Summary
Protokollen tillater generering av en ren adipocytpopulasjon fra induserte pluripotente stamceller (iPSCs). Retinsyre brukes til å differensiere iPSCs til mesenkymale stamceller (MSC) som brukes til å produsere adipocytter. Deretter brukes en sorteringsmetode basert på Nilrødfarging for å oppnå rene adipocytter.
Abstract
Nylige fremskritt innen indusert pluripotent stamcelleteknologi (iPSC) har gjort det mulig å generere forskjellige celletyper, inkludert adipocytter. Imidlertid har de nåværende differensieringsmetodene lav effektivitet og produserer ikke en homogen populasjon av adipocytter. Her omgår vi dette problemet ved å bruke en all-trans retinoic-basert metode for å produsere mesenkymale stamceller (MSC) i høyt utbytte. Ved å regulere veier som styrer celleproliferasjon, overlevelse og adhesjon, tillater vår differensieringsstrategi effektiv generering av embryonale legemer (EB) som skiller seg ut til en ren populasjon av multipotente MSC-er. Det høye antallet MSC generert av denne metoden gir en ideell kilde for å generere adipocytter. Imidlertid er prøveheterogenitet som følge av adipocytdifferensiering fortsatt en utfordring. Derfor brukte vi en Nilrødbasert metode for rensing av lipidbærende modne adipocytter ved bruk av FACS. Denne sorteringsstrategien tillot oss å etablere en pålitelig måte å modellere adipocytassosierte metabolske forstyrrelser ved å bruke en pool av adipocytter med redusert prøveheterogenitet og forbedret cellefunksjonalitet.
Introduction
Mesenkymale stamceller (MSC) fungerer som en effektiv forbigående ressurs for å produsere celler av mesodermal opprinnelse som adipocytter, osteocytter og kondrocytter, som videre kan brukes til å modellere deres respektive genetiske lidelser. Tidligere tilnærminger baserte seg imidlertid på å oppnå disse MSC-ene fra voksent vev 1, noe som medførte utfordringen med å skaffe dem i høyt antall fra donorene, og begrensningen av å holde dem funksjonelt levedyktige under suboptimale in vitro-kulturforhold 1,2. Disse hindringene har gitt stor etterspørsel etter å ha en protokoll for generering av MSC-er in vitro. Humaninduserte pluripotente stamceller (iPSCs) kan brukes som en verdifull kilde til MSC, med MSC-egenskaper 3,4,5. iPSCs-avledede MSCer kan brukes som et terapeutisk alternativ i flere sykdommer. Også evnen til iPSCs-avledede MSCer til å generere adipocytter, gjør dem til en verdifull in vitro menneskelig modell for å studere human adipogenese, fedme og adipocytt-assosierte lidelser.
Nåværende differensieringsprotokoller av adipocytter kan klassifiseres i to grupper, med en som involverer differensiering av adipocytter ved bruk av kjemiske eller proteinbaserte cocktailer som gir et resulterende utbytte på 30% -60% 6,7,8,9, mens den andre involverer genetisk manipulasjon for robust induksjon av viktige transkripsjonsfaktorer som styrer adipocytterutvikling for å gi et utbytte på 80% -90%10, 11. Genetisk manipulasjon rekapitulerer imidlertid ikke den naturlige prosessen med adipocytdifferensiering, og maskerer ofte de subtile paradigmene som kommer under adipogenese, noe som gjør den ineffektiv for sykdomsmodelleringsformål12,13. Derfor presenterer vi en måte å sortere kjemisk avledede modne adipocytter fra umodne ved fluorescerende merking av lipidbærende adipocytter ved bruk av Nilrød.
Her presenterer vi en protokoll som involverer forbigående inkubasjon av iPSCs-avledede embryoidlegemer (EB) med all-trans retinsyre for å produsere et høyt antall raskt prolifererende MSC, som videre kan brukes til å generere adipocytter14. Vi presenterer også en måte å sortere kjemisk avledede modne adipocytter fra det heterogene differensieringsbassenget ved fluorescerende merking av lipiddråpene ved hjelp av et lipofilt fargestoff; Nilen rød. Dette vil tillate generering av en ren populasjon av modne adipocytter med forbedret funksjonalitet for nøyaktig modellering av adipocytassosierte metabolske forstyrrelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien er godkjent av vedkommende institusjonelle forskningsetiske komité og utført i henhold til de etiske standarder som er fastsatt i Helsinkideklarasjonen av 1964 og senere endringer eller sammenlignbare etiske standarder. Protokollen ble godkjent av Institutional Review Board (IRB) av HMC (nr. 16260/16) og QBRI (nr. 2016-003). Dette arbeidet er også optimalisert for hESC-er som H1 og H9. Blodprøver ble innhentet fra friske personer med fullt informert samtykke. iPSCene genereres fra mononukleære celler i perifert blod (PBMC) hos friske individer.
1. Dyrking og vedlikehold av iPSCer
- Forbered kjellermembranmatrisebelagte plater ved å rekonstituere beleggmatriks i knockout-DMEM i forholdet 1:80 og lagre ved 4 °C.
- Forbered iPSCs dyrkningsmedier ved å tilsette 50 ml 10x stamcelletilskuddsmedier til 500 ml stamcellebasalmedier, sammen med 5 ml 100x penicillin-streptomycin (P/S) og oppbevares ved 4 °C for kortvarig eller ved -20 °C for langvarig bruk.
- Linje platene med belegningsmatrise-1 ml for en 6-brønnsplate, 500 μL for en 12-brønnsplate, 250 μL for en 24-brønnsplate - og inkuber platen ved 37 ° C i 1-2 timer.
- Fjern en alikot av iPSCs kulturmedium og forvarm ved romtemperatur før bruk.
- Tine et hetteglass med iPSC (ESC eller iPSC) i et vannbad på 37 °C og overfør til et 15 ml konisk rør inneholdende 2-3 ml dyrkningsmedium.
- Sentrifuger røret ved 120 x g i 4 minutter ved romtemperatur (RT-23 °C).
- Fjern supernatanten og tilsett 2 ml ferske kulturmedier supplert med 10 μM ROCK-hemmer (Y-27632). Plat cellene i en brønn på en matrisebelagt 6-brønnsplate og plasser platen ved 37 °C.
- Etter 24 timer, fjern mediet og erstatt det med friske kulturmedier.
- Bytt media hver dag til cellene når 80% -90% sammenløp.
- Når du når samløp, passasje celler ved å følge trinnene som er beskrevet nedenfor.
- Fjern mediet og vask cellene med Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS).
- Legg til iPSCs dissosiasjonsreagens (se materialtabell) -500 μL for en brønn med en 6-brønnsplate, 250 μL for en brønn med en 24-brønns plate - og inkuber i 1 min ved 37 ° C.
- Fjern dissosiasjonsreagenset og inkuber cellene tørre i 1 min ved 37 °C.
- Samle cellene ved hjelp av kultur media-1 ml for en brønn med en 6-brønnsplate og 250 μL for en brønn med en 24-brønnsplate i et 15 ml konisk rør og sentrifuge ved 120 x g i 4 minutter.
- Resuspendere celler i kultur media-2 ml for en brønn med en 6-brønnsplate og 500 μL for en brønn med en 24-brønns platesupplert med 10 μM ROCK-hemmer og plate dem på ferske matriksbelagte plater ved 40% konfluens.
2. Differensiering av iPSC til MSC-er
- Klargjør MSC-differensieringsmedier ved å tilsette 15 % føtal bovint serum (FBS) og 1 % P/S til DMEM + pyruvat med lav glukose og oppbevar ved 4 °C.
- Når du har oppnådd 80 % konfluens, bruk iPSCs for dannelse av embryoid legeme (EB) ved å følge trinnene som er beskrevet nedenfor.
- Vask cellene med DPBS og inkuber dem med dissosiasjonsmedium / EDTA-500 μL for en brønn med en 6-brønnsplate, 250 μL for en brønn med en 24-brønnsplate.
- Inkuber ved 37 °C i 1 min, aspirer dissosiasjonsreagenset og hold cellene ved 37 °C i ytterligere 1 min. For å starte MSC-differensiering kreves ~10-12 x 106 celler.
- Samle cellene i et 15 ml konisk rør ved hjelp av kulturmedier. Sørg for å være veldig forsiktig mens du samler for å forhindre at celler blir enkle og tillater EB-dannelse. Sentrifuger cellene ved 120 x g i 4 minutter.
- Resuspender cellene i 3 ml MSC differensieringsmedier inneholdende 10 μM ROCK-hemmer.
- Bland og fordel 0,5 ml/brønn i en 24-brønns ultra-lav festeplate.
MERK: Bruk av ultra-lav festeplate vil oppmuntre celleaggregering i EBs i stedet for deres vedlegg på overflaten. - Legg platen i inkubatoren ved 37 °C.
- Etter 24 timer, indusere de oppnådde EBs med høy retinsyre (RA) behandling ved å følge trinnene som er beskrevet nedenfor.
- Tilsett 10 μM RA til 3 ml MSC-differensieringsmedier. Samle EB-ene i et 15 ml rør og la dem slå seg ned i 15 minutter.
- Fjern supernatanten fra EB-er og tilsett MSC-differensieringsmedier supplert med 10 μM RA.
- Resuspender forsiktig og fordel 0,5 ml / brønn i samme 24-brønns ultra-lave festeplate.
- Legg platen i inkubatoren ved 37 °C. Ikke forstyrr EB de neste 48 timene.
- Etter 48 timer samler du EB i et 15 ml rør og lar dem roe seg ned i 15 minutter.
- Fjern supernatanten fra EB og tilsett MSC-differensieringsmedier supplert med 0,1 μM RA.
- Resuspender forsiktig og fordel 0,5 ml / brønn i samme 24-brønns ultra-lave festeplate.
- Legg platen i inkubatoren ved 37 °C. Ikke forstyrr EB de neste 48 timene.
- Fjern RA-en som er lagt til i cellene, ved å følge trinnene nedenfor.
- Etter 48 timer etter siste RA-behandling, samle EB-ene og la dem roe seg ned i 15 minutter.
- Fjern supernatanten og tilsett DMEM lavt glukosemedium uten cytokiner.
- Resuspender forsiktig og fordel 0,5 ml / brønn i en 24-brønns ultra-lav festeplate. Legg platen i inkubatoren ved 37 °C.
- Plate de iPSCs-avledede EB-ene ved å følge trinnene som er beskrevet nedenfor.
- Etter 48 timer fra forrige trinn (trinn 2.4), samle EB-ene i et 15 ml rør og la dem slå seg ned i 15 minutter.
- Fjern supernatanten og resuspender i 2 ml ferske MSC-differensieringsmedier.
- Overfør til to brønner i en kjellermembranmatrisebelagt 6-brønnsplate.
- Bytt media annenhver dag i ytterligere 5 dager.
- Etter 5 dager, fjern det brukte mediet og erstatt det med et nytt MSC-differensieringsmedium som inneholder 2,5 ng/ml basisk fibroblastvekstfaktor (bFGF).
- Pass de belagte EB-ene når de når 80%-90% samløp, ved å følge trinnene som er beskrevet nedenfor.
- Vask cellene med DPBS, tilsett trypsin-EDTA-500 μL for en brønn med en 6-brønns plate - og inkuber cellene ved 37 ° C i 3 minutter.
- Samle cellene ved hjelp av MSC-differensieringsmedier i et 15 ml konisk rør og spinn ved 750 x g i 4 minutter.
- Resuspender i MSC-differensieringsmedier med 2,5 ng / ml bFGF og plate cellene på kjellermembranmatrisebelagte plater i forholdet 1: 3.
- Gjenta passasjen når cellene når 70% -80% sammenløp. Det forventes å få 3-6 millioner celler ved 2-3 passasjer.
3. Flowcytometrianalyse av iPSCs-avledede MSC-er
MERK: Ved å gjennomgå 2-3 passasjer, bør cellene nås for effektiviteten av MSC-differensiering. Differensiering vil bli ansett som vellykket hvis cellene uttrykker MSC-differensieringsmarkører-CD44, CD73, CD90 og CD105 med mer enn 90% effektivitet, og ikke uttrykker høye nivåer av hematopoietiske markører-CD14, CD19, CD34 og CD45. Effektiviteten til disse markørene kan nås ved å følge trinnene nedenfor.
- Passér cellene ved hjelp av trinnene som er skissert ovenfor (trinn 2.6) og oppnå 1 x 105 celler i en brønn på en v-bunn 96-brønnplate.
- Sentrifuger platen ved 375 x g i 4 minutter ved 4 °C.
- Resuspender 1 x 105 celler i 100 μL kald DPBS med 1 μL konjugert antistoff (Ab) (se materialtabell) og inkuber ved 4 °C i 30-40 minutter og unngå eksponering for lys.
- Resuspender ytterligere 1 x 105 celler i 100 μL kald DPBS med den respektive isotypekontrollen av den konjugerte Ab i en konsentrasjon på 1:100) og inkuber ved 4 ° C i 30-40 minutter og forhindrer eksponering for lys.
- Etter inkubasjon, sentrifuger platen ved 375 x g i 4 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten ved å riste tallerkenen over vasken.
- Resuspender cellene i 100 μL kald DPBS.
- Sentrifuger cellene ved 375 x g i 4 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten.
- Resuspender cellene i 200 μL kald DPBS og samle i mørke, kalde 1,5 ml mikrosentrifugerør og hold dem på is til de analyseres ved fluorescensaktivert cellesortering (FACS).
- For FACS-analyse, distribuer cellene ved hjelp av sidespredt (SSC-A) versus fremoverspredt (FSC-A) for å utelukke rusk. Videre fordeler du de inngjerdede cellene ved hjelp av fremoverspredt høyde (FSC-H) versus fremoverspredt område (FSC-A) for å skille singleter fra dubletter fra populasjonen med levende celler.
MERK: Celler ble inngjerdet i forhold til skiftet av isotypekontroll for hver markør, og minst 10.000 gated hendelser fra hver farget prøve ble brukt til analyse.
4. Differensiering av MSC til adipocytter
- Forbered adipocytdifferensiering basalmedier ved å tilsette 10% knockout serumerstatning (KOSR), 1% glutamin, 1% P / S, 4,5 ng / μL glukose til minimum essensielle medier (MEM) -alfa og lagre ved 4 ° C.
- La MSC-er nå over 90 % sammenløp. Fortsett å dyrke dem i ytterligere 48 timer for å la dem gjennomgå en periode med vekststans.
- Forbered komplette adipocyttdifferensieringsmedier ved å tilsette 100 μg / ml 3-isobutyl-1-metylxanthin (IBMX), 1 mikrom deksametason, 0,2 U / ml insulin, 100 μM indometacin og 10 mikrom rosiglitazon til basalmediet.
- Fjern MSC-differensieringsmedier og vask cellene med DPBS.
- Legg til fullstendig adipocytdifferensieringsmedium-2 ml for en brønn med en 6-brønnsplate og 1 ml for en brønn på en 12-brønnsplate - og inkuber cellene ved 37 ° C. Endre komplette differensieringsmedier annenhver dag i 14 dager.
5. Evaluering av differensieringseffektiviteten av adipocytter
- På dag 14 av differensiering, kontroller effektiviteten av differensiering ved å fargelegge celler for adipocytmodningsmarkører, FABP4 og adiponektin.
- Fjern mediet og vask cellene med DPBS.
- Fest cellene med 4% paraformaldehyd (PFA) - 200 μL til en brønn med en 24-brønnsplate - og inkuber ved romtemperatur i 15 minutter.
- Kast PFA og vask med tris-bufret saltvann med 0,5% tween (TBST) og legg den på en shaker ved romtemperatur i 15 minutter. Gjenta prosessen to ganger.
- Permeabiliser de faste cellene med fosfatbufret saltvann med 0,5% Triton X-100 (PBST) og legg den på en shaker ved romtemperatur i 15-20 min.
- Kast PBST og legg til blokkeringsbufferen (5% -6% bovint serumalbumin (BSA) i PBST) -500 μL for en brønn med en 6-brønnsplate og 250 μL for en brønn med en 12-brønns plate - og inkuber ved romtemperatur på shakeren i 40-60 minutter.
- Fortynn de primære antistoffene mot FABP4, adiponektin i 2% -3% BSA, i en konsentrasjon på 1:500 (se materialtabellen). Tilsett disse antistoffene bare hvis de er oppdratt i forskjellige dyr, og legg platen på shakeren ved 4 ° C, over natten.
- Fjern de primære antistoffene og vask cellene tre ganger med TBST (15 min hver) og legg den på en shaker ved romtemperatur.
- Forbered Alexa Fluor sekundære antistoffer i PBST (1:500). Inkuber cellene i de sekundære antistoffkombinasjonene (i henhold til arten der det primære antistoffet heves) i 60 minutter ved romtemperatur og dekk platen med aluminiumsfolie for å beskytte den mot lys.
- Kast de sekundære antistoffene, vask med TBST tre ganger, og legg platen på shakeren.
- For å flekke kjernene, tilsett 1 μg / ml Hoechst 33342-200 μL for en brønn med en 24-brønns platefortynnet i PBS og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur.
- Kast Hoechst-løsningen og tilsett PBS-500 μL for en brønn med en 24-brønnsplate til cellene. Hold platene dekket fra lys til visualisert ved hjelp av et omvendt fluorescensmikroskop.
6. Sortering av adipocytter ved bruk av Nilrød
- Forbered Nilens røde arbeidsløsning ved å tilsette 1 mg/ml Niloppløsning i DMSO og lagre ved -20 °C. Rett før bruk, tine Nilens røde lager og rekonstituere i DPBS for å oppnå 300 nM arbeidsløsningskonsentrasjon.
- På eller etter dag 14 av adipocytdifferensiering, kast mediet fra cellene og vask med DPBS.
- Tilsett Nilens røde arbeidsløsning -1 ml i en brønn med en 6-brønns plate- og inkuber ved 37 °C i 15 minutter.
- Fjern den Nilrøde oppløsningen og tilsett trypsin-EDTA -500 μL i en brønn med en 6-brønns plate- og inkuber ved 37 °C i 4 minutter.
- Samle cellene ved hjelp av DMEM som inneholder 5% FBS i et 15 ml konisk rør. Sentrifuge ved 750 x g i 4 min.
- Fjern supernatanten og resuspender i DPBS-1 ml for 1 x 106 celler. Sentrifuge ved 750 x g i 4 min.
- Fjern supernatanten og resuspender i DPBS-1 ml for 1 x 106 celler. Bruk en FACS-sortering for å isolere Nilens rødpositive celler ved hjelp av FL1-kanalen.
- Re-kultur de sorterte cellene i adipocytdifferensieringsmedier eller samle de sorterte cellene for RNA og proteinisolering.
- Ekstrahere RNA fra de sorterte cellene og utføre relativ kvantitativ analyse av adipocytdifferensieringsmarkører, inkludert FABP4, PPARG og C / EBPA. Nilens rødpositive celler viser en signifikant oppregulering i genuttrykket på minst to folder sammenlignet med usorterte celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Skjematisk og morfologi av celler under mesenkymal differensiering: Differensiering av iPSC til MSC involverer ulike utviklingsstadier som spenner over EB-dannelse, MSC-differensiering og MSC-utvidelse (figur 1). I løpet av disse utviklingsstadiene får cellene forskjellig morfologi på grunn av de forskjellige stimulerende kjemikaliene de blir utsatt for. Ved initiering av differensiering blir cellene belagt med suspensjon og forventes å være runde, med definerte cellekanter, samtidig som de er små til middels store i diameter (figur 2). Valg av dyrkingsceller i suspensjon i den første fasen av differensiering gjør det mulig å ligne prosessen med naturlig embryonal utvikling, noe som gjør denne fasen svært avgjørende for vellykket differensiering. Fasen av EB-dannelse og RA-behandling etterfølges av plating av EB på kjellermembranmatriksbelagte plater. Levedyktigheten til EB ved plating kan nås ved å observere deres raske spredningsatferd, noe som gir opphav til flere MSC (figur 2). Denne raske spredningsatferden som MSC-er utviser, beholdes selv etter at de er passert på ferske matriksbelagte plater sammen med å beholde særegen, langstrakt morfologi (figur 2).
Kvantitativ vurdering av MSC-overflatemarkører: Differensieringseffektiviteten til MSC er tilgjengelig ved kvantifisering av overflatemarkører som er spesifikke for MSC-differensiering. God differensiering som gir pålitelige MSC-er bør vise mer enn 90 % effektivitet av mesenkymale overflatemarkører CD73, CD44 og CD90 (figur 3A). I tillegg vurderes celler også for fravær av overflatemarkører som viser hematopoietisk fenotype, CD14, CD34 og CD19, og forventes derfor å vise mindre enn 1% uttrykkseffektivitet for dem (figur 3B).
Differensiering av MSC til adipocytter: Differensiering av MSC til adipocytter kan nås ved farging for FABP4 og adiponektin. FABP4 er et cytoplasmatisk protein, og det regnes som en markør for terminalt differensierte adipocytter. Det høye uttrykket blant adipocytter, med cytoplasmatisk fordeling, er et sentralt tegn på deres utviklingsmessige modenhet (figur 4A). I tillegg til FABP4 regnes adiponektin som en av de viktige markørene for adipocyttmodenhet. Det høye uttrykket indikerer at adipocytter er funksjonelle nok til å gjennomgå lipidlagring og adipogenese som respons på glukosesignalering. Å være et sekretorisk protein, utviser adiponektin globulær morfologi med hver proteinkule som lett kan skilles i cytoplasma (figur 4B).
Farging og sortering av modne adipocytter ved bruk av Nilrød: Ved differensiering kan modne adipocytter skilles fra deres umodne kolleger ved farging for Nilrød. Nilrødt binder seg til lipidbærende adipocytter, en egenskap som er eksklusiv for modne adipocytter (figur 5A). Dette, sammen med det fluorescerende lageret som er karakteristisk for Nilrødt, gjør det til et effektivt verktøy for sortering av modne adipocytter ved bruk av fluorescerende aktivert flowcytometri (figur 5B). Effektiv sortering bør resultere i en forbedring av modningsmarkørene PPARG, C/EBPA og FABP4 med minst to ganger, bestemt ved kvantitativ sanntids-PCR (qRT-PCR) (figur5C).
Figur 1: Skjematisk diagram som viser differensiering av iPSC i MSC og adipocytter. iPSC er differensiert til MSC ved hjelp av embryoid body (EB) teknikk. EB-ene utsettes for en kort eksponering på 10 μM av all-trans retinsyre (RA). De genererte MSC-ene er differensiert i 40% -77% adipocytter basert på iPSC-linjen. Nilens røde positive celler sorteres ved hjelp av FACS for å oppnå en renset populasjon av modne adipocytter som kan brukes til å studere adipocytt-assosierte lidelser (sykdomsmodellering), identifisere nye legemidler og til slutt for personlig terapi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Differensiering av iPSC til MSC. Representative morfologiske bilder som viser ulike stadier av MSC-differensiering ved dag 2 (D2), 11 (D11), 15 (D15) og 24 (D24). Embryoide legemer (EB) generert i nærvær av 10 μM RA i 24 timer ble belagt ved dag 8 av differensiering, etterfulgt av dissosiasjon og passasje etter 12-17 dager med differensiering. MSC-ene ble passert flere ganger. Forkortelser: P2 = passasje 2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Ekspresjon av MSC-markører og hematopoietiske markører i iPSC-deriverte MSC-er. Representative flowcytometrihistogrammer som viser uttrykket av MSC-markørene, CD73, CD44 og CD90, (A) og hematopoietiske markører, CD34, CD19 og CD14 (B) i MSC generert fra iPSC-deriverte EBer behandlet med 10 μM RA. X-aksen i grafen representerer den fluorescerende intensiteten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Differensiering av iPSC-deriverte MSC til adipocytter. Immunfargingsbilder som viser uttrykket av FABP4 (A) og adiponektin (ADIPO) (B) i modne adipocytter avledet fra iPSCs. Kjernene ble farget med Hoechst. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Sortering av iPSC-deriverte adipocytter ved bruk av Nilrød. (A) Bilder som viser lyse felt (BF) og Nilen rødfargede modne adipocytter. (B) Kvantifisering av Nilrøde (PE-positive celler) i modne adipocytter ved bruk av FACS. (C) Sanntids PCR-analyse som viser uttrykket av C/EBPA, FABP4 og PPARG i sorterte versus usorterte modne adipocytter. Data er representert som gjennomsnitt ± SD; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen er svært viktig på grunn av dens evne til å levere MSC-er i høy ytelse og effektivitet. Denne masseskalaproduksjonen av MSC-er ble gjort mulig ved forbigående inkubasjon av iPSCs-avledede EB-er med 10 μM RA14,15. Forbigående behandling med 10 μM RA forbedret MSC-utbyttet med 11,2 til 1542 fold14,15, med denne protokollen som gjelder på både iPSCs og hPSCs. Ved denne dosen og behandlingsvarigheten forbedrer RA proliferative og overlevelseskapasiteten til EB-dannende celler ved direkte eller indirekte regulering av ekspresjonen av flere gener involvert i celleproliferasjon, apoptose og cellecelle- og ECM-celleadhesjoner, som er kritiske for overlevelse og spredning av iPSCs14,16. Genene inkluderer, men er ikke begrenset til, transkripsjonsfaktorer (som EGFR4, SOX4), vekstfaktorer og vekstfaktorreseptorer (som IGF2, FGFR4) og adhesjonsmolekyler (som FN1 og CAM). Imidlertid, i motsetning til lave doser (0,1-10 μM), ved høye doser (≥20 μM), regulerer RA negativt proliferasjon og overlevelse av EB-dannende celler, noe som resulterer i redusert PSC-avledet EB-antall og -størrelse og dermed redusert utbytte av MSC14. RA regnes som en proliferasjonshemmer i flere normale differensierte og kreftceller17,18,19. I EB er retinoidsignalering kontekst (tid, konsentrasjon, art og cellelinje)-avhengig; differensielt påvirker selvfornyelse, overlevelse og differensiering av EB-dannende celler ved å regulere distinkte gener og signalveier20,21. Derfor er bruk av RA i optimal tid og konsentrasjon av RA-10 μM på dag 3 av EB-induksjon etterfulgt av dosereduksjon til 0,1 μM på dag 5 i 2 dager som beskrevet i denne protokollen avgjørende for å indusere EB-dannende celleoverlevelse og proliferasjon.
I tillegg til å regulere vekst og overlevelse, utsetter RA de behandlede EBene for differensieringsforsinkelse sammenlignet med celler som ikke behandles med RA14. Faktisk opprettholder RA-behandlede EB-er sin kompakte form etter plettering og klarer ikke å differensiere til MSC-lignende celler, i motsetning til RA-ubehandlede EB-er. Dette stemmer overens med tidligere studier som rapporterer at kortvarig eksponering for RA-behandling hemmer celledifferensiering gjennom undertrykkelse av WNT-signalering21. Videre viste disse RA-behandlede differensieringsforsinkede cellene også forbedret ekspresjon av cadherin og ekstracellulære matriksproteiner14, som er kjent for å spille en viktig rolle i å opprettholde den pluripotente tilstanden til iPSCs16. For å frigjøre den RA-medierte differensieringsblokken, bør EB dissosieres, noe som resulterer i forstyrrende celleadhesjoner og tillater langsiktig MSC-differensiering ved plettering. Interessant nok holdt RA-behandling en differensieringsblokk over celler, men den opprettholdt ikke cellene i en pluripotent tilstand. Faktisk viser de EB-dannende cellene som gjennomgår kortvarig eksponering for 10 μM RA, signifikant redusert ekspresjon av viktige pluripotensmarkører - OCT4, SOX2 og NANOG14.
MSC-ene generert ved kortvarig RA-behandling av EB har vist seg å opprettholde sin typiske fibroblastlignende morfologi med rikelig uttrykk for MSC-overflatemarkører og deres multipotens etter kryopreservering, og dermed gjøre disse masseproduserte MSC-ene lagringsbare for langsiktige ekspansjonsstudier14. Når de utsettes for adipogene, kondrogene og osteogene differensieringsforhold, kan disse MSCene lett differensiere i de tre mesodermale celletypene, noe som gjør dem til en lett oppnåelig kilde for modellering av vevsrelaterte sykdommer14. Dermed gir den stabile og allsidige in vitro-oppførselen til MSC-ene generert av den RA-medierte differensieringsprotokollen dem avgjørende betydning i forsknings- og applikasjonsbaserte innstillinger.
Mens de kondrogene og osteogene differensieringspotensialene til MSC oppnådd fra RA-behandlede EB-er ser ut til å være lik MSCene oppnådd fra ubehandlede EB, ble førstnevnte funnet å vise et forbedret potensial for å differensiere til adipogen avstamning når de ble utsatt for adipogene differensieringsbetingelser14. Dette ble påvist ved en 2- til 3 ganger økning i intracellulær lipidakkumulering (Oil Red O-farging) og adipocyttmarkør FABP4-positive celler i differensieringsbassenget av celler oppnådd etter dyrkning av MSC avledet fra RA-behandlede EBs med adipogene differensieringsmedier, sammenlignet med MSC avledet fra RA-ubehandlede EBs. Dette kan være konsekvensen av reguleringen, av RA, av flere signalveier som styrer adipocyttutvikling som Hippo, WNT og ECM-celleinteraksjonsveier, som avslørt av RNA-sekvenseringsdata fra RA-behandlede og ubehandlede EBs 14,22,23,24,25. Denne forbedrede evnen til RA-avledede MSCer til å gjennomgå adipogen differensiering er verdifull, da tilgjengelige protokoller enten fører til dårlig adipocytutbytte eller benytter seg av genetisk manipulasjon, noe som gjør de genererte adipocytter uvurderlige for å utlede naturlig prosess rekapitulerte adipocytter. Adipocytter er klassifisert i tre typer hvit, brun og beige. Hvite adipocytter klassifiseres ved tilstedeværelse av en enkelt lipiddråpe og spiller en rolle i energilagring. Mens brune adipocytter er involvert i energiforbruk ved substratoksidasjon på grunn av den meget høye overflod av mitokondrier karakterisert ved uttrykket av UCP1. Mens de brune adipocytter som finnes lokalisert i hvitt fettvev er kjent som beige-eller brune-lignende-adipocytter. Disse MSC har potensial til å gi et rikelig utbytte av hvite adipocytter gitt preeksponering av EBs til RA. Tidligere publikasjoner har uttalt selektiv induksjon av iPSC i celler som uttrykker lav UCP1, dvs. hvite adipocytter, i stedet for å eksponere celler med høye UCP1-nivåer til RA26. Tidligere publikasjoner har rapportert at RA produsert fra nevrale kamceller i mus- og sebrafiskembryoer spiller en viktig rolle i dannelsen av hvite adipocytter27,28.
Selv om den RA-baserte protokollen tillot generering av MSC som gir økt utbytte av adipocytter som når 48,5% -77,4% (mot 22,5% -57,6% uten RA-behandling), er det fortsatt problematisk å ikke oppnå >90% når man modellerer multivariant adipocyttbaserte genetiske lidelser in vitro. Faktisk kan det å ikke nå en ren adipocytpopulasjon gjøre resultater som kommer fra multivariantsykdomsmodeller ambivalente, da det ville være vanskelig å skille om de observerte utviklingsforskjellene skyldes de forskjellige genetiske sammensetningene eller på grunn av inkonsekvent differensieringseffektivitet. For å omgå dette problemet var det viktig å sortere de differensierte cellene for å oppnå en pool av rene modne adipocytter, slik at eventuelle forskjeller i fenotyper bare kunne tilskrives iboende genetiske forskjeller. Flere studier har identifisert overflatemarkører på adipocytter som potensielt kan brukes til sortering. For eksempel tillot arbeid utført av Ronald Kahn identifisering av aminosyretransportøren ASC-1 som en ny overflatemarkør på hvite adipocytter29. I tillegg har studier som ekstraherer modne adipocytter fra ortale og subkutane regioner rapportert modne adipocytter for å uttrykke CD34, CD36 og CD59 på overflatene30, hvor CD36 er rapportert å fungere som en fettsyretransportør på overflaten av modne adipocytter31. Imidlertid har disse studiene gjort bruk av heterogene populasjoner av celler avledet fra fettvevet uten å spesifisere ekspresjonen av disse markørene til bare modne adipocytpopulasjoner. Videre kan disse markørene også uttrykkes av andre celletyper og er ikke spesifikke for adipocytter. For eksempel er ASC-1 tilstede på både astrocytter og nevroner32, CD34 er en markør for hematopoietiske stamceller33CD36 er tilstede på blodplater, mononukleære fagocytter, hepatocytter, myocytter og noen epiteler33, og CD59 uttrykkes på endotel- og lymfoide celler34,35. Derfor, som en alternativ løsning, ble Nilrød, den selektive fluorescerende flekken for intracellulære lipider, brukt som en mulig kandidat for sortering av adipocytter. Adipocytter lagrer en betydelig mengde lipider som kan frigjøres og brukes til å produsere energi, bygge membraner eller som signalmolekyler som regulerer metabolisme36. Nilrødt fargestoff har tidligere blitt brukt i flowcytometri og mikroskopi for å flekke adipocytter avledet fra murine og human MSC37. Tidligere studier har rapportert bruk av Nilrød for ESC-avledede adipocytter og forbedring av adipocytter markører etter sortering38. Adipocytter generert fra MSC oppnådd av den nåværende RA-baserte protokollen ble vurdert for deres evne til å bli farget av Nilrød, noe som indikerer deres modenhet, og sortert for å rense dem. Disse Nilens rødsorterte celler viste en to til tre ganger økning i ekspresjonen av adipocytmodningsmarkørene, inkludert PPARG, C/EBPAog FABP4 sammenlignet med usorterte celler, og øker dermed utbyttet av iPSCs-avledede adipocytter ytterligere. Selv om disse markørene uttrykkes før lipidakkumulering, merker deres ekspresjon en celle for terminal differensiering til lipidbærende adipocytter. Ved å sjekke sorteringseffektiviteten ved hjelp av disse markørene kan vi identifisere et basseng der alle celler er ekspresset FABP4, CEBPaog PPARg, som indikerer et basseng, som var forutbestemt for moden adipocyttdannelse. Cellene sorteres basert på fargepotensialet til Nilrødt. Renseeffektiviteten økte med to til tre ganger på grunn av det høye antallet adipocytter i den usorterte fraksjonen. Størrelsen på lipidbærende adipocytter varierer i stor grad under differensiering, hvor en pool av celler med identisk størrelsesfordeling sorteres. Usortert fraksjon omfatter lipidbærende adipocytter, men de er ikke fullt modne og styres av ulik størrelsesandel.
Heterogeniteten til MSC isolert fra menneskekroppen er tidligere rapportert39. Denne heterogeniteten avhenger av flere faktorer, for eksempel MSCs opprinnelse, givere og forhold39. Dette kan føre til variasjoner i effektiviteten i behandlingen av ulike sykdommer. Denne studien antyder at kort RA-behandling av hPSCs produsert under god produksjonspraksis (GMP)-kompatible kulturforhold vil gi en homogen populasjon av MSC. Dette indikerer at den nåværende protokollen er en lovende tilnærming for å generere et stort antall kliniske MSCer som kan brukes til MSC-basert terapi.
Kombinasjonen av den RA-baserte MSC-differensieringsprotokollen som førte til adipocytdifferensiering og Nilens rødsorteringsprotokoll tillot oss å oppnå iPSCs-avledede adipocytter med forbedret uttrykk for funksjonelle markører og økt utbytte og renhet. Dermed vil denne kombinerte protokollen tillate generering, i tilstrekkelig mengde og renhet, av modne adipocytter fra genetisk distinkte individer og potensiell avdekking av nye genetiske varianter bak adipocyttrelaterte metabolske forstyrrelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av et tilskudd fra Qatar National Research Fund (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi ble støttet av GSRA-stipend fra Qatar National Research Fund (QNRF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adiponectin | Abcam | ab22554 | Adipocyte maturation marker |
| anti-CD105 | BD Pharmingen | 560839 | MSC differentiation marker |
| anti-CD14 | BD Pharmingen | 561712 | MSC differentiation marker |
| anti-CD19 | BD Pharmingen | 555415 | MSC differentiation marker |
| anti-CD34 | BD Pharmingen | 555824 | MSC differentiation marker |
| anti-CD44 | abcam | ab93758 | MSC differentiation marker |
| anti-CD45 | BD Pharmingen | 560975 |
MSC differentiation marker |
| anti-CD73 | BD Pharmingen | 550256 | MSC differentiation marker |
| anti-CD90 | BD Pharmingen | 555596 | MSC differentiation marker |
| bFGF | R&D | 233-FP | MSC culture media supplement |
| C/EBPA | Abcam | ab40761 | Adipocyte maturation marker |
| Dexamethasone | Torics | 1126 | Adipocyte differentiation media supplement |
| FABP4 | Abcam | ab93945 | Adipocyte maturation marker |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10082147 | MSC culture media supplement |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050-061 | MSC culture media supplement |
| IBMX | Sigma Aldrich | I5879 | Adipocyte differentiation media supplement |
| Indomethacin | Sigma Aldrich | I7378 | Adipocyte differentiation media supplement |
| Insulin | Sigma Aldrich | 91077C | Adipocyte differentiation media supplement |
| Knockout DMEM | ThermoFisher | 12660012 | Basal media for preparing matrigel |
| Low glucose DMEM | ThermoFisher | 11885084 | MSC culturing media |
| Matrigel | Corning | 354230 | Coating matrix |
| MEM-alpha | ThermoFisher | 12561056 | Adipocyte differentiation media |
| Nilered | Sigma Aldrich | 19123 | Sorting marker for adipocyte |
| Penicillin | ThermoFisher | 15140122 | MSC/Adipocyte media supplement |
| Phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190144 | wash buffer |
| Pierce™ 20X TBS Buffer | Thermo Fisher | 28358 | wash buffer |
| PPARG | Cell Signaling Technology | 2443 | Adipocyte maturation marker |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Dissociation reagent |
| Retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625 | MSC differentiation media supplement |
| Rock inhibitor | Tocris | 1254/10 | hPSC culture media supplement |
| Roziglitazone | Sigma Aldrich | R2408 | Adipocyte differentiation media supplement |
| StemFlex | ThermoFisher | A334901 | hPSC culture media |
| Triton | Thermo Fisher | 28314 | Permebealization reagent |
| Trypsin | ThermoFisher | 25200072 | Dissociation reagent |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7942 | Wash buffer |
References
- Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling: CCS. 9, 12 (2011).
- Wagner, W., et al. Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells. PLoS One. 4 (6), 5846 (2009).
- Brown, P. T., Squire, M. W., Li, W. J. Characterization and evaluation of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells and bone marrow. Cell and Tissue Research. 358 (1), 149-164 (2014).
- Trivedi, P., Hematti, P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Experimental Hematology. 36 (3), 350-359 (2008).
- Barberi, T., Willis, L. M., Socci, N. D., Studer, L. Derivation of multipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells. PLoS Medicine. 2 (6), 161 (2005).
- Xiong, C., et al. Derivation of adipocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (6), 671-675 (2005).
- Cuaranta-Monroy, I., et al. Highly efficient differentiation of embryonic stem cells into adipocytes by ascorbic acid. Stem Cell Research. 13 (1), 88-97 (2014).
- van Harmelen, V., et al. Differential lipolytic regulation in human embryonic stem cell-derived adipocytes. Obesity (Silver Spring). 15 (4), 846-852 (2007).
- Noguchi, M., et al. In vitro characterization and engraftment of adipocytes derived from human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 22 (21), 2895-2905 (2013).
- Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
- Lee, Y. K., Cowan, C. A. Differentiation of white and brown adipocytes from human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 538, 35-47 (2014).
- Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (6), 2459-2483 (2021).
- Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
- Karam, M., Younis, I., Elareer, N. R., Nasser, S., Abdelalim, E. M. Scalable Generation of mesenchymal stem cells and adipocytes from human pluripotent stem cells. Cells. 9 (3), (2020).
- Karam, M., Abdelalim, E. M. Robust and highly efficient protocol for differentiation of human pluripotent stem cells into mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. (2020).
- Li, L., Bennett, S. A., Wang, L. Role of E-cadherin and other cell adhesion molecules in survival and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Adhesion & Migration. 6 (1), 59-70 (2012).
- Lai, L., Bohnsack, B. L., Niederreither, K., Hirschi, K. K. Retinoic acid regulates endothelial cell proliferation during vasculogenesis. Development. 130 (26), 6465-6474 (2003).
- Chanchevalap, S., Nandan, M. O., Merlin, D., Yang, V. W. All-trans retinoic acid inhibits proliferation of intestinal epithelial cells by inhibiting expression of the gene encoding Kruppel-like factor 5. FEBS Letters. 578 (1-2), 99-105 (2004).
- di Masi, A., et al. Retinoic acid receptors: from molecular mechanisms to cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 41, 1 (2015).
- Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Letters. 584 (14), 3123-3130 (2010).
- De Angelis, M. T., Parrotta, E. I., Santamaria, G., Cuda, G. Short-term retinoic acid treatment sustains pluripotency and suppresses differentiation of human induced pluripotent stem cells. Cell Death & Disease. 9 (1), 6 (2018).
- Li, L., Dong, L., Wang, Y., Zhang, X., Yan, J. Lats1/2-mediated alteration of hippo signaling pathway regulates the fate of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2018, 4387932 (2018).
- Moldes, M., et al. Peroxisome-proliferator-activated receptor gamma suppresses Wnt/beta-catenin signalling during adipogenesis. The Biochemical Journal. 376, Pt 3 607-613 (2003).
- Ross, S. E., et al. Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science. 289 (5481), 950-953 (2000).
- Wang, Y. K., Chen, C. S. Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 823-832 (2013).
- Mohsen-Kanson, T., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells into brown and white adipocytes: role of Pax3. Stem Cells. 32 (6), 1459-1467 (2014).
- Billon, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
- Li, N., Kelsh, R. N., Croucher, P., Roehl, H. H. Regulation of neural crest cell fate by the retinoic acid and Pparg signalling pathways. Development. 137 (3), 389-394 (2010).
- Ussar, S., et al. ASC-1, PAT2, and P2RX5 are cell surface markers for white, beige, and brown adipocytes. Science Translational Medicine. 6 (247), (2014).
- Festy, F., et al. Surface protein expression between human adipose tissue-derived stromal cells and mature adipocytes. Histochemistry and Cell Biology. 124 (2), 113-121 (2005).
- Cai, L., Wang, Z., Ji, A., Meyer, J. M., vander Westhuyzen, D. R. Scavenger receptor CD36 expression contributes to adipose tissue inflammation and cell death in diet-induced obesity. PLoS One. 7 (5), 36785 (2012).
- Mesuret, G., et al. A neuronal role of the Alanine-Serine-Cysteine-1 transporter (SLC7A10, Asc-1) for glycine inhibitory transmission and respiratory pattern. Scientific Reports. 8 (1), 8536 (2018).
- Silverstein, R. L., Febbraio, M. CD36, a scavenger receptor involved in immunity, metabolism, angiogenesis, and behavior. Science Signaling. 2 (72), (2009).
- Brooimans, R. A., van Wieringen, P. A., van Es, L. A., Daha, M. R. Relative roles of decay-accelerating factor, membrane cofactor protein, and CD59 in the protection of human endothelial cells against complement-mediated lysis. European Journal of Immunology. 22 (12), 3135-3140 (1992).
- Davies, A., et al. CD59, an LY-6-like protein expressed in human lymphoid cells, regulates the action of the complement membrane attack complex on homologous cells. The Journal of Experimental Medicine. 170 (3), 637-654 (1989).
- Lapid, K., Graff, J. M.
- Aldridge, A., et al. Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells--a direct comparison of four different methods. Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).
- Schaedlich, K., Knelangen, J. M., Navarrete Santos, A., Fischer, B., Navarrete Santos, A. A simple method to sort ESC-derived adipocytes. Cytometry A. 77 (10), 990-995 (2010).
- Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (2), 447-467 (2021).
