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Biology

रेस्पिरोमेट्रिक Assays के लिए माउस कंकाल की मांसपेशी से माइटोकॉन्ड्रिया का अलगाव

Published: February 10, 2022 doi: 10.3791/63336
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2, 1, 1,2
1Centro Andaluz de Biología del Desarrollo, CSIC-UPO-JA, Universidad Pablo de Olavide, 2CIBERER, Instituto de Salud Carlos III

Summary

यहां, हम माउस कंकाल की मांसपेशी से माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन करते हैं और माइक्रोप्लेट-आधारित श्वसनमितीय assays का उपयोग करके ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) द्वारा श्वसन के बाद के विश्लेषण का वर्णन करते हैं। इस पाइपलाइन को माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय पर कई पर्यावरणीय या आनुवंशिक हस्तक्षेपों के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।

Abstract

सेल की अधिकांश ऊर्जा ग्लूकोज, फैटी एसिड और अमीनो एसिड के क्षरण के माध्यम से विभिन्न मार्गों से प्राप्त की जाती है जो माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन (OXPHOS) प्रणाली पर अभिसरण करते हैं, जो सेलुलर मांगों के जवाब में विनियमित होता है। लिपिड अणु Coenzyme Q (CoQ) निरंतर ऑक्सीकरण / कमी चक्रों के माध्यम से इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (ETC) में जटिल III में इलेक्ट्रॉनों को स्थानांतरित करके इस प्रक्रिया में आवश्यक है। माइटोकॉन्ड्रिया की स्थिति और, अंततः, सेलुलर स्वास्थ्य का आकलन रेस्पिरोमेट्रिक एसेस का उपयोग करके ईटीसी ऑक्सीजन की खपत को मापकर किया जा सकता है। ये अध्ययन आमतौर पर स्थापित या प्राथमिक सेल लाइनों में किए जाते हैं जिन्हें कई दिनों से सुसंस्कृत किया गया है। दोनों मामलों में, प्राप्त श्वसन पैरामीटर किसी भी दिए गए अंग या ऊतक में सामान्य शारीरिक स्थितियों से विचलित हो सकते हैं।

इसके अतिरिक्त, कंकाल की मांसपेशियों से अलग सुसंस्कृत एकल फाइबर की आंतरिक विशेषताएं इस प्रकार के विश्लेषण को बाधित करती हैं। यह पेपर माउस कंकाल की मांसपेशी से ताजा अलग माइटोकॉन्ड्रिया में श्वसन के विश्लेषण के लिए एक अद्यतन और विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। हम संभावित समस्याओं के समाधान भी प्रदान करते हैं जो प्रक्रिया के किसी भी चरण में उत्पन्न हो सकते हैं। यहां प्रस्तुत विधि को विविध ट्रांसजेनिक माउस मॉडल में ऑक्सीजन की खपत दरों की तुलना करने और दवा उपचार या उम्र बढ़ने या सेक्स जैसे अन्य कारकों के लिए माइटोकॉन्ड्रियल प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है। यह माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक्स चयापचय और विनियमन के बारे में महत्वपूर्ण सवालों का जवाब देने के लिए एक व्यवहार्य तरीका है।

Introduction

माइटोकॉन्ड्रिया सेल 1 में प्राथमिक चयापचय ऑर्गेनेल हैं। ये विशेष झिल्ली-संलग्न ऑर्गेनेल पोषक तत्वों के अणुओं का उपयोग करते हैं ताकि OXPHOS द्वारा एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) के रूप में ऊर्जा का उत्पादन किया जा सके। यह प्रक्रिया ETC2 में रेडॉक्स प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला में दाता अणुओं से इलेक्ट्रॉनों के हस्तांतरण पर निर्भर करती है। CoQ एकमात्र रेडॉक्स-सक्रिय लिपिड है जो अंतर्जात रूप से सभी सेलुलर झिल्ली और परिसंचारी लिपोप्रोटीन में उत्पादित होता है जो एंटीऑक्सिडेंट फ़ंक्शन 3 दिखाता है। यह ईटीसी का एक आवश्यक घटक है, जो एनएडीएच-निर्भर कॉम्प्लेक्स I और FADH2-निर्भर कॉम्प्लेक्स II से इलेक्ट्रॉनों को जटिल III में स्थानांतरित करता है, हालांकि कई अन्य रिडक्टेस माइटोकॉन्ड्रियल कोक्यू को कई सेलुलर चयापचय मार्गों में एक अनिवार्य कदम के रूप में यूबिक्विनॉल में कम कर सकते हैं।

इस प्रक्रिया के दौरान, माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक झिल्ली में एक इलेक्ट्रोकेमिकल प्रोटॉन ग्रेडिएंट बनाया जाता है, जिसे एटीपी सिंथेज़ कॉम्प्लेक्स वी 2 द्वारा जैविक रूप से सक्रिय ऊर्जा में बदल दिया जाता है। नतीजतन, माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता मुख्य रूप से उच्च ऊर्जा आवश्यकताओं वाले ऊतकों को प्रभावित करने वाली रोग संबंधी स्थितियों के असंख्य की ओर ले जाती है- मस्तिष्क, हृदय और कंकाल की मांसपेशियों 6,7। इसलिए, स्वास्थ्य और बीमारी में अपनी भूमिका की जांच करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक्स का सटीक विश्लेषण करने के तरीकों को विकसित करना मौलिक है, विशेष रूप से कंकाल की मांसपेशियों जैसे अत्यधिक ऊर्जावान ऊतकों में।

क्लार्क-प्रकार के ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड का शास्त्रीय रूप से माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन 8 के अध्ययन में उपयोग किया गया है। हालांकि, इस प्रणाली को उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रौद्योगिकियों द्वारा उत्तरोत्तर विस्थापित किया गया है, जिसमें माइक्रोप्लेट-आधारित ऑक्सीजन खपत प्रौद्योगिकियां जैसे कि एजाइलेंट सीहोर्स एक्सएफ विश्लेषक विशेष रूप से लोकप्रिय हैं। कंकाल की मांसपेशियों के क्षेत्र में, ये अध्ययन आमतौर पर सुसंस्कृत कोशिकाओं में आयोजित किए जाते हैं, मुख्य रूप से C2C12 अमर माउस मायोब्लास्ट सेल लाइन या उपग्रह कोशिकाओं से व्युत्पन्न प्राथमिक संस्कृतियों में 10,11। हालांकि, ये अध्ययन विवो में स्थिति को पूरी तरह से याद नहीं करते हैं, खासकर जब माइटोकॉन्ड्रियल जीव विज्ञान की जांच करते हैं और विशिष्ट अपमान, गैर-आनुवंशिक हस्तक्षेप, या आनुवंशिक जोड़तोड़ पर ऊतक स्तर पर कार्य करते हैं।

इसके अलावा, कोशिकाओं में श्वसन assays अतिरिक्त कारकों के कारण अधिक जटिल हैं, जिसमें एटीपी और परख सब्सट्रेट या सिग्नलिंग घटनाओं की अतिरिक्त-माइटोकॉन्ड्रियल मांग शामिल है, जो परिणामों की व्याख्या को गुमराह कर सकती है। वैकल्पिक रूप से, मांसपेशियों से ताजा अलग मायोफाइबर के एकल या बंडलों का उपयोग करना भी संभव है। हालांकि, अलगाव विधि तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है और केवल कुछ मांसपेशियों के प्रकारों के लिए संभव है। इस मामले में, फ्लेक्सर डिजिटोरम ब्रेविस (एफडीबी) और एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस (ईडीएल) मांसपेशियों का उपयोग मुख्य रूप से 10,12,13 किया जाता है, हालांकि कुछ रिपोर्टों में अन्य मांसपेशियों के प्रकारों के साथ-साथ 14,15 के उपयोग का वर्णन किया गया है।

कंकाल की मांसपेशी वर्गों के bioenergetic प्रोफाइलिंग भी रिपोर्ट किया गया है16. इस विधि का प्रमुख लाभ यह है कि बरकरार मांसपेशियों का अध्ययन किया जा सकता है (लेखकों से पता चलता है कि फाइबर के माध्यम से स्लाइसिंग अलग-थलग मायोफाइबर की तुलना में परिणामों को परेशान नहीं करता है)। हालांकि, सब्सट्रेट और परख अवरोधकों के लिए माइटोकॉन्ड्रियल पहुंच सीमित है, और इस प्रकार, केवल कुछ मापदंडों को मापा जा सकता है16। अंत में, अलग-अलग माइटोकॉन्ड्रिया को भी इसी तरह से नियोजित किया जा सकता है9,17,18,19। इस मामले में, माइटोकॉन्ड्रिया अपने साइटोसोलिक वातावरण को खो देता है, जो उनके कार्य को प्रभावित कर सकता है। इसके विपरीत, यह विधि सब्सट्रेट और अवरोधकों तक पहुंच की गारंटी देती है, नमूना प्रकारों की अधिकता के विश्लेषण को सक्षम बनाती है, और आमतौर पर कम सामग्री की आवश्यकता होती है।

यह पेपर माइक्रोप्लेट-आधारित रेस्पिरोमेट्रिक एसेस (चित्रा 1) का उपयोग करके माउस कंकाल की मांसपेशी से अलग माइटोकॉन्ड्रिया के बायोएनर्जेटिक प्रोफाइलिंग को करने की एक विधि का वर्णन करता है। विशेष रूप से, तीन प्रोटोकॉल विस्तृत हैं: युग्मन परख, सीए ETC और OXPHOS मशीनरी के बीच युग्मन की डिग्री का आकलन करने के लिए; इलेक्ट्रॉन प्रवाह परख, ईएफए व्यक्तिगत ईटीसी परिसरों की गतिविधि को मापने के लिए; और बॉक्स परख माइटोकॉन्ड्रियल β ऑक्सीकरण क्षमता निर्धारित करने के लिए. विशेष रूप से, पारंपरिक श्वसनमिति विधियों की तुलना में केवल थोड़ी मात्रा में नमूनों की आवश्यकता होती है। यहां उपयोग किए जाने वाले अलगाव प्रोटोकॉल को कहीं और प्रकाशित विधि से संशोधित किया गया है18।

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Protocol

माउस आवास और ऊतक संग्रह Universidad पाब्लो डी ओलावाइड नैतिकता समिति (सेविला, स्पेन; प्रोटोकॉल 24/04/2018/056 और 12/03/2021/033) द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का उपयोग करके स्पेनिश रॉयल डिक्री 53/2013, यूरोपीय निर्देश 2010/63/EU, और अन्य प्रासंगिक दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था।

1. श्वसन assays के लिए स्टॉक, buffers, और अभिकर्मकों की तैयारी

  1. निम्नलिखित स्टॉक समाधान तैयार करें, जिसे महीनों तक संकेतित तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है। सभी मामलों में ultrapure H2O का उपयोग करें।
    1. 1x PBS तैयार करने के लिए H2O (H2O के 200 mL प्रति 1 गोली) में फॉस्फेट-बफ़र्ड सलाइन (PBS) गोलियों को भंग करें। समाधान को आटोक्लेव करें और इसे कमरे के तापमान (आरटी) पर स्टोर करें।
    2. 1 M NaOH तैयार करने के लिए H2O के 50 mL में NaOH छर्रों के 2 ग्राम भंग.
    3. पीएच अंशांकन के लिए 0.1 M, 1 M, 5 M, और 10 M KOH स्टॉक तैयार करें।
    4. H2O के 70 mL में EDTA का 14.612 g जोड़ें। जब तक pH 8.0 तक नहीं पहुंच जाता है, तब तक NaOH छर्रों को जोड़ें ताकि EDTA पूरी तरह से भंग हो जाए। 100 mL करने के लिए H2O क्वांटम satis (QS) जोड़ें। परिणामी 0.5 M EDTA (pH 8) समाधान को आटोक्लेव करें और इसे RT पर संग्रहीत करें।
    5. H2O के 70 mL में 19 g EGTA जोड़ें। जब तक कि EGTA को पूरी तरह से भंग करने की अनुमति देने के लिए pH 8.0 तक नहीं पहुंच जाता, तब तक NaOH छर्रों को जोड़ें। H2O QS को 100 mL में जोड़ें। परिणामी 0.5 M EGTA (pH 8) समाधान को आटोक्लेव करें और इसे RT पर संग्रहीत करें।
    6. PBS के 98 mL करने के लिए 0.5 M EDTA के 2 mL जोड़ें। RT पर परिणामी 10 mM EDTA/PBS समाधान संग्रहीत करें।
    7. 40 mL H2O में 5.958 g HEPES को भंग करें। H2O के साथ 50 mL के लिए KOH और QS के साथ pH को 7.2 पर समायोजित करें। परिणामी 0.5 M HEPES बफर को 0.45 μm जाल के माध्यम से फ़िल्टर करें और इसे RT पर संग्रहीत करें।
    8. H2O के 50 mL तक में KH2PO4 के 3.402 g को भंग करें। परिणामस्वरूप 0.5 M KH2PO4 समाधान को 0.45 μm जाल के माध्यम से फ़िल्टर करें और इसे RT पर संग्रहीत करें।
    9. H2O के 100 mL तक 9.521 ग्राम निर्जल MgCl2 को भंग करें। परिणामी 1 M MgCl2 समाधान को आटोक्लेव करें और इसे RT पर संग्रहीत करें।
      नोट: के रूप में यह एक exothermic प्रतिक्रिया है, सावधानी के साथ आगे बढ़ें और बर्फ पर MgCl2 भंग.
  2. सब्सट्रेट और अवरोधक स्टॉक समाधान तैयार करें ( तालिका 1 देखें)। एलीकोट और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। फ्रीज-thaw चक्र से बचें। एक अपवाद के रूप में, हमेशा उपयोग से तुरंत पहले पाइरूविक एसिड तैयार करें।
    1. Ultrapure H2O में तैयार करें: 0.5 एम succinate, 0.5 एम पाइरूविक एसिड, 0.5 एम मैलिक एसिड, 100 mM ADP, 1 एम ascorbic एसिड, और 50 mM N, N, N′, N′- tetramethyl-para-phenylene-diamine (TMPD) (प्रकाश से रक्षा)।
    2. 100% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में तैयार करें: 50 mM palmitoyl-L-carnitine, 4 mM rotenone, 20 mM कार्बोनिल साइनाइड-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP), 4 mM oligomycin, और 5 mM Antimycin A।
      नोट: माइक्रोप्लेट कुओं में 0.1% अंतिम DMSO एकाग्रता से अधिक न करें। इसलिए, इस सीमा से नीचे रहने के लिए अत्यधिक केंद्रित स्टॉक समाधान तैयार करें।
  3. प्रयोग के दिन माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव और प्रोटीन परिमाणीकरण के लिए बफर को ताजा तैयार करें। सभी मामलों में ultrapure H2O का उपयोग करें और बर्फ पर सभी buffers रखें जब तक कि अन्यथा कहा न जाए।
    नोट: समय बचाने के लिए, सभी अभिकर्मकों को तौला जा सकता है और पिछले दिन सही तापमान पर उपयुक्त कंटेनरों (जैसे, 15 एमएल ट्यूब) में रखा जा सकता है।
    1. 10% मुक्त फैटी एसिड (एफएफए) बीएसए तैयार करने के लिए, व्युत्क्रम / रोटेटरी व्हील द्वारा एच 2 ओ के 1.5 मिलीलीटर में एफएफए बीएसए के 150 मिलीग्राम को अच्छी तरह से भंग कर दें। फोमिंग से बचने के लिए भंवर न करें।
    2. 1x ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक तैयार करने के लिए, H2O के साथ 5x वाणिज्यिक स्टॉक समाधान को पतला करें और इसे आरटी पर अंधेरे में रखें।
    3. 8x माइटोकॉन्ड्रिया बफर (MB) तैयार करने के लिए, H2O के 15 mL में 4.112 ग्राम सुक्रोज और 763 mg HEPES को भंग करें। pH को 7.2 में समायोजित करें, H2O के साथ 10% FFA BSA और QS के 1.6 mL को 20 mL में जोड़ें।
    4. 20 mL आइसोलेशन बफर 1 (IB1) (प्रति नमूना 4 mL उपयोग किया जाता है) तैयार करने के लिए, H2O के 15 mL में 0.5 M EDTA के 400 μL, D-mannitol के 784 mg, और H2O के 15 mL में 8x MB के 2.5 mL को भंग करें। PH को 7.2 और QS को H2O के साथ समायोजित करें।
    5. आइसोलेशन बफर 2 (IB2) (प्रति नमूना 500 μL उपयोग किया जाता है) के 5 mL तैयार करने के लिए, 0.5 M EGTA के 30 μL, D-mannitol के 196 mg, और H2O के 4 mL में 8x MB के 625 μL को भंग करें। PH को 7.2 और QS को H2O के साथ समायोजित करें।
    6. 5 mL Resuspension Buffer (RB) (प्रति नमूना 200 μL का उपयोग किया जाता है) तैयार करने के लिए, 120 mg सुक्रोज, 191.3 mg D-mannitol, 0.5 M HEPES के 50 μL, और H2O के 4 mL में 0.5 M EGTA के 10 μL को भंग करें। PH को H2O के साथ 7.2 और QS को समायोजित करें।
    7. 2x माइटोकॉन्ड्रियल परख समाधान-1 (MAS-1) तैयार करने के लिए, 1.199 ग्राम सुक्रोज, 2.8 ग्राम मैनीटोल, 0.5 M KH2PO4 का 1 mL, 1 M MgCl2 का 250 μL, 0.5 M HEPES का 200 μL, और H2O के 20 mL में 0.5 M EGTA का 100 μL को भंग करें। H2O के 20 mL में pH को 7.2 और QS को 25 mL में समायोजित करें। लंबी अवधि के लिए, वर्षा से बचने के लिए इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    8. 1x युग्मन परख माध्यम (सीएएम) तैयार करने के लिए, दो अलग-अलग MAS-1-आधारित बफ़र्स तैयार करें: 1) सीए परख उचित के लिए सीएएम + बीएसए, और 2) परख अवरोधकों को तैयार करने के लिए सीएएम-बीएसए। पाइरूवेट: मैलेट अनुपात को हमेशा 10: 1 पर रखें।
      नोट: के रूप में बीएसए इंजेक्शन बंदरगाहों को बंद कर सकते हैं, बीएसए मुक्त सीएएम में अवरोधकों को पतला.
      1. CAM+BSA तैयार करने के लिए, 0.5 M पाइरूविक एसिड के 300 μL, 0.5 M मैलिक एसिड के 30 μL और H2O के 6 mL में 2x MAS-1 के 7.5 mL को पतला करें। pH को 7.2 में समायोजित करें। H2O के साथ 15 mL करने के लिए 10% FFA BSA और QS के 300 μL जोड़ें।
      2. CAM-BSA तैयार करने के लिए, H2O के 2 mL में 0.5 M पाइरूविक एसिड के 120 μL, 0.5 M मैलिक एसिड के 12 μL और 2x MAS-1 के 3 mL को पतला करें। PH को H2O के साथ 7.2 और QS को 6 mL में समायोजित करें।
    9. 1x इलेक्ट्रॉन प्रवाह परख माध्यम (EFAM) तैयार करने के लिए, दोनों BSA युक्त और BSA मुक्त EFAM buffers तैयार करें.
      1. EFAM+BSA तैयार करने के लिए, 0.5 M पाइरूविक एसिड के 300 μL, 0.5 M मैलिक एसिड के 60 μL, 20 mM FCCP के 3 μL और H2O के 6 mL में 2x MAS-1 के 7.5 mL को पतला करें। pH को 7.2 में समायोजित करें। H2O के साथ 15 mL करने के लिए 10% FFA BSA और QS के 300 μL जोड़ें।
      2. EFAM-BSA तैयार करने के लिए, 0.5 M पाइरूविक एसिड के 120 μL, 0.5 M मैलिक एसिड के 24 μL, 20 mM FCCP के 1.2 μL और H2O के 2 mL में 2x MAS-1 के 3 mL को पतला करें। HH को 7.2 और QS को H2O के साथ 6 mL में समायोजित करें।
    10. 1x β-ऑक्सीकरण माध्यम (BOXM) तैयार करने के लिए, BSA-युक्त और BSA-मुक्त BOXM समाधान तैयार करें।
      1. BOXM+BSA तैयार करने के लिए, H2O के 7 mL में 50 mM palmitoyl-L-carnitine के 12 μL, 0.5 M मैलिक एसिड के 30 μL और 2x MAS-1 के 7.5 mL को पतला करें। pH को 7.2 में समायोजित करें। H2O के साथ 15 mL करने के लिए 10% FFA BSA और QS के 300 μL जोड़ें।
      2. BOXM-BSA तैयार करने के लिए, H2O के 2 mL में 50 mM palmitoyl-L-carnitine के 4.8 μL, 0.5 M मैलिक एसिड के 12 μL और 2x MAS-1 के 3 mL को पतला करें। PH को 7.2 और QS को H2O के साथ 6 mL में समायोजित करें।

2. मांसपेशियों विच्छेदन, homogenization, और माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव

  1. बर्फ पर सभी सामग्रियों और बफ़र्स रखें। सुनिश्चित करें कि माइटोकॉन्ड्रिया को नुकसान से बचाने के लिए पूरी प्रक्रिया के दौरान सभी सामग्री बर्फ-ठंडी हैं।
  2. बर्फ पर प्रति नमूना तीन 50 एमएल बीकर रखें, और निम्नलिखित समाधान जोड़ें: बीकर 1 में पीबीएस के 10 मिलीलीटर, बीकर 2 में 10 एमएम ईडीटीए / पीबीएस के 10 एमएल, और बीकर 3 में आईबी 1 के 4 एमएल।
  3. गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन द्वारा माउस euthanize. सीओ 2 इच्छामृत्यु से बचें क्योंकि कंकाल की मांसपेशियां हाइपोक्सिक बन सकती हैं, श्वसन विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप कर सकती हैं।
  4. फर को शेडिंग से रोकने के लिए 70% इथेनॉल के साथ सही हिंडलिंब स्प्रे करें, और कॉर्क विच्छेदन बोर्ड को टेप अंग। बाएं अग्रभाग को भी टेप करें।
  5. घुटने से पैर तक त्वचा के माध्यम से एक बाँझ डिस्पोजेबल स्केलपेल के साथ एक चीरा बनाएं।
  6. टखने के स्तर पर दांतेदार संदंश के साथ त्वचा को पकड़ें और इसे टखने के चारों ओर ठीक कैंची के साथ काट लें।
  7. एक हाथ में ठीक-टिप चिमटी के साथ अंतर्निहित मांसपेशियों से दूर त्वचा को कम करें, जबकि इसे दूसरे हाथ में दांतेदार संदंश के साथ ऊपर खींचें।
  8. टखने से घुटने तक सभी कंकाल की मांसपेशियों को विच्छेदित करें (चित्रा 2)।
    1. ठीक चिमटी और कैंची का उपयोग कर मांसपेशियों के निष्कर्षण की सुविधा के लिए tibialis पूर्वकाल (टीए) मांसपेशी पर सभी संयोजी ऊतक निकालें।
    2. ईडीएल मांसपेशी के चार डिस्टल टेंडन का पता लगाएं और उन्हें पैर की उंगलियों में उनके सम्मिलन के करीब अनुभाग करें। टीए डिस्टल कण्डरा का पता लगाएं और इसे अपने सम्मिलन के करीब काट दें, हमेशा टखने के नीचे।
    3. ढीले सिरों को मुक्त करने के लिए टखने के ऊपर टीए और ईडीएल टेंडन को सावधानीपूर्वक खींचें।
    4. कण्डरा के ढीले सिरों को पकड़ें और मांसपेशियों को मांसपेशियों को बाकी मांसपेशियों और हड्डियों से दूर खींचकर कम करें। प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए ठीक चिमटी या कैंची का उपयोग करें। मायोफाइबर संकुचन से बचने के लिए देखभाल के साथ आगे बढ़ें।
    5. EDL और टीए मांसपेशी के समीपस्थ कण्डरा को घुटने के संपर्क में जितना संभव हो सके काटें।
    6. गैस्ट्रोकेनमियस (जीए) और सोलस मांसपेशी निष्कर्षण के साथ आगे बढ़ने के लिए माउस को उल्टा करें।
    7. दांतेदार संदंश के साथ बाइसेप्स फेमोरिस और जीए के बीच गठित जेब को पकड़ें। इन मांसपेशियों को अलग करने और समीपस्थ जीए कण्डरा की कल्पना करने के लिए ठीक कैंची का उपयोग करें।
    8. ठीक संदंश के साथ Achilles कण्डरा पकड़ो और ध्यान से यह ठीक कैंची के साथ कटौती. जीए और सोलस मांसपेशियों को अंतर्निहित हड्डी से उनके कण्डरा के माध्यम से खींचकर छोड़ दें। समीपस्थ GA कण्डरा को काटें जो इसे अंतर्निहित सोलस के साथ एक साथ मुक्त करता है।
    9. एक ही प्रक्रिया का पालन करते हुए कण्डरा से शेष मांसपेशियों को सावधानीपूर्वक विच्छेदित करें जब तक कि केवल हड्डियां न रह जाएं।
    10. क्वाड्रिसेप्स मांसपेशी को विच्छेदित करने के लिए प्रारंभिक स्थिति में माउस को फिर से पिन करें।
    11. दांतेदार संदंश और ठीक कैंची का उपयोग करके समीपस्थ पक्ष में क्वाड्रिसेप्स पर वसा ऊतक को छोड़ दें।
    12. क्वाड्रिसेप्स और फीमर के बीच ठीक चिमटी डालें और उन्हें हड्डी से मांसपेशियों को अलग करने के लिए फीमर अक्ष के साथ दोनों दिशाओं में ले जाएं।
    13. दांतेदार संदंश के साथ डिस्टल क्वाड्रिसेप्स मांसपेशी कण्डरा को पकड़ें और घुटने के संपर्क में जितना संभव हो सके ठीक कैंची के साथ कण्डरा काट लें।
    14. क्वाड्रिसेप्स को ऊपर खींचें और इसे ठीक कैंची के साथ समीपस्थ सम्मिलन पर मुक्त करें।
  9. बाएँ hindlimb के साथ इस अनुभाग से चरण 4-8 दोहराएँ।
  10. बीकर 1 में पहले और फिर बीकर 2 में सभी मांसपेशियों को कुल्ला।
  11. बीकर 3 में सभी मांसपेशियों को स्थानांतरित करें और बर्फ पर तेज कैंची के साथ सभी मांसपेशियों को बारीकी से कीमा बनाते हैं।
  12. निलंबन को सी ट्यूब (बैंगनी ढक्कन) में स्थानांतरित करें, हमेशा इसे बर्फ में रखें।
  13. कसकर सी ट्यूब को बंद करें और इसे homogenizer की आस्तीन पर उल्टा संलग्न करें। सुनिश्चित करें कि नमूना सामग्री रोटेटर / स्टेटर के क्षेत्र में है। m_mito_tissue_01 नामक 1-मिनट के प्रोग्राम का चयन करें।
  14. होमोजेनेट को दो 2 एमएल प्रीचिल्ड माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में विभाजित करें और एक टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 700 × जी पर सेंट्रीफ्यूज और सेंट्रीफ्यूज को विभाजित करें।
  15. नए 2 एमएल prechilled ट्यूबों के लिए supernatants हस्तांतरण, ध्यान से वसा और गैर homogenized ऊतक से बचने. विखंडन शुद्धता निर्धारण (अंश N) (चित्रा 3) के लिए छर्रों को -80 °C पर संग्रहीत करें।
  16. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 10,500 × ग्राम पर supernatants सेंट्रीफ्यूज।
  17. supernatants नए 2 mL prechilled ट्यूबों के लिए स्थानांतरण और Supernatant नंबर 1 (SN1) के रूप में उन्हें लेबल. विखंडन शुद्धता निर्धारण के लिए उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें (चित्रा 3)।
  18. फिर से निलंबित और बर्फ में IB2 के 500 μL की कुल मात्रा में दोनों छर्रों गठबंधन.
  19. 10,500 पर सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए × जी ।
  20. Supernatant को एक नई 2 mL prechilled ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे Supernatant नंबर 2 (SN2) के रूप में लेबल करें। विखंडन शुद्धता निर्धारण के लिए इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें (चित्रा 3)।
  21. आरबी के 200 μL में अंतिम माइटोकॉन्ड्रियल गोली को फिर से निलंबित कर दिया। प्रोटीन परिमाणीकरण के लिए जल्दी से 10 μL को अलग रखें और तुरंत क्षति को रोकने के लिए शेष माइटोकॉन्ड्रियल निलंबन में 10% एफएफए बीएसए के 10 μL जोड़ें।
  22. ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग कर प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें.
    1. मानक वक्र के लिए, आरबी बफर में एक प्रोटीन की ज्ञात एकाग्रता के सीरियल dilutions के 30 μL तैयार करें। उदाहरण के लिए, 1 मिलीग्राम / एमएल, 0.5 मिलीग्राम / एमएल, 0.25 मिलीग्राम / एमएल, 0.125 मिलीग्राम / एमएल, 0.0625 मिलीग्राम / एमएल, और बीएसए के 0 मिलीग्राम / एमएल का उपयोग करें।
    2. आरबी बफर में माइटोकॉन्ड्रियल नमूनों के 1: 3 और 1: 6 सीरियल dilutions तैयार करें।
    3. एक 96-अच्छी तरह से फ्लैट-बॉटम प्लेट में, पहले प्रति अच्छी तरह से नमूना / मानक के 2.5 μL लोड करें। अगला, प्रत्येक नमूने में 1 M NaOH के 10 μL जोड़ें और अंत में, 1x ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक के 200 μL। अच्छी तरह से मिलाएं, हवा के बुलबुले से बचें। नेत्रहीन जाँच करें कि नमूनों का रंग अंशांकन रेखा के भीतर है। हमेशा तीन प्रतियों में विश्लेषण करें।
    4. अंधेरे में आरटी पर 5 मिनट के लिए प्लेटों को इनक्यूबेट करें, और माइक्रोप्लेट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में 595 एनएम पर अवशोषण पढ़ें।
    5. इस अनुभाग (x-अक्ष) में चरण 22.1 में तैयार किए गए dilutions के संगत प्रोटीन सांद्रता बनाम absorbance मान (y-अक्ष) की साजिश रचकर मानक वक्र की गणना करें।
    6. मानक वक्र के साथ एक्सट्रपोलेशन द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल नमूनों में प्रोटीन की कुल मात्रा की गणना करें।

3. माइक्रोप्लेट-आधारित respirometric assays की तैयारी

  1. अच्छी तरह से अंशांकन बफर के 1 एमएल के साथ प्रयोग से पहले कम से कम 12 ज पर respirometric परख सेंसर हाइड्रेट. 37 डिग्री सेल्सियस (कोई सीओ 2) पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: हाइड्रेटेड सेंसर का उपयोग 72 घंटे तक किया जा सकता है। कारतूस को इस चरण के दौरान सावधानीपूर्वक संभाला जाना चाहिए: यदि कुछ भी सेंसर को छूता है, तो माप संवेदनशीलता प्रभावित हो सकती है।
  2. झूलती बाल्टी माइक्रोप्लेट रोटर और 4 डिग्री सेल्सियस पर इसी microplate एडाप्टर के साथ prechill prechill.
  3. कंप्यूटर को चालू करें, विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें, और वांछित प्रोटोकॉल का चयन करें।
    नोट:: एक क्लिक सुना है जब सॉफ़्टवेयर ऑक्सीजन की खपत को मापने वाले उपकरण से कनेक्ट करता है। हीटिंग सेंसर हरे रंग का होना चाहिए और प्रयोग शुरू होने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर होना चाहिए।
  4. अनुभाग 1 में इंगित शेयरों से अवरोधक समाधान तैयार करें, परख के अनुसार चरण 2 प्रदर्शन किया जा करने के लिए। प्रत्येक समाधान के लिए पर्याप्त मात्रा तैयार करें। संदर्भ के लिए तालिका 1 और तालिका 2 देखें।
  5. प्रत्येक पोर्ट में प्रत्येक अवरोधक की उपयुक्त मात्रा जोड़ें, कारतूस को ऑक्सीजन की खपत मापने वाले उपकरण में डालें, और अंशांकन शुरू करें।
    नोट: कारतूस के लिए अवरोधक जोड़ने और उपकरण में कारतूस डालने में 15-20 मिनट लगते हैं। सुनिश्चित करें कि सही कारतूस घटक पेश किए गए हैं। कारतूस ढक्कन और हाइड्रो बूस्टर को छोड़ दिया जा सकता है जबकि सेंसर कारतूस और उपयोगिता स्थान की आवश्यकता होती है।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए धारा 2, चरण 21 पर 10,500 × जी के केंद्रित माइटोकॉन्ड्रियल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें।
  7. 1x CAM + BSA, 1x EFAM + BSA, या 1x BOXM + BSA के 100 μL में माइटोकॉन्ड्रियल गोली को फिर से निलंबित करें, जो कि किए जाने वाले प्रोटोकॉल पर निर्भर करता है।
  8. इसके अलावा इसी परख माध्यम में एक अंतिम 0.2 μg / μL एकाग्रता के लिए केंद्रित माइटोकॉन्ड्रियल नमूना पतला।
  9. निलंबन के बीज 50 μL (प्रोटीन के कुल 10 μg) बर्फ पर एक prechilled 24 अच्छी तरह से microplate में अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से. पृष्ठभूमि सुधार कुओं में माइटोकॉन्ड्रिया न जोड़ें; केवल इसी परख माध्यम जोड़ें. विखंडन शुद्धता निर्धारण (चित्रा 3) के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर शेष माइटोकॉन्ड्रियल निलंबन को स्टोर करें।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 2,000 × ग्राम पर प्रीचिल्ड प्रीकेटिव सेंट्रीफ्यूज में माइक्रोप्लेट को स्पिन करें। तदनुसार संतुलन के लिए काउंटरवेट।
  11. माइक्रोप्लेट centrifugation के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस पर शेष परख माध्यम गर्म.
  12. centrifugation के बाद, माइक्रोप्लेट को संतुलित करने के लिए 5 मिनट के लिए बेंच पर छोड़ दें। आरटी में अच्छी तरह से प्रति 500 μL की अंतिम मात्रा के लिए गर्म परख माध्यम के 450 μL जोड़ें। इसे धीरे-धीरे और सावधानी से करें, माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने से बचने के लिए कुओं की दीवार में माध्यम को जोड़ें।
  13. ढक्कन के बिना ऑक्सीजन की खपत को मापने वाले उपकरण में माइक्रोप्लेट को तुरंत रखें, और प्रोटोकॉल शुरू करें (तालिका 3)। सुनिश्चित करें कि पहला कदम माइक्रोप्लेट को गर्म करने की अनुमति देने के लिए 10 मिनट का इनक्यूबेशन है।
  14. एक बार प्रयोग समाप्त होने के बाद, कारतूस और माइक्रोप्लेट को हटा दें, उपकरण को बंद कर दें, और विश्लेषण शुरू करें।

4. परिणामों का विश्लेषण

  1. CA और बॉक्स assays के मामले में, निम्न विश्लेषण निष्पादित करें:
    1. रिकॉर्ड nonmitochondrial O2 खपत, जो Antimycin ए और rotenone इंजेक्शन के बाद प्राप्त मूल्यों के माध्य से मेल खाती है।
      नोट: एंटीमाइसिन ए और रोटेनोन क्रमशः जटिल III और I अवरोधक हैं।
    2. बेसल मानों (माप बिंदु 1 और 2) से nonmitochondrial O2 खपत घटाकर बेसल श्वसन की गणना करें।
    3. माइटोकॉन्ड्रियल राज्य III को निर्धारित करने के लिए जटिल वी सब्सट्रेट एडीपी (इंजेक्शन ए) के इंजेक्शन के बाद मूल्यों से गैर-मिटोकॉन्ड्रियल ओ 2 खपत को घटाएं।
    4. माइटोकॉन्ड्रियल राज्य IVo प्राप्त करने के लिए जटिल वी अवरोधक ओलिगोमाइसिन (इंजेक्शन बी) के इंजेक्शन के बाद श्वसन मूल्यों से nonmitochondrial O2 खपत घटाएं।
    5. श्वसन पोस्ट FCCP इंजेक्शन (इंजेक्शन सी) से nonmitochondrial O2 खपत में कटौती करके माइटोकॉन्ड्रियल राज्य IIIu की गणना करें।
      नोट: FCCP एक शक्तिशाली माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन uncoupler है। एटीपी संश्लेषण को इसकी उपस्थिति में दरकिनार कर दिया जाता है, और ईटीसी अधिकतम गतिविधि प्राप्त करता है।
    6. माइटोकॉन्ड्रियल अतिरिक्त क्षमता प्राप्त करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल राज्य IIIu मूल्यों से बेसल श्वसन मूल्यों को घटाएं, जो बढ़ी हुई ऊर्जा मांग के मामले में अतिरिक्त एटीपी उत्पन्न करने की क्षमता है।
    7. श्वसन नियंत्रण अनुपात (आरसीआर) प्राप्त करने के लिए राज्य IVo मूल्यों द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल राज्य IIIu को विभाजित करें।
      नोट:: नकारात्मक या नल RCR मान इंगित करता है कि माइटोकॉन्ड्रियल युग्मन प्रभावित होता है।
  2. EFA के संदर्भ में, निम्न परिकलन करें:
    1. rotenone और Antimycin एक इंजेक्शन (इंजेक्शन ए और सी) के बाद माध्य मूल्य की गणना करके अवशिष्ट गतिविधि प्राप्त करें।
    2. बेसल मानों (माप बिंदु 1 और 2) से अवशिष्ट गतिविधि को घटाकर जटिल I से IV (CI-CIV) गतिविधि की गणना करें।
    3. CII-CIII-CIV गतिविधि प्राप्त करने के लिए CII सब्सट्रेट succinate (इंजेक्शन बी) के इंजेक्शन के बाद के मूल्यों से अवशिष्ट गतिविधि घटाएं।
    4. साइटोक्रोम सी-कम करने वाले एजेंटों, एस्कॉर्बिक एसिड और टीएमपीडी (इंजेक्शन डी) को इंजेक्ट करने के बाद प्राप्त मूल्यों से अवशिष्ट गतिविधि को घटाकर सीआईवी गतिविधि की गणना करें।
  3. उचित निष्कर्ष निकालने के लिए, बार प्लॉट्स का उपयोग करके सभी परिणामों का प्रतिनिधित्व करें, जैसा कि चित्र4 में है।

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Representative Results

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल माउस कंकाल की मांसपेशी से माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के विवो विश्लेषण की अनुमति देता है। विधि की एक रूपरेखा चित्र 1 में दिखाई गई है। हिंडलिंब्स (चित्रा 2) से कंकाल की मांसपेशियों को विच्छेदन करने के बाद, ऊतकों को समरूप किया जाता है और माइटोकॉन्ड्रिया शुद्ध किया जाता है, आइसोटोनिक परिस्थितियों के तहत, सीरियल सेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से। अलगाव प्रक्रिया के दौरान प्राप्त विभिन्न अंशों की शुद्धता का विश्लेषण विभिन्न ऑर्गेनेल मार्करों के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके पश्चिमी धब्बा द्वारा किया जा सकता है। चित्रा 3A अलग-अलग अंशों से सामान्य प्रोटीन प्रोफ़ाइल को दर्शाता है जो अलग-अलग अंशों में अलग-अलग प्रोटीन आबादी दिखाता है।

चित्रा 3 बी से पता चलता है कि सभी माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री माइटोकॉन्ड्रियल अंश में है, जैसा कि बाहरी (VDAC और TOMM20) और आंतरिक (TIMM23) माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली के मार्करों के लिए मजबूत संकेतों से स्पष्ट है, और यहां तक कि न्यूक्लियोइड-संबद्ध प्रोटीन (एमटीएफए) के लिए भी। सभी नाभिक और साइटोस्केलेटन (β-एक्टिन) अंश एन में मौजूद हैं, जो नाभिक और अविच्छिन्न सामग्री का प्रतिनिधित्व करता है (चित्रा 3 सी)। इसके अलावा, अधिकांश एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) (कैलनेक्सिन), प्लाज्मा झिल्ली (Na +/ K +-ATPaseα1), या साइटोप्लाज्म मार्कर (LDHA, HSP70, या AKT) SN1 या SN2 अंशों में रहते हैं, अलगाव के दौरान प्राप्त उच्च शुद्धता को उजागर करते हैं (चित्रा 3 C)। हालांकि, माइटोकॉन्ड्रियल अंश में ईआर संदूषण के कुछ निशान हैं, संभवतः इन ऑर्गेनेल की निकटता के कारण। बाद के श्वसन assays में प्राप्त परिणामों को देखते हुए, यहां वर्णित अलगाव प्रक्रिया अत्यधिक शुद्ध, व्यवहार्य माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी पैदा करती है।

सीए और बॉक्स एसेस दोनों कई सब्सट्रेट्स की उपस्थिति में विभिन्न माइटोकॉन्ड्रियल राज्यों की गणना की अनुमति देते हैं जो विशिष्ट चयापचय मार्गों को उत्तेजित करते हैं। विशेष रूप से, इन assays पाइरूविक एसिड या palmitoyl-L-carnitine क्लोराइड की उपस्थिति में प्रदर्शन कर रहे हैं. पाइरूविक एसिड क्रेब्स चक्र का एक सब्सट्रेट है; मैलिक एसिड एक क्रेब्स चक्र मध्यस्थ और एक एनएडीएच प्रेरक है, जबकि पाल्मिटोइल-एल-कार्निटाइन फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण मार्ग का एक सब्सट्रेट है। (चित्र 4ए, बी)। दोनों assays में, पहली स्थिति है कि मापा जा सकता है बेसल श्वसन दर है, जो सब्सट्रेट की उपस्थिति में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन का प्रतिनिधित्व करता है शुरू में परख माध्यम में जोड़ा. फिर, माइटोकॉन्ड्रियल स्टेट III प्राप्त किया जाता है, जो एडीपी और अकार्बनिक फॉस्फेट से एटीपी उत्पादन का प्रतिनिधित्व करता है, जो एक युग्मित राज्य में अधिकतम श्वसन दिखाता है। इस प्रकार, एडीपी के अतिरिक्त के बाद ऑक्सीजन की खपत में वृद्धि हुई है, जैसा कि चित्र 4 ए, बी में देखा गया है।

इसके अलावा, राज्य IVo ओलिगोमाइसिन द्वारा एटीपी सिंथेज़ के निषेध से जुड़े प्रोटॉन रिसाव को इंगित करता है, जो श्वसन में कमी की ओर जाता है, जैसा कि सीए और बॉक्स ग्राफ (चित्रा 4 ए, बी) में देखा गया है। FCCP के अलावा राज्य IIIu की ओर जाता है, जो अधिकतम श्वसन क्षमता है कि माइटोकॉन्ड्रिया एक uncoupled राज्य में प्रदर्शित कर सकते हैं जब ऑक्सीजन की खपत इन assays में अपने उच्चतम स्तर तक पहुँच जाता है दिखाता है. इन सभी राज्यों की गणना करने के लिए, यह nonmitochondrial श्वसन, जो परख के अंत में प्राप्त किया जाता है जब Antimycin ए और rotenone ऑक्सीडेटिव श्वसन को बाधित करने के लिए इंजेक्ट किया जाता है निर्धारित करने के लिए पहले मौलिक है। जैसा कि चित्रा 4ए, बी में दिखाया गया है, इन मूल्यों को हमेशा बेसल श्वसन से नीचे होना चाहिए और यहां वर्णित इन assays जैसे पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के साथ assays के मामले में शून्य के बहुत करीब होना चाहिए। अंत में, आरसीआर पैरामीटर की गणना माइटोकॉन्ड्रियल अखंडता का आकलन करने के लिए की जानी चाहिए। यह दर्शाता है कि क्या माइटोकॉन्ड्रिया कम प्रोटॉन रिसाव के साथ उच्च दर पर एटीपी का उत्पादन करके एडीपी पर प्रतिक्रिया कर सकता है। सीए और बॉक्स assays में पाया औसत RCR मान क्रमशः 5.78 ± 1.03 और 3.47 ± 0.42 (चित्रा 4A, B) थे, जो पहले 21,22,23,24 की रिपोर्ट किए गए इष्टतम RCRs के साथ समझौते में हैं।

इसके अतिरिक्त, EFA व्यक्तिगत रूप से या विशिष्ट substrates और inhibitors (चित्रा 4C) के इंजेक्शन के माध्यम से संयोजन में ETC परिसरों की गतिविधि की जांच करता है। सीआई-सीआईवी गतिविधि पाइरूवेट और मैलेट सब्सट्रेट के आधार पर माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन का प्रतिनिधित्व करती है जब कोई कॉम्प्लेक्स बाधित नहीं होता है; इस मामले में, अधिकांश इलेक्ट्रॉन सीआई के माध्यम से जाते हैं। चूंकि रोटेनोन सीआई का एक विशिष्ट अवरोधक है, सीआई को इसके अतिरिक्त के बाद अवरुद्ध कर दिया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप ऑक्सीजन की खपत में कमी आती है (चित्रा 4 सी)। सीआईआई-सीआईआईआई-सीआईवी गतिविधि श्वसन दिखाती है जब केवल सीआई अवरुद्ध हो जाता है, और सीआईआई सक्रिय होता है: पोर्ट बी के माध्यम से इंजेक्ट किया गया सक्सिनेट, जटिल II (सक्सिनेट डिहाइड्रोजनेज) का एक विशिष्ट सब्सट्रेट है। इस प्रकार, सीआईआई को कम कर दिया जाता है, सीआईआई से सीआईवी तक इलेक्ट्रॉन प्रवाह शुरू होता है, जबकि सीआई अभी भी पिछले रोटेनोन इंजेक्शन द्वारा बाधित होता है, जिससे ऑक्सीजन की खपत में वृद्धि होती है (चित्रा 4 सी)। एंटीमाइसिन ए इसके अलावा सीआईआईआई को रोकता है, ईटीसी के माध्यम से इलेक्ट्रॉन प्रवाह को अवरुद्ध करता है और ऑक्सीजन की खपत को कम करता है। इसके अलावा, सीआईवी गतिविधि तब निर्धारित की जाती है जब इसे साइटोक्रोम सी ऑक्सीकरण द्वारा उत्तेजित किया जाता है, जब एस्कॉर्बिक एसिड / टीएमपीडी के अलावा कम होने के बाद; चित्रा 4C से पता चलता है कि CIV सक्रियण ऑक्सीजन की खपत में वृद्धि का उत्पादन करता है। अंत में, अवशिष्ट गतिविधि ऑक्सीजन की खपत को संदर्भित करती है जब ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन श्रृंखला रोटेनोन और एंटीमाइसिन ए के अलावा के बाद निष्क्रिय हो जाती है। यह मान अनुभाग 4 में प्रोटोकॉल चरणों 2.2-2.4 में इंगित के रूप में complexes की गतिविधि की गणना के लिए पृष्ठभूमि स्थापित करता है।

Figure 1
चित्रा 1: विधि का योजनाबद्ध विज़ुअलाइज़ेशन. संक्षेप: OCR = ऑक्सीजन की खपत दर; ADP = एडेनोसिन डाइफॉस्फेट; OL = oligomycin; FCCP = कार्बोनिल साइनाइड-पी-trifluoromethoxyphenylhydrazone; AntA = Antimycin A; Rot = rotenone कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन विश्लेषण के लिए हिंडलिम्ब्स से मुरीन कंकाल की मांसपेशियों का विच्छेदन और अलगाव। (ए) दाएं हिंडलिंब को टेप के साथ फैलाया और स्थिर किया गया था। (बी) टखने के बगल से त्वचा के माध्यम से एक चीरा बनाया गया था, घुटने के समीपस्थ को रोक दिया गया था। टीए overlying संयोजी ऊतक ध्यान से हटा दिया गया था. ईडीएल (सी) और टीए (डी) टेंडन को उनके सम्मिलन के करीब विभाजित किया गया था। टीए कण्डरा को अंतर्निहित मांसपेशियों और हड्डी से दूर मांसपेशियों को कम करने के लिए खींचा गया था। फिर, टीए को समीपस्थ रूप से काट दिया गया था, टिबिया के लिए वेंट्रल शिखा के करीब। इसी तरह, ईडीएल मांसपेशी को दूर कर दिया गया था, और समीपस्थ कण्डरा को घुटने के किनारे पर सावधानीपूर्वक काट दिया गया था। (च) टीए और ईडीएल विच्छेदन के बाद दाएं हिंडलिंब। (जी) पीछे के हिंडलिंब में, अकिलीज़ कण्डरा को जीए और सोलस मांसपेशियों को विच्छेदित करने के लिए विभाजित किया गया था। (एच) जीए और सोलस को टिबियल हड्डी से सावधानीपूर्वक मुक्त किया गया था। (I) शेष मांसपेशियों को टखने से घुटने तक एकत्र किया गया था जब तक कि केवल फाइबुला और टिबियल हड्डियां नहीं रह गईं। (जे) विच्छेदन के बाद हिंडलिंब। (के) क्वाड्रिसेप्स को विच्छेदित किया गया था। (एल) सभी कंकाल की मांसपेशियों को पीछे के माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव के लिए एकत्र किया जाता है। यह प्रक्रिया दोनों hindlimbs के लिए किया गया था। संक्षिप्त रूप: टीए = टिबियलिस पूर्वकाल; ईडीएल = एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस; GA = gastrocnemius कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: विखंडन प्रक्रिया की शुद्धता। (A) सामान्य प्रोटीन प्रोफ़ाइल कूमासी नीले रंग से सना हुआ है। (बी) माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन शुद्धता प्रोफ़ाइल। (सी) Nonmitochondrial मार्करों. माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव के दौरान प्राप्त विभिन्न अंशों को लोड किया गया था और विशिष्ट उपकोशिकीय अंशों में विभिन्न प्रोटीनों के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया था। संक्षेप: भिन्न एन = गैर homogenized ऊतक और नाभिक; SN1 = supernatant संख्या 1: साइटोप्लाज्म + ऑर्गेनेल; SN2 = supernatant संख्या 2: साइटोप्लाज्म + ऑर्गेनेल; VDAC = वोल्टेज-निर्भर अनियन चैनल; TOMM20 = बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली 20 के ट्रांसलोकेस; mtTFA = माइटोकॉन्ड्रियल प्रतिलेखन कारक ए; TIMM23 = आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली 23 का ट्रांसलोकेस; LDHA = लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज ए; HSP70 = गर्मी सदमे प्रोटीन 70; ईआर = एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि परिणाम. माइटोकॉन्ड्रिया की बायोएनर्जेटिक प्रोफाइलिंग 13 महीने पुराने पुरुष जंगली प्रकार C57BL / 6N माउस की हिंडलिंब मांसपेशियों से अलग है। विभिन्न substrates और inhibitors के इंजेक्शन अंक प्रत्येक परख में संकेत दिया जाता है. ETC और OXPHOS मशीनरी के प्रदर्शन पाइरूवेट और मैलेट, या palmitoyl-L-carnitine और malate युग्मन परख (ए) या β-ऑक्सीकरण में substrates के रूप में क्रमशः का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है। (सी) इलेक्ट्रॉन प्रवाह परख पाइरूवेट, मैलेट और एफसीसीपी की उपस्थिति में व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रियल परिसरों के अध्ययन की अनुमति देता है; माइटोकॉन्ड्रिया के 10 μg प्रति अच्छी तरह से चढ़ाया गया था। परिणाम एक समेकित रूप में परिणामों को विज़ुअलाइज़ करने के लिए मध्य-बिंदु प्रतिनिधित्व विकल्प के बाद प्रदर्शित होते हैं। यह बिंदु-से-बिंदु विकल्प के विपरीत है, जो आमतौर पर प्रत्येक माप चरण के दौरान किए जाने वाले 9 लगातार मापों के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम करेगा। विज़ुअलाइज़ेशन के प्रकार विश्लेषण सॉफ्टवेयर में काइनेटिक लाइन चार्ट विकल्पों के तहत परख को पूरा करने के बाद बदला जा सकता है। संक्षिप्त रूप: FA = फैटी एसिड; OCR = ऑक्सीजन की खपत दर; ADP = एडेनोसिन डाइफॉस्फेट; FCCP = कार्बोनिल साइनाइड-पी-trifluoromethoxyphenylhydrazone; RCR = श्वसन नियंत्रण अनुपात; EFA = इलेक्ट्रॉन प्रवाह परख; BOX = FA का β-ऑक्सीकरण। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

युग्मन परख
बंदरगाह अवरोधक [स्टॉक] [इंजेक्शन पोर्ट] [अंतिम] नुस्खा
Inhib CAM-BSA
एक ADP 100 mM 50 mM 5 mM 650 μL 650 μL
B ऑलिगोमाइसिन 4 mM 31.6 μM 3.16 μM 11.3 μL 1418.7 μL
C FCCP 20 mM 60 μM 6 μM 4.68 μL 1555.32 μL
D एंटीमाइसिन ए / / रोटेनोन 5 mM // 4 mM 40 μM // 50 μM 4 μM // 5 μM 13.52 μL // 21.12 μL 1655.36 μL
इलेक्ट्रॉन प्रवाह परख
बंदरगाह अवरोधक [स्टॉक] [इंजेक्शन पोर्ट] [अंतिम] नुस्खा
Inhib EFAM-BSA
एक रोटेनोन 4 mM 50 μM 5 μM 16.25 μL 1283.7 μL
B Succinate 500 mM 100 mM 10 mM 286 μL 1144 μL
C एंटीमाइसिन A 5mM 4 μM 4 μM 12.48 μL 1547.5 μL
D Ascorbate // TMPD 1 M // 50 mM 100 mM // 1 mM 10 mM // 100 μM 169 μL // 33.8 μL 1487.2 μL
β ऑक्सीकरण परख
बंदरगाह अवरोधक [स्टॉक] [इंजेक्शन पोर्ट] [अंतिम] नुस्खा
Inhib बॉक्स-बीएसए
एक ADP 100 mM 40 mM 4 mM 520 μL 780 μL
B ऑलिगोमाइसिन 4 mM 31.6 μM 3.16 μM 11.3 μL 1418.7 μL
C FCCP 20 mM 60 μM 6 μM 4.68 μL 1555.32 μL
D एंटीमाइसिन ए / / रोटेनोन 5 mM // 4 mM 40 μM // 20 μM 4 μM // 2 μM 13.52 μL // 8.45 μL 1668 μL

तालिका 1: विभिन्न assays के लिए अवरोधक समाधान की तैयारी. [स्टॉक] कॉलम अवरोधक स्तंभ में इंगित यौगिक के स्टॉक समाधानों की सांद्रता को दर्शाता है। [इंजेक्शन पोर्ट] कारतूस के विभिन्न बंदरगाहों में लोड किए जाने वाले अवरोधक समाधानों की एकाग्रता को संदर्भित करता है, जबकि [अंतिम] स्तंभ कुओं में अवरोधकों की अंतिम एकाग्रता को इंगित करता है। अंत में, नुस्खा कॉलम स्टॉक अवरोधक समाधान और बीएसए-मुक्त मीडिया की मात्रा निर्दिष्ट करते हैं जिन्हें इंजेक्शन पोर्ट में लोड किए जाने वाले समाधान तैयार करने के लिए मिश्रित किया जाना चाहिए। संक्षेप: ADP = एडेनोसिन डाइफॉस्फेट; FCCP = कार्बोनिल साइनाइड-पी-trifluoromethoxyphenylhydrazone; TMPD = N, N,N′, N′-tetramethyl-para-phenylene-diamine; Inhib = अवरोधक; बीएसए = गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन; कैम-बीएसए = बीएसए मुक्त युग्मन परख माध्यम; EFAM-BSA = BSA मुक्त इलेक्ट्रॉन प्रवाह परख माध्यम; बॉक्स-बीएसए = बीएसए-मुक्त β-फैटी एसिड परख माध्यम का ऑक्सीकरण।

बंदरगाह मात्रा इंजेक्ट की गई स्टॉक तैयार (26 कुओं)
एक 50 μL 1300 μL
B 55 μL 1430 μL
C 60 μL 1560 μL
D 65 μL 1690 μL

तालिका 2: इंजेक्शन वॉल्यूम की गणना।

क्रिया समय (मिनट) दोहराव बंदरगाह
जांचना 15-20
ज़रा रुको 10
मिश्रण + प्रतीक्षा करें 1 + 3 × 2
मिलाना 1
उपाय + मिश्रण 3 + 1 × 2
चढा एक
मिलाना 1
माप 3
मिलाना 1
चढा B
मिलाना 1
माप 3
मिलाना 1
चढा C
मिलाना 1
माप 3
मिलाना 1
चढा D
मिश्रण + उपाय 1 + 3 × 2

तालिका 3: विभिन्न assays के लिए प्रोटोकॉल सेटिंग्स.

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Discussion

माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी तरीकों की अपनी सीमाएं हैं; इसलिए, उस विधि का चयन करना महत्वपूर्ण है जो एक विशिष्ट प्रयोगात्मक प्रश्न के लिए सबसे अच्छा है। यह काम माउस कंकाल की मांसपेशी से माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने के लिए माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने के लिए एक अद्यतन और विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है ताकि माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन की जांच करने के लिए विभिन्न श्वसन assays प्रदर्शन किया जा सके। दरअसल, माइक्रोप्लेट-आधारित प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके पृथक माइटोकॉन्ड्रिया में माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक्स का अध्ययन पुनरुत्पादन, विश्वसनीयता और जटिलता के संदर्भ में ऊतक-विशिष्ट श्वसन का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान है। इसके अलावा, पृथक माइटोकॉन्ड्रिया का उपयोग सब्सट्रेट उपलब्धता पर नियंत्रण प्रदान करता है, जिससे अंतर्निहित जैविक प्रक्रियाओं की समझ को सुविधाजनक बनाया जा सकता है। पृथक माइटोकॉन्ड्रिया का उपयोग करने का एक और सकारात्मक पहलू यह है कि राज्य III का अध्ययन करना संभव है क्योंकि एडीपी इंजेक्शन के बाद उत्पन्न एटीपी को फिर से नए एडीपी में परिवर्तित नहीं किया जाता है क्योंकि अधिकांश ट्रांसमेम्ब्रेन एटीपी खो जाते हैं। इसके अलावा, यहां वर्णित assays में, oligomycin संभावित nonspecific एटीपी संश्लेषण 20 को अवरुद्ध करने के लिए जोड़ा जाता है।

इस प्रोटोकॉल के लिए कई महत्वपूर्ण विचारों पर प्रकाश डाला जाना चाहिए। सबसे पहले, अलग-थलग माइटोकॉन्ड्रिया बेहद संवेदनशील हैं और उन्हें देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए। उपयोग किए जाने वाले बफ़र्स में सुक्रोज और मैनीटोल की उच्च सामग्री अलग-थलग माइटोकॉन्ड्रिया को नुकसान से बचाने के लिए इष्टतम आसमाटिक स्थितियों को सुनिश्चित करती है। फिर भी, परख अवधि को माइटोकॉन्ड्रियल व्यवहार्यता को संरक्षित करने और एक बार बीज ति माइक्रोप्लेट से टुकड़ी को रोकने के लिए कम से कम रखा जाना चाहिए। इस प्रकार, यह देखते हुए कि प्रोटोकॉल के कदम, जैसे परख मीडिया और सब्सट्रेट और अवरोधक समाधानों की तैयारी, या रेस्पिरोमेट्रिक परख कारतूस में अवरोधकों की लोडिंग, समय लेने वाली हैं, हर कदम को पूरी तरह से समन्वित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, एंजाइमेटिक पाचन 21,24 और मोर्टार और पेस्टल होमोजेनाइजेशन 17,19,21,23,24 पर आधारित अन्य तरीकों के विपरीत, यहां वर्णित विधि एक स्वचालित होमोजेनाइज़र के उपयोग पर निर्भर करती है, जिससे तेजी से और कुशल नमूना समरूपता सक्षम होती है। महत्वपूर्ण रूप से, माइटोकॉन्ड्रियल निलंबन कम संवेदनशील होते हैं यदि अत्यधिक केंद्रित होते हैं। इस प्रकार, केवल उनका उपयोग करने से तुरंत पहले dilutions तैयार करें। अंत में, यह respirometric परख उचित के दौरान जल्दी से काम करने के लिए आवश्यक है. आमतौर पर, इन assays में संस्कृति में कोशिकाओं का विश्लेषण करते समय, substrates या inhibitors के इंजेक्शन के बाद लगातार तीन माप चरणों का प्रदर्शन किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रोटोकॉल होते हैं जो 40 और 50 मिनट के बीच विस्तारित होते हैं, पूरी प्रक्रिया में पृथक माइटोकॉन्ड्रिया की व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए, माप चरणों की संख्या अक्सर उनकी भेद्यता के कारण कम से कम रखी जाती है19, 23,25, respirometric विश्लेषण को पूरा करने में लगने वाले समय को कम करने के लिए ~ 20 मिनट. इस कार्य (तालिका 3) में वर्णित प्रोटोकॉल इस प्रवृत्ति का पालन करते हैं, भले ही अन्य पहले प्रकाशित विधियाँ लंबे और अधिक मानक माप चरणों 26 के साथ कुशल OCR प्रोफ़ाइल की रिपोर्ट करें.

उदाहरण के लिए, यदि दो लगातार assays एक ही दिन में नमूनों के एक ही सेट के साथ चलाने जा रहे हैं, तो माइटोकॉन्ड्रियल dilutions को छोड़कर पहले एक के दौरान दूसरी परख के लिए सभी अभिकर्मकों को तैयार करें: केवल पतला, बीज, और स्पिन माइटोकॉन्ड्रिया तुरंत दूसरे परख शुरू करने से पहले, जबकि उपकरण कैलिब्रेट किया जा रहा है। एक बार प्रयोग पूरा हो जाने के बाद, आरसीआर पैरामीटर (अनुभाग 4, चरण 1.7) की गणना उपयोग की जाने वाली माइटोकॉन्ड्रियल तैयारियों की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए की जानी चाहिए। आमतौर पर, 3.5 और 5 के बीच आरसीआर मान दर्शाते हैं कि माइटोकॉन्ड्रियल अखंडता इष्टतम है और कार्यात्मक युग्मित ऑक्सीडेटिव श्वसन 25 दिखाती है। कम आरसीआर मूल्यों के साथ assays को छोड़ दिया जाना चाहिए क्योंकि माइटोकॉन्ड्रियल अखंडता अलगाव के दौरान समझौता किया गया था। इन मामलों में, माइटोकॉन्ड्रियल छर्रे को दो बार धोने पर विचार करें (अनुभाग 2, चरण 19-21)22, जैसा कि पहले बताया गया था।

दूसरा, पूरी प्रक्रिया में सही पीएच को बनाए रखना सफल परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। सुनिश्चित करें कि सभी समाधानों का पीएच संकेत के रूप में सेट किया गया है, अर्थात, पीएच 7.2, और यह कि पीएच हमेशा KOH के साथ समायोजित किया जाता है जब तक कि अन्यथा नहीं कहा जाता है। विशेष रूप से, बीएसए-युक्त बफ़र्स के पीएच को सीधे पीएच मीटर के साथ मापा नहीं जाना चाहिए क्योंकि बीएसए जांच को नुकसान पहुंचा सकता है। इस प्रकार, बीएसए जोड़ने से पहले संबंधित बफ़र्स में पीएच को समायोजित करें। बीएसए के अलावा के कारण पीएच में परिवर्तन से बचने के लिए, हमेशा एफएफए बीएसए का उपयोग करें। इसके अलावा, कुछ अल्ट्राप्योर एच 2 ओ बैच अम्लीय हो सकते हैं, इसलिए व्यावसायिक रूप से शुद्ध, पीएच 7 एच 2 ओ के उपयोग की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि पीएच मीटर सही ढंग से कैलिब्रेट किया गया है और यह तैयार किए जाने वाले रसायनों के पीएच को मापने के लिए उपयुक्त मॉडल है।

तीसरा, माइटोकॉन्ड्रियल विनाश को रोकने के लिए अंतिम माइटोकॉन्ड्रियल निलंबन (अनुभाग 2, चरण 21) के प्रोटीन माप के लिए नमूना संग्रह चरण को सही ढंग से निष्पादित करना महत्वपूर्ण है। गोली को जल्दी से लेकिन अच्छी तरह से निलंबित करें, एक एलीकोट इकट्ठा करें, और आसमाटिक संतुलन को संरक्षित करने और माइटोकॉन्ड्रिया को नुकसान से बचाने के लिए शेष निलंबन में एफएफए बीएसए जोड़ें। यदि एफएफए बीएसए पहले से ही पुनर्सप्ति बफर में मौजूद थे, और इस प्रकार, प्रोटीन परिमाणीकरण के दौरान, उच्च प्रोटीन सामग्री परिमाणीकरण परिणामों को भ्रमित करेगी। यही कारण है कि एफएफए बीएसए को परिमाणीकरण के लिए एक एलीकोट को अलग करने के बाद जोड़ा जाना चाहिए।

चौथा, यह विधि अत्यधिक बहुमुखी है और प्रयोगकर्ता की जरूरतों के लिए समायोजित की जा सकती है। उदाहरण के लिए, यदि अध्ययन के तहत पशु मॉडल को कम मांसपेशी द्रव्यमान (जैसे, सार्कोपेनिक चूहों) की विशेषता है, तो अतिरिक्त मांसपेशियां माइटोकॉन्ड्रियल उपज को बढ़ा सकती हैं। हालांकि इस काम में एक वयस्क जंगली-प्रकार के पुरुष C57BL / 6N माउस का उपयोग किया गया था, किसी भी लिंग, उम्र या आनुवंशिक पृष्ठभूमि के जानवरों के साथ-साथ विशिष्ट मांसपेशियों के प्रकारों को इसके बजाय नियोजित किया जा सकता है।

पांचवां, बफर और अभिकर्मकों की संरचना में मामूली बदलाव के कारण श्वसन मूल्य प्रयोगों के बीच भिन्न हो सकते हैं, जिन्हें हर बार ताजा तैयार करने की आवश्यकता होती है। उम्र, लिंग, आनुवांशिक पृष्ठभूमि, या पर्यावरणीय स्थितियों का भी परिणामों पर गहरा प्रभाव पड़ सकता है। हालांकि, एक सफल प्रयोग को एडीपी और सक्सिनेट जैसे जटिल सब्सट्रेट के इंजेक्शन के बाद ऑक्सीजन की खपत में वृद्धि को प्रस्तुत करना चाहिए, ओलिगोमाइसिन या रोटेनोन जैसे अवरोधकों के इंजेक्शन के बाद कम हो जाता है, और शक्तिशाली अनकपलर एफसीसीपी को जोड़ने पर चिह्नित वृद्धि होती है। इसके अलावा, उच्च तकनीकी परिवर्तनशीलता को रोकने के लिए, माइक्रोप्लेट में सीडिंग से पहले सजातीय निलंबन प्राप्त करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल छर्रों के पूरी तरह से पुनर्सस्पेंशन सुनिश्चित करें।

छठा, यदि बेसल श्वसन मान कम हैं, तो सीडिंग के लिए प्रोटीन की मात्रा को समायोजित करने के लिए एक अनुमापन प्रयोग करने पर विचार करें। अंत में, क्योंकि यह काम कच्चे माइटोकॉन्ड्रियल अर्क को प्राप्त करने के लिए एक विधि प्रदान करता है, अन्य ऑर्गेनेल, मुख्य रूप से ईआर से जुड़ी अशुद्धता का एक निश्चित ग्रेड अपेक्षित है। इन अशुद्धियों को दूर करने के लिए एक अधिक आक्रामक विखंडन प्रक्रिया माइटोकॉन्ड्रियल व्यवहार्यता के लिए हानिकारक होगी, जो श्वसन assays के प्रदर्शन में बाधा डालती है। यदि शुद्धता एक चिंता का विषय है, खासकर अगर यह नमूनों के बीच संगत नहीं है, परख परिणामों को विभिन्न ऑर्गेनेल मार्करों (चित्रा 3) के खिलाफ पश्चिमी धब्बों को चलाने के बाद माइटोकॉन्ड्रियल शुद्धता के सापेक्ष सामान्यीकृत किया जा सकता है। हमारे ज्ञान के लिए, यह पहली विधि है जो कच्चे अर्क में माइटोकॉन्ड्रियल शुद्धता के बारे में चिंताओं को उजागर करती है। आमतौर पर, पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के साथ श्वसनमितीय assays के लिए अन्य प्रोटोकॉल में, नमूनों की तुलना करने के लिए कुओं में प्रोटीन निकालने की समान मात्रा को बीज दिया जाता है, यह मानते हुए कि माइटोकॉन्ड्रिया की समान मात्रा का उपयोग सभी मामलों में किया जाता है। यह एक उचित धारणा है कि अलगाव सभी नमूनों में समानांतर में किया जाता है पर विचार करते हुए। हालांकि, अध्ययन के तहत नमूनों की आनुवंशिक या पर्यावरणीय पृष्ठभूमि माइटोकॉन्ड्रियल अर्क की शुद्धता में काफी अंतर पैदा कर सकती है। उदाहरण के लिए, यदि कोई दिया गया आनुवंशिक उत्परिवर्तन साइटोप्लाज्मिक ईआर के विकास में वृद्धि का कारण बनता है, तो इन जानवरों से कच्चे माइटोकॉन्ड्रियल अर्क में अपेक्षित ईआर सामग्री से अधिक हो सकता है, और परिणामस्वरूप, अपेक्षित माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन से कम हो सकता है। इस प्रकार, भले ही नियंत्रण और उत्परिवर्ती नमूनों से कुल प्रोटीन की समान मात्रा को माइक्रोप्लेट में सीड किया जाता है, उत्परिवर्ती की ऑक्सीजन की खपत को कम करके आंका जाएगा। इसलिए, यह सिफारिश की जाती है कि अध्ययन के तहत सभी स्थितियों के अर्क की शुद्धता निर्धारित की जानी चाहिए। यदि मान तुलनीय हैं, तो कोई सामान्यीकरण की आवश्यकता नहीं है। हालांकि, यदि नमूनों के बीच शुद्धता मान सांख्यिकीय त्रुटि से परे काफी भिन्न होते हैं, तो प्रयोगकर्ता स्वीकार करने के लिए तैयार है, तो उनका उपयोग ऑक्सीजन खपत परिणामों को सामान्य करने के लिए किया जाना चाहिए।

वर्तमान प्रोटोकॉल की कुछ सीमाएं हैं। ध्यान दें, इस विधि को चूहों से अलग कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों के लिए अनुकूलित किया गया है। विभिन्न प्रजातियों से विभिन्न ऊतकों या कंकाल की मांसपेशियों का उपयोग करते समय समायोजन करने की आवश्यकता हो सकती है। इसके अतिरिक्त, जब पृथक माइटोकॉन्ड्रिया पर विश्लेषण किया जाता है, तो सामान्य सेलुलर माइक्रोएन्वायरमेंट सेलुलर संदर्भ की अनुपस्थिति और अन्य ऑर्गेनेल के कारण खो जाता है जो माइटोकॉन्ड्रिया के साथ बातचीत कर सकते हैं। इससे ऐसे परिणाम हो सकते हैं जो शारीरिक स्थितियों से थोड़ा विचलित होते हैं। अंत में, जैसा कि माइटोकॉन्ड्रिया को सेंट्रीफ्यूज किया जाता है, वे कुओं के तल का पालन करते हैं। जबकि पूरी तरह से आवश्यक है, उनके सामान्य राज्य पर सेंट्रीफ्यूजेशन के संभावित प्रभाव अज्ञात हैं।

यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि, श्वसनीय परख विश्लेषण करने के बाद, एटीपी-लिंक्ड या एफसीसीपी-उत्तेजित श्वसन से जुड़े ऑक्सीजन की खपत में कमी अलग-थलग माइटोकॉन्ड्रिया में संभावित माइटोकॉन्ड्रियल परिवर्तनों का संकेत दे सकती है जिन्हें 20 द्वारा समझाया जा सकता है: 1) आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली में सब्सट्रेट का प्रतिबंधित परिवहन, 2) विशिष्ट चयापचय मार्गों की दर-सीमित प्रतिक्रियाओं में शामिल एंजाइमों की गतिविधि में कमी जैसे कि ETC, Krebs चक्र, या β-ऑक्सीकरण, या 3) बिगड़ा हुआ ETC फ़ंक्शन, अन्य संभावित स्पष्टीकरणों के बीच।

संक्षेप में, यहां वर्णित अद्यतन विधि कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों से ईटीसी और OXPHOS फ़ंक्शन का आकलन करने के लिए एक पर्याप्त और विश्वसनीय तरीका का प्रतिनिधित्व करती है। इसमें यह मूल्यांकन करने के लिए कई अनुप्रयोग हैं कि आनुवंशिक संशोधन या पर्यावरण एक विशिष्ट फेनोटाइप में योगदान देने वाले माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को कैसे प्रभावित कर सकता है। उल्लेखनीय रूप से, वर्तमान प्रोटोकॉल को अन्य मॉडल जीवों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है या मानव रोग से जुड़े संभावित माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए मानव नमूनों के साथ उपयोग किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

हम Homogenizer और तकनीकी सहायता के लिए CABD प्रोटिओमिक्स और पशुपालन सुविधाओं के उपयोग के लिए जुआन जे टेना को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को स्पेनिश शिक्षा, संस्कृति और खेल मंत्रालय द्वारा फेलोशिप FPU16/03264 के माध्यम से J.D.H.C. के माध्यम से समर्थित किया गया था, एसोसिएशन Française contre les Myopathies (AFM) फेलोशिप अनुदान # 22450 के माध्यम से C.V.-G. को, एक संस्थागत अनुदान MDM-2016-0687 (मारिया डी Maeztu उत्कृष्टता इकाई, जीन विनियमन और Mfogenesis के विभाग, जीन विनियमन और Mfogenesis के विभाग के लिए CABD में 80.C जुंटा डी अंडालुसिया अनुदान P18-RT-4572, यूरोपीय संघ से फेडर फंडिंग कार्यक्रम, और स्पेनिश विज्ञान, नवाचार और विश्वविद्यालयों के मंत्रालय RED2018-102576-T को P.N.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ADP Sigma A5285 Stock at -20 °C
AKT antibody Cell Signaling Technology C67E7 Rabbit (Host species)
anti-Goat HRP Sigma 401504 Rabbit (Host species)
anti-Mouse HRP Cell Signaling #7076 Horse (Host species)
Antimycin A Sigma A8674 Stock at -20 °C
anti-Rabbit HRP Cell Signaling #7074 Goat (Host species)
Ascorbic acid Sigma A5960 Stock at RT
Bactin antibody Sigma MBS4-48085 Goat (Host species)
Bio-Rad Protein Assay Kit II Bio-Rad 5000002 It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve
BSA, fraction V, Fatty Acid-Free Calbiochem 126575 Stock at 4 °C
C tube Miltenyi Biotec 130-093-237 Purple lid
Calnexin antibody ThermoFisher MA3-027 Mouse (Host species)
D-mannitol Sigma M4125 Stock at RT
EDTA BDH 280254D Stock at 4 °C
EGTA Sigma E-4378 Stock at RT
FCCP Sigma C2920 Stock at -20 °C
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 Homogenizer
HEPES Sigma H3375 Stock at RT
HSP70 antibody Proteintech 10995-1-AP Rabbit (Host species)
LDH-A antibody Santa Cruz Biotechnology SC27230 Goat (Host species)
Magnesium chloride ChemCruz sc-255260A Stock at RT
Malic acid Sigma P1645 Stock at RT
Microplate spectrophotometer BMG LABTECH GmbH POLARstar OMEGA S/N 415-0292 Stock at RT
Milli-Q water Millipore system F7HA17757A Ultrapure water
mtTFA antibody Santa Cruz Biotechnology SC23588 Goat (Host species)
Na+/K+-ATPase α1 antibody Novus Biologicals NB300-14755 Mouse (Host species)
Oligomycin Sigma O4876 Stock at -20 °C
Palmitoyl-L-carnitine Sigma P1645 Stock at -20 °C
PBS tablets Sigma P4417-100TAB 1x stock at RT
Potassium dihydrogen phosphate ChemCruz sc-203211 Stock at RT
Potassium hydroxide Sigma 60377 Stock at RT
Pyruvic acid Sigma 107360 Stock at 4 °C
Rotenone Sigma R8875 Stock at -20 °C
Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer Agilent Technologies 420179 XFe24 model
Seahorse XFe24 FluxPak mini Agilent Technologies 102342-100 The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution
Succinate Sigma S7626 Stock at RT
Sucrose Sigma S9378 Stock at RT
TIMM23 antibody Abcam ab230253 Rabbit (Host species)
TMPD Sigma T7394 Stock at -20 °C
TOMM20 antibody Abcam ab56783 Mouse (Host species)
VDAC antibody Abcam ab15895 Rabbit (Host species)

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References

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जीव विज्ञान अंक 180
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Hernández-Camacho, J. D.,… More

Hernández-Camacho, J. D., Vicente-García, C., Sánchez-Cuesta, A., Fernandez-Ayala, D. J. M., Carvajal, J. J., Navas, P. Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays. J. Vis. Exp. (180), e63336, doi:10.3791/63336 (2022).

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