Summary
이 프로토콜은 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로부터 순수한 지방세포 집단의 생성을 허용합니다. 레티노산은 iPSC를 지방세포 생성에 사용되는 중간엽 줄기세포(MSC)로 분화시키는 데 사용됩니다. 그런 다음 나일 레드 염색을 기반으로 한 분류 접근법을 사용하여 순수한 지방 세포를 얻습니다.
Abstract
유도만능줄기세포(iPSC) 기술의 최근 발전으로 지방세포를 비롯한 다양한 세포 유형의 생성이 가능해졌습니다. 그러나, 현재의 분화 방법은 효율이 낮고, 지방세포의 균질한 집단을 생성하지 않는다. 여기에서 우리는 높은 수율로 중간엽 줄기 세포(MSC)를 생산하기 위해 all-trans retinoic 기반 방법을 사용하여 이 문제를 우회합니다. 세포 증식, 생존 및 부착을 제어하는 경로를 조절함으로써 당사의 분화 전략은 다능성 중간엽의 순수한 집단으로 분화하는 배아체(EB)의 효율적인 생성을 가능하게 합니다. 이 방법에 의해 생성된 많은 수의 중간엽 줄기세포는 지방세포를 생성하기 위한 이상적인 공급원을 제공합니다. 그러나 지방 세포 분화로 인한 샘플 이질성은 여전히 과제로 남아 있습니다. 따라서 우리는 FACS를 사용하여 지질 함유 성숙 지방 세포를 정제하기 위해 Nile red 기반 방법을 사용했습니다. 이 분류 전략을 통해 샘플 이질성이 감소하고 세포 기능이 향상된 지방 세포 풀을 사용하여 지방 세포 관련 대사 장애를 모델링하는 신뢰할 수 있는 방법을 확립할 수 있었습니다.
Introduction
중간엽 줄기 세포(MSC)는 지방 세포, 골 세포 및 연골 세포와 같은 중배엽 기원 세포를 생산하기 위한 효과적인 일시적 자원 역할을 하며, 이는 각각의 유전 질환을 모델링하는 데 추가로 사용될 수 있습니다. 그러나, 이전의 접근법은 성인 조직으로부터 이러한 중간엽 줄기세포를 얻는 것에 의존했다1, 이는 기증자로부터 많은 수의 중간엽 줄기세포를 얻는 데 어려움을 겪었고, 차선의 체외 배양 조건1,2에서 기능적으로 생존할 수 있도록 유지하는 데 한계가 있었다. 이러한 장애물은 시험관 내에서 MSC를 생성하기 위한 프로토콜을 갖는 것에 대한 큰 수요를 낳았습니다. 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)는 MSC 특성 3,4,5를 나타내는 MSC의 귀중한 공급원으로 사용될 수 있습니다. iPSC 유래 중간엽 줄기세포는 여러 질병에서 치료 옵션으로 사용할 수 있습니다. 또한 iPSC 유래 중간엽 줄기세포가 지방세포를 생성하는 능력은 인간 지방생성, 비만 및 지방세포 관련 장애를 연구하는 데 유용한 시험관 내 인간 모델이 됩니다.
지방세포의 현재 분화 프로토콜은 두 그룹으로 분류할 수 있는데, 하나는 화학적 또는 단백질 기반 칵테일을 사용하여 지방세포를 분화하여 30%-60%6,7,8,9의 결과 수율을 제공하는 반면, 다른 하나는 80%-90%10의 수율을 제공하기 위해 지방세포 발달을 지배하는 주요 전사 인자의 강력한 유도를 위한 유전자 조작을 포함합니다. 11. 그러나 유전자 조작은 지방세포 분화의 자연적 과정을 요약하지 않으며, 종종 지방 생성 중에 도달하는 미묘한 패러다임을 가려서 질병 모델링 목적에는 효과적이지 않습니다12,13. 따라서 우리는 나일 레드를 사용하여 지질 함유 지방 세포를 형광으로 태그하여 화학적으로 파생된 성숙한 지방 세포를 미성숙 지방세포에서 분류하는 방법을 제시합니다.
여기에서 우리는 지방 세포 생성에 추가로 사용될 수 있는 많은 수의 빠르게 증식하는 중간엽을 생성하기 위해 iPSC 유래 배아체(EB)를 all-trans retinoic acid와 함께 일시적으로 배양하는 프로토콜을 제시합니다14. 우리는 또한 친유성 염료를 사용하여 지질 방울에 형광 태그를 지정하여 이질적인 분화 풀에서 화학적으로 파생된 성숙한 지방 세포를 분류하는 방법을 제시합니다. 나일 레드. 이를 통해 지방 세포 관련 대사 장애를 정확하게 모델링할 수 있는 향상된 기능을 가진 성숙한 지방 세포의 순수한 집단을 생성할 수 있습니다.
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Protocol
이 연구는 적절한 기관 연구 윤리위원회의 승인을 받았으며 1964 년 헬싱키 선언 및 이후 개정 또는 유사한 윤리 기준에 명시된 윤리 기준에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜은 HMC(No. 16260/16) 및 QBRI(No. 2016-003)의 IRB(Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다. 이 작업은 H1 및 H9와 같은 hESC에도 최적화되어 있습니다. 충분한 정보에 입각한 동의를 받은 건강한 개인으로부터 혈액 샘플을 채취했습니다. iPSC는 건강한 개인의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 생성됩니다.
1. iPSC 배양 및 유지
- 코팅 매트릭스를 knockout-DMEM에서 1:80의 비율로 재구성하여 기저막 매트릭스 코팅 플레이트를 준비하고 4°C에서 보관합니다.
- 500mL의 줄기세포 기저 배지에 50mL의 10배 줄기세포 보충 배지와 5mL의 100x 페니실린-스트렙토마이신(P/S)을 추가하여 iPSC 배양액을 준비하고 단기간의 경우 4°C에서, 장기간 사용의 경우 -20°C에서 보관합니다.
- 플레이트를 코팅 매트릭스-1 mL 6-웰 플레이트에 대해, 500 μL에 12-웰 플레이트에, 250 μL에 24-웰 플레이트-플레이트를 37°C에서 1-2시간 동안 인큐베이션한다.
- iPSC 배양 배지의 분취량을 제거하고 사용하기 전에 실온에서 예열합니다.
- iPSC(ESC 또는 iPSC) 바이알을 37°C 수조에서 해동하고 2-3mL의 배양 배지가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
- 튜브를 실온(RT-23°C)에서 4분 동안 120 x g 로 원심분리합니다.
- 상층액을 제거하고 10μM ROCK 억제제(Y-27632)가 보충된 2mL의 신선한 배양 배지를 추가합니다. 매트릭스가 코팅된 6-웰 플레이트의 하나의 웰에 세포를 플레이트하고, 플레이트를 37°C에서 위치시킨다.
- 24시간 후 배지를 제거하고 신선한 배양 배지로 교체합니다.
- 세포가 80%-90% 밀도에 도달할 때까지 매일 배지를 교체하십시오.
- 합류도에 도달하면 아래에 설명된 단계에 따라 세포를 계대합니다.
- 배지를 제거하고 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 세포를 세척합니다.
- 6-웰 플레이트의 웰에 대해 500 μL, 24-웰 플레이트의 웰에 대해 250 μL--37°C에서 1분 동안 인큐베이션하는 iPSCs 해리 시약 ( 재료 표 참조)을 첨가한다.
- 해리 시약을 제거하고 37°C에서 1분 동안 건조된 세포를 배양한다.
- 15 mL 원뿔형 튜브에 6-웰 플레이트의 웰에 대해 1 mL 및 24-웰 플레이트의 웰에 대해 250 μL-배양 배지를 사용하여 세포를 수집하고, 120 x g 에서 4분 동안 원심분리한다.
- 10μM ROCK 억제제가 보충된 24웰 플레이트의 웰에 대해 6웰 플레이트의 웰에 대해 2mL의 배양 배지에 세포를 재현탁하고 40% 밀도로 새로운 매트릭스 코팅 플레이트에 플레이트합니다.
2. iPSC를 MSC로 차별화
- 저포도당 DMEM + 피루브산에 15% 소 태아 혈청(FBS)과 1% P/S를 첨가하여 MSC 분화 배지를 준비하고 4°C에서 보관합니다.
- 80% 밀도에 도달하면 아래에 설명된 단계에 따라 배아체(EB) 형성에 iPSC를 사용합니다.
- 세포를 DPBS로 세척하고 6웰 플레이트의 웰에 대해 해리 배지/EDTA-500μL, 24웰 플레이트의 웰에 대해 250μL로 배양합니다.
- 37°C에서 1분 동안 인큐베이션하고, 해리 시약을 흡인하고, 세포를 37°C에서 추가로 1분 동안 유지합니다. MSC 분화를 시작하려면 ~10-12 x 106 개의 세포가 필요합니다.
- 배양 배지를 사용하여 15mL 원뿔형 튜브에 세포를 수집합니다. 세포가 단일화되는 것을 방지하고 EB 형성을 허용하기 위해 수집하는 동안 매우 부드럽게하십시오. 세포를 120 x g 에서 4분 동안 원심분리합니다.
- 세포를 10 μM ROCK 억제제를 함유하는 3 mL의 MSC 분화 배지에 재현탁시킨다.
- 0.5 mL/well을 24웰 초저 부착 플레이트에 혼합하여 분배합니다.
참고: 초저 부착 플레이트를 사용하면 표면에 부착되는 것보다 EB로 세포 응집이 촉진됩니다. - 플레이트를 37°C의 인큐베이터에 넣습니다.
- 24시간 후, 아래에 설명된 단계에 따라 높은 레티노산(RA) 처리로 달성된 EB를 유도합니다.
- 10μM RA를 MSC 분화 배지 3mL에 추가합니다. 15mL 튜브에 EB를 수집하고 15분 동안 안정화시킵니다.
- EBs로부터 상청액을 제거하고, 10 μM RA로 보충된 MSC 분화 배지를 첨가한다.
- 부드럽게 재현탁하고 동일한 0.5웰 초저 부착 플레이트에 24mL/웰을 분배합니다.
- 플레이트를 37°C의 인큐베이터에 넣습니다. 다음 48시간 동안 EB를 방해하지 마십시오.
- 48시간 후 15mL 튜브에 EB를 수집하고 15분 동안 안정화시킵니다.
- EB에서 상청액을 제거하고 0.1μM RA가 보충된 MSC 분화 배지를 추가합니다.
- 부드럽게 재현탁하고 동일한 0.5웰 초저 부착 플레이트에 24mL/웰을 분배합니다.
- 플레이트를 37°C의 인큐베이터에 넣습니다. 다음 48시간 동안 EB를 방해하지 마십시오.
- 아래에 설명된 단계에 따라 셀에 추가된 RA를 제거합니다.
- 마지막 RA 치료 48시간 후, EB를 수집하고 15분 동안 안정되도록 합니다.
- 상청액을 제거하고 사이토카인이 없는 DMEM 저혈당 배지를 추가합니다.
- 부드럽게 재현탁하고 0.5웰 초저 부착 플레이트에 24mL/웰을 분배합니다. 플레이트를 37°C의 인큐베이터에 넣습니다.
- 아래에 설명된 단계에 따라 iPSC 파생 EB를 플레이트링합니다.
- 이전 단계(2.4단계)에서 48시간 후 15mL 튜브에 EB를 수집하고 15분 동안 안정화합니다.
- 상층액을 제거하고 2mL의 신선한 MSC 분화 배지에 재현탁합니다.
- 기저막 매트릭스 코팅된 6-웰 플레이트의 2개의 웰로 옮깁니다.
- 추가 5일 동안 격일로 미디어를 변경합니다.
- 5일 후, 사용한 배지를 제거하고 2.5ng/mL의 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 함유한 새로운 MSC 분화 배지로 교체합니다.
- 도금된 EB가 80%-90% 밀도에 도달하면 아래에 설명된 단계에 따라 통과시킵니다.
- 세포를 DPBS로 세척하고, 6-웰 플레이트의 웰에 트립신-EDTA-500 μL를 첨가하고, 세포를 37°C에서 3분 동안 인큐베이션한다.
- MSC 분화 배지를 사용하여 15mL 원뿔형 튜브에서 세포를 수집하고 750 x g 에서 4분 동안 회전합니다.
- 2.5ng/mL의 bFGF와 함께 MSC 분화 배지에 재현탁하고 세포를 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에 1:3의 비율로 플레이트합니다.
- 세포가 70%-80% 밀도에 도달하면 통과를 반복합니다. 2-3 계대까지 3-600만 개의 세포를 얻을 것으로 예상됩니다.
3. iPSC 유래 중간엽 줄기세포의 유세포 분석
참고: 2-3 계대 과정을 거치면 MSC 분화의 효율성을 위해 세포에 접근해야 합니다. 세포가 MSC 분화 마커-CD44, CD73, CD90 및 CD105를 90% 이상의 효율로 발현하고 높은 수준의 조혈 마커-CD14, CD19, CD34 및 CD45를 발현하지 않는 경우 분화가 성공적인 것으로 간주됩니다. 이러한 마커의 효율성은 아래 단계에 따라 액세스할 수 있습니다.
- 상기 약술된 단계(단계 2.6)를 사용하여 세포를 계대배양하고, v자형 바닥 96-웰 플레이트의 하나의 웰에서 1 x 105 세포를 얻는다.
- 플레이트를 4°C에서 4분 동안 375 x g 로 원심분리합니다.
- 1 μL의 접합 항체(Ab)와 함께 100 μL의 차가운 DPBS에 1 x 105 세포를 재현탁하고( 재료 표 참조) 4°C에서 30-40분 동안 배양하여 빛에 노출되지 않도록 합니다.
- 1:100 농도에서 접합된 Ab의 각각의 이소타입 대조군과 함께 100μL의 차가운 DPBS에 또 다른 1 x 105 세포를 재현탁하고 빛에 노출되지 않도록 4°C에서 30-40분 동안 배양합니다.
- 인큐베이션에 이어서, 플레이트를 4°C에서 4분 동안 375 x g 로 원심분리한다. 싱크대 위로 접시를 흔들어 상등액을 버립니다.
- 차가운 DPBS 100μL에 세포를 재현탁합니다.
- 세포를 4°C에서 4분 동안 375 x g 로 원심분리합니다. 상청액을 버리십시오.
- 200μL의 차가운 DPBS에 세포를 재현탁하고 어둡고 차가운 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 수집하고 형광 활성화 세포 분류(FACS)로 분석할 때까지 얼음 위에 보관합니다.
- FACS 분석의 경우, 측면 산란(SSC-A) 대 전방 산란(FSC-A)을 사용하여 세포를 분산시켜 잔해를 배제합니다. 또한, 전방 산란 높이(FSC-H) 대 전방 산란 영역(FSC-A)을 사용하여 게이트 세포를 분배하여 살아있는 세포 집단에서 싱글렛과 더블렛을 구별합니다.
참고: 모든 마커에 대한 이소타입 대조군의 이동과 관련하여 세포를 게이팅하고, 모든 염색된 샘플에서 최소 10,000개의 게이팅된 이벤트를 분석에 사용했습니다.
4. 중간엽 줄기세포의 지방세포로의 분화
- 10% 녹아웃 혈청 대체물(KOSR), 1% 글루타민, 1% P/S, 4.5ng/μL의 포도당을 최소 필수 배지(MEM)-알파에 첨가하여 지방세포 분화 기본 배지를 준비하고 4°C에서 보관합니다.
- MSC가 90% 이상의 밀도에 도달하도록 합니다. 성장 정지 기간을 겪을 수 있도록 48시간 동안 계속 배양합니다.
- 100μg/mL의 3-이소부틸-1-메틸크산틴(IBMX), 1μM의 덱사메타손, 0.2U/mL의 인슐린, 100μM의 인도메타신 및 10μM의 로시글리타존을 기본 배지에 추가하여 완전한 지방세포 분화 배지를 준비합니다.
- MSC 분화 배지를 제거하고 DPBS를 사용하여 세포를 세척합니다.
- 6-웰 플레이트의 웰에 2 mL 및 12-웰 플레이트의 웰에 1 mL-완전 지방세포 분화 배지를 추가하고, 세포를 37°C에서 배양한다. 14일 동안 격일로 완전한 분화 배지를 교체하십시오.
5. 지방세포의 분화 효율 평가
- 분화 14일째에 지방세포 성숙 마커인 FABP4와 아디포넥틴을 세포에 염색하여 분화 효율을 확인하였다.
- 배지를 제거하고 DPBS로 세포를 세척합니다.
- 200 μL의 4% 파라포름알데히드(PFA)를 사용하여 세포를 24웰 플레이트의 웰에 고정하고 실온에서 15분 동안 배양합니다.
- PFA를 버리고 0.5% 트윈(TBST)이 함유된 트리스 완충 식염수로 세척하고 실온에서 15분 동안 셰이커에 놓습니다. 이 과정을 두 번 반복합니다.
- 고정된 세포를 0.5% Triton X-100(PBST)이 함유된 인산염 완충 식염수로 투과시키고 실온에서 15-20분 동안 진탕기에 놓습니다.
- PBST를 버리고 블로킹 완충액(PBST 중 5%-6% 소 혈청 알부민(BSA))-500 μL를 6-웰 플레이트의 웰에 첨가하고 250 μL를 12-웰 플레이트의 웰에 첨가하고 실온에서 40-60분 동안 진탕기에서 배양합니다.
- FABP4에 대한 1차 항체, 아디포넥틴을 2%-3% BSA에 1:500의 농도로 희석합니다( 재료 표 참조). 다른 동물에서 자란 경우에만 이러한 항체를 함께 첨가하고 플레이트를 4°C에서 밤새 쉐이커에 놓습니다.
- 1차 항체를 제거하고 TBST(각각 15분)로 세포를 3회 세척한 후 실온에서 진탕기에 올려놓았다.
- PBST에서 Alexa Fluor 2차 항체를 준비합니다(1:500). 실온에서 60분 동안 2차 항체 조합(1차 항체가 상승하는 종에 따라)에서 세포를 배양하고 플레이트를 알루미늄 호일로 덮어 빛으로부터 보호합니다.
- 2차 항체를 버리고 TBST로 3회 세척한 후 플레이트를 셰이커에 올려놓는다.
- 핵을 염색하려면 PBS에 희석한 24웰 플레이트의 웰에 1μg/mL의 Hoechst 33342-200μL를 추가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
- Hoechst 용액을 버리고 PBS-500 μL를 24-웰 플레이트의 웰에 첨가하여 세포에 첨가하였다. 도립 형광 현미경을 사용하여 시각화될 때까지 플레이트를 빛으로부터 덮으십시오.
6. 나일 레드를 이용한 지방 세포 분류
- DMSO에 1mg/mL Nile red 원액을 첨가하여 나일 레드 작업 용액을 준비하고 -20°C에서 보관합니다. 사용 직전에 나일강 스톡을 해동하고 DPBS에서 재구성하여 300nM 작업 용액 농도를 달성합니다.
- 지방세포 분화 14일째 또는 그 후, 세포로부터 배지를 버리고 DPBS를 사용하여 세척한다.
- 나일 레드 작업 용액-1 mL를 6-웰 플레이트의 웰에 첨가하고 37°C에서 15분 동안 인큐베이션한다.
- 나일 레드 용액을 제거하고, 트립신-EDTA-500 μL를 6-웰 플레이트의 웰에 첨가하고, 37°C에서 4분 동안 인큐베이션한다.
- 15 mL 코니컬 튜브에 5% FBS를 함유하는 DMEM을 사용하여 세포를 수집한다. 750 x g 에서 4분 동안 원심분리기.
- 상층액을 제거하고 1 x 106 세포에 대해 DPBS-1 mL에 재현탁합니다. 750 x g 에서 4분 동안 원심분리기.
- 상층액을 제거하고 1 x 106 세포에 대해 DPBS-1 mL에 재현탁합니다. FACS 분류기를 사용하여 FL1 채널을 사용하여 나일 적색 양성 세포를 분리합니다.
- 분류된 세포를 지방세포 분화 배지에서 재배양하거나 RNA 및 단백질 분리를 위해 분류된 세포를 수집합니다.
- 분류된 세포에서 RNA를 추출하고 FABP4, PPARG 및 C/EBPA를 포함한 지방세포 분화 마커의 상대적 정량 분석을 수행합니다. 나일 적색 양성 세포는 분류되지 않은 세포에 비해 적어도 2배의 유전자 발현에서 상당한 상향 조절을 보여줍니다.
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Representative Results
중간엽 분화 중 세포의 도식 및 형태: iPSC를 중간엽 줄기세포로 분화하려면 EB 형성, 중간엽 분화 및 MSC 확장에 걸친 다양한 발달 단계가 포함됩니다(그림 1). 이러한 발달 단계에서 세포는 다양한 자극 화학 물질로 인해 다양한 형태를 얻습니다. 분화가 시작되면 세포는 현탁액에 도말되며 직경이 작거나 중간 크기인 동안 정의된 세포 경계와 함께 둥글게 될 것으로 예상됩니다(그림 2). 분화 초기 단계에서 현탁액으로 세포를 배양하는 것을 선택하면 자연 배아 발달 과정과 매우 유사하므로 이 단계는 성공적인 분화에 매우 중요합니다. EB 형성 및 RA 처리 단계는 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에 EB를 도금하는 단계가 뒤따릅니다. 도금 시 EB의 생존 가능성은 더 많은 중간엽을 생성하는 빠른 확산 거동을 관찰함으로써 접근할 수 있습니다(그림 2). 중간엽 줄기세포가 나타내는 이러한 빠른 증식 거동은 특이하고 길쭉한 형태를 유지하면서 새로운 매트릭스 코팅 플레이트에 통과시킨 후에도 유지됩니다(그림 2).
MSC 표면 마커의 정량적 평가: MSC 분화에 특이적인 표면 마커의 정량화를 통해 MSC의 분화 효율에 접근할 수 있습니다. 신뢰할 수 있는 중간엽 줄기세포를 생산하는 우수한 분화는 중간엽 표면 마커 CD73, CD44 및 CD90의 90% 이상의 효율을 보여야 합니다(그림 3A). 그 외에도 세포는 조혈 표현형, CD14, CD34 및 CD19를 묘사하는 표면 마커가 없는 경우에도 평가되므로 이들에 대해 1% 미만의 발현 효율을 보일 것으로 예상됩니다(그림 3B).
중간엽 줄기세포의 지방세포로의 분화: 중간엽 줄기세포의 지방세포로의 분화는 FABP4 및 아디포넥틴에 대한 염색을 통해 접근할 수 있습니다. FABP4는 세포질 단백질이며 말기 분화 지방 세포의 마커로 간주됩니다. 세포질 분포를 가진 지방 세포 사이에서 높은 발현은 발달 성숙도의 핵심 신호입니다(그림 4A). FABP4 외에도 아디포넥틴은 지방 세포 성숙의 중요한 지표 중 하나로 간주됩니다. 그것의 높은 발현은 지방 세포가 포도당 신호 전달에 반응하여 지질 저장 및 지방 생성을 겪기에 충분히 기능적임을 나타냅니다. 분비 단백질인 아디포넥틴은 세포질 내에서 쉽게 구별할 수 있는 모든 단백질 소구와 함께 구형 형태를 나타냅니다(그림 4B).
나일 레드를 사용한 성숙한 지방 세포의 염색 및 분류: 분화 시 성숙한 지방 세포는 나일 레드에 대한 염색을 통해 미성숙 지방세포와 구별할 수 있습니다. 나일 레드는 지질 함유 지방 세포에 결합하며, 이는 성숙한 지방 세포에만 있는 특성입니다(그림 5A). 이는 나일 레드의 형광 함유 특성과 함께 형광 활성화 유세포 분석을 사용하여 성숙한 지방 세포를 분류하는 데 효과적인 도구입니다(그림 5B). 효과적인 분류는 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)에 의해 결정된 성숙 마커(PPARG, C/EBPA 및 FABP4)를 최소 2배 이상 향상시켜야 합니다(그림5C).
그림 1: iPSC가 중간엽 줄기세포와 지방세포로 분화되는 것을 보여주는 개략도. iPSC는 배아체(EB) 기술을 사용하여 중간엽 줄기세포로 분화됩니다. EB는 10μM의 모든 트랜스 레티노산(RA)에 단기간 노출됩니다. 생성된 중간엽 줄기세포는 iPSC 라인을 기반으로 40%-77% 지방세포로 분화됩니다. 나일 레드 양성 세포는 FACS를 사용하여 분류되어 지방 세포 관련 장애 연구(질병 모델링), 신약 식별 및 궁극적으로 개인화된 치료에 사용할 수 있는 성숙한 지방 세포의 정제된 집단을 얻습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: iPSC와 중간엽 줄기세포의 분화. 2일(D2), 11일(D11), 15일(D15) 및 24일(D24)에 MSC 분화의 다양한 단계를 보여주는 대표적인 형태학적 이미지. 24시간 동안 10μM의 RA의 존재 하에서 생성된 배아체(EB)를 분화 8일째에 도말한 다음, 분화 12-17일 후에 해리 및 계대배양을 수행했습니다. MSC는 여러 번 통과되었습니다. 약어: P2 = 구절 2. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: iPSC 유래 중간엽 줄기세포에서 MSC 마커 및 조혈 마커의 발현. 10 μM의 RA로 처리된 iPSC 유래 EBs로부터 생성된 중간엽에서 MSC 마커, CD73, CD44, 및 CD90, (A) 및 조혈 마커, CD34, CD19, 및 CD14 (B)의 발현을 나타내는 대표적인 유세포 분석 히스토그램. 그래프의 X축은 형광 강도를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: iPSC 유래 중간엽 줄기세포의 지방세포로의 분화. iPSCs로부터 유래된 성숙 지방세포에서 FABP4(A) 및 아디포넥틴(ADIPO)(B)의 발현을 보여주는 면역염색 이미지. 핵은 Hoechst로 염색되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 나일 레드를 사용한 iPSC 유래 지방 세포 분류. (A) 명시야(BF)와 나일 레드로 염색된 성숙한 지방세포를 보여주는 이미지. (B) FACS를 이용한 성숙 지방세포에서 나일 레드(PE 양성 세포)의 정량화. (C) 분류된 성숙 지방세포와 분류되지 않은 성숙한 지방세포에서 C/EBPA, FABP4 및 PPARG의 발현을 보여주는 Real-time PCR 분석. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 MSC에 높은 수율과 효율성을 제공할 수 있는 능력으로 인해 가장 중요합니다. 중간엽 줄기세포의 이러한 대량 생산은 10μM의 RA14,15를 사용한 iPSC 유래 EB의 일시적인 배양에 의해 가능했습니다. 10μM의 RA를 사용한 일시적인 처리는 MSC 수율을 11.2배에서 1542배까지14,15배 향상시켰으며, 이 프로토콜은 iPSC와 hPSC 모두에 적용할 수 있습니다. 이 용량과 치료 기간에서 RA는 iPSC의 생존 및 증식에 중요한 세포 증식, 세포자멸사, 세포-세포 및 ECM-세포 부착에 관여하는 여러 유전자의 발현을 직간접적으로 조절함으로써 EB 형성 세포의 증식 및 생존 능력을 향상시킨다14,16. 유전자는 전사 인자 (예 : EGFR4, SOX4), 성장 인자 및 성장 인자 수용체 (예 : IGF2, FGFR4) 및 접착 분자 (예 : FN1 및 CAM)를 포함하지만 이에 제한되지 않습니다. 그러나, 저용량(0.1-10 μM)과 달리, 고용량(≥20 μM)에서 RA는 EB 형성 세포의 증식 및 생존을 음성으로 조절하여 PSC 유래 EB 수와 크기를 감소시켜 중간엽 줄기세포의 수율을 감소시킨다14. RA는 몇몇 정상 분화 및 암성 세포에서 증식 억제제로 간주된다17,18,19. EB에서 레티노이드 신호전달은 맥락(시간, 농도, 종 및 세포주)에 따라 다릅니다. 뚜렷한 유전자와 신호 전달 경로를 조절하여 EB 형성 세포의 자가 재생, 생존 및 분화에 차별적으로 영향을 미침20,21. 그러므로, 본 프로토콜에 기재된 바와 같이, 2일 동안 EB 유도 3일째에 RA-10 μM의 최적 시간 및 농도에서 RA-10 μM의 투여량 감소에 이어 2일 동안 5일째에 0.1 μM으로 용량 감소로 RA를 사용하는 것은 EB-형성 세포 생존 및 증식을 유도하는 데 결정적이다.
성장 및 생존을 조절하는 것 외에도, RA는 RA14로 처리되지 않은 세포에 비해 처리된 EB를 분화 지연에 노출시킨다. 사실, RA 처리 EB는 도금 후 조밀한 모양을 유지하고 RA 처리되지 않은 EB와 달리 MSC 유사 세포로 분화하지 못합니다. 이는 RA 치료에 대한 단기 노출이 WNT 신호전달의 억제를 통해 세포 분화를 억제한다는 이전 연구와 일치한다21. 더욱이, 이러한 RA 처리된 분화 지연 세포는 또한 iPSCs16의 만능 상태를 유지하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 카드헤린 및 세포외 기질 단백질14의 향상된 발현을 보여주었습니다. RA 매개 분화 블록을 방출하려면 EB를 해리해야 하며, 이는 세포 접착을 방해하고 도금 시 장기간 MSC 분화를 허용합니다. 흥미롭게도, RA 처리는 세포에 대한 분화 블록을 유지했지만, 세포를 만능 상태로 유지하지는 않았다. 사실, 10μM RA에 단기간 노출된 EB 형성 세포는 주요 만능 마커인 OCT4, SOX2 및 NANOG14의 발현이 크게 감소한 것으로 나타났습니다.
EB의 단기 RA 처리에 의해 생성된 중간엽 줄기세포는 MSC 표면 마커의 풍부한 발현과 동결 보존 후 다분화능을 통해 전형적인 섬유아세포와 유사한 형태를 유지하는 것으로 나타났으며, 따라서 이러한 대량 생산된 중간엽 줄기세포는 장기 확장 연구를 위해 보관할 수 있습니다14. 이들을 지방성, 연골형성 및 골형성 분화 조건에 노출시킬 때, 이들 중간엽 줄기세포는 세 가지 중배엽 세포 유형으로 쉽게 분화할 수 있으므로 조직 관련 질병을 모델링하기 위한 쉽게 얻을 수 있는 공급원이 된다14. 따라서, RA-매개 분화 프로토콜에 의해 생성된 중간엽 줄기세포의 안정적이고 다재다능한 시험관내 거동은 연구 및 응용 기반 설정에서 가장 중요한 중요성을 제공합니다.
RA 처리된 EB로부터 얻어진 중간엽 줄기세포의 연골형성 및 골형성 분화 전위는 처리되지 않은 EB로부터 얻어진 중간엽 줄기세포의 그것과 유사한 것으로 보이지만, 전자는 지방성 분화 조건에 노출되었을 때 지방형성 계통으로 분화할 수 있는 향상된 잠재력을 나타내는 것으로 밝혀졌다14. 이는 RA 미처리 EB에서 유래한 중간엽 줄기세포와 비교하여 RA 처리된 EB에서 유래한 중간엽을 지방생성 분화 배지로 배양한 후 얻은 세포의 분화 풀에서 세포내 지질 축적(Oil Red O 염색) 및 지방세포 마커 FABP4 양성 세포의 2배 내지 3배 증가에 의해 입증되었다. 이것은 RA 처리 및 처리되지 않은 EB 14,22,23,24,25의 RNA 시퀀싱 데이터에 의해 밝혀진 바와 같이 Hippo, WNT 및 ECM 세포 상호 작용 경로와 같은 지방 세포 발달을 지배하는 여러 신호 전달 경로의 RA에 의한 조절의 결과일 수 있습니다. RA 유래 중간엽 줄기세포가 지방성 분화를 겪는 이러한 향상된 능력은 현재 이용 가능한 프로토콜이 불량한 지방세포 수율을 유도하거나 생성된 지방세포를 자연 과정 요약 지방세포를 유도하는 데 매우 중요하게 만드는 유전자 조작을 사용하기 때문에 가치가 있습니다. 지방 세포는 흰색, 갈색 및 베이지 색의 세 가지 유형으로 분류됩니다. 백색 지방 세포는 단일 지질 방울의 존재에 의해 분류되며 에너지 저장에 중요한 역할을 합니다. 반면, 갈색 지방세포는 UCP1의 발현을 특징으로 하는 매우 높은 미토콘드리아로 인해 기질 산화에 의한 에너지 소비에 관여한다. 백색 지방 조직에 국한된 갈색 지방 세포는 베이지 색 또는 갈색과 같은 지방 세포로 알려져 있습니다. 이러한 MSC는 EB가 RA에 사전 노출된 경우 백색 지방세포의 풍부한 수율을 제공할 가능성이 있습니다. 이전 간행물에서는 높은 UCP1 수준을 가진 세포를 RA26에 노출시키는 대신 낮은 UCP1을 발현하는 세포, 즉 백색 지방세포로 iPSC를 선택적으로 유도한다고 밝혔습니다. 이전 간행물에서는 마우스 및 제브라피쉬 배아의 신경 능선 세포에서 생산된 RA가 백색 지방세포 형성에 중요한 역할을 한다고 보고했습니다27,28.
RA-기반 프로토콜이 48.5%-77.4%(RA 처리 없이 22.5%-57.6%)에 도달하는 증가된 지방세포 수율을 제공하는 중간엽 줄기세포의 생성을 허용했지만, >90%를 달성하지 못하는 것은 다변량 지방세포 기반 유전 장애를 모델링할 때 여전히 문제가 된다 in vitro. 사실, 순수한 지방세포 집단에 도달하지 못하면 관찰된 발달 차이가 다른 유전적 구성으로 인한 것인지 아니면 일관되지 않은 분화 효율로 인한 것인지 구별하기 어렵기 때문에 다중 변이 질병 모델에서 나온 결과를 양가적으로 만들 수 있습니다. 이 문제를 피하기 위해서는 분화된 세포를 분류하여 순수한 성숙한 지방 세포 풀을 얻는 것이 중요했기 때문에 표현형의 차이는 고유한 유전적 차이에 기인할 수 있었습니다. 여러 연구에서 잠재적으로 분류에 사용될 수 있는 지방 세포의 표면 마커를 확인했습니다. 예를 들어, 로널드 칸 (Ronald Kahn)에 의해 수행 된 연구는 아미노산 수송 체 ASC-1을 백색 지방 세포에 대한 새로운 표면 마커로 식별 할 수있게했다29. 또한, omental 및 subphysical region에서 성숙한 지방 세포를 추출하는 연구에서는 성숙한 지방 세포가 표면에서 CD34, CD36 및 CD59를 발현하는 것으로 보고되었습니다30여기서 CD36은 성숙한 지방세포의 표면에서 지방산 수송체로서 기능하는 것으로 보고되었습니다31. 그러나 이러한 연구는 성숙한 지방 세포 집단에만 이러한 마커의 발현을 지정하지 않고 지방 조직에서 유래한 이질적인 세포 집단을 사용했습니다. 또한, 이들 마커는 다른 세포 유형에 의해서도 발현될 수 있고, 지방세포에 특이적이지 않다. 예를 들어, ASC-1은 성상교세포와 뉴런 모두에 존재합니다32, CD34는 조혈 줄기 세포의 마커입니다33, CD36은 혈소판, 단핵 식세포, 간세포, 근세포 및 일부 상피에 존재합니다33CD59는 내피 및 림프 세포 상에서 발현된다34,35. 따라서 대체 용액으로 세포 내 지질에 대한 선택적 형광 염색인 나일 레드(Nile red)를 지방 세포 분류에 가능한 후보로 사용했습니다. 지방 세포는 방출되어 에너지를 생산하거나 막을 만들거나 신진대사를 조절하는 신호 분자로 사용할 수 있는 상당한 양의 지질을 저장합니다36. 나일 레드 염료는 이전에 쥐 및 인간 중간엽 줄기 세포에서 유래 한 지방 세포를 염색하기 위해 유세포 분석 및 현미경 검사에 사용되었습니다37. 이전 연구에서는 ESC 유래 지방 세포에 나일 레드를 사용하고 분류 후 지방 세포 마커를 향상시켰다고 보고했습니다38. 본 RA-기반 프로토콜에 의해 수득된 중간엽 줄기세포로부터 생성된 지방세포는 이들의 성숙도를 나타내는 나일 레드에 의해 염색되는 그들의 능력에 대해 평가되었고, 이들을 정제하기 위해 분류되었다. 이들 나일 적색 분류된 세포는 지방세포 성숙 마커의 발현에서 2 내지 3배 증가를 나타내었다 PPARG, C/EBPA그리고 FABP4 분류되지 않은 세포에 비해 iPSC 유래 지방 세포의 수율을 더욱 증가시킵니다. 이러한 마커는 지질 축적 전에 발현되지만, 이들의 발현은 지질 보유 지방 세포로의 말단 분화를 위해 세포에 태그를 지정합니다. 이러한 마커로 분류 효율성을 확인하면 모든 세포가 발현되는 풀을 식별할 수 있습니다 FABP4, CEBPa그리고 PPARg이는 성숙한 지방 세포 형성을 위해 미리 예정된 수영장을 나타냅니다. 세포는 나일 레드에 대한 염색 가능성에 따라 분류됩니다. 정제 효율은 분류되지 않은 분획에서 많은 수의 지방 세포로 인해 2 내지 3 배 증가했다. 지질 함유 지방 세포의 크기는 분화 과정에서 크게 달라지며, 여기서 동일한 크기 분포를 가진 세포 풀이 분류됩니다. 분류되지 않은 분획은 지질 함유 지방 세포를 포함하지만 완전히 성숙하지 않고 서로 다른 크기 비율에 의해 지배됩니다.
인체로부터 분리된 중간엽 줄기세포의 이질성은 이전에 보고된 바 있다39. 이러한 이질성은 MSC 기원, 기증자 및 상태와 같은 여러 요인에 따라 달라집니다39. 이것은 다른 질병을 치료하는 효율성의 변화로 이어질 수 있습니다. 이 연구는 GMP(Good Manufacturing Practice) 호환 배양 조건에서 생산된 hPSC의 짧은 RA 처리가 균일한 중간엽 줄기세포 집단을 제공할 것임을 시사합니다. 이는 현재 프로토콜이 MSC 기반 치료에 사용할 수 있는 많은 수의 임상 등급 MSC를 생성하기 위한 유망한 접근 방식임을 나타냅니다.
지방세포 분화를 유도하는 RA 기반 MSC 분화 프로토콜과 Nile 적색 분류 프로토콜의 조합을 통해 기능적 마커의 발현이 향상되고 수율과 순도가 증가한 iPSC 유래 지방세포를 얻을 수 있었습니다. 따라서 이 결합된 프로토콜은 유전적으로 구별되는 개체로부터 성숙한 지방 세포를 충분한 양과 순도로 생성하고 지방 세포 관련 대사 장애 뒤에 있는 새로운 유전적 변이체를 잠재적으로 밝혀낼 수 있도록 합니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 카타르 국립 연구 기금 (QNRF) (보조금 번호 NPRP10-1221-160041)의 보조금으로 자금을 지원받았습니다. 마리암 아가디는 카타르 국립 연구 기금(QNRF)의 GSRA 장학금을 지원받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adiponectin | Abcam | ab22554 | Adipocyte maturation marker |
| anti-CD105 | BD Pharmingen | 560839 | MSC differentiation marker |
| anti-CD14 | BD Pharmingen | 561712 | MSC differentiation marker |
| anti-CD19 | BD Pharmingen | 555415 | MSC differentiation marker |
| anti-CD34 | BD Pharmingen | 555824 | MSC differentiation marker |
| anti-CD44 | abcam | ab93758 | MSC differentiation marker |
| anti-CD45 | BD Pharmingen | 560975 |
MSC differentiation marker |
| anti-CD73 | BD Pharmingen | 550256 | MSC differentiation marker |
| anti-CD90 | BD Pharmingen | 555596 | MSC differentiation marker |
| bFGF | R&D | 233-FP | MSC culture media supplement |
| C/EBPA | Abcam | ab40761 | Adipocyte maturation marker |
| Dexamethasone | Torics | 1126 | Adipocyte differentiation media supplement |
| FABP4 | Abcam | ab93945 | Adipocyte maturation marker |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10082147 | MSC culture media supplement |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050-061 | MSC culture media supplement |
| IBMX | Sigma Aldrich | I5879 | Adipocyte differentiation media supplement |
| Indomethacin | Sigma Aldrich | I7378 | Adipocyte differentiation media supplement |
| Insulin | Sigma Aldrich | 91077C | Adipocyte differentiation media supplement |
| Knockout DMEM | ThermoFisher | 12660012 | Basal media for preparing matrigel |
| Low glucose DMEM | ThermoFisher | 11885084 | MSC culturing media |
| Matrigel | Corning | 354230 | Coating matrix |
| MEM-alpha | ThermoFisher | 12561056 | Adipocyte differentiation media |
| Nilered | Sigma Aldrich | 19123 | Sorting marker for adipocyte |
| Penicillin | ThermoFisher | 15140122 | MSC/Adipocyte media supplement |
| Phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190144 | wash buffer |
| Pierce™ 20X TBS Buffer | Thermo Fisher | 28358 | wash buffer |
| PPARG | Cell Signaling Technology | 2443 | Adipocyte maturation marker |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Dissociation reagent |
| Retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625 | MSC differentiation media supplement |
| Rock inhibitor | Tocris | 1254/10 | hPSC culture media supplement |
| Roziglitazone | Sigma Aldrich | R2408 | Adipocyte differentiation media supplement |
| StemFlex | ThermoFisher | A334901 | hPSC culture media |
| Triton | Thermo Fisher | 28314 | Permebealization reagent |
| Trypsin | ThermoFisher | 25200072 | Dissociation reagent |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7942 | Wash buffer |
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