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Developmental Biology

Diferenciación robusta de iPSCs humanas en una población pura de adipocitos para estudiar trastornos asociados a adipocitos

Published: February 9, 2022 doi: 10.3791/63311
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Diabetes Research Center, Qatar Biomedical Research Institute (QBRI), Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation (QF), 2College of Health and Life Sciences, Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation

Summary

El protocolo permite la generación de una población de adipocitos puros a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). El ácido retinoico se utiliza para diferenciar las iPSC en células madre mesenquimales (MSC) que se utilizan para producir adipocitos. Luego, se utiliza un enfoque de clasificación basado en la tinción de rojo del Nilo para obtener adipocitos puros.

Abstract

Los avances recientes en la tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) han permitido la generación de diferentes tipos de células, incluidos los adipocitos. Sin embargo, los métodos de diferenciación actuales tienen baja eficiencia y no producen una población homogénea de adipocitos. Aquí, evitamos este problema mediante el uso de un método basado en retinoico totalmente trans para producir células madre mesenquimales (MSC) en alto rendimiento. Al regular las vías que gobiernan la proliferación, supervivencia y adhesión celular, nuestra estrategia de diferenciación permite la generación eficiente de cuerpos embrionarios (EB) que se diferencian en una población pura de MSC multipotentes. El alto número de MSCs generadas por este método proporciona una fuente ideal para generar adipocitos. Sin embargo, la heterogeneidad de la muestra resultante de la diferenciación de los adipocitos sigue siendo un desafío. Por lo tanto, utilizamos un método basado en rojo del Nilo para purificar los adipocitos maduros que contienen lípidos mediante FACS. Esta estrategia de clasificación nos permitió establecer una forma confiable de modelar los trastornos metabólicos asociados a los adipocitos utilizando un grupo de adipocitos con heterogeneidad reducida de la muestra y funcionalidad celular mejorada.

Introduction

Las células madre mesenquimales (MSC) actúan como un recurso transitorio eficaz para producir células de origen mesodérmico como adipocitos, osteocitos y condrocitos, que podrían usarse para modelar sus respectivos trastornos genéticos. Sin embargo, los enfoques anteriores se basaron en la obtención de estas MSC a partir de tejidos adultos 1, lo que impuso el desafío de obtenerlas en grandes cantidades de los donantes, y la limitación de mantenerlas funcionalmente viables en condiciones de cultivo in vitro subóptimas 1,2. Estos obstáculos han producido una gran demanda de contar con un protocolo para generar MSCs in vitro. Las células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSCs) pueden ser utilizadas como una valiosa fuente de MSCs, exhibiendo características MSC 3,4,5. Las MSC derivadas de iPSCs se pueden utilizar como una opción terapéutica en varias enfermedades. Además, la capacidad de las MSC derivadas de iPSCs para generar adipocitos, las convierte en un valioso modelo humano in vitro para estudiar la adipogénesis humana, la obesidad y los trastornos asociados a los adipocitos.

Los protocolos actuales de diferenciación de los adipocitos se pueden clasificar en dos grupos, uno que implica la diferenciación de los adipocitos utilizando cócteles químicos o basados en proteínas que dan un rendimiento resultante de 30%-60%6,7,8,9, mientras que el otro implica la manipulación genética para la inducción robusta de factores de transcripción clave que rigen el desarrollo de los adipocitos para dar un rendimiento del 80%-90%10, 11. Sin embargo, la manipulación genética no recapitula el proceso natural de diferenciación de los adipocitos, y a menudo enmascara los paradigmas sutiles que llegan durante la adipogénesis, haciéndola ineficaz para fines de modelado de enfermedades12,13. Por lo tanto, presentamos una forma de clasificar los adipocitos maduros derivados químicamente de los inmaduros marcando fluorescentemente los adipocitos que contienen lípidos utilizando rojo del Nilo.

Aquí presentamos un protocolo que involucra la incubación transitoria de cuerpos embrioides (EB) derivados de iPSCs con ácido todo-trans retinoico para producir un alto número de MSCs de rápida proliferación, que podrían ser utilizados para generar adipocitos14. También presentamos una forma de clasificar los adipocitos maduros derivados químicamente del grupo de diferenciación heterogénea marcando fluorescentemente sus gotas de lípidos utilizando un colorante lipofílico; Rojo del Nilo. Esto permitiría la generación de una población pura de adipocitos maduros con funcionalidad mejorada para modelar con precisión los trastornos metabólicos asociados a los adipocitos.

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Protocol

El estudio ha sido aprobado por el comité ético de investigación institucional apropiado y realizado siguiendo los estándares éticos establecidos en la Declaración de Helsinki de 1964 y sus enmiendas posteriores o estándares éticos comparables. El protocolo fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de HMC (no. 16260/16) y QBRI (no. 2016-003). Este trabajo también está optimizado para hESCs como H1 y H9. Se obtuvieron muestras de sangre de individuos sanos con pleno consentimiento informado. Las iPSCs se generan a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de individuos sanos.

1. Cultivo y mantenimiento de iPSCs

  1. Preparar las placas recubiertas de matriz de membrana basal reconstituyendo la matriz de recubrimiento en DMEM knockout en una proporción de 1:80 y almacenar a 4 °C.
  2. Prepare medios de cultivo iPSCs agregando 50 ml de 10x medios de suplemento de células madre a 500 ml de medios basales de células madre, junto con 5 ml de 100x penicilina-estreptomicina (P/S) y guárdelos a 4 °C para uso a corto plazo o a -20 °C para uso a largo plazo.
  3. Forrar las placas con matriz de recubrimiento (1 ml para una placa de 6 pocillos, 500 μL para una placa de 12 pocillos, 250 μL para una placa de 24 pocillos) e incubar la placa a 37 °C durante 1-2 h.
  4. Retire una alícuota de medios de cultivo iPSCs y precaliente a temperatura ambiente antes de usar.
  5. Descongele un vial de iPSCs (ESCs o iPSCs) en un baño maría a 37 °C y transfiéralo a un tubo cónico de 15 mL que contenga 2-3 mL de medios de cultivo.
  6. Centrifugar el tubo a 120 x g durante 4 min a temperatura ambiente (RT-23 °C).
  7. Retire el sobrenadante y agregue 2 ml de medios de cultivo frescos suplementados con un inhibidor ROCK de 10 μM (Y-27632). Colocar las células en un pocillo de una placa de 6 pocillos recubierta de matriz y colocar la placa a 37 °C.
  8. Después de 24 h, retire el medio y reemplácelo con medios de cultivo frescos.
  9. Cambie los medios todos los días hasta que las células alcancen el 80% -90% de confluencia.
  10. Al llegar a la confluencia, pase las celdas siguiendo los pasos que se describen a continuación.
    1. Retire el medio y lave las células con solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco.
    2. Añadir reactivo de disociación iPSCs (ver Tabla de materiales) -500 μL para un pocillo de una placa de 6 pocillos, 250 μL para un pocillo de una placa de 24 pocillos e incubar durante 1 min a 37 °C.
    3. Retirar el reactivo de disociación e incubar las células secas durante 1 min a 37 °C.
    4. Recolectar las células usando medios de cultivo -1 ml para un pocillo de una placa de 6 pocillos y 250 μL para un pocillo de una placa de 24 pocillos- en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 120 x g durante 4 min.
    5. Resuspender células en medios de cultivo-2 mL para un pocillo de una placa de 6 pocillos y 500 μL para un pocillo de una placa de 24 pocillos suplementada con un inhibidor ROCK de 10 μM y placarlas en placas recubiertas de matriz fresca al 40% de confluencia.

2. Diferenciación de iPSC en MSCs

  1. Preparar medios de diferenciación MSC añadiendo 15% de suero fetal bovino (FBS) y 1% P/S a DMEM + piruvato bajo en glucosa y almacenar a 4 °C.
  2. Al alcanzar el 80% de confluencia, use iPSC para la formación del cuerpo embrioide (EB) siguiendo los pasos que se describen a continuación.
    1. Lave las células con DPBS e incubarlas con medio de disociación/EDTA-500 μL para un pocillo de una placa de 6 pocillos, 250 μL para un pocillo de una placa de 24 pocillos.
    2. Incubar a 37 °C durante 1 min, aspirar el reactivo de disociación y mantener las células a 37 °C durante 1 min adicional. Para iniciar la diferenciación MSC, se requieren ~10-12 x 106 celdas.
    3. Recolectar las células en un tubo cónico de 15 ml utilizando medios de cultivo. Asegúrese de ser muy suave durante la recolección para evitar que las células se vuelvan solteras y permitir la formación de EB. Centrifugar las células a 120 x g durante 4 min.
    4. Resuspender las células en 3 ml de medios de diferenciación MSC que contengan 10 μM inhibidor de ROCK.
    5. Mezcle y distribuya 0,5 ml/pocillo en una placa de fijación ultra baja de 24 pocillos.
      NOTA: El uso de una placa de fijación ultra baja fomentaría la agregación celular en EB en lugar de su fijación en la superficie.
    6. Colocar la placa en la incubadora a 37 °C.
  3. Después de 24 h, inducir los EB alcanzados con un tratamiento con ácido retinoico (AR) alto siguiendo los pasos que se describen a continuación.
    1. Añadir 10 μM RA a 3 ml de medios de diferenciación MSC. Recoja los EB en un tubo de 15 ml y déjelos asentarse durante 15 minutos.
    2. Retire el sobrenadante de los EB y agregue medios de diferenciación MSC suplementados con 10 μM RA.
    3. Resuspenda suavemente y distribuya 0,5 ml/pocillo en la misma placa de fijación ultra baja de 24 pocillos.
    4. Colocar la placa en la incubadora a 37 °C. No molestar a los EB durante las próximas 48 h.
    5. Después de 48 h, recoja los EB en un tubo de 15 ml y déjelos asentarse durante 15 minutos.
    6. Retire el sobrenadante de los EB y agregue medios de diferenciación MSC suplementados con 0.1 μM RA.
    7. Resuspenda suavemente y distribuya 0,5 ml/pocillo en la misma placa de fijación ultra baja de 24 pocillos.
    8. Colocar la placa en la incubadora a 37 °C. No molestar a los EB durante las próximas 48 h.
  4. Elimine el RA agregado a las celdas siguiendo los pasos que se describen a continuación.
    1. Después de 48 h del último tratamiento de AR, recoger los EB y dejar que se asienten durante 15 min.
    2. Retire el sobrenadante y agregue DMEM medios de glucosa baja sin citoquinas.
    3. Resuspenda suavemente y distribuya 0,5 ml/pocillo en una placa de fijación ultrabaja de 24 pocillos. Colocar la placa en la incubadora a 37 °C.
  5. Coloque los EB derivados de iPSC siguiendo los pasos que se describen a continuación.
    1. Después de 48 h del paso anterior (paso 2.4), recoja los EB en un tubo de 15 ml y déjelos reposar durante 15 minutos.
    2. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender en 2 ml de medios de diferenciación MSC frescos.
    3. Transferencia a dos pocillos de una placa de 6 pocillos recubierta de matriz de membrana basal.
    4. Cambie los medios cada dos días durante 5 días adicionales.
    5. Después de 5 días, retire el medio gastado y reemplácelo con un nuevo medio de diferenciación MSC que contenga 2,5 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF).
  6. Pase los EB plateados cuando alcancen la confluencia del 80% -90%, siguiendo los pasos que se describen a continuación.
    1. Lavar las células con DPBS, añadir tripsina -EDTA-500 μL para un pocillo de una placa de 6 pocillos e incubar las células a 37 °C durante 3 min.
    2. Recolectar las células usando medios de diferenciación MSC en un tubo cónico de 15 ml y girar a 750 x g durante 4 min.
    3. Resuspender en medios de diferenciación MSC con 2,5 ng/ml de bFGF y placar las células en placas recubiertas con matriz de membrana basal en una proporción de 1:3.
    4. Repita el pasaje cuando las células alcancen el 70%-80% de confluencia. Se espera que gane 3-6 millones de células por 2-3 pasajes.

3. Análisis por citometría de flujo de MSCs derivadas de iPSCs

NOTA: Al someterse a 2-3 pasajes, se debe acceder a las celdas para la eficiencia de la diferenciación de MSC. La diferenciación se considerará exitosa si las células expresan marcadores de diferenciación MSC: CD44, CD73, CD90 y CD105 con una eficiencia superior al 90%, y no expresan altos niveles de marcadores hematopoyéticos: CD14, CD19, CD34 y CD45. Se puede acceder a la eficiencia de estos marcadores siguiendo los pasos a continuación.

  1. Pase las celdas siguiendo los pasos descritos anteriormente (paso 2.6) y obtenga 1 x 105 celdas en un pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo en V.
  2. Centrifugar la placa a 375 x g durante 4 min a 4 °C.
  3. Resuspender 1 x 105 células en 100 μL de DPBS frío con 1 μL de anticuerpo conjugado (Ab) (ver Tabla de materiales) e incubar a 4 °C durante 30-40 min evitando la exposición a la luz.
  4. Resuspender otras 1 x 105 células en 100 μL de DPBS frío con el respectivo control de isotipo del Ab conjugado a una concentración de 1:100 ) e incubar a 4 °C durante 30-40 min evitando la exposición a la luz.
  5. Después de la incubación, centrifugar la placa a 375 x g durante 4 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante agitando el plato sobre el fregadero.
  6. Resuspender las células en 100 μL de DPBS frío.
  7. Centrifugar las células a 375 x g durante 4 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
  8. Resuspender las células en 200 μL de DPBS frío y recoger en tubos de microcentrífuga oscuros y fríos de 1,5 ml y mantenerlos en hielo hasta que se analicen mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).
  9. Para el análisis de FACS, distribuya las celdas utilizando dispersión lateral (SSC-A) versus dispersión directa (FSC-A) para excluir los desechos. Además, distribuya las celdas cerradas utilizando la altura dispersa hacia adelante (FSC-H) frente al área dispersa hacia adelante (FSC-A) para distinguir los singletes de los dobletes de la población de células vivas.
    NOTA: Las células se cerraron en relación con el cambio de control de isotipo para cada marcador, y se utilizó un mínimo de 10,000 eventos cerrados de cada muestra teñida para el análisis.

4. Diferenciación de MSCs en adipocitos

  1. Preparar los medios basales de diferenciación de adipocitos añadiendo un 10% de reemplazo sérico knockout (KOSR), 1% de glutamina, 1% de P/S, 4,5 ng/μL de glucosa a un medio esencial mínimo (MEM)-alfa y almacenar a 4 °C.
  2. Permitir que las MSC alcancen una confluencia superior al 90%. Continúe cultivándolos durante otras 48 horas para permitir que se sometan a un período de detención del crecimiento.
  3. Prepare medios completos de diferenciación de adipocitos agregando 100 μg/ml de 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), 1 μM de dexametasona, 0,2 U/ml de insulina, 100 μM de indometacina y 10 μM de rosiglitazona a los medios basales.
  4. Retire los medios de diferenciación MSC y lave las células con DPBS.
  5. Añadir medios completos de diferenciación de adipocitos -2 ml para un pocillo de una placa de 6 pocillos y 1 ml para un pocillo de una placa de 12 pocillos- e incubar las células a 37 °C. Cambie los medios de diferenciación completa cada dos días durante 14 días.

5. Evaluación de la eficiencia de diferenciación de los adipocitos

  1. En el día 14 de diferenciación, verifique la eficiencia de la diferenciación teñiendo las células para marcadores de maduración de adipocitos, FABP4 y adiponectina.
  2. Retire el medio y lave las células con DPBS.
  3. Fijar las células con paraformaldehído al 4% (PFA) - 200 μL a un pocillo de una placa de 24 pocillos - e incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
  4. Deseche el PFA y lávelo con solución salina tamponada con tris con tween al 0,5% (TBST) y colóquelo en una coctelera a temperatura ambiente durante 15 min. Repita el proceso dos veces.
  5. Permeabilice las células fijas con solución salina tamponada con fosfato con Triton X-100 (PBST) al 0,5% y colóquela en un agitador a temperatura ambiente durante 15-20 min.
  6. Desechar el PBST y añadir el tampón de bloqueo (albúmina sérica bovina (BSA) al 5% -6% en PBST)-500 μL para un pocillo de una placa de 6 pocillos y 250 μL para un pocillo de una placa de 12 pocillos- e incubar a temperatura ambiente en el agitador durante 40-60 min.
  7. Diluir los anticuerpos primarios contra FABP4, adiponectina en 2% -3% BSA, a una concentración de 1:500 (ver Tabla de materiales). Añadir estos anticuerpos juntos sólo si se crían en diferentes animales y colocar la placa en el agitador a 4 °C, durante la noche.
  8. Retire los anticuerpos primarios y lave las células tres veces con TBST (15 minutos cada una) y colóquelo en un agitador a temperatura ambiente.
  9. Prepare anticuerpos secundarios de Alexa Fluor en PBST (1:500). Incubar las células en las combinaciones de anticuerpos secundarios (según la especie en la que se eleva el anticuerpo primario) durante 60 minutos a temperatura ambiente y cubrir la placa con papel de aluminio para protegerla de la luz.
  10. Deseche los anticuerpos secundarios, lávese con TBST tres veces y coloque la placa en el agitador.
  11. Para teñir los núcleos, añadir 1 μg/ml de Hoechst 33342-200 μL para un pocillo de una placa de 24 pocillos diluida en PBS e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
  12. Deseche la solución de Hoechst y agregue PBS-500 μL para un pocillo de una placa de 24 pocillos a las células. Mantenga las placas cubiertas de luz hasta que se visualicen con un microscopio de fluorescencia invertida.

6. Clasificación de adipocitos usando rojo del Nilo

  1. Preparar la solución de trabajo de rojo del Nilo añadiendo 1 mg/ml de solución madre roja del Nilo en DMSO y almacenar a -20 °C. Justo antes de su uso, descongele la cepa roja del Nilo y reconstituya en DPBS para alcanzar una concentración de solución de trabajo de 300 nM.
  2. En o después del día 14 de diferenciación de adipocitos, deseche los medios de las células y lave con DPBS.
  3. Añadir la solución de trabajo rojo del Nilo -1 ml en un pocillo de una placa de 6 pocillos- e incubar a 37 °C durante 15 min.
  4. Retirar la solución roja del Nilo y añadir tripsina-EDTA -500 μL en un pocillo de una placa de 6 pocillos- e incubar a 37 °C durante 4 min.
  5. Recoja las células usando DMEM que contiene 5% de FBS en un tubo cónico de 15 ml. Centrifugadora a 750 x g durante 4 min.
  6. Retire el sobrenadante y vuelva a suspenderlo en DPBS-1 ml para 1 x 106 células. Centrifugadora a 750 x g durante 4 min.
  7. Retire el sobrenadante y vuelva a suspenderlo en DPBS-1 ml para 1 x 106 células. Utilice un clasificador FACS para aislar los glóbulos rojos positivos del Nilo utilizando el canal FL1.
  8. Vuelva a cultivar las células clasificadas en medios de diferenciación de adipocitos o recolecte las células clasificadas para el aislamiento de ARN y proteínas.
  9. Extraiga ARN de las células clasificadas y realice un análisis cuantitativo relativo de los marcadores de diferenciación de adipocitos, incluidos FABP4, PPARG y C / EBPA. Las células rojas positivas del Nilo muestran una regulación positiva significativa en la expresión génica de al menos dos pliegues en comparación con las células no clasificadas.

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Representative Results

Esquema y morfología de las células durante la diferenciación mesenquimal: La diferenciación de iPSCs en MSCs implica varias etapas de desarrollo que abarcan la formación de EB, la diferenciación de MSC y la expansión de MSC (Figura 1). Durante estas etapas de desarrollo, las células adquieren una morfología diversa debido a los diferentes productos químicos estimulantes a los que están sometidas. Al iniciar la diferenciación, las células están en suspensión y se espera que sean redondas, con bordes celulares definidos, mientras que son de tamaño pequeño a mediano en diámetro (Figura 2). La elección del cultivo de células en suspensión durante la fase inicial de diferenciación permite que se parezca mucho al proceso de desarrollo embrionario natural, lo que hace que esta fase sea muy crucial para una diferenciación exitosa. La fase de formación de EB y tratamiento de la AR es seguida por el recubrimiento de EB en placas recubiertas de matriz de membrana basal. Se puede acceder a la viabilidad de las EB tras el recubrimiento observando su comportamiento de rápida proliferación que da lugar a más MSC (Figura 2). Este comportamiento de rápida proliferación exhibido por las MSC se conserva incluso después de pasarlas a placas recubiertas de matriz fresca junto con la retención de una morfología peculiar y alargada (Figura 2).

Evaluación cuantitativa de marcadores de superficie MSC: Se accede a la eficiencia de diferenciación de MSC mediante la cuantificación de marcadores de superficie específicos para la diferenciación de MSC. Una buena diferenciación que produzca MSC confiables debe mostrar una eficiencia superior al 90% de los marcadores de superficie mesenquimales CD73, CD44 y CD90 (Figura 3A). Además de eso, las células también se evalúan para detectar la ausencia de marcadores de superficie que representen el fenotipo hematopoyético, CD14, CD34 y CD19, y por lo tanto se espera que muestren una eficiencia de expresión inferior al 1% para ellas (Figura 3B).

Diferenciación de MSCs en adipocitos: Se puede acceder a la diferenciación de MSCs en adipocitos mediante tinción para FABP4 y adiponectina. FABP4 es una proteína citoplasmática, y se considera como un marcador de adipocitos terminalmente diferenciados. Su alta expresión entre los adipocitos, con una distribución citoplasmática, es un signo clave de su madurez evolutiva (Figura 4A). Además de FABP4, la adiponectina se considera uno de los marcadores importantes para la madurez de los adipocitos. Su alta expresión indica que los adipocitos son lo suficientemente funcionales como para someterse al almacenamiento de lípidos y adipogénesis en respuesta a la señalización de la glucosa. Al ser una proteína secretora, la adiponectina exhibe morfología globular con cada glóbulo proteico fácilmente distinguible dentro del citoplasma (Figura 4B).

Tinción y clasificación de adipocitos maduros usando rojo del Nilo: Tras la diferenciación, los adipocitos maduros se pueden distinguir de sus contrapartes inmaduras al teñir el rojo del Nilo. El rojo del Nilo se une a los adipocitos portadores de lípidos, una característica exclusiva de los adipocitos maduros (Figura 5A). Esto, junto con el cojinete fluorescente característico del rojo del Nilo, lo convierte en una herramienta eficaz para clasificar los adipocitos maduros mediante citometría de flujo activada fluorescente (Figura 5B). La clasificación efectiva debe resultar en la mejora de los marcadores de maduración (PPARG, C / EBPA y FABP4) en al menos dos pliegues, determinados por PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) (Figura5C).

Figure 1
Figura 1: Diagrama esquemático que muestra la diferenciación de las iPSCs en MSCs y adipocitos. Las iPSCs se diferencian en MSCs utilizando la técnica del cuerpo embrioide (EB). Los EB se someten a una exposición corta de 10 μM de ácido transretinoico (AR) todo-trans. Las MSC generadas se diferencian en 40%-77% de adipocitos basados en la línea iPSC. Los glóbulos rojos positivos del Nilo se clasifican utilizando FACS para obtener una población purificada de adipocitos maduros que se pueden usar para estudiar trastornos asociados a los adipocitos (modelado de enfermedades), identificar nuevos medicamentos y, finalmente, para terapia personalizada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Diferenciación de iPSCs en MSCs. Imágenes morfológicas representativas que muestran diferentes etapas de diferenciación de MSC en los días 2 (D2), 11 (D11), 15 (D15) y 24 (D24). Los cuerpos embrioides (EB) generados en presencia de 10 μM de AR durante 24 h se platearon en el día 8 de diferenciación, seguido de disociación y paso después de 12-17 días de diferenciación. Los MSC fueron aprobados varias veces. Abreviaturas: P2 = pasaje 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Expresión de marcadores MSC y marcadores hematopoyéticos en MSCs derivadas de iPSC. Histogramas de citometría de flujo representativos que muestran la expresión de los marcadores MSC, CD73, CD44 y CD90, (A) y los marcadores hematopoyéticos, CD34, CD19 y CD14 (B) en las MSC generadas a partir de EB derivadas de iPSC tratadas con 10 μM de AR. El eje X en el gráfico representa la intensidad fluorescente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Diferenciación de MSCs derivadas de iPSC en adipocitos. Imágenes de inmunotinción que muestran la expresión de FABP4 (A) y adiponectina (ADIPO) (B) en adipocitos maduros derivados de iPSCs. Los núcleos fueron teñidos con Hoechst. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Clasificación de adipocitos derivados de iPSC utilizando rojo del Nilo. (A) Imágenes que muestran adipocitos maduros teñidos de rojo del Nilo (BF) y campo brillante. (B) Cuantificación de glóbulos rojos del Nilo (PE-positivos) en adipocitos maduros utilizando FACS. (C) Análisis de PCR en tiempo real que muestra la expresión de C / EBPA, FABP4 y PPARG en adipocitos maduros ordenados versus no clasificados. Los datos se representan como media ± DE; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo tiene una importancia primordial debido a su capacidad para proporcionar MSC en alto rendimiento y eficiencia. Esta producción a gran escala de MSC fue posible gracias a la incubación transitoria de EB derivadas de iPSCs con 10 μM de RA14,15. El tratamiento transitorio con 10 μM de AR mejoró el rendimiento de MSC de 11,2 a 1542 veces14,15, siendo este protocolo aplicable tanto en iPSCs como en hPSCs. A esta dosis y duración del tratamiento, la AR mejora las capacidades proliferativas y de supervivencia de las células formadoras de EB mediante la regulación directa o indirecta de la expresión de varios genes implicados en la proliferación celular, la apoptosis y las adherencias célula-célula y ECM-célula, que son críticas para la supervivencia y proliferación de iPSCs14,16. Los genes incluyen, pero no se limitan a, factores de transcripción (como EGFR4, SOX4), factores de crecimiento y receptores de factores de crecimiento (como IGF2, FGFR4) y moléculas de adhesión (como FN1 y CAM). Sin embargo, en contraste con dosis bajas (0,1-10 μM), a dosis altas (≥20 μM), la AR regula negativamente la proliferación y la supervivencia de las células formadoras de EB, lo que resulta en una reducción del número y tamaño de EB derivada de PSC y, por lo tanto, una disminución del rendimiento de las MSC14. La AR es considerada como un inhibidor de la proliferación en varias células normales diferenciadas y cancerosas17,18,19. En las EB, la señalización de retinoides depende del contexto (tiempo, concentración, especie y línea celular); afectando diferencialmente la autorrenovación, supervivencia y diferenciación de las células formadoras de EB mediante la regulación de genes distintos y vías de señalización20,21. Por lo tanto, el uso de AR en un tiempo óptimo y la concentración de AR-10 μM en el día 3 de la inducción de EB seguida de una reducción de la dosis a 0,1 μM el día 5 durante 2 días como se describe en el presente protocolo, es crucial para inducir la supervivencia y proliferación de células formadoras de EB.

Además de regular el crecimiento y la supervivencia, la AR somete a las EB tratadas a un retraso en la diferenciación en comparación con las células no tratadas con AR14. De hecho, los EB tratados con AR mantienen su forma compacta después del recubrimiento y no se diferencian en células similares a MSC, en contraste con los EB no tratados con AR. Esto es consistente con estudios previos que informan que la exposición a corto plazo al tratamiento de la AR inhibe la diferenciación celular a través de la supresión de la señalización WNT21. Además, estas células retardadas por diferenciación tratadas con AR también mostraron una mayor expresión de cadherina y proteínas de la matriz extracelular14, que se sabe que desempeñan un papel importante en el mantenimiento del estado pluripotente de las iPSCs16. Para liberar el bloque de diferenciación mediada por AR, los EB deben disociarse, lo que resulta en la interrupción de las adherencias celulares y permite la diferenciación de MSC a largo plazo en el recubrimiento. Curiosamente, el tratamiento con AR mantuvo un bloqueo de diferenciación sobre las células, pero no mantuvo las células en un estado pluripotente. De hecho, las células formadoras de EB sometidas a exposición a corto plazo a 10 μM AR muestran una expresión significativamente reducida de los marcadores clave de pluripotencia: OCT4, SOX2 y NANOG14.

Se ha demostrado que las MSC generadas por el tratamiento a corto plazo de la AR de las EB mantienen su morfología típica similar a los fibroblastos con abundante expresión de marcadores de superficie de MSC y su multipotencia después de la criopreservación, lo que hace que estas MSC producidas en masa sean almacenables para estudios de expansión a largo plazo14. Al someterlos a condiciones de diferenciación adipogénica, condrogénica y osteogénica, estas MSC podrían diferenciarse fácilmente en los tres tipos de células mesodérmicas, lo que las convierte en una fuente fácilmente alcanzable para modelar enfermedades relacionadas con tejidos14. Por lo tanto, el comportamiento in vitro estable y versátil de las MSC generadas por el protocolo de diferenciación mediada por AR les proporciona una importancia primordial en entornos basados en la investigación y la aplicación.

Mientras que los potenciales de diferenciación condrogénica y osteogénica de las MSC obtenidas de EBs tratadas con AR parecen ser similares a los de las MSCs obtenidas de EBs no tratadas, se encontró que el primero muestra un mayor potencial para diferenciarse en linaje adipogénico cuando se somete a condiciones de diferenciación adipogénica14. Esto se evidenció por un aumento de 2 a 3 veces en la acumulación de lípidos intracelulares (tinción Oil Red O) y células positivas para FABP4 con marcador de adipocitos en el grupo de diferenciación de células obtenidas después de cultivar las MSC derivadas de EB tratadas con AR con medios de diferenciación adipogénicos, en comparación con las MSC derivadas de EB no tratadas con AR. Esto podría ser la consecuencia de la regulación, por AR, de varias vías de señalización que rigen el desarrollo de los adipocitos, como las vías de interacción Hippo, WNT y ECM-cell, como lo revelan los datos de secuenciación de ARN de EB tratadas y no tratadascon AR 14,22,23,24,25. Esta capacidad mejorada de las MSC derivadas de AR para someterse a una diferenciación adipogénica es valiosa, ya que los protocolos actualmente disponibles conducen a un rendimiento de adipocitos deficiente o hacen uso de la manipulación genética, lo que hace que los adipocitos generados sean invaluables para derivar adipocitos recapitulados del proceso natural. Los adipocitos se clasifican en tres tipos: blanco, marrón y beige. Los adipocitos blancos se clasifican por la presencia de una sola gota de lípidos y desempeñan un papel en el almacenamiento de energía. Mientras que, los adipocitos marrones están involucrados en el gasto de energía por oxidación del sustrato debido a la muy alta abundancia de mitocondrias caracterizadas por la expresión de UCP1. Mientras que los adipocitos marrones que se encuentran localizados en el tejido adiposo blanco se conocen como adipocitos beige o marrones. Estos MSC tienen el potencial de dar un rendimiento abundante de adipocitos blancos dada la preexposición de EB a la AR. Publicaciones anteriores han indicado la inducción selectiva de iPSC en células que expresan UCP1 baja, es decir, adipocitos blancos, en lugar de exponer las células con altos niveles de UCP1 a la AR26. Publicaciones anteriores han reportado que la AR producida a partir de células de la cresta neural en embriones de ratón y pez cebra juega un papel importante en la formación de adipocitos blancos27,28.

Aunque el protocolo basado en AR permitió la generación de MSC que proporcionan un mayor rendimiento de adipocitos que alcanzan el 48,5%-77,4% (frente al 22,5%-57,6% sin tratamiento de AR), no alcanzar el >90% sigue siendo problemático cuando se modelan trastornos genéticos basados en adipocitos multivariantes in vitro. De hecho, no llegar a una población de adipocitos puros podría hacer que los resultados provenientes de modelos de enfermedades multivariantes sean ambivalentes, ya que sería difícil distinguir si las diferencias de desarrollo observadas se deben a las diferentes composiciones genéticas o a eficiencias de diferenciación inconsistentes. Para evitar este problema, era importante clasificar las células diferenciadas para obtener un conjunto de adipocitos maduros puros, de modo que cualquier diferencia en los fenotipos solo pudiera atribuirse a diferencias genéticas inherentes. Varios estudios han identificado marcadores de superficie en los adipocitos que podrían usarse potencialmente para la clasificación. Por ejemplo, el trabajo realizado por Ronald Kahn permitió la identificación del transportador de aminoácidos ASC-1 como un nuevo marcador de superficie en adipocitos blancos29. Además, los estudios que extraen adipocitos maduros de las regiones omental y subcutánea han informado que los adipocitos maduros expresan CD34, CD36 y CD59 en sus superficies.30, donde se ha informado que CD36 funciona como un transportador de ácidos grasos en la superficie de los adipocitos maduros31. Sin embargo, estos estudios han hecho uso de poblaciones heterogéneas de células derivadas del tejido adiposo sin especificar la expresión de estos marcadores a poblaciones de adipocitos maduras. Además, estos marcadores también pueden ser expresados por otros tipos de células y no son específicos de los adipocitos. Por ejemplo, ASC-1 está presente tanto en astrocitos como en neuronas.32, CD34 es un marcador de células madre hematopoyéticas33, CD36 está presente en plaquetas, fagocitos mononucleares, hepatocitos, miocitos y algunos epitelios33, y CD59 se expresa en células endoteliales y linfoides34,35. Por lo tanto, como solución alternativa, se utilizó el rojo del Nilo, la tinción fluorescente selectiva para los lípidos intracelulares, como un posible candidato para clasificar los adipocitos. Los adipocitos almacenan una gran cantidad de lípidos que pueden liberarse y usarse para producir energía, construir membranas o como moléculas de señalización que regulan el metabolismo.36. El colorante rojo del Nilo se ha utilizado previamente en citometría de flujo y microscopía para teñir adipocitos derivados de MSC murinas y humanas.37. Estudios previos han reportado el uso de rojo del Nilo para los adipocitos derivados de ESC y la mejora de los marcadores de adipocitos después de la clasificación.38. Los adipocitos generados a partir de las MSC obtenidas por el presente protocolo basado en AR se evaluaron por su capacidad para ser teñidos por el rojo del Nilo, indicando su madurez, y se clasificaron para purificarlos. Estas células clasificadas en rojo del Nilo mostraron un aumento de dos a tres veces en la expresión de los marcadores de maduración de los adipocitos, incluyendo: PPARG, C/EBPAy FABP4 en comparación con las células no clasificadas, lo que aumenta aún más el rendimiento de los adipocitos derivados de iPSC. Aunque estos marcadores se expresan antes de la acumulación de lípidos, su expresión marca una célula para la diferenciación terminal a los adipocitos portadores de lípidos. La comprobación de la eficiencia de clasificación por estos marcadores nos permite identificar un grupo donde todas las celdas están expresas FABP4, CEBPay PPARg, indicando un grupo, que estaba predestinado para la formación de adipocitos maduros. Las células se clasifican en función de su potencial de tinción a rojo del Nilo. La eficiencia de purificación aumentó de dos a tres veces debido al alto número de adipocitos en la fracción no clasificada. El tamaño de los adipocitos portadores de lípidos varía en gran medida durante la diferenciación, donde se clasifica un grupo de células con distribución de tamaño idéntica. La fracción no clasificada abarca los adipocitos que contienen lípidos, pero no están completamente maduros y gobernados por proporciones de tamaño diferentes..

La heterogeneidad de las MSCs aisladas del cuerpo humano ha sido reportada previamente39. Esa heterogeneidad depende de varios factores, como el origen de la CMS, los donantes y las condiciones39. Esto puede conducir a variaciones en su eficiencia en el tratamiento de diferentes enfermedades. Este estudio sugiere que el tratamiento corto de la AR de las hPSC producidas bajo condiciones de cultivo compatibles con las buenas prácticas de fabricación (GMP) daría una población homogénea de MSC. Esto indica que el protocolo actual es un enfoque prometedor para generar un gran número de MSC de grado clínico que se pueden utilizar para la terapia basada en MSC.

La combinación del protocolo de diferenciación MSC basado en RA que conduce a la diferenciación de adipocitos y el protocolo de clasificación de rojo del Nilo nos permitió obtener adipocitos derivados de iPSCs con una expresión mejorada de marcadores funcionales y un mayor rendimiento y pureza. Por lo tanto, este protocolo combinado permitiría la generación, en cantidad y pureza suficientes, de adipocitos maduros de individuos genéticamente distintos y el descubrimiento potencial de nuevas variantes genéticas detrás de los trastornos metabólicos relacionados con los adipocitos.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por una subvención del Fondo Nacional de Investigación de Qatar (QNRF) (Subvención No. NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi fue apoyada por la beca GSRA del Fondo Nacional de Investigación de Qatar (QNRF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adiponectin Abcam ab22554 Adipocyte maturation marker
anti-CD105 BD Pharmingen 560839 MSC differentiation marker
anti-CD14 BD Pharmingen 561712 MSC differentiation marker
anti-CD19 BD Pharmingen 555415 MSC differentiation marker
anti-CD34 BD Pharmingen 555824 MSC differentiation marker
anti-CD44 abcam ab93758 MSC differentiation marker
anti-CD45 BD Pharmingen
560975		 MSC differentiation marker
anti-CD73 BD Pharmingen 550256 MSC differentiation marker
anti-CD90 BD Pharmingen 555596 MSC differentiation marker
bFGF R&D 233-FP MSC culture media supplement
C/EBPA Abcam ab40761 Adipocyte maturation marker
Dexamethasone Torics 1126 Adipocyte differentiation media supplement
FABP4 Abcam ab93945 Adipocyte maturation marker
Fetal bovine serum ThermoFisher 10082147 MSC culture media supplement
Glutamax ThermoFisher 35050-061 MSC culture media supplement
IBMX Sigma Aldrich I5879 Adipocyte differentiation media supplement
Indomethacin Sigma Aldrich I7378 Adipocyte differentiation media supplement
Insulin Sigma Aldrich 91077C Adipocyte differentiation media supplement
Knockout DMEM ThermoFisher 12660012 Basal media for preparing matrigel
Low glucose DMEM ThermoFisher 11885084 MSC culturing media
Matrigel Corning 354230 Coating matrix
MEM-alpha ThermoFisher 12561056 Adipocyte differentiation media
Nilered Sigma Aldrich 19123 Sorting marker for adipocyte
Penicillin ThermoFisher 15140122 MSC/Adipocyte media supplement
Phosphate-buffered saline ThermoFisher 14190144 wash buffer
Pierce™ 20X TBS Buffer Thermo Fisher 28358 wash buffer
PPARG Cell Signaling Technology 2443 Adipocyte maturation marker
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872 Dissociation reagent
Retinoic acid Sigma Aldrich R2625 MSC differentiation media supplement
Rock inhibitor Tocris 1254/10 hPSC culture media supplement
Roziglitazone Sigma Aldrich R2408 Adipocyte differentiation media supplement
StemFlex ThermoFisher A334901 hPSC culture media
Triton Thermo Fisher 28314 Permebealization reagent
Trypsin ThermoFisher 25200072 Dissociation reagent
Tween 20 Sigma Aldrich P7942 Wash buffer

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Aghadi, M., Karam, M., Abdelalim, E. M. Robust Differentiation of Human iPSCs into a Pure Population of Adipocytes to Study Adipocyte-Associated Disorders. J. Vis. Exp. (180), e63311, doi:10.3791/63311 (2022).

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