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Developmental Biology

Robuste Differenzierung von humanen iPS-Zellen in eine reine Population von Adipozyten zur Untersuchung von Adipozyten-assoziierten Erkrankungen

Published: February 9, 2022 doi: 10.3791/63311
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Diabetes Research Center, Qatar Biomedical Research Institute (QBRI), Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation (QF), 2College of Health and Life Sciences, Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation

Summary

Das Protokoll ermöglicht die Erzeugung einer reinen Adipozytenpopulation aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs). Retinsäure wird verwendet, um iPS-Zellen in mesenchymale Stammzellen (MSCs) zu differenzieren, die für die Produktion von Adipozyten verwendet werden. Anschließend wird ein Sortieransatz auf Basis der Nilrotfärbung verwendet, um reine Adipozyten zu erhalten.

Abstract

Jüngste Fortschritte in der Technologie der induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) haben die Erzeugung verschiedener Zelltypen, einschließlich Adipozyten, ermöglicht. Die derzeitigen Differenzierungsmethoden haben jedoch eine geringe Effizienz und erzeugen keine homogene Population von Adipozyten. Hier umgehen wir dieses Problem, indem wir eine all-trans-retinische Methode verwenden, um mesenchymale Stammzellen (MSCs) in hoher Ausbeute herzustellen. Durch die Regulierung von Signalwegen, die die Zellproliferation, das Überleben und die Adhäsion steuern, ermöglicht unsere Differenzierungsstrategie die effiziente Erzeugung von embryonalen Körperchen (EBs), die sich zu einer reinen Population multipotenter MSCs differenzieren. Die hohe Anzahl von MSCs, die durch diese Methode erzeugt werden, bietet eine ideale Quelle für die Bildung von Adipozyten. Die Heterogenität der Proben, die sich aus der Differenzierung von Adipozyten ergibt, bleibt jedoch eine Herausforderung. Daher haben wir eine Nilrot-basierte Methode zur Reinigung lipidhaltiger reifer Adipozyten mit FACS verwendet. Diese Sortierstrategie ermöglichte es uns, eine zuverlässige Methode zur Modellierung von Adipozyten-assoziierten Stoffwechselstörungen unter Verwendung eines Pools von Adipozyten mit reduzierter Probenheterogenität und verbesserter Zellfunktionalität zu etablieren.

Introduction

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) fungieren als effektive transitorische Ressource für die Produktion von Zellen mesodermalen Ursprungs wie Adipozyten, Osteozyten und Chondrozyten, die für die Modellierung ihrer jeweiligen genetischen Erkrankungen verwendet werden könnten. Bisherige Ansätze beruhten jedoch auf der Gewinnung dieser MSCs aus adulten Geweben 1, was die Herausforderung mit sich brachte, sie in großer Zahl von den Spendern zu erhalten, und die Einschränkung der funktionellen Lebensfähigkeit unter suboptimalen In-vitro-Kulturbedingungen mit sich brachte 1,2. Diese Hindernisse haben zu einem großen Bedarf an einem Protokoll für die Herstellung von MSCs in vitro geführt. Humane induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) können als wertvolle Quelle für MSCs verwendet werden, die MSC-Eigenschaften aufweisen 3,4,5. Aus iPS-Zellen gewonnene MSCs können als therapeutische Option bei verschiedenen Krankheiten eingesetzt werden. Auch die Fähigkeit von aus iPS-Zellen gewonnenen MSCs, Adipozyten zu erzeugen, macht sie zu einem wertvollen In-vitro-Humanmodell zur Untersuchung von menschlicher Adipogenese, Fettleibigkeit und Adipozyten-assoziierten Erkrankungen.

Die derzeitigen Differenzierungsprotokolle von Adipozyten können in zwei Gruppen eingeteilt werden, wobei die eine die Differenzierung der Adipozyten unter Verwendung chemischer oder proteinbasierter Cocktails beinhaltet, die eine resultierende Ausbeute von 30%-60%6,7,8,9 ergeben, während die andere genetische Manipulation zur robusten Induktion von Schlüsseltranskriptionsfaktoren, die die Entwicklung von Adipozyten steuern, beinhaltet, um eine Ausbeute von 80%-90% zu erzielen10. 11. Sonstiges Die genetische Manipulation rekapituliert jedoch nicht den natürlichen Prozess der Adipozytendifferenzierung und verschleiert oft die subtilen Paradigmen, die während der Adipogenese auftreten, was sie für die Modellierung von Krankheiten unwirksam macht12,13. Daher stellen wir eine Möglichkeit vor, chemisch gewonnene reife Adipozyten von unreifen zu sortieren, indem lipidtragende Adipozyten fluoreszenzartig mit Nilrot markiert werden.

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, das die transiente Inkubation von iPS-abgeleiteten Embryoidkörpern (EBs) mit all-trans-Retinsäure beinhaltet, um eine große Anzahl schnell proliferierender MSCs zu produzieren, die zur Erzeugung von Adipozyten verwendet werden könnten14. Wir stellen auch eine Möglichkeit vor, chemisch gewonnene reife Adipozyten aus dem heterogenen Differenzierungspool zu sortieren, indem ihre Lipidtröpfchen mit einem lipophilen Farbstoff fluoreszenzmarkiert werden. Nilrot. Dies würde es ermöglichen, eine reine Population reifer Adipozyten mit verbesserter Funktionalität zu erzeugen, um Adipozyten-assoziierte Stoffwechselstörungen genau zu modellieren.

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Protocol

Die Studie wurde von der zuständigen institutionellen Forschungsethikkommission genehmigt und nach den ethischen Standards durchgeführt, wie sie in der Deklaration von Helsinki von 1964 und ihren späteren Änderungen oder vergleichbaren ethischen Standards festgelegt sind. Das Protokoll wurde vom Institutional Review Board (IRB) der HMC (Nr. 16260/16) und QBRI (Nr. 2016-003) genehmigt. Diese Arbeit ist auch für hES-Zellen wie H1 und H9 optimiert. Die Blutproben wurden von gesunden Personen mit vollständiger Einverständniserklärung entnommen. Die iPS-Zellen werden aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) gesunder Personen gebildet.

1. Kultivierung und Pflege von iPS-Zellen

  1. Bereiten Sie mit Basalmembranmatrix beschichtete Platten vor, indem Sie die Beschichtungsmatrix im Verhältnis 1:80 in Knockout-DMEM rekonstituieren und bei 4 °C lagern.
  2. Bereiten Sie iPS-Nährmedien vor, indem Sie 50 ml 10-fache Stammzell-Ergänzungsmedien zu 500 ml Stammzell-Basalmedium zusammen mit 5 ml 100-fachem Penicillin-Streptomycin (P/S) hinzufügen und bei 4 °C für die kurzfristige Anwendung oder bei -20 °C für die Langzeitanwendung lagern.
  3. Legen Sie die Platten mit einer Beschichtungsmatrix aus - 1 ml für eine 6-Well-Platte, 500 μl für eine 12-Well-Platte, 250 μl für eine 24-Well-Platte - und inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 1-2 h.
  4. Entfernen Sie ein Aliquot der iPS-Nährmedien und wärmen Sie es vor Gebrauch bei Raumtemperatur vor.
  5. Tauen Sie eine Durchstechflasche mit iPS-Zellen (ES-Zellen oder iPS-Zellen) in einem 37 °C-Wasserbad auf und geben Sie sie in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 2-3 ml Nährmedien.
  6. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 120 x g für 4 min bei Raumtemperatur (RT-23 °C).
  7. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 2 ml frisches Nährmedium hinzu, das mit einem 10 μM ROCK-Inhibitor (Y-27632) ergänzt ist. Platten Sie die Zellen in einer Vertiefung einer matrixbeschichteten 6-Well-Platte und platzieren Sie die Platte bei 37 °C.
  8. Entfernen Sie nach 24 Stunden das Medium und ersetzen Sie es durch frische Nährmedien.
  9. Wechseln Sie das Medium jeden Tag, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 % bis 90 % erreichen.
  10. Wenn Sie die Konfluenz erreicht haben, passieren Sie die Zellen, indem Sie die unten beschriebenen Schritte ausführen.
    1. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit der phosphatgepufferten Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco.
    2. iPSCs-Dissoziationsreagenz (siehe Materialtabelle) - 500 μl für eine Vertiefung einer 6-Well-Platte, 250 μl für eine Vertiefung einer 24-Well-Platte - hinzufügen und 1 min bei 37 °C inkubieren.
    3. Entfernen Sie das Dissoziationsreagenz und inkubieren Sie die Zellen trocken für 1 min bei 37 °C.
    4. Sammeln Sie die Zellen mit Nährmedien - 1 ml für eine Vertiefung einer 6-Well-Platte und 250 μl für eine Vertiefung einer 24-Well-Platte - in einem konischen 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie 4 Minuten lang bei 120 x g .
    5. Resuspendieren Sie die Zellen in Nährmedien - 2 ml für eine Vertiefung einer 6-Well-Platte und 500 μl für eine Vertiefung einer 24-Well-Platte, ergänzt mit 10 μM ROCK-Inhibitor, und plattieren Sie sie auf frischen, matrixbeschichteten Platten bei 40% Konfluenz.

2. Unterscheidung von iPSC in MSCs

  1. MSC-Differenzierungsmedien werden durch Zugabe von 15 % fötalem Kälberserum (FBS) und 1 % P/S zu DMEM + Pyruvat mit niedrigem Glukosegehalt hergestellt und bei 4 °C gelagert.
  2. Wenn Sie eine Konfluenz von 80 % erreicht haben, verwenden Sie iPS-Zellen für die Bildung von Embryoidkörpern (EB), indem Sie die unten beschriebenen Schritte befolgen.
    1. Waschen Sie die Zellen mit DPBS und inkubieren Sie sie mit Dissoziationsmedium/EDTA-500 μL für eine Vertiefung einer 6-Well-Platte, 250 μL für eine Vertiefung einer 24-Well-Platte.
    2. 1 min bei 37 °C inkubieren, Dissoziationsreagenz absaugen und die Zellen weitere 1 min bei 37 °C halten. Um mit der MSC-Differenzierung zu beginnen, werden ~10-12 x 106 Zellen benötigt.
    3. Sammeln Sie die Zellen in einem konischen 15-ml-Röhrchen mit Nährmedien. Achten Sie darauf, beim Sammeln sehr vorsichtig zu sein, um zu verhindern, dass die Zellen einzeln werden und die EB-Bildung ermöglicht wird. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 120 x g für 4 min.
    4. Resuspendieren Sie die Zellen in 3 ml MSC-Differenzierungsmedien, die 10 μM ROCK-Inhibitor enthalten.
    5. Mischen und verteilen Sie 0,5 ml/Well in einer 24-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz.
      HINWEIS: Die Verwendung einer extrem niedrigen Bindungsplatte würde die Zellaggregation in EBs fördern, anstatt sich an der Oberfläche anzuheften.
    6. Stellen Sie die Platte bei 37 °C in den Inkubator.
  3. Nach 24 Stunden sind die erreichten EBs mit einer Behandlung mit hoher Retinsäure (RA) zu induzieren, indem Sie die unten beschriebenen Schritte befolgen.
    1. Fügen Sie 10 μM RA zu 3 ml MSC-Differenzierungsmedium hinzu. Sammeln Sie EBs in einem 15-ml-Röhrchen und lassen Sie sie 15 Minuten lang einwirken.
    2. Entfernen Sie den Überstand von EBs und fügen Sie MSC-Differenzierungsmedien hinzu, die mit 10 μM RA ergänzt werden.
    3. Vorsichtig resuspendieren und 0,5 ml/Well in derselben 24-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz verteilen.
    4. Stellen Sie die Platte bei 37 °C in den Inkubator. Stören Sie EBs für die nächsten 48 Stunden nicht.
    5. Sammeln Sie EBs nach 48 Stunden in einem 15-ml-Röhrchen und lassen Sie sie 15 Minuten lang einwirken.
    6. Entfernen Sie den Überstand von EBs und fügen Sie MSC-Differenzierungsmedien hinzu, die mit 0,1 μM RA ergänzt sind.
    7. Vorsichtig resuspendieren und 0,5 ml/Well in derselben 24-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz verteilen.
    8. Stellen Sie die Platte bei 37 °C in den Inkubator. Stören Sie EBs für die nächsten 48 Stunden nicht.
  4. Entfernen Sie die RA, die den Zellen hinzugefügt wurde, indem Sie die unten beschriebenen Schritte ausführen.
    1. Sammeln Sie nach 48 Stunden der letzten RA-Behandlung die EBs und lassen Sie sie 15 Minuten lang einwirken.
    2. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie DMEM-Medien mit niedrigem Glukosegehalt ohne Zytokine hinzu.
    3. Vorsichtig resuspendieren und 0,5 ml/Well in einer 24-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz verteilen. Stellen Sie die Platte bei 37 °C in den Inkubator.
  5. Platten Sie die von iPSCs abgeleiteten EBs, indem Sie die unten beschriebenen Schritte ausführen.
    1. Nach 48 Stunden nach dem vorherigen Schritt (Schritt 2.4) sammeln Sie die EBs in einem 15-ml-Röhrchen und lassen Sie sie 15 Minuten lang einwirken.
    2. Überstand entfernen und in 2 ml frischem MSC-Differenzierungsmedium resuspendieren.
    3. Überführung in zwei Vertiefungen einer mit Basalmembranmatrix beschichteten 6-Well-Platte.
    4. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag für weitere 5 Tage.
    5. Entfernen Sie nach 5 Tagen das verbrauchte Medium und ersetzen Sie es durch ein frisches MSC-Differenzierungsmedium mit 2,5 ng/ml basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF).
  6. Passieren Sie die plattierten EBs, wenn sie eine Konfluenz von 80 % bis 90 % erreichen, indem Sie die unten beschriebenen Schritte ausführen.
    1. Waschen Sie die Zellen mit DPBS, fügen Sie Trypsin-EDTA-500 μL für eine Vertiefung einer 6-Well-Platte hinzu und inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 3 min.
    2. Sammeln Sie die Zellen mit MSC-Differenzierungsmedien in einem konischen 15-ml-Röhrchen und schleudern Sie sie 4 Minuten lang bei 750 x g .
    3. Resuspendierung in MSC-Differenzierungsmedien mit 2,5 ng/ml bFGF und Platte der Zellen auf basalmembranmatrixbeschichteten Platten im Verhältnis 1:3.
    4. Wiederholen Sie die Passage, wenn die Zellen eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreichen. Es wird erwartet, dass es durch 2-3 Passagen 3-6 Millionen Zellen gewinnt.

3. Durchflusszytometrische Analyse von aus iPS-Zellen gewonnenen MSCs

HINWEIS: Nach 2-3 Passagen sollten die Zellen für die Effizienz der MSC-Differenzierung zugänglich gemacht werden. Die Differenzierung gilt als erfolgreich, wenn die Zellen die MSC-Differenzierungsmarker CD44, CD73, CD90 und CD105 mit einer Effizienz von mehr als 90 % exprimieren und keine hohen Mengen an hämatopoetischen Markern CD14, CD19, CD34 und CD45 exprimieren. Auf die Effizienz dieser Marker können Sie zugreifen, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.

  1. Passieren Sie die Zellen mit den oben beschriebenen Schritten (Schritt 2.6) und erhalten Sie 1 x 105 Zellen in einer Vertiefung einer 96-Well-Platte mit V-Boden.
  2. Zentrifugieren Sie die Platte bei 375 x g für 4 min bei 4 °C.
  3. 1 x 105 Zellen in 100 μl kaltem DPBS mit 1 μl konjugiertem Antikörper (Ab) resuspendieren (siehe Materialtabelle) und 30-40 min bei 4 °C inkubieren, um eine Lichtexposition zu vermeiden.
  4. Weitere 1 x 105 Zellen in 100 μl kaltem DPBS mit der entsprechenden Isotypkontrolle des konjugierten Ab in einer Konzentration von 1:100 ) resuspendieren und bei 4 °C für 30-40 min inkubieren, um eine Lichtexposition zu vermeiden.
  5. Nach der Inkubation wird die Platte bei 375 x g für 4 min bei 4 °C zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie den Teller über der Spüle schütteln.
  6. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl kaltem DPBS.
  7. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 375 x g für 4 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand.
  8. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl kaltem DPBS und sammeln Sie sie in dunklen, kalten 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und bewahren Sie sie auf Eis auf, bis sie durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) analysiert werden.
  9. Verteilen Sie die Zellen für die FACS-Analyse mit Seitenstreuung (SSC-A) und Vorwärtsstreuung (FSC-A), um die Ablagerungen auszuschließen. Verteilen Sie die Gated Cells unter Verwendung der vorwärts gestreuten Höhe (FSC-H) im Vergleich zur vorwärts gestreuten Fläche (FSC-A), um Einzellinge von Dubletten aus der lebenden Zellpopulation zu unterscheiden.
    HINWEIS: Die Zellen wurden relativ zur Verschiebung der Isotypkontrolle für jeden Marker gegatet, und für die Analyse wurden mindestens 10.000 Gated Events aus jeder gefärbten Probe verwendet.

4. Differenzierung von MSCs in Adipozyten

  1. Bereiten Sie Basalmedien zur Adipozytendifferenzierung zu, indem Sie 10 % Knockout-Serumersatz (KOSR), 1 % Glutamin, 1 % P/S, 4,5 ng/μl Glukose zu minimalen essentiellen Medien (MEM)-alpha hinzufügen und bei 4 °C lagern.
  2. Ermöglichen Sie es MSCs, eine Konfluenz von über 90 % zu erreichen. Kultivieren Sie sie weitere 48 Stunden, damit sie eine Zeit des Wachstumsstopps durchlaufen können.
  3. Bereiten Sie ein vollständiges Adipozyten-Differenzierungsmedium vor, indem Sie 100 μg/ml 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX), 1 μM Dexamethason, 0,2 U/ml Insulin, 100 μM Indometacin und 10 μM Rosiglitazon zu den Basalmedien hinzufügen.
  4. Entfernen Sie MSC-Differenzierungsmedien und waschen Sie die Zellen mit DPBS.
  5. Fügen Sie ein vollständiges Adipozyten-Differenzierungsmedium hinzu - 2 ml für eine Vertiefung einer 6-Well-Platte und 1 ml für eine Vertiefung einer 12-Well-Platte - und inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C. Wechseln Sie das komplette Differenzierungsmedium 14 Tage lang jeden zweiten Tag.

5. Bewertung der Differenzierungseffizienz von Adipozyten

  1. Überprüfen Sie am 14. Tag der Differenzierung die Effizienz der Differenzierung, indem Sie Zellen auf Adipozytenreifungsmarker, FABP4 und Adiponektin färben.
  2. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit DPBS.
  3. Fixieren Sie die Zellen mit 4%igem Paraformaldehyd (PFA) - 200 μL in einer Vertiefung einer 24-Well-Platte - und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  4. Entsorgen Sie das PFA und waschen Sie es mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,5 % Tween (TBST) und legen Sie es 15 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einen Shaker. Wiederholen Sie den Vorgang zweimal.
  5. Permeabilisieren Sie die fixierten Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 0,5% Triton X-100 (PBST) und legen Sie sie für 15-20 min bei Raumtemperatur auf einen Shaker.
  6. Verwerfen Sie das PBST und fügen Sie den Blockierungspuffer (5%-6% Rinderserumalbumin (BSA) in PBST)-500 μl für eine Vertiefung einer 6-Well-Platte und 250 μl für eine Vertiefung einer 12-Well-Platte hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur auf dem Schüttler für 40-60 Minuten.
  7. Verdünnen Sie die primären Antikörper gegen FABP4, Adiponektin in 2%-3% BSA, in einer Konzentration von 1:500 (siehe Materialtabelle). Fügen Sie diese Antikörper nur zusammen, wenn sie bei verschiedenen Tieren aufgezogen wurden, und legen Sie die Platte über Nacht bei 4 °C auf den Shaker.
  8. Entfernen Sie die primären Antikörper und waschen Sie die Zellen dreimal mit TBST (jeweils 15 Minuten) und legen Sie sie bei Raumtemperatur auf einen Shaker.
  9. Bereiten Sie Alexa Fluor-Sekundärantikörper in PBST (1:500) vor. Inkubieren Sie die Zellen in den sekundären Antikörperkombinationen (je nach Spezies, bei der der primäre Antikörper aufgezogen wird) für 60 min bei Raumtemperatur und decken Sie die Platte mit Alufolie ab, um sie vor Licht zu schützen.
  10. Entsorgen Sie die sekundären Antikörper, waschen Sie sie dreimal mit TBST und legen Sie die Platte auf den Shaker.
  11. Um die Zellkerne zu färben, fügen Sie 1 μg/ml Hoechst 33342-200 μL für eine Vertiefung einer 24-Well-Platte hinzu, die in PBS verdünnt ist, und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  12. Verwerfen Sie die Hoechst-Lösung und geben Sie PBS-500 μL für eine Vertiefung einer 24-Well-Platte zu den Zellen. Halten Sie die Platten vor Licht geschützt, bis sie mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden.

6. Sortierung von Adipozyten mit Nilrot

  1. Bereiten Sie die Nilrot-Arbeitslösung durch Zugabe von 1 mg/ml Nilrot-Stammlösung in DMSO vor und lagern Sie sie bei -20 °C. Tauen Sie den roten Nilstamm unmittelbar vor der Anwendung auf und rekonstituieren Sie ihn in DPBS, um eine Arbeitslösungskonzentration von 300 nM zu erreichen.
  2. Am oder nach dem 14. Tag der Adipozytendifferenzierung wird das Medium aus den Zellen verworfen und mit DPBS gewaschen.
  3. Nilrote Arbeitslösung -1 ml in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte geben und bei 37 °C 15 min inkubieren.
  4. Entfernen Sie die Nilrotlösung und geben Sie Trypsin-EDTA -500 μL in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte und inkubieren Sie sie bei 37 °C für 4 min.
  5. Sammeln Sie die Zellen mit DMEM, das 5 % FBS enthält, in einem konischen 15-ml-Röhrchen. Zentrifugieren bei 750 x g für 4 min.
  6. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie ihn in DPBS-1 ml für 1 x 106 Zellen. Zentrifugieren bei 750 x g für 4 min.
  7. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie ihn in DPBS-1 ml für 1 x 106 Zellen. Verwenden Sie einen FACS-Sortierer, um die rot-positiven Nilzellen mithilfe des FL1-Kanals zu isolieren.
  8. Rekultivieren Sie die sortierten Zellen in Adipozyten-Differenzierungsmedien oder sammeln Sie die sortierten Zellen für die RNA- und Proteinisolierung.
  9. Extrahieren Sie RNA aus den sortierten Zellen und führen Sie eine relative quantitative Analyse von Adipozyten-Differenzierungsmarkern durch, einschließlich FABP4, PPARG und C/EBPA. Die Nilrot-positiven Zellen zeigen eine signifikante Hochregulation der Genexpression um mindestens das Zweifache im Vergleich zu unsortierten Zellen.

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Representative Results

Schematische Darstellung und Morphologie von Zellen während der mesenchymalen Differenzierung: Die Differenzierung von iPS-Zellen in MSCs umfasst verschiedene Entwicklungsstadien, die sich über EB-Bildung, MSC-Differenzierung und MSC-Expansion erstrecken (Abbildung 1). Während dieser Entwicklungsstadien erhalten die Zellen aufgrund der verschiedenen stimulierenden Chemikalien, denen sie ausgesetzt sind, eine unterschiedliche Morphologie. Nach Beginn der Differenzierung werden die Zellen in Suspension plattiert und es wird erwartet, dass sie rund sind, definierte Zellränder aufweisen und einen kleinen bis mittleren Durchmesser haben (Abbildung 2). Die Wahl der Kultivierung von Zellen in Suspension während der Anfangsphase der Differenzierung ermöglicht es, dem Prozess der natürlichen Embryonalentwicklung sehr ähnlich zu sein, was diese Phase für eine erfolgreiche Differenzierung von entscheidender Bedeutung macht. Auf die Phase der EB-Bildung und RA-Behandlung folgt die Beschichtung von EBs auf basalmembranmatrixbeschichteten Platten. Die Lebensfähigkeit von EBs nach der Beschichtung kann durch die Beobachtung ihres schnellen Proliferationsverhaltens erreicht werden, das zu mehr MSCs führt (Abbildung 2). Dieses schnelle Proliferationsverhalten von MSCs bleibt auch nach dem Passieren auf frisch matrixbeschichteten Platten erhalten und behält eine eigentümliche, längliche Morphologie bei (Abbildung 2).

Quantitative Bewertung von MSC-Oberflächenmarkern: Die Differenzierungseffizienz von MSCs wird durch die Quantifizierung von Oberflächenmarkern erreicht, die für die MSC-Differenzierung spezifisch sind. Eine gute Differenzierung, die zuverlässige MSCs hervorbringt, sollte eine Effizienz von mehr als 90 % der mesenchymalen Oberflächenmarker CD73, CD44 und CD90 aufweisen (Abbildung 3A). Darüber hinaus werden die Zellen auch auf das Fehlen von Oberflächenmarkern untersucht, die den hämatopoetischen Phänotyp, CD14, CD34 und CD19 darstellen, und es wird daher erwartet, dass sie eine Expressionseffizienz von weniger als 1 % aufweisen (Abbildung 3B).

Differenzierung von MSCs zu Adipozyten: Die Differenzierung von MSCs zu Adipozyten kann durch Färbung von FABP4 und Adiponektin erreicht werden. FABP4 ist ein zytoplasmatisches Protein und gilt als Marker für terminal differenzierte Adipozyten. Seine hohe Expression unter den Adipozyten mit zytoplasmatischer Verteilung ist ein wichtiges Zeichen für ihre Entwicklungsreife (Abbildung 4A). Neben FABP4 gilt Adiponektin als einer der wichtigen Marker für die Reife von Adipozyten. Seine hohe Expression deutet darauf hin, dass Adipozyten funktionell genug sind, um als Reaktion auf die Glukosesignalisierung eine Lipidspeicherung und Adipogenese zu durchlaufen. Da es sich um ein sekretorisches Protein handelt, weist Adiponektin eine globuläre Morphologie auf, wobei jedes Proteinkügelchen im Zytoplasma leicht zu unterscheiden ist (Abbildung 4B).

Färbung und Sortierung reifer Adipozyten mit Nilrot: Bei der Differenzierung können reife Adipozyten von ihren unreifen Gegenstücken unterschieden werden, indem sie auf Nilrot gefärbt werden. Nilrot bindet an lipidtragende Adipozyten, eine Eigenschaft, die ausschließlich reifen Adipozyten vorbehalten ist (Abbildung 5A). Zusammen mit der fluoreszierenden Eigenschaft von Nilrot macht es dies zu einem effektiven Werkzeug für die Sortierung reifer Adipozyten mittels fluoreszierender aktivierter Durchflusszytometrie (Abbildung 5B). Eine effektive Sortierung sollte zu einer Verbesserung der Reifungsmarker PPARG, C/EBPA und FABP4 um mindestens das Zweifache führen, die durch quantitative real-time PCR (qRT-PCR) bestimmt wird (Abbildung5C).

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Differenzierung von iPS-Zellen in MSCs und Adipozyten. iPS-Zellen werden mit Hilfe der Embryoid Body (EB)-Technik in MSCs differenziert. Die EBs werden einer kurzen Exposition von 10 μM all-trans-Retinsäure (RA) ausgesetzt. Die generierten MSCs werden in 40%-77% Adipozyten differenziert, basierend auf der iPSC-Linie. Die Nilrot-positiven Zellen werden mit FACS sortiert, um eine gereinigte Population reifer Adipozyten zu erhalten, die für die Untersuchung von Adipozyten-assoziierten Erkrankungen (Krankheitsmodellierung), die Identifizierung neuer Medikamente und schließlich für eine personalisierte Therapie verwendet werden kann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Unterscheidung von iPS-Zellen in MS-Zellen. Repräsentative morphologische Bilder, die verschiedene Stadien der MSC-Differenzierung an den Tagen 2 (D2), 11 (D11), 15 (D15) und 24 (D24) zeigen. Embryoide Körperchen (EBs), die in Gegenwart von 10 μM RA für 24 Stunden erzeugt wurden, wurden am 8. Tag der Differenzierung plattiert, gefolgt von Dissoziation und Passage nach 12-17 Tagen der Differenzierung. Die MSCs wurden mehrmals durchquert. Abkürzungen: P2 = Passage 2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Expression von MSC-Markern und hämatopoetischen Markern in iPSC-abgeleiteten MSCs. Repräsentative Durchflusszytometrie-Histogramme, die die Expression der MSC-Marker CD73, CD44 und CD90 (A) und der hämatopoetischen Marker CD34, CD19 und CD14 (B) in den MSCs zeigen, die aus iPSC-abgeleiteten EBs generiert wurden, die mit 10 μM RA behandelt wurden. Die X-Achse im Diagramm stellt die Fluoreszenzintensität dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Differenzierung von iPSC-abgeleiteten MSCs in Adipozyten. Immunfärbungsbilder, die die Expression von FABP4 (A) und Adiponektin (ADIPO) (B) in reifen Adipozyten zeigen, die aus iPS-Zellen stammen. Die Zellkerne wurden mit Hoechst gefärbt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Sortierung von iPSC-abgeleiteten Adipozyten mit Nilrot. (A) Bilder zeigen hellfeld- (BF) und nilrot gefärbte reife Adipozyten. (B) Quantifizierung von Nilrot (PE-positive Zellen) in reifen Adipozyten mittels FACS. (C) Real-Time-PCR-Analyse, die die Expression von C/EBPA, FABP4 und PPARG in sortierten und unsortierten reifen Adipozyten zeigt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Dieses Protokoll ist von größter Bedeutung, da es in der Lage ist, MSCs mit hoher Ausbeute und Effizienz zu liefern. Diese Massenproduktion von MSCs wurde durch die transiente Inkubation von iPSCs-abgeleiteten EBs mit 10 μM RA14,15 ermöglicht. Die transiente Behandlung mit 10 μM RA erhöhte die MSC-Ausbeute um das 11,2- bis 1542-fache14,15, wobei dieses Protokoll sowohl auf iPS-Zellen als auch auf hPS-Zellen anwendbar ist. Bei dieser Dosis und Dauer der Behandlung verbessert RA die Proliferations- und Überlebensfähigkeit EB-bildender Zellen durch direkte oder indirekte Regulierung der Expression mehrerer Gene, die an der Zellproliferation, Apoptose und Zell-Zell- und EZM-Zell-Adhäsion beteiligt sind, die für das Überleben und die Proliferation von iPS-Zellen entscheidend sind14,16. Zu den Genen gehören unter anderem Transkriptionsfaktoren (z. B. EGFR4, SOX4), Wachstumsfaktoren und Wachstumsfaktorrezeptoren (z. B. IGF2, FGFR4) sowie Adhäsionsmoleküle (z. B. FN1 und CAMs). Im Gegensatz zu niedrigen Dosen (0,1-10 μM) reguliert RA bei hohen Dosen (≥20 μM) jedoch die Proliferation und das Überleben von EB-bildenden Zellen negativ, was zu einer reduzierten Anzahl und Größe von PSCs und damit zu einer verringerten Ausbeute an MSCs führt14. RA wird als Proliferationshemmer in mehreren normalen, differenzierten und krebsartigen Zellen angesehen17,18,19. Bei EBs ist die Retinoid-Signalübertragung kontextabhängig (Zeit, Konzentration, Spezies und Zelllinie). Differentielle Beeinflussung der Selbsterneuerung, des Überlebens und der Differenzierung EB-bildender Zellen durch die Regulierung bestimmter Gene und Signalwege20,21. Daher ist die Verwendung von RA in einer optimalen Zeit und Konzentration von RA-10 μM an Tag 3 der EB-Induktion, gefolgt von einer Dosisreduktion auf 0,1 μM an Tag 5 für 2 Tage, wie im vorliegenden Protokoll beschrieben, entscheidend, um das Überleben und die Proliferation EB-bildender Zellen zu induzieren.

Zusätzlich zur Regulierung des Wachstums und des Überlebens unterwirft die RA die behandelten EBs einer Differenzierungsverzögerung im Vergleich zu Zellen, die nicht mit RA14 behandelt wurden. Tatsächlich behalten RA-behandelte EBs nach dem Plattieren ihre kompakte Form bei und differenzieren sich im Gegensatz zu RA-unbehandelten EBs nicht in MSC-ähnliche Zellen. Dies steht im Einklang mit früheren Studien, in denen berichtet wurde, dass eine kurzfristige Exposition gegenüber einer RA-Behandlung die Zelldifferenzierung durch die Unterdrückung des WNT-Signalwegs hemmt21. Darüber hinaus zeigten diese mit RA behandelten Zellen mit verzögerter Differenzierung auch eine erhöhte Expression von Cadherin und extrazellulären Matrixproteinen14, von denen bekannt ist, dass sie eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung des pluripotenten Zustands von iPS-Zellen spielen16. Um den RA-vermittelten Differenzierungsblock zu lösen, sollten EBs dissoziiert werden, was zu einer Störung der Zelladhäsion führt und eine langfristige MSC-Differenzierung nach der Beschichtung ermöglicht. Interessanterweise hielt die Behandlung der rheumatoiellen Arthritis zwar eine Differenzierungsblockade über den Zellen, aber sie hielt die Zellen nicht in einem pluripotenten Zustand. Tatsächlich zeigen die EB-bildenden Zellen, die einer kurzzeitigen Exposition bei 10 μM RA unterzogen werden, eine signifikant reduzierte Expression der wichtigsten Pluripotenzmarker OCT4, SOX2 und NANOG14.

Es wurde gezeigt, dass die MSCs, die durch die kurzfristige Behandlung von EBs mit rheumatoider Arthritis erzeugt werden, ihre typische fibroblastenähnliche Morphologie mit einer reichlichen Expression von MSC-Oberflächenmarkern und ihrer Multipotenz nach der Kryokonservierung beibehalten, wodurch diese massenproduzierten MSCs für Langzeitexpansionsstudien lagerfähig sind14. Wenn sie adipogenen, chondrogenen und osteogenen Differenzierungsbedingungen ausgesetzt wurden, konnten sich diese MSCs leicht in die drei mesodermalen Zelltypen differenzieren, was sie zu einer leicht zugänglichen Quelle für die Modellierung gewebebezogener Krankheiten machte14. Das stabile und vielseitige In-vitro-Verhalten der MSCs, das durch das RA-vermittelte Differenzierungsprotokoll erzeugt wird, verleiht ihnen daher eine überragende Bedeutung in der Forschung und in der Anwendung.

Während die chondrogenen und osteogenen Differenzierungspotentiale von MSCs, die aus RA-behandelten EBs gewonnen wurden, denen der MSCs aus unbehandelten EBs ähnlich zu sein scheinen, zeigte erstere ein erhöhtes Potenzial, sich in eine adipogene Linie zu differenzieren, wenn sie adipogenen Differenzierungsbedingungen ausgesetzt wurden14. Dies zeigte sich in einem 2- bis 3-fachen Anstieg der intrazellulären Lipidakkumulation (Oil Red O-Färbung) und der FABP4-positiven Adipozytenmarker im Differenzierungspool von Zellen, die nach der Kultivierung der MSCs aus RA-behandelten EBs mit adipogenen Differenzierungsmedien im Vergleich zu MSCs aus RA-unbehandelten EBs gewonnen wurden. Dies könnte die Folge der Regulation mehrerer Signalwege durch RA sein, die die Entwicklung von Adipozyten steuern, wie z. B. Hippo-, WNT- und EZM-Zell-Interaktionswege, wie RNA-Sequenzierungsdaten von RA-behandelten und unbehandelten EBs zeigen 14,22,23,24,25. Diese verbesserte Fähigkeit von RA-abgeleiteten MSCs, eine adipogene Differenzierung zu durchlaufen, ist wertvoll, da die derzeit verfügbaren Protokolle entweder zu einer schlechten Adipozytenausbeute führen oder genetische Manipulationen nutzen, die die erzeugten Adipozyten für die Gewinnung von natürlichen, rekapitulierten Adipozyten von unschätzbarem Wert machen. Adipozyten werden in drei Typen eingeteilt: weiß, braun und beige. Weiße Fettzellen werden durch das Vorhandensein eines einzelnen Lipidtröpfchens klassifiziert und spielen eine Rolle bei der Energiespeicherung. Braune Adipozyten hingegen sind aufgrund der sehr hohen Häufigkeit von Mitochondrien, die durch die Expression von UCP1 gekennzeichnet sind, am Energieverbrauch durch Substratoxidation beteiligt. Die braunen Adipozyten, die im weißen Fettgewebe lokalisiert sind, werden als beige- oder braunartige Adipozyten bezeichnet. Diese MSC haben das Potenzial, eine reichliche Ausbeute an weißen Adipozyten zu liefern, wenn man bedenkt, dass EBs vor der RA exponiert sind. Frühere Veröffentlichungen haben eine selektive Induktion von iPSC in Zellen mit niedrigem UCP1-Spiegel, d.h. weißen Adipozyten, festgestellt, anstatt Zellen mit hohen UCP1-Spiegeln RA26 auszusetzen. Frühere Veröffentlichungen haben berichtet, dass RA, die aus Neuralleistenzellen in Maus- und Zebrafischembryonen produziert wird, eine wichtige Rolle bei der Bildung weißer Fettzellen spielt27,28.

Obwohl das RA-basierte Protokoll die Generierung von MSCs ermöglichte, die eine erhöhte Ausbeute an Adipozyten von 48,5 % bis 77,4 % (gegenüber 22,5 % bis 57,6 % ohne RA-Behandlung) ermöglichen, ist das Nichterreichen von >90 % bei der Modellierung multivarianter adipozytenbasierter genetischer Erkrankungen immer noch problematisch in vitro. In der Tat könnte das Nichterreichen einer reinen Adipozytenpopulation die Ergebnisse von multivarianten Krankheitsmodellen ambivalent machen, da es schwierig wäre zu unterscheiden, ob die beobachteten Entwicklungsunterschiede auf die unterschiedliche genetische Ausstattung oder auf inkonsistente Differenzierungseffizienzen zurückzuführen sind. Um dieses Problem zu umgehen, war es wichtig, die differenzierten Zellen zu sortieren, um einen Pool von reinen, reifen Adipozyten zu erhalten, so dass Unterschiede in den Phänotypen nur auf inhärente genetische Unterschiede zurückgeführt werden konnten. Mehrere Studien haben Oberflächenmarker auf Adipozyten identifiziert, die möglicherweise für die Sortierung verwendet werden könnten. So gelang es beispielsweise durch die Arbeit von Ronald Kahn, den Aminosäuretransporter ASC-1 als neuartigen Oberflächenmarker auf weißen Fettzellen zu identifizieren29. Darüber hinaus haben Studien, in denen reife Adipozyten aus omentalen und subkutanen Regionen extrahiert wurden, berichtet, dass reife Adipozyten CD34, CD36 und CD59 auf ihren Oberflächen exprimieren30, in dem CD36 als Fettsäuretransporter auf der Oberfläche reifer Adipozyten fungiert31. In diesen Studien wurden jedoch heterogene Populationen von Zellen verwendet, die aus dem Fettgewebe stammen, ohne die Expression dieser Marker nur für reife Adipozytenpopulationen zu spezifizieren. Darüber hinaus können diese Marker auch von anderen Zelltypen exprimiert werden und sind nicht spezifisch für Adipozyten. Zum Beispiel ist ASC-1 sowohl auf Astrozyten als auch auf Neuronen vorhanden32ist CD34 ein Marker für hämatopoetische Stammzellen33ist CD36 auf Blutplättchen, mononukleären Fresszellen, Hepatozyten, Myozyten und einigen Epithelien vorhanden33, und CD59 wird auf Endothel- und lymphatischen Zellen exprimiert34,35. Daher wurde als alternative Lösung Nilrot, die selektive Fluoreszenzfärbung für intrazelluläre Lipide, als möglicher Kandidat für die Sortierung von Adipozyten verwendet. Adipozyten speichern einen erheblichen Teil der Lipide, die freigesetzt und zur Energiegewinnung, zum Aufbau von Membranen oder als Signalmoleküle zur Regulierung des Stoffwechsels verwendet werden können36. Der Farbstoff Nilrot wurde zuvor in der Durchflusszytometrie und Mikroskopie verwendet, um Adipozyten zu färben, die aus murinen und menschlichen MSCs stammen37. Frühere Studien haben über die Verwendung von Nilrot für ESC-abgeleitete Adipozyten und die Verbesserung von Adipozytenmarkern nach der Sortierung berichtet38. Die Adipozyten, die aus den MSCs generiert wurden, die durch das vorliegende RA-basierte Protokoll erhalten wurden, wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, mit Nilrot gefärbt zu werden, was ihre Reife anzeigt, und sortiert, um sie zu reinigen. Diese in Nilrot sortierten Zellen zeigten eine zwei- bis dreifache Erhöhung der Expression der Adipozyten-Reifungsmarker, darunter PPARG, C/EBPAund FABP4 im Vergleich zu unsortierten Zellen, wodurch die Ausbeute an aus iPS-Zellen gewonnenen Adipozyten weiter erhöht wird. Obwohl diese Marker vor der Lipidakkumulation exprimiert werden, markiert ihre Expression eine Zelle für die terminale Differenzierung zu lipidtragenden Adipozyten. Die Überprüfung der Sortiereffizienz anhand dieser Marker ermöglicht es uns, einen Pool zu identifizieren, in dem alle Zellen exprimiert werden FABP4, CEBPaund PPARg, was auf einen Pool hindeutet, der für die Bildung reifer Adipozyten prädestiniert war. Die Zellen werden nach ihrem Färbepotenzial zu Nilrot sortiert. Die Reinigungseffizienz erhöhte sich aufgrund der hohen Anzahl von Adipozyten in der unsortierten Fraktion um das Zwei- bis Dreifache. Die Größe der lipidtragenden Adipozyten variiert stark während der Differenzierung, bei der ein Pool von Zellen mit identischer Größenverteilung sortiert wird. Die unsortierte Fraktion umfasst lipidtragende Adipozyten, die jedoch noch nicht vollständig ausgereift sind und unterschiedliche Größenverhältnisse aufweisen.

Über die Heterogenität der aus dem menschlichen Körper isolierten MSCs wurde bereits berichtet39. Diese Heterogenität hängt von mehreren Faktoren ab, wie z. B. der MSC-Herkunft, den Spendern und den Bedingungen39. Dies kann zu unterschiedlichen Effizienzen bei der Behandlung verschiedener Krankheiten führen. Diese Studie legt nahe, dass eine kurze Behandlung mit rheumatoider Arthritis von hPSCs, die unter GMP-kompatiblen Kulturbedingungen hergestellt wurden, zu einer homogenen Population von MSCs führen würde. Dies deutet darauf hin, dass das aktuelle Protokoll ein vielversprechender Ansatz ist, um eine große Anzahl von MSCs in klinischer Qualität zu generieren, die für eine MSC-basierte Therapie verwendet werden können.

Die Kombination aus dem RA-basierten MSC-Differenzierungsprotokoll, das zur Adipozytendifferenzierung führt, und dem Nil-Red-Sorting-Protokoll ermöglichte es uns, aus iPSCs gewonnene Adipozyten mit erhöhter Expression funktioneller Marker und erhöhter Ausbeute und Reinheit zu erhalten. Somit würde dieses kombinierte Protokoll die Erzeugung reifer Adipozyten von genetisch unterschiedlichen Individuen in ausreichender Menge und Reinheit und die potenzielle Aufdeckung neuer genetischer Varianten hinter Adipozyten-bedingten Stoffwechselstörungen ermöglichen.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss des Qatar National Research Fund (QNRF) finanziert (Fördernummer NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi wurde durch ein GSRA-Stipendium des Qatar National Research Fund (QNRF) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adiponectin Abcam ab22554 Adipocyte maturation marker
anti-CD105 BD Pharmingen 560839 MSC differentiation marker
anti-CD14 BD Pharmingen 561712 MSC differentiation marker
anti-CD19 BD Pharmingen 555415 MSC differentiation marker
anti-CD34 BD Pharmingen 555824 MSC differentiation marker
anti-CD44 abcam ab93758 MSC differentiation marker
anti-CD45 BD Pharmingen
560975		 MSC differentiation marker
anti-CD73 BD Pharmingen 550256 MSC differentiation marker
anti-CD90 BD Pharmingen 555596 MSC differentiation marker
bFGF R&D 233-FP MSC culture media supplement
C/EBPA Abcam ab40761 Adipocyte maturation marker
Dexamethasone Torics 1126 Adipocyte differentiation media supplement
FABP4 Abcam ab93945 Adipocyte maturation marker
Fetal bovine serum ThermoFisher 10082147 MSC culture media supplement
Glutamax ThermoFisher 35050-061 MSC culture media supplement
IBMX Sigma Aldrich I5879 Adipocyte differentiation media supplement
Indomethacin Sigma Aldrich I7378 Adipocyte differentiation media supplement
Insulin Sigma Aldrich 91077C Adipocyte differentiation media supplement
Knockout DMEM ThermoFisher 12660012 Basal media for preparing matrigel
Low glucose DMEM ThermoFisher 11885084 MSC culturing media
Matrigel Corning 354230 Coating matrix
MEM-alpha ThermoFisher 12561056 Adipocyte differentiation media
Nilered Sigma Aldrich 19123 Sorting marker for adipocyte
Penicillin ThermoFisher 15140122 MSC/Adipocyte media supplement
Phosphate-buffered saline ThermoFisher 14190144 wash buffer
Pierce™ 20X TBS Buffer Thermo Fisher 28358 wash buffer
PPARG Cell Signaling Technology 2443 Adipocyte maturation marker
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872 Dissociation reagent
Retinoic acid Sigma Aldrich R2625 MSC differentiation media supplement
Rock inhibitor Tocris 1254/10 hPSC culture media supplement
Roziglitazone Sigma Aldrich R2408 Adipocyte differentiation media supplement
StemFlex ThermoFisher A334901 hPSC culture media
Triton Thermo Fisher 28314 Permebealization reagent
Trypsin ThermoFisher 25200072 Dissociation reagent
Tween 20 Sigma Aldrich P7942 Wash buffer

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