Summary
Protokollet möjliggör generering av en ren adipocytpopulation från inducerade pluripotenta stamceller (iPSC). Retinsyra används för att differentiera iPSC till mesenkymala stamceller (MSC) som används för att producera adipocyter. Därefter används en sorteringsmetod baserad på Nile röd färgning för att erhålla rena adipocyter.
Abstract
De senaste framstegen inom inducerad pluripotent stamcellsteknik (iPSC) har möjliggjort generering av olika celltyper, inklusive adipocyter. De nuvarande differentieringsmetoderna har emellertid låg effektivitet och producerar inte en homogen population av adipocyter. Här kringgår vi detta problem genom att använda en all-trans retinoic-baserad metod för att producera mesenkymala stamceller (MSC) i hög avkastning. Genom att reglera vägar som styr cellproliferation, överlevnad och vidhäftning möjliggör vår differentieringsstrategi effektiv generering av embryonala kroppar (EB) som differentieras till en ren population av multipotenta MSC. Det stora antalet MSC som genereras med denna metod ger en idealisk källa för att generera adipocyter. Provheterogenitet som härrör från adipocytdifferentiering är dock fortfarande en utmaning. Därför använde vi en Nile rödbaserad metod för att rena lipidbärande mogna adipocyter med hjälp av FACS. Denna sorteringsstrategi gjorde det möjligt för oss att etablera ett tillförlitligt sätt att modellera adipocytassocierade metaboliska störningar med hjälp av en pool av adipocyter med minskad provheterogenitet och förbättrad cellfunktionalitet.
Introduction
Mesenkymala stamceller (MSC) fungerar som en effektiv övergående resurs för att producera celler av mesodermalt ursprung som adipocyter, osteocyter och kondrocyter, som vidare kan användas för att modellera deras respektive genetiska störningar. Tidigare tillvägagångssätt förlitade sig dock på att uppnå dessa MSC från vuxna vävnader 1, vilket innebar utmaningen att erhålla dem i stort antal från givarna och begränsningen att hålla dem funktionellt livskraftiga under suboptimala in vitro-odlingsförhållanden 1,2. Dessa hinder har skapat en stor efterfrågan på att ha ett protokoll för att generera MSC in vitro. Humant inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) kan användas som en värdefull källa till MSC och uppvisar MSC-egenskaper 3,4,5. iPSCs-härledda MSC kan användas som ett terapeutiskt alternativ vid flera sjukdomar. Dessutom gör förmågan hos iPSC-härledda MSC att generera adipocyter dem till en värdefull in vitro human modell för att studera human adipogenesis, fetma och adipocytassocierade störningar.
Nuvarande differentieringsprotokoll för adipocyter kan klassificeras i två grupper, där den ena involverar differentiering av adipocyter med användning av kemiska eller proteinbaserade cocktails som ger ett resulterande utbyte på 30%-60%6,7,8,9, medan den andra involverar genetisk manipulation för robust induktion av viktiga transkriptionsfaktorer som styr adipocytutveckling för att ge ett utbyte på 80%-90%10, 11. Genetisk manipulation rekapitulerar emellertid inte den naturliga processen för adipocytdifferentiering och maskerar ofta de subtila paradigmerna som anländer under adipogenesis, vilket gör den ineffektiv för sjukdomsmodelleringsändamål12,13. Därför presenterar vi ett sätt att sortera kemiskt härledda mogna adipocyter från omogna genom att fluorescerande märka lipidbärande adipocyter med Nile röd.
Här presenterar vi ett protokoll som involverar övergående inkubation av iPSCs-härledda embryoidkroppar (EB) med all-trans retinsyra för att producera ett stort antal snabbt prolifererande MSC, som kan användas vidare för att generera adipocyter14. Vi presenterar också ett sätt att sortera kemiskt härledda mogna adipocyter från den heterogena differentieringspoolen genom att fluorescerande märka sina lipiddroppar med hjälp av ett lipofilt färgämne; Nilen röd. Detta skulle möjliggöra generering av en ren population av mogna adipocyter med förbättrad funktionalitet för att exakt modellera adipocytassocierade metaboliska störningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien har godkänts av vederbörande institutionella forskningsetiska kommitté och utförts i enlighet med de etiska normer som fastställs i Helsingforsdeklarationen från 1964 och dess senare ändringar eller jämförbara etiska normer. Protokollet godkändes av HMC:s Institutional Review Board (IRB) (nr. 16260/16) och QBRI (nr. 2016-003). Detta arbete är också optimerat för hESC som H1 och H9. Blodprover erhölls från friska individer med fullt informerat samtycke. iPSC genereras från mononukleära celler i perifert blod (PBMC) hos friska individer.
1. Odling och underhåll av iPSC
- Bered matrisbelagda plattor av basalmembran genom att rekonstituera beläggningsmatrisen i knockout-DMEM i förhållandet 1:80 och förvara vid 4 °C.
- Förbered iPSCs odlingsmedia genom att tillsätta 50 ml 10x stamcellstillskottsmedia till 500 ml stamcellssubstrat, tillsammans med 5 ml 100x penicillin-streptomycin (P / S) och förvara vid 4 ° C för kort sikt eller vid -20 ° C för långvarig användning.
- Klä plattorna med beläggningsmatris-1 ml för en 6-brunnsplatta, 500 μL för en 12-brunnsplatta, 250 μL för en 24-brunnsplatta - och inkubera plattan vid 37 °C i 1-2 timmar.
- Ta bort en alikvot av iPSCs odlingsmedia och förvärm vid rumstemperatur före användning.
- Tina en injektionsflaska med iPSC (ESC eller iPSC) i ett 37 °C vattenbad och överför till ett 15 ml koniskt rör innehållande 2–3 ml odlingsmedium.
- Centrifugera röret vid 120 x g i 4 min vid rumstemperatur (RT-23 °C).
- Ta bort supernatanten och tillsätt 2 ml färskt odlingsmedium kompletterat med 10 μM ROCK-hämmare (Y-27632). Platta cellerna i en brunn på en matrisbelagd 6-brunnsplatta och placera plattan vid 37 °C.
- Efter 24 timmar, ta bort mediet och ersätt det med färskt kulturmedium.
- Byt media varje dag tills cellerna når 80% -90% sammanflöde.
- När du når sammanflödet passerar du celler genom att följa stegen nedan.
- Ta bort mediet och tvätta cellerna med Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS).
- Tillsätt iPSCs dissociationsreagens (se Materialtabell)-500 μL för en brunn med 6 brunnar, 250 μL för en brunn med en platta med 24 brunnar och inkubera i 1 min vid 37 °C.
- Ta bort dissociationsreagenset och inkubera cellerna torra i 1 min vid 37 °C.
- Samla cellerna med odlingsmedia-1 ml för en brunn med en 6-brunnsplatta och 250 μL för en brunn med en 24-brunnsplatta - i ett 15 ml koniskt rör och centrifugera vid 120 x g i 4 minuter.
- Resuspendera celler i odlingsmedia-2 ml för en brunn med en 6-brunnsplatta och 500 μL för en brunn med en 24-brunnsplatta kompletterad med 10 μM ROCK-hämmare och platta dem på färska matrisbelagda plattor vid 40% sammanflöde.
2. Differentiering av iPSC i MSC
- Bered MSC-differentieringsmedier genom att tillsätta 15% fetalt bovint serum (FBS) och 1% P/S till DMEM + pyruvat med låg glukos och förvara vid 4 °C.
- När du når 80% sammanflöde, använd iPSC för embryoidkroppsbildning (EB) enligt stegen nedan.
- Tvätta cellerna med DPBS och inkubera dem med dissociationsmedium/EDTA-500 μL för en brunn med en 6-brunnsplatta, 250 μL för en brunn med en 24-brunnsplatta.
- Inkubera vid 37 °C i 1 minut, aspirera dissociationsreagenset och håll cellerna vid 37 °C i ytterligare 1 minut. För att starta MSC-differentiering krävs ~ 10-12 x 106 celler.
- Samla cellerna i ett 15 ml koniskt rör med odlingsmedia. Se till att vara mycket försiktig när du samlar in för att förhindra att celler blir singel och tillåter EB-bildning. Centrifugera cellerna vid 120 x g i 4 minuter.
- Resuspendera cellerna i 3 ml MSC-differentieringsmedium innehållande 10 μM ROCK-hämmare.
- Blanda och fördela 0,5 ml / brunn i en 24-brunns ultralåg fästplatta.
OBS: Användning av ultralåg fästplatta skulle uppmuntra cellaggregering i EB snarare än deras fastsättning på ytan. - Placera plattan i inkubatorn vid 37 °C.
- Efter 24 timmar, inducera de uppnådda EBs med hög retinsyra (RA) behandling genom att följa stegen nedan.
- Tillsätt 10 μM RA till 3 ml MSC-differentieringsmedium. Samla EBs i ett 15 ml rör och låt dem slå sig ner i 15 minuter.
- Ta bort supernatanten från EB och tillsätt MSC-differentieringsmedium kompletterat med 10 μM RA.
- Suspendera försiktigt och fördela 0,5 ml/brunn i samma 24-brunns ultralåga fästplatta.
- Placera plattan i inkubatorn vid 37 °C. Stör inte EBs under de kommande 48 timmarna.
- Efter 48 timmar, samla EBs i ett 15 ml rör och låt dem slå sig ner i 15 minuter.
- Ta bort supernatanten från EB och tillsätt MSC-differentieringsmedium kompletterat med 0,1 μM RA.
- Suspendera försiktigt och fördela 0,5 ml/brunn i samma 24-brunns ultralåga fästplatta.
- Placera plattan i inkubatorn vid 37 °C. Stör inte EBs under de kommande 48 timmarna.
- Ta bort RA som lagts till i cellerna genom att följa stegen nedan.
- Efter 48 timmar av den sista RA-behandlingen, samla EB och låt dem slå sig ner i 15 minuter.
- Ta bort supernatanten och tillsätt DMEM lågglukosmedia utan cytokiner.
- Resuspendera försiktigt och fördela 0,5 ml / brunn i en 24-brunns ultralåg fästplatta. Placera plattan i inkubatorn vid 37 °C.
- Platta de iPSC-härledda EB: erna genom att följa stegen nedan.
- Efter 48 timmar från föregående steg (steg 2.4), samla EB: erna i ett 15 ml rör och låt dem sätta sig i 15 minuter.
- Ta bort supernatanten och suspendera på nytt i 2 ml nytt MSC-differentieringsmedium.
- Överför till två brunnar i en matrisbelagd 6-brunnsplatta med basalmembran.
- Byt media varannan dag i ytterligare 5 dagar.
- Efter 5 dagar, ta bort det använda mediet och ersätt det med nytt MSC-differentieringsmedium som innehåller 2,5 ng / ml basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF).
- Passera de pläterade EB: erna när de når 80% -90% sammanflöde genom att följa stegen nedan.
- Tvätta cellerna med DPBS, tillsätt trypsin-EDTA-500 μL för en brunn med en 6-brunnsplatta och inkubera cellerna vid 37 °C i 3 minuter.
- Samla cellerna med MSC-differentieringsmedia i ett 15 ml koniskt rör och snurra vid 750 x g i 4 minuter.
- Resuspendera i MSC-differentieringsmedia med 2,5 ng/ml bFGF och platta cellerna på matrisbelagda plattor med basalmembran i förhållandet 1:3.
- Upprepa passagen när cellerna når 70% -80% sammanflöde. Det förväntas få 3-6 miljoner celler med 2-3 passager.
3. Flödescytometrianalys av iPSC-härledda MSC
OBS: Vid att genomgå 2-3 passager bör cellerna nås för effektiviteten av MSC-differentiering. Differentiering kommer att anses vara framgångsrik om cellerna uttrycker MSC-differentieringsmarkörer-CD44, CD73, CD90 och CD105 med mer än 90% effektivitet och inte uttrycker höga nivåer av hematopoetiska markörer-CD14, CD19, CD34 och CD45. Effektiviteten hos dessa markörer kan nås genom att följa stegen nedan.
- För cellerna genom stegen ovan (steg 2.6) och uppnå 1 x 105 celler i en brunn på en v-bottenplatta med 96 brunnar.
- Centrifugera plattan vid 375 x g i 4 min vid 4 °C.
- Resuspendera 1 x 105 celler i 100 μL kall DPBS med 1 μL konjugerad antikropp (Ab) (se materialtabell) och inkubera vid 4 °C i 30-40 minuter för att förhindra exponering för ljus.
- Resuspendera ytterligare 1 x 105 celler i 100 μL kall DPBS med respektive isotypkontroll av den konjugerade Ab i en koncentration av 1:100 ) och inkubera vid 4 °C i 30-40 minuter för att förhindra exponering för ljus.
- Efter inkubation centrifugeras plattan vid 375 x g i 4 min vid 4 °C. Kassera supernatanten genom att skaka plattan över diskbänken.
- Resuspendera cellerna i 100 μL kall DPBS.
- Centrifugera cellerna vid 375 x g i 4 min vid 4 °C. Kassera supernatanten.
- Återsuspendera cellerna i 200 μL kall DPBS och samla i mörka, kalla 1,5 ml mikrocentrifugrör och håll dem på is tills de analyseras genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS).
- För FACS-analys, fördela cellerna med hjälp av sidospridda (SSC-A) kontra framåtspridda (FSC-A) för att utesluta skräpet. Vidare distribuerar du de gated cellerna med hjälp av forward scattered height (FSC-H) kontra forward scattered area (FSC-A) för att skilja singlets från dubletter från levande cellpopulation.
OBS: Cellerna var grindade i förhållande till skiftet av isotypkontroll för varje markör, och minst 10 000 gated händelser från varje färgat prov användes för analys.
4. Differentiering av MSC i adipocyter
- Bered basala substrat för adipocytdifferentiering genom att tillsätta 10 % knockoutserumersättning (KOSR), 1 % glutamin, 1 % P/S, 4,5 ng/μl glukos till MEM-alfa (minimum essential media) och förvara vid 4 °C.
- Låt MSC nå över 90% sammanflöde. Fortsätt odla dem i ytterligare 48 timmar så att de kan genomgå en period av tillväxtstopp.
- Bered kompletta substrat för differentiering av adipocyter genom att tillsätta 100 μg/ml 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX), 1 μM dexametason, 0,2 E/ml insulin, 100 μM indometacin och 10 μM rosiglitazon till basmediet.
- Ta bort MSC-differentieringsmedia och tvätta cellerna med DPBS.
- Tillsätt komplett adipocytdifferentieringsmedia-2 ml för en brunn med en 6-brunnsplatta och 1 ml för en brunn med en 12-brunnsplatta - och inkubera cellerna vid 37 °C. Byt fullständigt differentieringsmedium varannan dag i 14 dagar.
5. Utvärdering av differentieringseffektiviteten hos adipocyter
- På dag 14 av differentiering, kontrollera effektiviteten av differentiering genom färgning av celler för adipocytmognadsmarkörer, FABP4 och adiponektin.
- Ta bort mediet och tvätta cellerna med DPBS.
- Fixera cellerna med 4% paraformaldehyd (PFA) - 200 μL till en brunn på en 24-brunnsplatta - och inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter.
- Kassera PFA och tvätta med trisbuffrad saltlösning med 0,5% tween (TBST) och placera den på en shaker vid rumstemperatur i 15 minuter. Upprepa processen två gånger.
- Permeabilisera de fasta cellerna med fosfatbuffrad saltlösning med 0,5% Triton X-100 (PBST) och placera den på en shaker vid rumstemperatur i 15-20 minuter.
- Kassera PBST och tillsätt blockeringsbufferten (5%-6% bovint serumalbumin (BSA) i PBST)-500 μL för en brunn med en 6-brunnsplatta och 250 μL för en brunn med en 12-brunnsplatta - och inkubera vid rumstemperatur på skakapparaten i 40-60 minuter.
- Späd de primära antikropparna mot FABP4, adiponektin i 2%-3% BSA, vid en koncentration av 1:500 (se materialtabell). Tillsätt dessa antikroppar endast om de är uppfödda på olika djur och placera plattan på shakern vid 4 °C över natten.
- Ta bort de primära antikropparna och tvätta cellerna tre gånger med TBST (15 min vardera) och placera den på en shaker vid rumstemperatur.
- Förbered Alexa Fluor sekundära antikroppar i PBST (1:500). Inkubera cellerna i de sekundära antikroppskombinationerna (enligt arten där den primära antikroppen höjs) i 60 minuter vid rumstemperatur och täck plattan med aluminiumfolie för att skydda den mot ljus.
- Kassera de sekundära antikropparna, tvätta med TBST tre gånger och placera plattan på shakern.
- För att färga kärnorna, tillsätt 1 μg/ml Hoechst 33342-200 μL för en brunn med en 24-brunnsplatta utspädd i PBS och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Kassera Hoechst-lösningen och tillsätt PBS-500 μL för en brunn med en 24-brunnsplatta till cellerna. Håll plattorna täckta från ljus tills de visualiseras med hjälp av ett inverterat fluorescensmikroskop.
6. Sortering av adipocyter med Nile röd
- Bered Nile röd arbetslösning genom att tillsätta 1 mg/ml Nile röd stamlösning i DMSO och förvara vid -20 °C. Strax före användning, tina den röda massan av Nilen och rekonstituera den i DPBS för att uppnå en koncentration på 300 nM arbetslösning.
- På eller efter dag 14 av adipocytdifferentiering, kassera mediet från cellerna och tvätta med DPBS.
- Tillsätt Nile röd arbetslösning -1 ml i en brunn med en 6-brunnsplatta och inkubera vid 37 °C i 15 minuter.
- Ta bort den röda lösningen från Nilen och tillsätt trypsin-EDTA -500 μL i en brunn med en platta med 6 brunnar och inkubera vid 37 °C i 4 minuter.
- Samla cellerna med DMEM innehållande 5% FBS i ett 15 ml koniskt rör. Centrifugera vid 750 x g i 4 min.
- Ta bort supernatanten och suspendera igen i DPBS-1 ml för 1 x 106 celler. Centrifugera vid 750 x g i 4 min.
- Ta bort supernatanten och suspendera igen i DPBS-1 ml för 1 x 106 celler. Använd en FACS-sorterare för att isolera de röda positiva cellerna i Nilen med FL1-kanalen.
- Omkultur de sorterade cellerna i adipocytdifferentieringsmedia eller samla de sorterade cellerna för RNA- och proteinisolering.
- Extrahera RNA från de sorterade cellerna och utför relativ kvantitativ analys av adipocytdifferentieringsmarkörer, inklusive FABP4, PPARG och C / EBPA. De röda positiva cellerna i Nilen visar en signifikant uppreglering i genuttrycket av minst två veck jämfört med osorterade celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Schematisk och morfologi av celler under mesenkymal differentiering: Differentiering av iPSC till MSC involverar olika utvecklingsstadier som spänner över EB-bildning, MSC-differentiering och MSC-expansion (figur 1). Under dessa utvecklingsstadier förvärvar celler olika morfologi på grund av de olika stimulerande kemikalier de utsätts för. Vid initiering av differentiering pläteras cellerna i suspension och förväntas vara runda, med definierade cellgränser, samtidigt som de är små till medelstora i diameter (figur 2). Valet av odlingsceller i suspension under den inledande fasen av differentiering gör det möjligt att likna processen för naturlig embryonal utveckling, vilket gör denna fas mycket avgörande för framgångsrik differentiering. Fasen av EB-bildning och RA-behandling följs av plätering av EB på matrisbelagda plattor med basalmembran. EB: s livskraft vid plätering kan nås genom att observera deras snabba spridningsbeteende, vilket ger upphov till fler MSC (figur 2). Detta snabba spridningsbeteende som uppvisas av MSC bibehålls även efter att ha passerat dem på färska matrisbelagda plattor tillsammans med bibehållen märklig, långsträckt morfologi (figur 2).
Kvantitativ bedömning av MSC-ytmarkörer: Differentieringseffektiviteten hos MSC uppnås genom kvantifiering av ytmarkörer som är specifika för MSC-differentiering. God differentiering som producerar tillförlitliga MSC bör visa mer än 90% effektivitet av mesenkymala ytmarkörer CD73, CD44 och CD90 (figur 3A). Utöver detta bedöms celler också för frånvaro av ytmarkörer som visar hematopoetisk fenotyp, CD14, CD34 och CD19, och förväntas därför visa mindre än 1% uttryckseffektivitet för dem (figur 3B).
Differentiering av MSC i adipocyter: Differentiering av MSC till adipocyter kan nås genom färgning för FABP4 och adiponektin. FABP4 är ett cytoplasmatiskt protein, och det betraktas som en markör för terminalt differentierade adipocyter. Dess höga uttryck bland adipocyter, med en cytoplasmatisk fördelning, är ett viktigt tecken på deras utvecklingsmognad (figur 4A). Förutom FABP4 betraktas adiponektin som en av de viktiga markörerna för adipocytmognad. Dess höga uttryck indikerar att adipocyter är funktionella nog för att genomgå lipidlagring och adipogenesis som svar på glukossignalering. Att vara ett sekretoriskt protein uppvisar adiponektin globulär morfologi med varje proteinkula lätt urskiljbar inom cytoplasman (figur 4B).
Färgning och sortering av mogna adipocyter med Nile röd: Vid differentiering kan mogna adipocyter särskiljas från sina omogna motsvarigheter genom färgning för Nilröd. Nilrött binder till lipidbärande adipocyter, en egenskap som är exklusiv för mogna adipocyter (figur 5A). Detta tillsammans med den fluorescerande lagerkarakteristiken hos Nilröd gör det till ett effektivt verktyg för sortering av mogna adipocyter med fluorescerande aktiverad flödescytometri (figur 5B). Effektiv sortering bör resultera i en förbättring av mognadsmarkörerna PPARG, C/EBPA och FABP4 med minst två gånger, bestämda genom kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR) (figur5C).
Figur 1: Schematiskt diagram som visar differentieringen av iPSC i MSC och adipocyter. iPSC differentieras till MSC med hjälp av embryoidkroppstekniken (EB). EB: erna utsätts för en kort exponering av 10 μM all-trans retinsyra (RA). De genererade MSC: erna differentieras i 40% -77% adipocyter baserat på iPSC-linjen. De Nilens röda positiva cellerna sorteras med hjälp av FACS för att erhålla en renad population av mogna adipocyter som kan användas för att studera adipocytassocierade störningar (sjukdomsmodellering), identifiera nya läkemedel och så småningom för personlig terapi. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Differentiering av iPSC i MSC. Representativa morfologiska bilder som visar olika stadier av MSC-differentiering dag 2 (D2), 11 (D11), 15 (D15) och 24 (D24). Embryoidkroppar (EB) genererade i närvaro av 10 μM RA under 24 timmar pläterades vid dag 8 av differentiering, följt av dissociation och passaging efter 12-17 dagars differentiering. MSC passerades flera gånger. Förkortningar: P2 = passage 2. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Uttryck av MSC-markörer och hematopoetiska markörer i iPSC-härledda MSC. Histogram för representativ flödescytometri som visar uttrycket av MSC-markörerna, CD73, CD44 och CD90, (A) och de hematopoetiska markörerna, CD34, CD19 och CD14 (B) i MSC: erna genererade från iPSC-härledda EBs behandlade med 10 μM RA. X-axeln i diagrammet representerar den fluorescerande intensiteten. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Differentiering av iPSC-härledda MSC i adipocyter. Immunfärgningsbilder som visar uttrycket av FABP4 (A) och adiponektin (ADIPO) (B) i mogna adipocyter härrörande från iPSC. Kärnorna färgades med Hoechst. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Sortering av iPSC-härledda adipocyter med Nile röd. (A) Bilder som visar ljusfält (BF) och Nilrödfärgade mogna adipocyter. (B) Kvantifiering av Nilrött (PE-positiva celler) i mogna adipocyter med användning av FACS. (C) PCR-analys i realtid som visar uttrycket av C/EBPA, FABP4 och PPARG i sorterade kontra osorterade mogna adipocyter. Data representeras som medelvärde ± SD; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll är av största vikt på grund av dess förmåga att tillhandahålla MSC i hög avkastning och effektivitet. Denna storskaliga produktion av MSC möjliggjordes genom övergående inkubation av iPSCs-härledda EB med 10 μM RA14,15. Övergående behandling med 10 μM RA ökade MSC-utbytet med 11,2 till 1542 gånger14,15, med detta protokoll tillämpligt på både iPSC och hPSC. Vid denna dos och behandlingstid förbättrar RA proliferativa och överlevnadskapaciteten hos EB-bildande celler genom direkt eller indirekt reglering av uttrycket av flera gener som är involverade i cellproliferation, apoptos och cell-cell- och ECM-celladhesioner, som är kritiska för överlevnad och spridning av iPSC14,16. Generna inkluderar, men är inte begränsade till, transkriptionsfaktorer (såsom EGFR4, SOX4), tillväxtfaktorer och tillväxtfaktorreceptorer (såsom IGF2, FGFR4) och vidhäftningsmolekyler (såsom FN1 och CAMs). Till skillnad från låga doser (0,1–10 μM), vid höga doser (≥20 μM), reglerar RA emellertid negativt proliferation och överlevnad av EB-bildande celler, vilket resulterar i minskat PSC-härlett EB-antal och EB-storlek och därmed ett minskat utbyte av MSC14. RA betraktas som en proliferationshämmare i flera normala differentierade och cancerceller17,18,19. I EB är retinoidsignalering kontext (tid, koncentration, art och cellinje) beroende av; differentiellt påverkar självförnyelse, överlevnad och differentiering av EB-bildande celler genom att reglera distinkta gener och signalvägar20,21. Därför är användningen av RA vid en optimal tid och koncentration av RA-10 μM på dag 3 av EB-induktion följt av dosreduktion till 0,1 μM på dag 5 i 2 dagar enligt beskrivningen i detta protokoll avgörande för att inducera EB-bildande cellöverlevnad och proliferation.
Förutom att reglera tillväxt och överlevnad utsätter RA de behandlade EB: erna för differentieringsfördröjning jämfört med celler som inte behandlas med RA14. Faktum är att RA-behandlade EB behåller sin kompakta form efter plätering och misslyckas med att differentiera till MSC-liknande celler, i motsats till RA-obehandlade EB. Detta överensstämmer med tidigare studier som rapporterar att kortvarig exponering för RA-behandling hämmar celldifferentiering genom undertryckande av WNT-signalering21. Dessutom visade dessa RA-behandlade differentieringsfördröjda celler också förbättrat uttryck av kadherin och extracellulära matrisproteiner14, som är kända för att spela en viktig roll för att upprätthålla det pluripotenta tillståndet hos iPSC16. För att frigöra det RA-medierade differentieringsblocket bör EB dissocieras, vilket resulterar i störande celladhesioner och möjliggör långvarig MSC-differentiering vid plätering. Intressant nog höll RA-behandling ett differentieringsblock över celler, men det höll inte cellerna i ett pluripotent tillstånd. Faktum är att de EB-bildande cellerna som genomgår kortvarig exponering för 10 μM RA visar signifikant minskat uttryck av viktiga pluripotensmarkörer-OCT4, SOX2 och NANOG14.
MSC: erna som genereras av korttids RA-behandling av EB har visat sig bibehålla sin typiska fibroblastliknande morfologi med rikligt uttryck av MSC-ytmarkörer och deras multipotens efter kryokonservering, vilket gör dessa massproducerade MSC lagringsbara för långsiktiga expansionsstudier14. När de utsätts för adipogena, kondrogeniska och osteogena differentieringsförhållanden kan dessa MSC lätt differentieras till de tre mesodermala celltyperna, vilket gör dem till en lätt uppnåelig källa för modellering av vävnadsrelaterade sjukdomar14. Således ger det stabila och mångsidiga in vitro-beteendet hos MSC: erna som genereras av det RA-medierade differentieringsprotokollet dem av största vikt i forsknings- och applikationsbaserade inställningar.
Medan de kondrogena och osteogena differentieringspotentialerna för MSC erhållna från RA-behandlade EB verkar likna de hos MSC erhållna från obehandlade EB, visade sig den förra visa en förbättrad potential att differentiera till adipogen härstamning när den utsattes för adipogenic differentieringsförhållanden14. Detta bevisades av en 2- till 3-faldig ökning av intracellulär lipidackumulering (Oil Red O-färgning) och adipocytmarkör FABP4-positiva celler i differentieringspoolen av celler erhållna efter odling av MSC härledda från RA-behandlade EB med adipogenic differentieringsmedia, jämfört med MSC härledda från RA-obehandlade EB. Detta kan vara konsekvensen av regleringen, av RA, av flera signalvägar som styr adipocytutveckling, såsom Hippo, WNT och ECM-cellinteraktionsvägar, vilket avslöjas av RNA-sekvenseringsdata från RA-behandlade och obehandlade EB 14,22,23,24,25. Denna förbättrade förmåga hos RA-härledda MSC att genomgå adipogenic differentiering är värdefull, eftersom för närvarande tillgängliga protokoll antingen leder till dåligt adipocytutbyte eller använder genetisk manipulation vilket gör de genererade adipocyterna ovärderliga för att härleda naturliga processrekapitulerade adipocyter. Adipocyter klassificeras i tre typer-vit, brun och beige. Vita adipocyter klassificeras genom närvaron av en enda lipiddroppe och spelar en roll i energilagring. Medan bruna adipocyter är involverade i energiförbrukningen genom substratoxidation på grund av den mycket höga överflödet av mitokondrier som kännetecknas av uttrycket av UCP1. Medan de bruna adipocyterna som finns lokaliserade i vit fettvävnad är kända som beige- eller brunliknande adipocyter. Dessa MSC har potential att ge ett rikligt utbyte av vita adipocyter med tanke på EBs förexponering för RA. Tidigare publikationer har angett selektiv induktion av iPSC i celler som uttrycker låg UCP1, dvs vita adipocyter, snarare än att utsätta celler med höga UCP1-nivåer för RA26. Tidigare publikationer har rapporterat att RA producerad från neurala vapenceller i mus- och zebrafiskembryon spelar en viktig roll vid vit adipocytbildning27,28.
Även om det RA-baserade protokollet tillät generering av MSC som ger ökat utbyte av adipocyter som når 48.5% -77.4% (jämfört med 22.5% -57.6% utan RA-behandling), är det fortfarande problematiskt att uppnå >90% vid modellering av multivarianta adipocytbaserade genetiska störningar in vitro. Faktum är att inte nå en ren adipocytpopulation kan göra resultat som kommer från multivarianta sjukdomsmodeller ambivalenta, eftersom det skulle vara svårt att skilja om de observerade utvecklingsskillnaderna beror på de olika genetiska sminkarna eller på grund av inkonsekventa differentieringseffektiviteter. För att kringgå denna fråga var det viktigt att sortera de differentierade cellerna för att erhålla en pool av rena mogna adipocyter, så att eventuella skillnader i fenotyper endast kunde hänföras till inneboende genetiska skillnader. Flera studier har identifierat ytmarkörer på adipocyter som potentiellt skulle kunna användas för sortering. Till exempel möjliggjorde Ronald Kahns arbete identifieringen av aminosyratransportören ASC-1 som en ny ytmarkör på vita adipocyter29. Dessutom har studier som extraherar mogna adipocyter från omentala och subkutana regioner rapporterat mogna adipocyter för att uttrycka CD34, CD36 och CD59 på sina ytor30, där CD36 har rapporterats fungera som en fettsyratransportör på ytan av mogna adipocyter31. Dessa studier har emellertid använt heterogena populationer av celler härrörande från fettvävnaden utan att specificera uttrycket av dessa markörer till endast mogna adipocytpopulationer. Dessutom kan dessa markörer också uttryckas av andra celltyper och är inte specifika för adipocyter. Till exempel är ASC-1 närvarande på både astrocyter och neuroner32, CD34 är en markör för hematopoetiska stamceller33, CD36 finns på blodplättar, mononukleära fagocyter, hepatocyter, myocyter och vissa epitel33, och CD59 uttrycks på endotel- och lymfoida celler34,35. Därför, som en alternativ lösning, användes Nilröd, den selektiva fluorescerande fläcken för intracellulära lipider, som en möjlig kandidat för sortering av adipocyter. Adipocyter lagrar en betydande del av lipider som kan frigöras och användas för att producera energi, bygga membran eller som signalmolekyler som reglerar ämnesomsättningen36. Nile rött färgämne har tidigare använts i flödescytometri och mikroskopi för att färga adipocyter härrörande från murina och humana MSC37. Tidigare studier har rapporterat användning av Nilen röd för ESC-härledda adipocyter och förbättring av adipocytmarkörer efter sortering38. De adipocyter som genererades från MSC erhållna med det nuvarande RA-baserade protokollet bedömdes för deras förmåga att färgas av Nilröd, vilket indikerar deras mognad och sorterades för att rena dem. Dessa rödsorterade celler från Nilen uppvisade en två- till trefaldig ökning av uttrycket av adipocytmognadsmarkörerna, inklusive PPARG, C/EBPAoch FABP4 jämfört med osorterade celler, vilket ytterligare ökar utbytet av iPSCs-härledda adipocyter. Även om dessa markörer uttrycks före lipidackumulering, märker deras uttryck en cell för terminal differentiering till lipidbärande adipocyter. Genom att kontrollera sorteringseffektiviteten med dessa markörer kan vi identifiera en pool där alla celler uttrycks FABP4, CEBPaoch PPARg, vilket indikerar en pool, som var förutbestämd för mogen bildning av adipocyter. Celler sorteras utifrån deras färgningspotential till Nilen röd. Reningseffektiviteten ökade med två till tre gånger på grund av det stora antalet adipocyter i den osorterade fraktionen. Storleken på lipidbärande adipocyter varierar till stor del under differentiering, där en pool av celler med identisk storleksfördelning sorteras. Osorterad fraktion omfattar lipidbärande adipocyter, men de är inte helt mogna och styrs av olika storleksproportioner.
Heterogeniteten hos MSC isolerade från människokroppen har tidigare rapporterats39. Denna heterogenitet beror på flera faktorer, såsom MSC-ursprung, givare och villkor39. Detta kan leda till variationer i deras effektivitet vid behandling av olika sjukdomar. Denna studie tyder på att kort RA-behandling av hPSC som produceras under odlingsförhållanden som är förenliga med god tillverkningssed (GMP) skulle ge en homogen population av MSC. Detta indikerar att det nuvarande protokollet är ett lovande tillvägagångssätt för att generera ett stort antal MSC av klinisk kvalitet som kan användas för MSC-baserad terapi.
Kombinationen av det RA-baserade MSC-differentieringsprotokollet som leder till adipocytdifferentiering och Nile red-sorting-protokoll gjorde det möjligt för oss att erhålla iPSC-härledda adipocyter med förbättrat uttryck av funktionella markörer och ökat utbyte och renhet. Således skulle detta kombinerade protokoll möjliggöra generering, i tillräcklig mängd och renhet, av mogna adipocyter från genetiskt distinkta individer och potentiell upptäckt av nya genetiska varianter bakom adipocytrelaterade metaboliska störningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av ett bidrag från Qatar National Research Fund (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi stöddes av GSRA-stipendium från Qatar National Research Fund (QNRF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adiponectin | Abcam | ab22554 | Adipocyte maturation marker |
| anti-CD105 | BD Pharmingen | 560839 | MSC differentiation marker |
| anti-CD14 | BD Pharmingen | 561712 | MSC differentiation marker |
| anti-CD19 | BD Pharmingen | 555415 | MSC differentiation marker |
| anti-CD34 | BD Pharmingen | 555824 | MSC differentiation marker |
| anti-CD44 | abcam | ab93758 | MSC differentiation marker |
| anti-CD45 | BD Pharmingen | 560975 |
MSC differentiation marker |
| anti-CD73 | BD Pharmingen | 550256 | MSC differentiation marker |
| anti-CD90 | BD Pharmingen | 555596 | MSC differentiation marker |
| bFGF | R&D | 233-FP | MSC culture media supplement |
| C/EBPA | Abcam | ab40761 | Adipocyte maturation marker |
| Dexamethasone | Torics | 1126 | Adipocyte differentiation media supplement |
| FABP4 | Abcam | ab93945 | Adipocyte maturation marker |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10082147 | MSC culture media supplement |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050-061 | MSC culture media supplement |
| IBMX | Sigma Aldrich | I5879 | Adipocyte differentiation media supplement |
| Indomethacin | Sigma Aldrich | I7378 | Adipocyte differentiation media supplement |
| Insulin | Sigma Aldrich | 91077C | Adipocyte differentiation media supplement |
| Knockout DMEM | ThermoFisher | 12660012 | Basal media for preparing matrigel |
| Low glucose DMEM | ThermoFisher | 11885084 | MSC culturing media |
| Matrigel | Corning | 354230 | Coating matrix |
| MEM-alpha | ThermoFisher | 12561056 | Adipocyte differentiation media |
| Nilered | Sigma Aldrich | 19123 | Sorting marker for adipocyte |
| Penicillin | ThermoFisher | 15140122 | MSC/Adipocyte media supplement |
| Phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190144 | wash buffer |
| Pierce™ 20X TBS Buffer | Thermo Fisher | 28358 | wash buffer |
| PPARG | Cell Signaling Technology | 2443 | Adipocyte maturation marker |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Dissociation reagent |
| Retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625 | MSC differentiation media supplement |
| Rock inhibitor | Tocris | 1254/10 | hPSC culture media supplement |
| Roziglitazone | Sigma Aldrich | R2408 | Adipocyte differentiation media supplement |
| StemFlex | ThermoFisher | A334901 | hPSC culture media |
| Triton | Thermo Fisher | 28314 | Permebealization reagent |
| Trypsin | ThermoFisher | 25200072 | Dissociation reagent |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7942 | Wash buffer |
References
- Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling: CCS. 9, 12 (2011).
- Wagner, W., et al. Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells. PLoS One. 4 (6), 5846 (2009).
- Brown, P. T., Squire, M. W., Li, W. J. Characterization and evaluation of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells and bone marrow. Cell and Tissue Research. 358 (1), 149-164 (2014).
- Trivedi, P., Hematti, P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Experimental Hematology. 36 (3), 350-359 (2008).
- Barberi, T., Willis, L. M., Socci, N. D., Studer, L. Derivation of multipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells. PLoS Medicine. 2 (6), 161 (2005).
- Xiong, C., et al. Derivation of adipocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (6), 671-675 (2005).
- Cuaranta-Monroy, I., et al. Highly efficient differentiation of embryonic stem cells into adipocytes by ascorbic acid. Stem Cell Research. 13 (1), 88-97 (2014).
- van Harmelen, V., et al. Differential lipolytic regulation in human embryonic stem cell-derived adipocytes. Obesity (Silver Spring). 15 (4), 846-852 (2007).
- Noguchi, M., et al. In vitro characterization and engraftment of adipocytes derived from human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 22 (21), 2895-2905 (2013).
- Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
- Lee, Y. K., Cowan, C. A. Differentiation of white and brown adipocytes from human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 538, 35-47 (2014).
- Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (6), 2459-2483 (2021).
- Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
- Karam, M., Younis, I., Elareer, N. R., Nasser, S., Abdelalim, E. M. Scalable Generation of mesenchymal stem cells and adipocytes from human pluripotent stem cells. Cells. 9 (3), (2020).
- Karam, M., Abdelalim, E. M. Robust and highly efficient protocol for differentiation of human pluripotent stem cells into mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. (2020).
- Li, L., Bennett, S. A., Wang, L. Role of E-cadherin and other cell adhesion molecules in survival and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Adhesion & Migration. 6 (1), 59-70 (2012).
- Lai, L., Bohnsack, B. L., Niederreither, K., Hirschi, K. K. Retinoic acid regulates endothelial cell proliferation during vasculogenesis. Development. 130 (26), 6465-6474 (2003).
- Chanchevalap, S., Nandan, M. O., Merlin, D., Yang, V. W. All-trans retinoic acid inhibits proliferation of intestinal epithelial cells by inhibiting expression of the gene encoding Kruppel-like factor 5. FEBS Letters. 578 (1-2), 99-105 (2004).
- di Masi, A., et al. Retinoic acid receptors: from molecular mechanisms to cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 41, 1 (2015).
- Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Letters. 584 (14), 3123-3130 (2010).
- De Angelis, M. T., Parrotta, E. I., Santamaria, G., Cuda, G. Short-term retinoic acid treatment sustains pluripotency and suppresses differentiation of human induced pluripotent stem cells. Cell Death & Disease. 9 (1), 6 (2018).
- Li, L., Dong, L., Wang, Y., Zhang, X., Yan, J. Lats1/2-mediated alteration of hippo signaling pathway regulates the fate of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2018, 4387932 (2018).
- Moldes, M., et al. Peroxisome-proliferator-activated receptor gamma suppresses Wnt/beta-catenin signalling during adipogenesis. The Biochemical Journal. 376, Pt 3 607-613 (2003).
- Ross, S. E., et al. Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science. 289 (5481), 950-953 (2000).
- Wang, Y. K., Chen, C. S. Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 823-832 (2013).
- Mohsen-Kanson, T., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells into brown and white adipocytes: role of Pax3. Stem Cells. 32 (6), 1459-1467 (2014).
- Billon, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
- Li, N., Kelsh, R. N., Croucher, P., Roehl, H. H. Regulation of neural crest cell fate by the retinoic acid and Pparg signalling pathways. Development. 137 (3), 389-394 (2010).
- Ussar, S., et al. ASC-1, PAT2, and P2RX5 are cell surface markers for white, beige, and brown adipocytes. Science Translational Medicine. 6 (247), (2014).
- Festy, F., et al. Surface protein expression between human adipose tissue-derived stromal cells and mature adipocytes. Histochemistry and Cell Biology. 124 (2), 113-121 (2005).
- Cai, L., Wang, Z., Ji, A., Meyer, J. M., vander Westhuyzen, D. R. Scavenger receptor CD36 expression contributes to adipose tissue inflammation and cell death in diet-induced obesity. PLoS One. 7 (5), 36785 (2012).
- Mesuret, G., et al. A neuronal role of the Alanine-Serine-Cysteine-1 transporter (SLC7A10, Asc-1) for glycine inhibitory transmission and respiratory pattern. Scientific Reports. 8 (1), 8536 (2018).
- Silverstein, R. L., Febbraio, M. CD36, a scavenger receptor involved in immunity, metabolism, angiogenesis, and behavior. Science Signaling. 2 (72), (2009).
- Brooimans, R. A., van Wieringen, P. A., van Es, L. A., Daha, M. R. Relative roles of decay-accelerating factor, membrane cofactor protein, and CD59 in the protection of human endothelial cells against complement-mediated lysis. European Journal of Immunology. 22 (12), 3135-3140 (1992).
- Davies, A., et al. CD59, an LY-6-like protein expressed in human lymphoid cells, regulates the action of the complement membrane attack complex on homologous cells. The Journal of Experimental Medicine. 170 (3), 637-654 (1989).
- Lapid, K., Graff, J. M.
- Aldridge, A., et al. Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells--a direct comparison of four different methods. Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).
- Schaedlich, K., Knelangen, J. M., Navarrete Santos, A., Fischer, B., Navarrete Santos, A. A simple method to sort ESC-derived adipocytes. Cytometry A. 77 (10), 990-995 (2010).
- Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (2), 447-467 (2021).
