μM rosiglitazon ekleyerek tam adiposit farklılaşma ortamı hazırlayın.
- MSC farklılaşma ortamını çıkarın ve DPBS kullanarak hücreleri yıkayın.
- Tam adiposit farklılaşma ortamı-6 delikli bir plaka kuyusu için 2 mL ve 12 delikli bir plaka kuyusu için 1 mL ekleyin ve hücreleri 37 ° C'de inkübe edin. Tam farklılaştırma ortamını 14 gün boyunca her gün değiştirin.
5. Adipositlerin farklılaşma etkinliğinin değerlendirilmesi
- Farklılaşmanın 14. gününde, adiposit olgunlaşma belirteçleri, FABP4 ve adiponektin için hücreleri boyayarak farklılaşmanın etkinliğini kontrol edin.
- Ortamı çıkarın ve hücreleri DPBS ile yıkayın.
- Hücreleri% 4 paraformaldehit (PFA) - 200 μL kullanarak 24 delikli bir plakanın kuyucuğuna sabitleyin - ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
- PFA'yı atın ve% 0.5 ara (TBST) ile tris tamponlu salin kullanarak yıkayın ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında bir çalkalayıcıya yerleştirin. İşlemi iki kez tekrarlayın.
- Sabit hücreleri% 0.5 Triton X-100 (PBST) ile fosfat tamponlu salin ile geçirgen hale getirin ve 15-20 dakika boyunca oda sıcaklığında bir çalkalayıcıya yerleştirin.
- PBST'yi atın ve bloke edici tamponu (PBST'de% 5 -% 6 sığır serum albümini (BSA)-6 delikli bir plaka kuyusu için -500 μL ve 12 delikli bir plaka kuyusu için 250 μL ekleyin ve 40-60 dakika boyunca çalkalayıcıda oda sıcaklığında inkübe edin.
- FABP4'e karşı birincil antikorları, adiponektini% 2 -% 3 BSA'da, 1:500'lük bir konsantrasyonda seyreltin (bakınız Malzeme Tablosu). Bu antikorları yalnızca farklı hayvanlarda yetiştirilirse bir araya getirin ve plakayı gece boyunca 4 ° C'de çalkalayıcıya yerleştirin.
- Birincil antikorları çıkarın ve hücreleri TBST ile üç kez yıkayın (her biri 15 dakika) ve oda sıcaklığında bir çalkalayıcıya yerleştirin.
- Alexa Fluor ikincil antikorlarını PBST'de hazırlayın (1:500). Sekonder antikor kombinasyonlarındaki hücreleri (birincil antikorun yükseldiği türlere göre) oda sıcaklığında 60 dakika boyunca inkübe edin ve plakayı ışıktan korumak için alüminyum folyo ile örtün.
- İkincil antikorları atın, TBST ile üç kez yıkayın ve plakayı çalkalayıcıya yerleştirin.
- Çekirdekleri lekelemek için, PBS'de seyreltilmiş 24 delikli bir plaka kuyucuğu için 1 μg / mL Hoechst 33342-200 μL ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
- Hoechst çözeltisini atın ve hücrelere 24 delikli bir plaka kuyusu için PBS-500 μL ekleyin. Ters çevrilmiş floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilinceye kadar plakaları ışıktan kapalı tutun.
6. Nil kırmızısı kullanarak adipositlerin sıralanması
- DMSO'ya 1 mg/mL Nil kırmızısı stok çözeltisi ekleyerek Nil kırmızısı çalışma solüsyonunu hazırlayın ve -20 °C'de saklayın. Kullanmadan hemen önce, Nil kırmızı stoğunu çözün ve 300 nM çalışma çözeltisi konsantrasyonuna ulaşmak için DPBS'de yeniden oluşturun.
- Adiposit farklılaşmasının 14. gününde veya sonrasında, ortamı hücrelerden atın ve DPBS kullanarak yıkayın.
- Nil kırmızısı çalışma solüsyonunu -6 delikli bir plakanın kuyucuğuna 1 mL- ekleyin ve 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Nil kırmızısı çözeltisini çıkarın ve 6 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna tripsin-EDTA -500 μL ekleyin ve 4 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- 15 mL'lik bir konik tüpte% 5 FBS içeren DMEM kullanarak hücreleri toplayın. 4 dakika boyunca 750 x g'de santrifüj.
- Süpernatantı çıkarın ve 1 x 106 hücre için DPBS-1 mL'de yeniden askıya alın. 4 dakika boyunca 750 x g'de santrifüj.
- Süpernatantı çıkarın ve 1 x 106 hücre için DPBS-1 mL'de yeniden askıya alın. FL1 kanalını kullanarak Nil kırmızı-pozitif hücrelerini izole etmek için bir FACS sıralayıcısı kullanın.
- Adiposit farklılaşma ortamındaki sıralanmış hücreleri yeniden kültüre alın veya RNA ve protein izolasyonu için sıralanmış hücreleri toplayın.
- Sıralanmış hücrelerden RNA'yı çıkarın ve FABP4, PPARG ve C / EBPA dahil olmak üzere adiposit farklılaşma belirteçlerinin göreceli kantitatif analizini yapın. Nil kırmızı-pozitif hücreleri, sıralanmamış hücrelere kıyasla en az iki katın gen ekspresyonunda önemli bir artış gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mezenkimal farklılaşma sırasında hücrelerin şematik ve morfolojisi: iPSC'lerin MSC'lere farklılaşması, EB oluşumu, MSC farklılaşması ve MSC genişlemesi boyunca uzanan çeşitli gelişim aşamalarını içerir (Şekil 1). Gelişimin bu aşamalarında, hücreler maruz kaldıkları farklı uyarıcı kimyasallar nedeniyle çeşitli morfolojiler kazanırlar. Farklılaşmayı başlattıktan sonra, hücreler süspansiyonla kaplanır ve çapı küçük ila orta büyüklükte iken, tanımlanmış hücre kenarlıkları ile yuvarlak olması beklenir. (Şekil 2). Farklılaşmanın ilk aşamasında süspansiyondaki kültür hücrelerinin seçimi, doğal embriyonik gelişim sürecine çok benzemesini sağlar ve bu fazı başarılı farklılaşma için oldukça önemli kılar. EB oluşumu ve RA tedavisi aşamasını, EB'lerin bazal membran matris kaplı plakalar üzerine kaplanması izler. EB'lerin kaplama üzerindeki canlılığına, daha fazla MSC'ye yol açan hızlı çoğalma davranışlarını gözlemleyerek ulaşılabilir (Şekil 2). MSC'ler tarafından sergilenen bu hızlı proliferasyon davranışı, taze matris kaplı plakalara geçirildikten sonra bile, kendine özgü, uzun morfolojiyi koruyarak korunur (Şekil 2).
MSC yüzey belirteçlerinin kantitatif değerlendirmesi: MSC'lerin farklılaşma verimliliğine, MSC farklılaşmasına özgü yüzey belirteçlerinin nicelleştirilmesi ile erişilir. Güvenilir MSC'ler üreten iyi farklılaşma, CD73, CD44 ve CD90 mezenkimal yüzey belirteçlerinin %90'ından fazla verimlilik göstermelidir (Şekil 3A). Buna ek olarak, hücreler hematopoetik fenotip, CD14, CD34 ve CD19'u gösteren yüzey belirteçlerinin yokluğu açısından da değerlendirilir ve bu nedenle onlar için% 1'den az ekspresyon verimliliği göstermesi beklenir (Şekil 3B).
MSC'lerin adipositlere farklılaşması: MSC'lerin adipositlere farklılaşmasına FABP4 ve adiponektin için boyama yapılarak erişilebilir. FABP4 sitoplazmik bir proteindir ve terminal olarak farklılaşmış adipositler için bir belirteç olarak kabul edilir. Sitoplazmik dağılıma sahip adipositler arasındaki yüksek ekspresyonu, gelişimsel olgunluklarının önemli bir işaretidir (Şekil 4A). FABP4'e ek olarak, adiponektin, adiposit olgunluğu için önemli belirteçlerden biri olarak kabul edilir. Yüksek ekspresyonu, adipositlerin glikoz sinyalizasyonuna yanıt olarak lipid depolaması ve adipogenez geçirecek kadar işlevsel olduğunu gösterir. Bir salgı proteini olan adiponektin, sitoplazma içinde kolayca ayırt edilebilen her protein küreciği ile küresel morfoloji sergiler (Şekil 4B).
Olgun adipositlerin Nil kırmızısı kullanılarak boyanması ve sıralanması: Farklılaşma üzerine, olgun adipositler Nil kırmızısı için boyanarak olgunlaşmamış meslektaşlarından ayırt edilebilir. Nil kırmızısı, olgun adipositlere özgü bir özellik olan lipit taşıyan adipositlere bağlanır (Şekil 5A). Bu, Nil kırmızısının floresan taşıyıcı özelliği ile birlikte, floresan aktif akış sitometrisi kullanarak olgun adipositleri sıralamak için etkili bir araç haline getirir (Şekil 5B). Etkili sıralama, olgunlaşma belirteçlerinin (PPARG, C / EBPA ve FABP4) nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) ile belirlenen en az iki kat artmasına neden olmalıdır (Şekil5C).
Şekil 1: iPSC'lerin MSC'lere ve adipositlere farklılaşmasını gösteren şematik diyagram. iPSC'ler , embriyoid cisim (EB) tekniği kullanılarak MSC'lere ayrılır. EB'ler, 10 μM all-trans retinoik asidin (RA) kısa bir maruziyetine maruz kalır. Üretilen MSC'ler iPSC hattına göre %40-%77 adipositlere ayrılır. Nil kırmızısı pozitif hücreleri, adipositle ilişkili bozuklukları incelemek (hastalık modellemesi), yeni ilaçları tanımlamak ve nihayetinde kişiselleştirilmiş terapi için kullanılabilecek saflaştırılmış bir olgun adiposit popülasyonu elde etmek için FACS kullanılarak sıralanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: iPSC'lerin MSC'lere farklılaşması. 2. (D2), 11 (D11), 15 (D15) ve 24. (D24) günlerde MSC farklılaşmasının farklı aşamalarını gösteren temsili morfolojik görüntüler. 24 saat boyunca 10 μM RA varlığında üretilen embriyoid cisimler (EB'ler), farklılaşmanın 8. gününde kaplandı, bunu 12-17 günlük farklılaşmadan sonra ayrışma ve pasörleşme izledi. MSC'ler birkaç kez geçildi. Kısaltmalar: P2 = pasaj 2. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: iPSC türevi MSC'lerde MSC belirteçlerinin ve hematopoetik belirteçlerin ekspresyonu. 10 μM RA ile tedavi edilen iPSC türevli EB'lerden üretilen MSC'lerde MSC belirteçleri, CD73, CD44 ve CD90, (A) ve hematopoetik belirteçler, CD34, CD19 ve CD14 (B) ekspresyonunu gösteren temsili akım sitometri histogramları. Grafikteki X ekseni, floresan yoğunluğunu temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: iPSC türevi MSC'lerin adipositlere farklılaşması. iPSC'lerden türetilen olgun adipositlerde FABP4 (A) ve adiponektin (ADIPO) (B) ekspresyonunu gösteren immün boyama görüntüleri. Çekirdekler Hoechst ile boyandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Nil kırmızısı kullanılarak iPSC türevi adipositlerin sıralanması. (A) Parlak alan (BF) ve Nil kırmızısı boyalı olgun adipositleri gösteren görüntüler. (B) FACS kullanılarak olgun adipositlerde Nil kırmızısının (PE-pozitif hücreler) miktarının belirlenmesi. (C) Sıralanmış ve sıralanmamış olgun adipositlerde C/EBPA, FABP4 ve PPARG ekspresyonunu gösteren gerçek zamanlı PCR analizi. Veriler ortalama ± SD olarak temsil edilir; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, MSC'leri yüksek verim ve verimlilikte sağlama kabiliyeti nedeniyle büyük önem taşımaktadır. MSC'lerin bu kitlesel ölçekli üretimi, iPSC'lerden türetilmiş EB'lerin 10 μM RA14,15 ile geçici inkübasyonu ile mümkün olmuştur. 10 μM RA ile geçici işlem, MSC verimini 11,2 ila 1542 kat artırdı14,15, bu protokol hem iPSC'lerde hem de hPSC'lerde uygulanabilir. Bu doz ve tedavi süresinde RA, iPSC'lerin hayatta kalması ve çoğalması için kritik olan hücre proliferasyonu, apoptoz ve hücre-hücre ve ECM-hücre adezyonları ile ilgili çeşitli genlerin ekspresyonunun doğrudan veya dolaylı olarak düzenlenmesi yoluyla EB oluşturan hücrelerin proliferatif ve sağkalım kapasitelerini arttırır14,16. Genler, transkripsiyon faktörlerini (EGFR4, SOX4 gibi), büyüme faktörlerini ve büyüme faktörü reseptörlerini (IGF2, FGFR4 gibi) ve adezyon moleküllerini (FN1 ve CAM'ler gibi) içerir, ancak bunlarla sınırlı değildir. Bununla birlikte, düşük dozların (0.1-10 μM) aksine, yüksek dozlarda (≥20 μM), RA, EB oluşturan hücrelerin proliferasyonunu ve sağkalımını negatif olarak düzenler, bu da PSC kaynaklı EB sayısının ve boyutunun azalmasına ve böylece MSC'lerin veriminin azalmasına neden olur14. RA, birçok normal diferansiye ve kanserli hücrede proliferasyon inhibitörü olarak kabul edilir17,18,19. EB'lerde, retinoid sinyalleme bağlama (zaman, konsantrasyon, tür ve hücre hattı) bağımlıdır; Farklı genleri ve sinyal yollarını düzenleyerek EB oluşturan hücrelerin kendini yenilemesini, hayatta kalmasını ve farklılaşmasını farklı şekilde etkiler20,21. Bu nedenle, EB indüksiyonunun 3. gününde RA-10 μM'nin optimal bir zamanda ve konsantrasyonunda kullanılması, ardından mevcut protokolde açıklandığı gibi 2 gün boyunca 5. günde 0.1 μM'ye doz azaltılması - EB oluşturan hücre sağkalımını ve proliferasyonunu indüklemek için çok önemlidir.
Büyüme ve sağkalımı düzenlemeye ek olarak, RA, tedavi edilen EB'leri, RA14 ile tedavi edilmeyen hücrelere kıyasla farklılaşma gecikmesine maruz bırakır. Aslında, RA ile tedavi edilen EB'ler, kaplamadan sonra kompakt şekillerini korurlar ve RA ile tedavi edilmemiş EB'lerin aksine, MSC benzeri hücrelere farklılaşamazlar. Bu, RA tedavisine kısa süreli maruz kalmanın, WNT sinyal21'in baskılanması yoluyla hücre farklılaşmasını inhibe ettiğini bildiren önceki çalışmalarla tutarlıdır. Dahası, bu RA ile tedavi edilen farklılaşma gecikmeli hücreler, iPSC'lerin pluripotent durumunun korunmasında önemli bir rol oynadığı bilinen kadherin ve hücre dışı matriks proteinlerinin14 ekspresyonunun arttığını da göstermiştir16. RA aracılı farklılaşma bloğunu serbest bırakmak için, EB'ler ayrıştırılmalıdır, bu da hücre yapışmalarını bozar ve kaplama sırasında uzun süreli MSC farklılaşmasına izin verir. İlginç bir şekilde, RA tedavisi hücreler üzerinde bir farklılaşma bloğu tuttu, ancak hücreleri pluripotent bir durumda tutmadı. Aslında, 10 μM RA'ya kısa süreli maruz kalan EB oluşturan hücreler, anahtar pluripotens belirteçlerinin (OCT4, SOX2 ve NANOG14) ekspresyonunun önemli ölçüde azaldığını göstermektedir.
EB'lerin kısa süreli RA tedavisi ile üretilen MSC'lerin, tipik fibroblast benzeri morfolojilerini, MSC yüzey belirteçlerinin bol miktarda ekspresyonu ve kriyoprezervasyonu takiben multipotensleri ile korudukları gösterilmiştir, böylece bu seri üretilen MSC'leri uzun süreli genişleme çalışmaları için depolanabilir hale getirmektedir14. Onları adipojenik, kondrojenik ve osteojenik farklılaşma koşullarına maruz bırakırken, bu MSC'ler üç mezodermal hücre tipine kolayca farklılaşabilir ve böylece dokuyla ilgili hastalıkların modellenmesi için kolayca ulaşılabilir bir kaynak haline gelebilir14. Bu nedenle, RA aracılı farklılaşma protokolü tarafından üretilen MSC'lerin kararlı ve çok yönlü in vitro davranışı, onlara araştırma ve uygulama tabanlı ortamlarda büyük önem kazandırmaktadır.
RA ile tedavi edilen EB'lerden elde edilen MSC'lerin kondrojenik ve osteojenik farklılaşma potansiyelleri, tedavi edilmemiş EB'lerden elde edilen MSC'lerinkine benzer görünse de, birincisinin, adipojenik farklılaşma koşullarına maruz kaldığında adipojenik soya farklılaşmak için gelişmiş bir potansiyel sergilediği bulunmuştur14. Bu, RA-tedavi edilmemiş EB'lerden türetilen MSC'lere kıyasla, adipojenik farklılaşma ortamı ile RA ile tedavi edilen EB'lerden türetilen MSC'lerin kültürlenmesinden sonra elde edilen hücrelerin farklılaşma havuzundaki hücre içi lipid birikiminde (Yağ Kırmızı O boyama) ve adiposit belirteci FABP4-pozitif hücrelerde 2 ila 3 kat artış ile kanıtlanmıştır. Bu, RA ile tedavi edilmiş ve tedavi edilmemiş EB'lerden 14,22,23,24,25 RNA dizileme verileriyle ortaya konduğu gibi, Hippo, WNT ve ECM-hücre etkileşim yolları gibi adiposit gelişimini yöneten çeşitli sinyal yollarının RA tarafından düzenlenmesinin bir sonucu olabilir. RA kaynaklı MSC'lerin adipojenik farklılaşmaya uğrama konusundaki bu gelişmiş yeteneği değerlidir, çünkü şu anda mevcut protokoller ya zayıf adiposit verimine yol açmakta ya da üretilen adipositleri doğal süreç özetlenmiş adipositlerin türetilmesi için paha biçilmez kılan genetik manipülasyondan yararlanmaktadır. Adipositler beyaz, kahverengi ve bej olmak üzere üç tipte sınıflandırılır. Beyaz adipositler, tek bir lipit damlacığının varlığına göre sınıflandırılır ve enerji depolamada rol oynar. Oysa, kahverengi adipositler, UCP1 ekspresyonu ile karakterize edilen çok yüksek mitokondri bolluğu nedeniyle substrat oksidasyonu ile enerji harcamasında rol oynarlar. Beyaz yağ dokusunda lokalize olarak bulunan kahverengi adipositler ise bej veya kahverengi benzeri adipositler olarak bilinir. Bu MSC, EB'lerin RA'ya ön maruziyeti göz önüne alındığında bol miktarda beyaz adiposit verimi verme potansiyeline sahiptir. Önceki yayınlar, yüksek UCP1 seviyelerine sahip hücreleri RA26'ya maruz bırakmak yerine, düşük UCP1'i, yani beyaz adipositleri eksprese eden hücrelere iPSC'nin seçici indüksiyonunu belirtmiştir. Önceki yayınlar, fare ve zebra balığı embriyolarında nöral krest hücrelerinden üretilen RA'nın beyaz adiposit oluşumunda önemli bir rol oynadığını bildirmiştir27,28.
RA tabanlı protokol, adipositlerin %48.5-%77.4'e ulaşan (RA tedavisi olmadan %22.5-%57.6'ya kıyasla) artan verimini sağlayan MSC'lerin üretilmesine izin vermesine rağmen, çok değişkenli adiposit bazlı genetik bozuklukların modellenmesinde %>90'a ulaşılamaması hala sorunludur in vitro. Aslında, saf bir adiposit popülasyonuna ulaşmamak, çok değişkenli hastalık modellerinden gelen sonuçları kararsız hale getirebilir, çünkü gözlemlenen gelişimsel farklılıkların farklı genetik yapılardan mı yoksa tutarsız farklılaşma verimliliklerinden mi kaynaklandığını ayırt etmek zor olacaktır. Bu sorunu aşmak için, saf olgun adipositlerden oluşan bir havuz elde etmek için farklılaşmış hücreleri sıralamak önemliydi, böylece fenotiplerdeki herhangi bir farklılık yalnızca doğal genetik farklılıklara atfedilebilirdi. Birkaç çalışma, adipositler üzerinde sıralama için potansiyel olarak kullanılabilecek yüzey belirteçleri tanımlamıştır. Örneğin, Ronald Kahn tarafından yürütülen çalışma, amino asit taşıyıcı ASC-1'in beyaz adipositler üzerinde yeni bir yüzey belirteci olarak tanımlanmasına izin verdi29. Ek olarak, omental ve subkutan bölgelerden matür adipositleri ekstrakte eden çalışmalar, olgun adipositlerin yüzeylerinde CD34, CD36 ve CD59'u eksprese ettiklerini bildirmiştir30CD36'nın olgun adipositlerin yüzeyinde bir yağ asidi taşıyıcısı olarak işlev gördüğü bildirilmiştir31. Bununla birlikte, bu çalışmalar, yağ dokusundan türetilen hücrelerin heterojen popülasyonlarını, bu belirteçlerin ekspresyonunu sadece olgun adiposit popülasyonlarına belirtmeden kullanmıştır. Ayrıca, bu belirteçler diğer hücre tipleri tarafından da eksprese edilebilir ve adipositlere özgü değildir. Örneğin, ASC-1 hem astrositlerde hem de nöronlarda bulunur32CD34, hematopoetik kök hücrelerin bir belirtecidir33CD36 trombositlerde, mononükleer fagositlerde, hepatositlerde, miyositlerde ve bazı epitellerde bulunur33ve CD59 endotel ve lenfoid hücrelerde eksprese edilir34,35. Bu nedenle, alternatif bir çözüm olarak, hücre içi lipitler için seçici floresan boyası olan Nil kırmızısı, adipositleri sıralamak için olası bir aday olarak kullanılmıştır. Adipositler, enerji üretmek, membran oluşturmak veya metabolizmayı düzenleyen sinyal molekülleri olarak salınabilen ve kullanılabilen lipitlerin önemli bir kısmını depolar36. Nil kırmızısı boya daha önce murin ve insan MSC'lerinden türetilen adipositleri boyamak için akış sitometrisinde ve mikroskopide kullanılmıştır37. Önceki çalışmalar, ESC kaynaklı adipositler için Nil kırmızısının kullanımını ve sıralama sonrası adiposit belirteçlerinin arttırıldığını bildirmiştir38. Mevcut RA tabanlı protokol ile elde edilen MSC'lerden üretilen adipositler, olgunluklarını gösteren Nil kırmızısı ile lekelenme yetenekleri açısından değerlendirildi ve onları saflaştırmak için sıralandı. Bu Nil kırmızısı sıralanmış hücreler, adiposit olgunlaşma belirteçlerinin ekspresyonunda iki ila üç kat artış gösterdi. PPARG, C/EBPAve FABP4 sıralanmamış hücrelerle karşılaştırıldığında, böylece iPSC'lerden türetilmiş adipositlerin verimini daha da arttırır. Bu belirteçler lipit birikiminden önce eksprese edilmesine rağmen, ekspresyonları, lipit taşıyan adipositlere terminal farklılaşma için bir hücreyi etiketler. Bu belirteçlerle sıralama verimliliğini kontrol etmek, tüm hücrelerin eksprese edildiği bir havuzu tanımlamamızı sağlar FABP4, CEBPave PPARg, olgun adiposit oluşumu için önceden belirlenmiş bir havuzu gösterir. Hücreler, Nil kırmızısına boyanma potansiyellerine göre sıralanır. Saflaştırma verimliliği, sıralanmamış fraksiyondaki yüksek sayıda adiposit nedeniyle iki ila üç kat artmıştır. Lipit taşıyan adipositlerin boyutu, aynı boyut dağılımına sahip bir hücre havuzunun sıralandığı farklılaşma sırasında büyük ölçüde değişir. Sıralanmamış fraksiyon, lipit taşıyan adipositleri kapsar, ancak tamamen olgun değildir ve farklı boyut oranları tarafından yönetilir.
İnsan vücudundan izole edilen MSC'lerin heterojenliği daha önce bildirilmiştir39. Bu heterojenlik, MSC kökeni, donörler ve koşullar gibi çeşitli faktörlere bağlıdır39. Bu, farklı hastalıkların tedavisinde etkinliklerinde farklılıklara yol açabilir. Bu çalışma, iyi üretim uygulamaları (GMP) uyumlu kültür koşulları altında üretilen hPSC'lerin kısa RA tedavisinin homojen bir MSC popülasyonu vereceğini düşündürmektedir. Bu, mevcut protokolün, MSC tabanlı tedavi için kullanılabilecek çok sayıda klinik dereceli MSC üretmek için umut verici bir yaklaşım olduğunu göstermektedir.
Adiposit farklılaşmasına yol açan RA tabanlı MSC farklılaşma protokolünün ve Nil kırmızısı sıralama protokolünün kombinasyonu, fonksiyonel belirteçlerin gelişmiş ekspresyonu ve artan verim ve saflık ile iPSC'lerden türetilmiş adipositler elde etmemizi sağladı. Böylece, bu kombine protokol, genetik olarak farklı bireylerden olgun adipositlerin yeterli miktarda ve saflıkta üretilmesine ve adipositle ilişkili metabolik bozuklukların arkasındaki yeni genetik varyantların potansiyel olarak ortaya çıkarılmasına izin verecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar birbiriyle çelişen çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma Katar Ulusal Araştırma Fonu'ndan (QNRF) bir hibe ile finanse edilmiştir (Hibe No. NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi Katar Ulusal Araştırma Fonu'ndan (QNRF) GSRA bursu ile desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adiponectin | Abcam | ab22554 | Adipocyte maturation marker |
| anti-CD105 | BD Pharmingen | 560839 | MSC differentiation marker |
| anti-CD14 | BD Pharmingen | 561712 | MSC differentiation marker |
| anti-CD19 | BD Pharmingen | 555415 | MSC differentiation marker |
| anti-CD34 | BD Pharmingen | 555824 | MSC differentiation marker |
| anti-CD44 | abcam | ab93758 | MSC differentiation marker |
| anti-CD45 | BD Pharmingen | 560975 |
MSC differentiation marker |
| anti-CD73 | BD Pharmingen | 550256 | MSC differentiation marker |
| anti-CD90 | BD Pharmingen | 555596 | MSC differentiation marker |
| bFGF | R&D | 233-FP | MSC culture media supplement |
| C/EBPA | Abcam | ab40761 | Adipocyte maturation marker |
| Dexamethasone | Torics | 1126 | Adipocyte differentiation media supplement |
| FABP4 | Abcam | ab93945 | Adipocyte maturation marker |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10082147 | MSC culture media supplement |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050-061 | MSC culture media supplement |
| IBMX | Sigma Aldrich | I5879 | Adipocyte differentiation media supplement |
| Indomethacin | Sigma Aldrich | I7378 | Adipocyte differentiation media supplement |
| Insulin | Sigma Aldrich | 91077C | Adipocyte differentiation media supplement |
| Knockout DMEM | ThermoFisher | 12660012 | Basal media for preparing matrigel |
| Low glucose DMEM | ThermoFisher | 11885084 | MSC culturing media |
| Matrigel | Corning | 354230 | Coating matrix |
| MEM-alpha | ThermoFisher | 12561056 | Adipocyte differentiation media |
| Nilered | Sigma Aldrich | 19123 | Sorting marker for adipocyte |
| Penicillin | ThermoFisher | 15140122 | MSC/Adipocyte media supplement |
| Phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190144 | wash buffer |
| Pierce™ 20X TBS Buffer | Thermo Fisher | 28358 | wash buffer |
| PPARG | Cell Signaling Technology | 2443 | Adipocyte maturation marker |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Dissociation reagent |
| Retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625 | MSC differentiation media supplement |
| Rock inhibitor | Tocris | 1254/10 | hPSC culture media supplement |
| Roziglitazone | Sigma Aldrich | R2408 | Adipocyte differentiation media supplement |
| StemFlex | ThermoFisher | A334901 | hPSC culture media |
| Triton | Thermo Fisher | 28314 | Permebealization reagent |
| Trypsin | ThermoFisher | 25200072 | Dissociation reagent |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7942 | Wash buffer |
References
- Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling: CCS. 9, 12 (2011).
- Wagner, W., et al. Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells. PLoS One. 4 (6), 5846 (2009).
- Brown, P. T., Squire, M. W., Li, W. J. Characterization and evaluation of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells and bone marrow. Cell and Tissue Research. 358 (1), 149-164 (2014).
- Trivedi, P., Hematti, P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Experimental Hematology. 36 (3), 350-359 (2008).
- Barberi, T., Willis, L. M., Socci, N. D., Studer, L. Derivation of multipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells. PLoS Medicine. 2 (6), 161 (2005).
- Xiong, C., et al. Derivation of adipocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (6), 671-675 (2005).
- Cuaranta-Monroy, I., et al. Highly efficient differentiation of embryonic stem cells into adipocytes by ascorbic acid. Stem Cell Research. 13 (1), 88-97 (2014).
- van Harmelen, V., et al. Differential lipolytic regulation in human embryonic stem cell-derived adipocytes. Obesity (Silver Spring). 15 (4), 846-852 (2007).
- Noguchi, M., et al. In vitro characterization and engraftment of adipocytes derived from human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 22 (21), 2895-2905 (2013).
- Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
- Lee, Y. K., Cowan, C. A. Differentiation of white and brown adipocytes from human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 538, 35-47 (2014).
- Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (6), 2459-2483 (2021).
- Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
- Karam, M., Younis, I., Elareer, N. R., Nasser, S., Abdelalim, E. M. Scalable Generation of mesenchymal stem cells and adipocytes from human pluripotent stem cells. Cells. 9 (3), (2020).
- Karam, M., Abdelalim, E. M. Robust and highly efficient protocol for differentiation of human pluripotent stem cells into mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. (2020).
- Li, L., Bennett, S. A., Wang, L. Role of E-cadherin and other cell adhesion molecules in survival and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Adhesion & Migration. 6 (1), 59-70 (2012).
- Lai, L., Bohnsack, B. L., Niederreither, K., Hirschi, K. K. Retinoic acid regulates endothelial cell proliferation during vasculogenesis. Development. 130 (26), 6465-6474 (2003).
- Chanchevalap, S., Nandan, M. O., Merlin, D., Yang, V. W. All-trans retinoic acid inhibits proliferation of intestinal epithelial cells by inhibiting expression of the gene encoding Kruppel-like factor 5. FEBS Letters. 578 (1-2), 99-105 (2004).
- di Masi, A., et al. Retinoic acid receptors: from molecular mechanisms to cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 41, 1 (2015).
- Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Letters. 584 (14), 3123-3130 (2010).
- De Angelis, M. T., Parrotta, E. I., Santamaria, G., Cuda, G. Short-term retinoic acid treatment sustains pluripotency and suppresses differentiation of human induced pluripotent stem cells. Cell Death & Disease. 9 (1), 6 (2018).
- Li, L., Dong, L., Wang, Y., Zhang, X., Yan, J. Lats1/2-mediated alteration of hippo signaling pathway regulates the fate of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2018, 4387932 (2018).
- Moldes, M., et al. Peroxisome-proliferator-activated receptor gamma suppresses Wnt/beta-catenin signalling during adipogenesis. The Biochemical Journal. 376, Pt 3 607-613 (2003).
- Ross, S. E., et al. Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science. 289 (5481), 950-953 (2000).
- Wang, Y. K., Chen, C. S. Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 823-832 (2013).
- Mohsen-Kanson, T., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells into brown and white adipocytes: role of Pax3. Stem Cells. 32 (6), 1459-1467 (2014).
- Billon, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
- Li, N., Kelsh, R. N., Croucher, P., Roehl, H. H. Regulation of neural crest cell fate by the retinoic acid and Pparg signalling pathways. Development. 137 (3), 389-394 (2010).
- Ussar, S., et al. ASC-1, PAT2, and P2RX5 are cell surface markers for white, beige, and brown adipocytes. Science Translational Medicine. 6 (247), (2014).
- Festy, F., et al. Surface protein expression between human adipose tissue-derived stromal cells and mature adipocytes. Histochemistry and Cell Biology. 124 (2), 113-121 (2005).
- Cai, L., Wang, Z., Ji, A., Meyer, J. M., vander Westhuyzen, D. R. Scavenger receptor CD36 expression contributes to adipose tissue inflammation and cell death in diet-induced obesity. PLoS One. 7 (5), 36785 (2012).
- Mesuret, G., et al. A neuronal role of the Alanine-Serine-Cysteine-1 transporter (SLC7A10, Asc-1) for glycine inhibitory transmission and respiratory pattern. Scientific Reports. 8 (1), 8536 (2018).
- Silverstein, R. L., Febbraio, M. CD36, a scavenger receptor involved in immunity, metabolism, angiogenesis, and behavior. Science Signaling. 2 (72), (2009).
- Brooimans, R. A., van Wieringen, P. A., van Es, L. A., Daha, M. R. Relative roles of decay-accelerating factor, membrane cofactor protein, and CD59 in the protection of human endothelial cells against complement-mediated lysis. European Journal of Immunology. 22 (12), 3135-3140 (1992).
- Davies, A., et al. CD59, an LY-6-like protein expressed in human lymphoid cells, regulates the action of the complement membrane attack complex on homologous cells. The Journal of Experimental Medicine. 170 (3), 637-654 (1989).
- Lapid, K., Graff, J. M.
- Aldridge, A., et al. Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells--a direct comparison of four different methods. Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).
- Schaedlich, K., Knelangen, J. M., Navarrete Santos, A., Fischer, B., Navarrete Santos, A. A simple method to sort ESC-derived adipocytes. Cytometry A. 77 (10), 990-995 (2010).
- Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (2), 447-467 (2021).
