Summary
Burada, fare iskelet kasından mitokondri izolasyonu için ayrıntılı bir yöntem ve ardından mikroplaka tabanlı respirometrik testler kullanılarak Oksijen Tüketim Hızı (OCR) ile solunum analizi için ayrıntılı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu boru hattı, çoklu çevresel veya genetik müdahalelerin mitokondriyal metabolizma üzerindeki etkilerini incelemek için uygulanabilir.
Abstract
Hücrenin enerjisinin çoğu, glikozun, yağ asitlerinin ve amino asitlerin, hücresel taleplere yanıt olarak düzenlenen mitokondriyal oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) sistemi üzerinde birleşen farklı yollarla parçalanmasıyla elde edilir. Lipid molekülü Koenzim Q (CoQ), elektronları sabit oksidasyon/indirgeme döngüleri yoluyla elektron taşıma zincirindeki (ETM) kompleks III'e aktararak bu süreçte esastır. Mitokondri durumu ve nihayetinde hücresel sağlık, respirometrik testler kullanılarak ETC oksijen tüketiminin ölçülmesiyle değerlendirilebilir. Bu çalışmalar tipik olarak birkaç gündür kültürlenmiş yerleşik veya birincil hücre hatlarında gerçekleştirilir. Her iki durumda da, elde edilen solunum parametreleri, herhangi bir organ veya dokudaki normal fizyolojik koşullardan sapmış olabilir.
Ek olarak, iskelet kasından izole edilen kültürlenmiş tek liflerin içsel özellikleri bu tür analizleri engellemektedir. Bu yazıda, fare iskelet kasından yeni izole edilmiş mitokondrilerde solunumun analizi için güncellenmiş ve ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Ayrıca, sürecin herhangi bir adımında ortaya çıkabilecek potansiyel sorunlara da çözümler sunuyoruz. Burada sunulan yöntem, çeşitli transgenik fare modellerinde oksijen tüketim oranlarını karşılaştırmak ve ilaç tedavilerine veya yaşlanma veya cinsiyet gibi diğer faktörlere mitokondriyal yanıtı incelemek için uygulanabilir. Bu, mitokondriyal biyoenerjetik metabolizma ve düzenleme ile ilgili önemli sorulara cevap vermek için uygun bir yöntemdir.
Introduction
Mitokondri, hücredeki birincil metabolik organellerdir1. Bu özel membranla çevrili organeller, OXPHOS tarafından adenozin trifosfat (ATP) formunda enerji üretmek için besin molekülleri kullanır. Bu süreç, ETC2'deki bir dizi redoks reaksiyonunda donör moleküllerden elektronların transferine dayanır. CoQ, tüm hücresel membranlarda endojen olarak üretilen ve antioksidan fonksiyon gösteren dolaşımdaki lipoproteinlerde bulunan tek redoks-aktif lipittir3. Elektronları NADH'ye bağımlı kompleks I ve FADH2'ye bağımlı kompleks II'den kompleks III'e aktaran ETM'nin önemli bir bileşenidir, ancak diğer birçok redüktaz, mitokondriyal CoQ'nun çoklu hücresel metabolik yollarda zorunlu bir adım olarak ubikinol'e indirgenmesini sağlayabilir4,5.
İşlem boyunca, ATP sentaz kompleksi V2 tarafından biyolojik olarak aktif enerjiye dönüştürülen mitokondriyal iç zar boyunca bir elektrokimyasal proton gradyanı oluşturulur. Sonuç olarak, mitokondriyal disfonksiyon, esas olarak yüksek enerji gereksinimi olan beyin, kalp ve iskelet kası gibi dokuları etkileyen sayısız patolojik duruma yol açar6,7. Bu nedenle, mitokondriyal biyoenerjetik maddeleri, özellikle iskelet kasları gibi yüksek enerjili dokularda, sağlık ve hastalıktaki rolünü araştırmak için doğru bir şekilde analiz etmek için yöntemler geliştirmek esastır.
Clark tipi oksijen elektrodu, mitokondriyal solunum çalışmasında klasik olarak kullanılmıştır8. Bununla birlikte, bu sistem giderek daha yüksek çözünürlüklü teknolojilerle yer değiştirmiştir ve Agilent Seahorse XF analizörleri gibi mikroplaka tabanlı oksijen tüketim teknolojileri özellikle popülerdir9. İskelet kası alanında, bu çalışmalar tipik olarak kültürlenmiş hücrelerde, özellikle C2C12 ölümsüzleştirilmiş fare miyoblast hücre hattında veya uydu hücrelerinden türetilen birincil kültürlerde gerçekleştirilir10,11. Bununla birlikte, bu çalışmalar, özellikle mitokondriyal biyolojiyi araştırırken ve belirli hakaretler, genetik olmayan müdahaleler veya genetik manipülasyonlar üzerine doku düzeyinde işlev görürken, durumu in vivo olarak tam olarak özetlememektedir.
Ayrıca, hücrelerdeki solunum tahlilleri, ATP'nin mitokondriyal olmayan talebi ve sonuçların yorumlanmasını yanlış yönlendirebilecek tahlil substratları veya sinyal olayları da dahil olmak üzere ek faktörler nedeniyle daha karmaşıktır. Alternatif olarak, kaslardan yeni izole edilmiş miyoliflerin tek veya demetlerini kullanmak da mümkündür. Bununla birlikte, izolasyon yöntemi teknik olarak zordur ve sadece birkaç kas tipi için uygulanabilir. Bu durumda, fleksör digitorum brevis (FDB) ve ekstansör digitorum longus (EDL) kasları esas olarak kullanılır10,12,13, ancak birkaç rapor diğer kas tiplerinin kullanımını da açıklamaktadır14,15.
İskelet kası kesitlerinin biyoenerjetik profillemesi de bildirilmiştir16. Bu yöntemin en büyük avantajı, sağlam kasların çalışılabilmesidir (yazarlar, liflerden dilimlemenin, izole miyoliflerle karşılaştırıldığında sonuçları rahatsız etmediğini göstermektedir). Bununla birlikte, substratlara ve tahlil inhibitörlerine mitokondriyal erişim sınırlıdır ve bu nedenle sadece birkaç parametre ölçülebilir16. Son olarak, izole mitokondri de aynı şekilde kullanılabilir9,17,18,19. Bu durumda, mitokondri sitozolik ortamlarını kaybeder ve bu da işlevlerini etkileyebilir. Buna karşılık, bu yöntem substratlara ve inhibitörlere erişimi garanti eder, çok sayıda numune tipinin analizini sağlar ve tipik olarak daha az malzeme gerektirir.
Bu yazıda, mikroplaka tabanlı respirometrik testler kullanılarak fare iskelet kasından izole edilmiş mitokondrinin biyoenerjetik profillemesini gerçekleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır (Şekil 1). Özellikle, üç protokol detaylandırılmıştır: ETC ve OXPHOS makineleri arasındaki bağlantı derecesini değerlendirmek için Kaplin Testi, CA; Elektron Akış Testi, bireysel ETC komplekslerinin aktivitesini ölçmek için EFA; ve mitokondriyal β-oksidasyon kapasitesini belirlemek için BOX testi. Özellikle, geleneksel respirometri yöntemlerine kıyasla sadece az miktarda numune gereklidir. Burada kullanılan yalıtım protokolü, başka bir yerde yayınlanan yöntemden değiştirilmiştir18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fare muhafazası ve doku toplama, Universidad Pablo de Olavide Etik Komitesi (Sevilla, İspanya; protokoller 24/04/2018/056 ve 12/03/2021/033) tarafından onaylanan protokoller kullanılarak İspanya Kraliyet Kararnamesi 53/2013, Avrupa Direktifi 2010/63/EU ve diğer ilgili yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Solunum tahlilleri için stokların, tamponların ve reaktiflerin hazırlanması
- Belirtilen sıcaklıkta aylarca saklanabilen aşağıdaki stok çözeltilerini hazırlayın. Her durumda ultra saf H2O kullanın.
- 1x PBS hazırlamak için fosfat tamponlu salin (PBS) tabletlerini H2O'da (200 mL H2O başına 1 tablet) çözün. Çözeltiyi otoklav edin ve oda sıcaklığında (RT) saklayın.
- 1 M NaOH hazırlamak için 2 g NaOH peletini 50 mL H2O'da çözün.
- pH kalibrasyonu için 0,1 M, 1 M, 5 M ve 10 M KOH stokları hazırlayın.
- 70 mL H2O'ya 14.612 g EDTA ekleyin. 100 mL'ye H2O kuantum satis (QS) ekleyin. Elde edilen 0,5 M EDTA (pH 8) çözeltisini otoklav edin ve RT'de saklayın.
- 70 mL H2O'ya 19 g EGTA ekleyin. EGTA'nın tamamen çözünmesini sağlamak için pH 8.0'a ulaşana kadar NaOH peletleri ekleyin. 100 mL'ye H2O QS ekleyin. Elde edilen 0,5 M EGTA (pH 8) çözeltisini otoklav edin ve RT'de saklayın.
- 98 mL PBS'ye 2 mL 0,5 M EDTA ekleyin. Elde edilen 10 mM EDTA/PBS çözümünü RT'de saklayın.
- 5.958 g HEPES'i 40 mL H2O'da çözün. pH'ı KOH ile 7.2'ye ve QS'yi H2O ile 50 mL'ye ayarlayın. Elde edilen 0.5 M HEPES tamponunu 0.45 μm'lik bir ağdan filtreleyin ve RT'de saklayın.
- 3.402 g KH2PO4'ü 50 mL'ye kadar H2O'da çözün. Elde edilen 0,5 M KH2PO4 çözeltisini 0,45 μm'lik bir ağdan filtreleyin ve RT'de saklayın.
- 9.521 g susuz MgCl2'yi 100 mL'ye kadar H2O'da çözün.
NOT: Bu ekzotermik bir reaksiyon olduğundan, dikkatli bir şekilde ilerleyin ve MgCl2'yi buz üzerinde çözün.
- Substrat ve inhibitör stok çözeltileri hazırlayın (bakınız Tablo 1). Aliquot ve -20 ° C'de saklayın. Donma-çözülme döngülerinden kaçının. Bir istisna olarak, her zaman kullanımdan hemen önce piruvik asit hazırlayın.
- Ultra saf H2O'da hazırlayın: 0,5 M süksinat, 0,5 M piruvik asit, 0,5 M malik asit, 100 mM ADP, 1 M askorbik asit ve 50 mM N,N,N′,N′-tetrametil-para-fenilen-diamin (TMPD) (ışıktan koruyun).
- %100 dimetil sülfoksit (DMSO) içinde hazırlayın: 50 mM palmitoil-L-karnitin, 4 mM rotenon, 20 mM karbonil siyanür-p-triflorometoksifenilhidrazon (FCCP), 4 mM oligomisin ve 5 mM Antimisin A.
NOT: Mikroplaka kuyucuklarındaki nihai DMSO konsantrasyonunu %0,1 aşmayın. Bu nedenle, bu sınırın altında kalmak için yüksek konsantrasyonlu stok çözümleri hazırlayın.
- Mitokondri izolasyonu ve protein niceliği için tamponları deney gününde taze olarak hazırlayın. Her durumda ultra saf H2O kullanın ve aksi belirtilmedikçe tüm tamponları buz üzerinde tutun.
NOT: Zamandan tasarruf etmek için, tüm reaktifler tartılabilir ve önceki gün doğru sıcaklıkta uygun kaplarda (örneğin, 15 mL tüpler) tutulabilir.- % 10 serbest yağ asitleri (FFA) BSA hazırlamak için, 150 mg FFA BSA'yı 1.5 mL H2O içinde ters çevirme / dönme tekerleği ile iyice çözün. Köpüklenmeyi önlemek için vorteks yapmayın.
- 1x Bradford reaktifi hazırlamak için 5x ticari stok çözümünü H2O ile seyreltin ve RT'de karanlıkta tutun.
- 8x Mitokondri Tamponu (MB) hazırlamak için, 15 mL H2O'da 4.112 g sakkaroz ve 763 mg HEPES'i çözün. pH'yi 7.2'ye ayarlayın, 1.6 mL% 10 FFA BSA ve QS'yi H2O ile 20 mL'ye ekleyin.
- 20 mL İzolasyon Arabelleği 1 (IB1) (numune başına 4 mL kullanılır) hazırlamak için, 15 mL H2O'da 400 μL 0,5 M EDTA, 784 mg D-mannitol ve 2,5 mL 8x MB çözün.
- 5 mL İzolasyon Tamponu 2 (IB2) (numune başına 500 μL kullanılır) hazırlamak için, 4 mL H2O'da 30 μL 0,5 M EGTA, 196 mg D-mannitol ve 625 μL 8x MB çözün.
- 5 mL Resuspension Buffer (RB) (numune başına 200 μL kullanılır) hazırlamak için, 120 mg sakaroz, 191.3 mg D-mannitol, 50 μL 0.5 M HEPES ve 10 μL 0.5 M EGTA'yı 4 mL H2O'da çözün.
- 2x Mitokondriyal Tahlil Çözeltisi-1 (MAS-1) hazırlamak için, 1.199 g sakaroz, 2.8 g mannitol, 1 mL 0.5 M KH2PO4, 250 μL 1 M MgCl2, 200 μL 0.5 M HEPES, ve 100 μL 0.5 M EGTA 20 mL H2O'da çözün. pH'yi 7.2 ve QS'yi H2O ile 25 mL'ye ayarlayın. Daha uzun süreler boyunca, yağışı önlemek için 4 ° C'de tutun.
- 1x Kaplin Testi ortamını (CAM) hazırlamak için iki farklı MAS-1 tabanlı tampon hazırlayın: 1) CA testi için CAM + BSA ve 2) Tahlil inhibitörlerini hazırlamak için CAM-BSA. Piruvat: malat oranını daima 10: 1'de tutun.
NOT: BSA enjeksiyon portlarını tıkayabildiğinden, inhibitörleri BSA içermeyen CAM'de seyreltin.- CAM + BSA'yı hazırlamak için, 300 μL 0,5 M piruvik asit, 30 μL 0,5 M malik asit ve 7,5 mL 2x MAS-1'i 6 mL H2O'da seyreltin. H2O ile 15 mL'ye 300 μL %10 FFA BSA ve QS ekleyin.
- CAM-BSA'yı hazırlamak için, 2 mL H2O'da 120 μL 0,5 M piruvik asit, 12 μL 0,5 M malik asit ve 3 mL 2x MAS-1 seyreltin.
- 1x Elektron Akış Testi ortamı (EFAM) hazırlamak için, hem BSA içeren hem de BSA içermeyen EFAM tamponları hazırlayın.
- EFAM + BSA'yı hazırlamak için, 300 μL 0,5 M piruvik asit, 60 μL 0,5 M malik asit, 3 μL 20 mM FCCP ve 7,5 mL 2x MAS-1'i 6 mL H2O'da seyreltin. H2O ile 15 mL'ye 300 μL %10 FFA BSA ve QS ekleyin.
- EFAM-BSA'yı hazırlamak için, 2 mL H2O'da 120 μL 0,5 M piruvik asit, 24 μL 0,5 M malik asit, 1,2 μL 20 mM FCCP ve 3 mL 2x MAS-1 seyreltin.
- 1x β oksidasyon ortamı (BOXM) hazırlamak için BSA içeren ve BSA içermeyen BOXM çözeltileri hazırlayın.
- BOXM + BSA'yı hazırlamak için, 7 mL H2O'da 12 μL 50 mM palmitoyl-L-karnitin, 30 μL 0.5 M malik asit ve 7.5 mL 2x MAS-1 seyreltin. H2O ile 15 mL'ye 300 μL %10 FFA BSA ve QS ekleyin.
- BOXM-BSA'yı hazırlamak için, 2 mL H2O'da 4.8 μL 50 mM palmitoil-L-karnitin, 12 μL 0.5 M malik asit ve 3 mL 2x MAS-1 seyreltin.
2. Kas diseksiyonu, homojenizasyon ve mitokondriyal izolasyon
- Tüm malzemeleri ve tamponları buzun üzerine yerleştirin. Mitokondrileri hasardan korumak için tüm prosedür boyunca tüm malzemelerin buz gibi soğuk olduğundan emin olun.
- Buz üzerine numune başına üç adet 50 mL beher yerleştirin ve aşağıdaki çözeltileri ekleyin: Beher 1'de 10 mL PBS, beher 2'de 10 mL 10 mM EDTA/PBS ve beher 3'te 4 mL IB1.
- Servikal çıkık ile fareyi ötenazileştirin. CO2 ötenazisinden kaçının, çünkü iskelet kasları hipoksik hale gelebilir ve solunum analizlerine müdahale edebilir.
- Kürkün dökülmesini önlemek için sağ arka bacağı% 70 etanol ile püskürtün ve bant uzuvunu mantar diseksiyon panosuna püskürtün. Sol ön ayağı da bantlayın.
- Steril tek kullanımlık neşter ile dizden ayak parmağına kadar deriden bir kesi yapın.
- Cildi ayak bileği seviyesinde dişli forseps ile tutun ve ayak bileği çevresinde ince makasla kesin.
- Bir elinizde ince uçlu cımbızla cildi altta yatan kas yapısından uzaklaştırırken, diğer elinizde dişli forseps ile yukarı çekin.
- Ayak bileğinden dize kadar tüm iskelet kaslarını diseke edin (Şekil 2).
- İnce cımbız ve makas kullanarak kas ekstraksiyonunu kolaylaştırmak için tibialis anterior (TA) kası üzerindeki tüm bağ dokusunu çıkarın.
- EDL kasının dört distal tendonunu bulun ve ayak parmaklarındaki yerleştirmelerine yakın bir şekilde bölümlere ayırın. TA distal tendonunu bulun ve her zaman ayak bileğinin altında, yerleştirilmesine yakın bir yerde kesin.
- Gevşek uçları serbest bırakmak için TA ve EDL tendonlarını ayak bileğinin üzerine dikkatlice çekin.
- Tendonların gevşek uçlarını tutun ve kasları yukarı çekerek kas sisteminin ve kemiklerin geri kalanından uzaklaştırın. İşlemi kolaylaştırmak için ince cımbız veya makas kullanın. Miyofiber kasılmasını önlemek için dikkatli bir şekilde devam edin.
- EDL'nin proksimal tendonunu ve TA kasını diz kapağına mümkün olduğunca yakın kesin.
- Gastroknemius (GA) ve soleus kas ekstraksiyonuna devam etmek için fareyi baş aşağı çevirin.
- Biceps femoris ve GA arasında oluşan cebi dişli forseps ile tutun. Bu kasları ayırmak ve proksimal GA tendonunu görselleştirmek için ince makas kullanın.
- Aşil tendonunu ince forsepslerle tutun ve ince makasla dikkatlice kesin. GA ve soleus kaslarını altta yatan kemikten tendonlarından yukarı çekerek serbest bırakın. Proksimal GA tendonunu altta yatan soleus ile birlikte serbest bırakarak kesin.
- Sadece kemikler kalana kadar aynı prosedürü izleyerek kalan kasları tendondan tendona dikkatlice inceleyin.
- Kuadriseps kasını incelemek için fareyi başlangıç pozisyonunda yeniden sabitleyin.
- Dişli forseps ve ince makas kullanarak yağ dokusunu proksimal taraftaki kuadrisepslerin üzerine atın.
- Kuadriseps ve femur arasına ince cımbız yerleştirin ve kası kemikten ayırmak için femur ekseni boyunca her iki yönde de hareket ettirin.
- Distal kuadriseps kas tendonlarını dişli forseps ile tutun ve tendonu diz kapağına mümkün olduğunca yakın ince makasla kesin.
- Kuadrisepsleri yukarı çekin ve ince makasla proksimal yerleştirmede serbest bırakın.
- Bu bölümdeki 4-8 arası adımları sol arka bacakla tekrarlayın.
- Tüm kasları önce Beaker 1'de, sonra Beaker 2'de durulayın.
- Tüm kasları Beher 3'e aktarın ve tüm kasları buz üzerinde keskin makasla ince bir şekilde kesin.
- Süspansiyonu daima buzda tutarak bir C Tüpüne (mor kapak) aktarın.
- C Tüpünü sıkıca kapatın ve homojenizatörün manşonuna baş aşağı takın. Numune malzemesinin rotator/stator alanında olduğundan emin olun. m_mito_tissue_01 adlı 1 dakikalık programı seçin.
- Homojenatı iki adet 2 mL önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpüne bölün ve bir masa üstü santrifüjde 4 °C'de 10 dakika boyunca 700 × g'da santrifüj yapın.
- Süpernatantları yeni 2 mL önceden soğutulmuş tüplere aktarın, yağ ve homojenize edilmemiş dokudan dikkatlice kaçının. Parçalanma saflığının belirlenmesi için peletleri -80 °C'de saklayın (fraksiyon N) (Şekil 3).
- Süpernatantları 4 ° C'de 10 dakika boyunca 10.500 × g'de santrifüj yapın.
- Süpernatantları yeni 2 mL önceden soğutulmuş tüplere aktarın ve bunları Süpernatant Numarası 1 (SN1) olarak etiketleyin. Parçalanma saflığının belirlenmesi için -80 °C'de saklayın (Şekil 3).
- Her iki peleti de buzda toplam 500 μL IB2 hacminde yeniden askıya alın ve birleştirin.
- 4°C'de 10 dakika boyunca 10.500 × g'de santrifüj.
- Süpernatantı yeni bir 2 mL önceden soğutulmuş tüpe aktarın ve Süpernatant Numarası 2 (SN2) olarak etiketleyin. Parçalanma saflığının belirlenmesi için -80 °C'de saklayın (Şekil 3).
- Son mitokondriyal peleti 200 μL RB'de yeniden askıya alın. Protein niceliği için hızlı bir şekilde 10 μL ayırın ve hasarı önlemek için kalan mitokondriyal süspansiyona derhal 10 μL% 10 FFA BSA ekleyin.
- Bradford testini kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin.
- Standart eğri için, RB tamponunda bir proteinin bilinen konsantrasyonunun 30 μL seri seyreltisini hazırlayın. Örneğin, 1 mg / mL, 0.5 mg / mL, 0.25 mg / mL, 0.125 mg / mL, 0.0625 mg / mL ve 0 mg / mL BSA kullanın.
- RB tamponunda mitokondriyal örneklerin 1: 3 ve 1: 6 seri seyreltmelerini hazırlayın.
- 96 delikli düz tabanlı bir plakada, önce kuyu başına 2,5 μL numune/standart yükleyin. Daha sonra, her numuneye 10 μL 1 M NaOH ve son olarak 200 μL 1x Bradford reaktifi ekleyin. Hava kabarcıklarından kaçınarak iyice karıştırın. Numunelerin renginin kalibrasyon çizgisi içinde olup olmadığını görsel olarak kontrol edin. Analizi her zaman üçlü olarak gerçekleştirin.
- Plakaları karanlıkta RT'de 5 dakika boyunca inkübe edin ve bir mikroplaka spektrofotometresinde 595 nm'deki absorbansı okuyun.
- Bu bölümdeki (x ekseni) adım 22.1'de hazırlanan seyreltmelerin karşılık gelen protein konsantrasyonuna karşı absorbans değerlerini (y ekseni) çizerek standart eğriyi hesaplayın.
- Standart eğri ile ekstrapolasyon yaparak mitokondriyal örneklerdeki toplam protein miktarını hesaplayın.
3. Mikroplaka bazlı respirometrik testlerin hazırlanması
- Deneyden en az 12 saat önce respirometrik tahlil sensörünü, kuyu başına 1 mL kalibrasyon tamponu ile nemlendirin. 37 °C'de inkübe edin (CO2 yok).
NOT: Hidratlı sensörler 72 saate kadar kullanılabilir. Bu adımda kartuş dikkatli bir şekilde kullanılmalıdır: sensörlere herhangi bir şey dokunursa, ölçüm hassasiyeti etkilenebilir. - Hazırlık santrifüjünü, sallanan kova mikroplaka rotoru ve ilgili mikroplaka adaptörleri ile 4 °C'de önceden soğutun.
- Bilgisayarı açın, analiz yazılımını açın ve istediğiniz protokolü seçin.
NOT: Yazılım oksijen tüketimi ölçüm cihazına bağlandığında bir tıklama duyulur. Isıtma sensörü, deney başlamadan önce yeşil ve 37 ° C'de olmalıdır. - İnhibitör çözeltilerini, yapılacak tahlil uyarınca bölüm 1, adım 2'de belirtilen stoklardan hazırlayın. Her çözüm için yeterli hacim hazırlayın. Başvuru için Tablo 1 ve Tablo 2'ye bakınız.
- Her bağlantı noktasına her bir inhibitörün uygun hacmini ekleyin, kartuşu oksijen tüketimi ölçüm cihazına takın ve kalibrasyona başlayın.
NOT: Kartuşa inhibitör eklenmesi ve kartuşun cihaza takılması 15-20 dakika sürer. Doğru kartuş bileşenlerinin takıldığından emin olun. Kartuş kapağı ve hidro hidrofor, sensör kartuşu ve yardımcı alana ihtiyaç duyulurken atılabilir. - Bölüm 2'nin konsantre mitokondriyal süspansiyonunu, adım 21'i 10.500 × g'de 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
- Mitokondriyal peleti, gerçekleştirilecek protokole bağlı olarak 100 μL 1x CAM + BSA, 1x EFAM + BSA veya 1x BOXM + BSA'da yeniden askıya alın.
- Konsantre mitokondriyal numuneyi, karşılık gelen tahlil ortamında son 0.2 μg / μL konsantrasyonuna kadar seyreltin.
- Buz üzerinde önceden soğutulmuş 24 delikli bir mikroplakada kuyu başına süspansiyonun 50 μL'sini (toplam 10 μg protein) tohumlayın. Arka plan düzeltme kuyularına mitokondri eklemeyin; sadece ilgili tahlil ortamını ekleyin. Parçalanma saflığının belirlenmesi için kalan mitokondriyal süspansiyonu -80 °C'de saklayın (Şekil 3).
- Mikro plakayı önceden soğutulmuş preparatif santrifüjde 2.000 × g'de 4 ° C'de 20 dakika boyunca döndürün. Buna göre dengelemek için karşı ağırlık.
- Mikroplaka santrifüjleme sırasında kalan tahlil ortamını 37 ° C'de ısıtın.
- Santrifüjlemeden sonra, dengelemek için mikro plakayı tezgahta 5 dakika bekletin. RT'de kuyucuk başına 500 μL'lik son hacim için 450 μL sıcak tahlil ortamı ekleyin. Bunu yavaş ve dikkatli bir şekilde yapın, mitokondrilerin ayrılmasını önlemek için ortamı kuyucukların duvarına ekleyin.
- Mikroplakayı hemen oksijen tüketimi ölçüm cihazına kapaksız olarak yerleştirin ve protokolü başlatın (Tablo 3). Mikro plakanın ısınmasına izin vermek için ilk adımın 10 dakikalık bir inkübasyon olduğundan emin olun.
- Deney bittiğinde, kartuşu ve mikro plakayı çıkarın, cihazı kapatın ve analizi başlatın.
4. Sonuçların analizi
- CA ve BOX tahlilleri söz konusu olduğunda, aşağıdaki analizleri gerçekleştirin:
- Antimisin A ve rotenon enjeksiyonundan sonra elde edilen değerlerin ortalamasına karşılık gelen mitokondriyal olmayan O2 tüketimini kaydedin.
NOT: Antimisin A ve rotenon sırasıyla kompleks III ve I inhibitörleridir. - Bazal değerlerden mitokondriyal olmayan O2 tüketimini çıkararak bazal solunumu hesaplayın (ölçüm noktaları 1 ve 2).
- Mitokondriyal olmayan O2 tüketimini, mitokondriyal durum III'ü belirlemek için karmaşık V substratı ADP'nin (enjeksiyon A) enjeksiyonundan sonraki değerlerden çıkarın.
- Mitokondriyal durum IVo'yu elde etmek için kompleks V inhibitörü oligomisinin (enjeksiyon B) enjeksiyonundan sonra mitokondriyal olmayan O2 tüketimini solunum değerlerinden çıkarın.
- FCCP enjeksiyonu sonrası solunumdan mitokondriyal olmayan O2 tüketimini düşerek mitokondriyal durum IIIu'yu hesaplayın (enjeksiyon C).
NOT: FCCP güçlü bir mitokondriyal oksidatif fosforilasyon çözücüsüdür. ATP sentezi varlığında atlanır ve ETC maksimum aktiviteye ulaşır. - Artan enerji talebi durumunda ekstra ATP üretme kapasitesi olan mitokondriyal yedek kapasiteyi elde etmek için mitokondriyal durum IIIu değerlerinden bazal solunum değerlerini çıkarın.
- Solunum Kontrol Oranını (RCR) elde etmek için mitokondriyal durum IIIu'yu durum IVo değerlerine bölün.
NOT: Negatif veya boş RCR değerleri, mitokondriyal kuplajın etkilendiğini gösterir.
- Antimisin A ve rotenon enjeksiyonundan sonra elde edilen değerlerin ortalamasına karşılık gelen mitokondriyal olmayan O2 tüketimini kaydedin.
- EFA'ya başvurmak için aşağıdaki hesaplamaları gerçekleştirin:
- Rotenon ve Antimisin A enjeksiyonu sonrası ortalama değeri hesaplayarak artık aktivite elde edin (A ve C enjeksiyonları).
- Bazal değerlerden (ölçüm noktaları 1 ve 2) artık aktiviteyi çıkararak karmaşık I ila IV (CI-CIV) aktivitesini hesaplayın.
- CII-CIII-CIV aktivitesini elde etmek için CII substrat süksinatının (enjeksiyon B) enjeksiyonundan sonraki değerlerden artık aktiviteyi çıkarın.
- Sitokrom c-indirgeyici ajanlar, askorbik asit ve TMPD (enjeksiyon D) enjekte edildikten sonra elde edilen değerlerden artık aktiviteyi düşerek CIV aktivitesini hesaplayın.
- Uygun sonuçları çıkarmak için Şekil 4'te olduğu gibi çubuk grafikler kullanarak tüm sonuçları temsil edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada sunulan protokol, mitokondrinin fare iskelet kasından izole edilmesi yoluyla mitokondriyal solunumun in vivo analizine izin verir. Yöntemin bir anahattı Şekil 1'de gösterilmiştir. İskelet kasları arka bacaklardan diseke ettikten sonra (Şekil 2), dokular homojenize edilir ve izotonik koşullar altında, seri santrifüjlemeler yoluyla mitokondri saflaştırılır. İzolasyon işlemi sırasında elde edilen farklı fraksiyonların saflığı, farklı organel belirteçlerine karşı antikorlar kullanılarak batı lekesi ile analiz edilebilir. Şekil 3A , izole edilen fraksiyonlarda farklı protein popülasyonları gösteren farklı fraksiyonlardan genel protein profilini göstermektedir.
Şekil 3B, dış (VDAC ve TOMM20) ve iç (TIMM23) mitokondriyal membranların belirteçleri ve hatta nükleoid ile ilişkili proteinler (mtTFA) için güçlü sinyallerle kanıtlandığı gibi, tüm mitokondriyal içeriğin mitokondriyal fraksiyonda olduğunu göstermektedir. Tüm çekirdekler ve sitoiskelet (β-aktin), çekirdekleri ve bozulmamış materyali temsil eden Fraksiyon N'de bulunur (Şekil 3C). Ayrıca, endoplazmik retikulumun (ER) (Calnexin), plazma zarının (Na + / K + -ATPaseα1) veya sitoplazma belirteçlerinin (LDHA, HSP70 veya AKT) çoğu, izolasyon sırasında elde edilen yüksek saflığı vurgulayarak SN1 veya SN2 fraksiyonlarında kalır (Şekil 3C). Bununla birlikte, mitokondriyal fraksiyonda, muhtemelen bu organellerin yakınlığından dolayı birkaç ER kontaminasyonu izi vardır. Sonraki solunum tahlillerinde elde edilen sonuçlar göz önüne alındığında, burada açıklanan izolasyon prosedürü oldukça saf, uygulanabilir mitokondriyal preparatlar verir.
Hem CA hem de BOX testleri, spesifik metabolik yolları uyaran birkaç substratın varlığında farklı mitokondriyal durumların hesaplanmasına izin verir. Spesifik olarak, bu testler piruvik asit veya palmitoyl-L-karnitin klorür varlığında gerçekleştirilir. Piruvik asit, Krebs döngüsünün bir substratıdır; malik asit bir Krebs döngüsü aracısı ve bir NADH indüktörüdür, palmitoil-L-karnitin ise yağ asidi β-oksidasyon yolunun bir substratıdır. (Şekil 4A,B). Her iki tahlilde de, ölçülebilen ilk durum, başlangıçta tahlil ortamına eklenen substratların varlığında mitokondriyal solunumu temsil eden bazal solunum hızıdır. Daha sonra, ADP ve inorganik fosfattan ATP üretimini temsil eden ve kuplajlı bir durumda maksimum solunumu gösteren mitokondriyal Durum III elde edilir. Bu nedenle, Şekil 4A,B'de görüldüğü gibi, ADP ilavesinden sonra oksijen tüketiminde bir artış vardır.
Ayrıca, Devlet IVo, ATP sentazının oligomisin tarafından inhibisyonu ile ilişkili proton sızıntısını gösterir, bu da CA ve BOX grafiklerinde gözlemlendiği gibi solunumda bir azalmaya yol açar (Şekil 4A, B). FCCP'nin eklenmesi, bu tahlillerde oksijen tüketimi en yüksek seviyesine ulaştığında mitokondrinin bağlanmamış bir durumda gösterebileceği maksimum solunum kapasitesini gösteren Durum IIIu'ya yol açar. Tüm bu durumları hesaplamak için, oksidatif solunumu inhibe etmek için Antimisin A ve rotenon enjekte edildiğinde tahlilin sonunda elde edilen mitokondriyal olmayan solunumu belirlemek esastır. Şekil 4A,B'de gösterildiği gibi, bu değerlerin her zaman bazal solunumun altında olması ve burada açıklanan bu tahliller gibi izole mitokondrili tahlillerde sıfıra çok yakın olması gerekir. Son olarak, mitokondriyal bütünlüğü değerlendirmek için RCR parametresi hesaplanmalıdır. Mitokondrinin, düşük proton sızıntısı ile yüksek oranda ATP üreterek ADP'ye tepki verip veremeyeceğini yansıtır. CA ve BOX tahlillerinde bulunan ortalama RCR değerleri sırasıyla 5.78 ± 1.03 ve 3.47 ± 0.42 idi (Şekil 4A,B), daha önce bildirilen optimal RCR'lerle uyumludur21,22,23,24.
Ek olarak, EFA, ETC komplekslerinin aktivitesini bireysel olarak veya spesifik substratların ve inhibitörlerin enjeksiyonu yoluyla kombinasyon halinde inceler (Şekil 4C). CI-CIV aktivitesi, hiçbir kompleks inhibe edilmediğinde piruvat ve malat substratlarına dayanan mitokondriyal solunumu temsil eder; Bu durumda, elektronların çoğu CI'den geçer. Rotenon spesifik bir CI inhibitörü olduğundan, CI ilavesinden sonra bloke edilir ve oksijen tüketiminin azalmasına neden olur (Şekil 4C). CII-CIII-CIV aktivitesi, sadece CI bloke edildiğinde ve CII aktive edildiğinde solunum gösterir: B portundan enjekte edilen süksinat, kompleks II'nin (süksinat dehidrojenaz) spesifik bir substratıdır. Böylece, CII azalır, CII'den CIV'ye elektron akışını başlatırken, CI hala önceki rotenon enjeksiyonu tarafından inhibe edilir ve oksijen tüketiminde bir artış sağlar (Şekil 4C). Antimisin A ilavesi CIII'yi inhibe eder, ETC boyunca elektron akışını bloke eder ve oksijen tüketimini azaltır. Ayrıca, CIV aktivitesi, askorbik asit / TMPD ilavesiyle indirgendikten sonra sitokrom C oksidasyonu ile uyarıldığında belirlenir; Şekil 4C, CIV aktivasyonunun oksijen tüketiminde bir artış sağladığını göstermektedir. Son olarak, artık aktivite, oksidatif fosforilasyon zinciri rotenon ve Antimisin A ilavesinden sonra inaktive edildiğinde oksijen tüketimini ifade eder. Bu değer, bölüm 4'teki protokol adımları 2.2-2.4'te belirtildiği gibi komplekslerin aktivitesinin hesaplanması için arka planı oluşturur.
Şekil 1: Yöntemin şematik görselleştirmesi. Kısaltmalar: OCR = oksijen tüketim oranı; ADP = adenozin difosfat; OL = oligomisin; FCCP = karbonil siyanür-p-triflorometoksifenilhidrazon; AntA = Antimisin A; Çürük = rotenon. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Mitokondriyal solunum analizleri için murin iskelet kaslarının arka bacaklardan diseksiyonu ve izolasyonu . (A) Sağ arka bacak gerildi ve bantla hareketsiz hale getirildi. (B) Ayak bileğinin yanından deriden bir kesi yapıldı ve diz proksimalini durdurdu. TA'nın üzerindeki bağ dokusu dikkatlice çıkarıldı. EDL (C) ve TA (D) tendonları yerleştirmelerine yakın bölümlere ayrıldı. TA tendonu, kası altta yatan kas yapısından ve kemikten uzaklaştırmak için yukarı çekildi. Daha sonra, TA, ventral tepeye tibiaya yakın bir yerde, proksimal olarak kesildi. Benzer şekilde, EDL kası gevşetildi ve proksimal tendon dizin yan tarafında titizlikle kesildi. (F) TA ve EDL diseksiyonundan sonra sağ arka bacak. (G) Arka arka bacakta, Aşil tendonu GA ve soleus kaslarını diseke etmek için bölümlere ayrıldı. (H) GA ve soleus, tibial kemikten dikkatlice kurtarıldı. (I) Kalan kaslar, sadece fibula ve tibial kemikler kalana kadar ayak bileğinden dize kadar toplandı. (J) Diseksiyon sonrası arka böcek. (K) Quadriceps diseke edildi. (L) Posterior mitokondriyal izolasyon için toplanan tüm iskelet kasları. İşlem her iki arka bacak için de gerçekleştirildi. Kısaltmalar: TA = tibialis anterior; EDL = ekstansör digitorum longus; GA = gastroknemius. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Parçalanma sürecinin saflığı . (A) Coomassie mavisi ile boyanmış genel protein profili. (B) Mitokondriyal protein saflık profili. (C) Konjondriyal olmayan belirteçler. Mitokondri izolasyonu sırasında elde edilen farklı fraksiyonlar, spesifik hücre altı fraksiyonlardaki farklı proteinlere karşı antikorlarla yüklendi ve inkübe edildi. Kısaltmalar: fraksiyon N = homojenize edilmemiş doku ve çekirdekler; SN1 = süpernatant sayısı 1: sitoplazma + organeller; SN2 = süpernatant sayısı 2: sitoplazma + organeller; VDAC = voltaja bağlı anyon kanalı; TOMM20 = dış mitokondriyal membran 20'nin translokazı; mtTFA = mitokondriyal transkripsiyon faktörü A; TIMM23 = iç mitokondriyal membran translokazı 23; LDHA = laktat dehidrogenaz A; HSP70 = ısı şoku proteini 70; ER = endoplazmik retikulum. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Temsili sonuçlar. 13 aylık erkek vahşi tip C57BL/6N farenin arka bacak kaslarından izole edilen mitokondrinin biyoenerjetik profillemesi. Farklı substratların ve inhibitörlerin enjeksiyon noktaları her tahlilde belirtilmiştir. ETC ve OXPHOS makinelerinin performansı, sırasıyla Kaplin Tahlilinde (A) veya FA tahlillerinin (B) β-oksidasyonunda substrat olarak piruvat ve malat veya palmitoil-L-karnitin ve malat kullanılarak analiz edilebilir. (C) Elektron akış testi, piruvat, malat ve FCCP varlığında bireysel mitokondriyal komplekslerin incelenmesine izin verir; Kuyu başına 10 μg mitokondri kaplandı. Sonuçlar, sonuçları toplu bir biçimde görselleştirmek için orta nokta gösterimi seçeneğinin ardından görüntülenir. Bu, genellikle her ölçüm adımında gerçekleştirilen 9 ardışık ölçümün görselleştirilmesini sağlayacak noktadan noktaya seçeneğinin aksinedir. Görselleştirme türü, analiz yazılımındaki Kinetik çizgi grafik seçenekleri altında tahlil tamamlandıktan sonra değiştirilebilir. Kısaltmalar: FA = yağ asitleri; OCR = oksijen tüketim oranı; ADP = adenozin difosfat; FCCP = karbonil siyanür-p-triflorometoksifenilhidrazon; RCR = solunum kontrol oranı; EFA = Elektron Akış Testi; BOX = FA'nın β-oksidasyonu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Kaplin Testi | ||||||
| Liman | Inhibitörü | [Stok] | [Enjeksiyon Bağlantı Noktası] | [Final] | Yemek tarifi | |
| İnhibisyon | CAM-BSA | |||||
| A | ADP | 100 mM | 50 mM | 5 mM | 650 μL | 650 μL |
| B | Oligomisin | 4 mM | 31,6 μM | 3,16 μM | 11,3 μL | 1418,7 μL |
| C | FCCP (Mali İşler Sözleşmesi) | 20 mM | 60 μM | 6 μM | 4,68 μL | 1555,32 μL |
| D | Antimisin A // Rotenon | 5 mM // 4 mM | 40 μM // 50 μM | 4 μM // 5 μM | 13,52 μL // 21,12 μL | 1655,36 μL |
| Elektron Akış Testi | ||||||
| Liman | Inhibitörü | [Stok] | [Enjeksiyon Bağlantı Noktası] | [Final] | Yemek tarifi | |
| İnhibisyon | EFAM-BSA | |||||
| A | Rotenon | 4 mM | 50 μM | 5 μM | 16,25 μL | 1283,7 μL |
| B | Süksinat | 500 mM | 100 mM | 10 mM | 286 μL | 1144 μL |
| C | Antimisin A | 5mM | 4 μM | 4 μM | 12,48 μL | 1547,5 μL |
| D | Askorbat // TMPD | 1 M // 50 mM | 100 mM // 1 mM | 10 mM // 100 μM | 169 μL // 33,8 μL | 1487,2 μL |
| β-Oksidasyon Testi | ||||||
| Liman | Inhibitörü | [Stok] | [Enjeksiyon Bağlantı Noktası] | [Final] | Yemek tarifi | |
| İnhibisyon | KUTU-BSA | |||||
| A | ADP | 100 mM | 40 mM | 4 mM | 520 μL | 780 μL |
| B | Oligomisin | 4 mM | 31,6 μM | 3,16 μM | 11,3 μL | 1418,7 μL |
| C | FCCP (Mali İşler Sözleşmesi) | 20 mM | 60 μM | 6 μM | 4,68 μL | 1555,32 μL |
| D | Antimisin A // Rotenon | 5 mM // 4 mM | 40 μM // 20 μM | 4 μM // 2 μM | 13,52 μL // 8,45 μL | 1668 μL |
Tablo 1: Farklı tahliller için inhibitör solüsyonlarının hazırlanması. [Stok] sütunu, İnhibitör sütununda belirtilen bileşiğin stok çözeltilerinin konsantrasyonlarını gösterir. [Enjeksiyon Portu ], kartuşun farklı portlarına yüklenecek inhibitör çözeltilerinin konsantrasyonunu ifade ederken, [Son] kolonu, inhibitörlerin kuyulardaki son konsantrasyonunu gösterir. Son olarak, Reçete sütunları, enjeksiyon portlarına yüklenecek çözeltileri hazırlamak için karıştırılması gereken stok inhibitörü çözeltilerinin ve BSA içermeyen ortamların hacimlerini belirtir. Kısaltmalar: ADP = adenozin difosfat; FCCP = karbonil siyanür-p-triflorometoksifenilhidrazon; TMPD = N,N,N′ ,N′-tetrametil-para-fenilen-diamin; İnhib = inhibitör; BSA = sığır serum albümini; CAM-BSA = BSA'sız kaplin testi ortamı; EFAM-BSA = BSA'sız elektron akış testi ortamı; BOX-BSA = BSA içermeyen β-oksidasyonu yağ asidi tahlil ortamı.
| Liman | Enjekte edilen hacim | Hazırlanan stok (26 kuyu) |
| A | 50 μL | 1300 μL |
| B | 55 μL | 1430 μL |
| C | 60 μL | 1560 μL |
| D | 65 μL | 1690 μL |
Tablo 2: Enjeksiyon hacimlerinin hesaplanması.
| Eylem | Süre (dakika) | Tekrarlama | Liman |
| Ayarlamak | 15-20 | ||
| Beklemek | 10 | ||
| Karıştır + Bekle | 1 + 3 | × 2 | |
| Karışım | 1 | ||
| Ölçü + Karıştır | 3 + 1 | × 2 | |
| Enjekte | A | ||
| Karışım | 1 | ||
| Ölçmek | 3 | ||
| Karışım | 1 | ||
| Enjekte | B | ||
| Karışım | 1 | ||
| Ölçmek | 3 | ||
| Karışım | 1 | ||
| Enjekte | C | ||
| Karışım | 1 | ||
| Ölçmek | 3 | ||
| Karışım | 1 | ||
| Enjekte | D | ||
| Karıştır + Ölç | 1 + 3 | × 2 |
Tablo 3: Farklı tahliller için protokol ayarları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mitokondriyal solunumu incelemek için kullanılan tüm yöntemlerin sınırlamaları vardır; Bu nedenle, belirli bir deneysel soruya en uygun yöntemi seçmek çok önemlidir. Bu çalışma, mitokondriyal fonksiyonu araştırmak için farklı solunum tahlilleri yapmak üzere mitokondrileri fare iskelet kasından izole etmek için güncellenmiş ve ayrıntılı bir protokol sağlar. Gerçekten de, mikroplaka bazlı teknolojiler kullanılarak izole mitokondride mitokondriyal biyoenerjetik çalışmaların incelenmesi, dokuya özgü solunumu tekrarlanabilirlik, güvenilirlik ve karmaşıklık açısından incelemek için değerlidir. Ayrıca, izole mitokondri kullanımı, substrat mevcudiyeti üzerinde kontrol sağlar ve altta yatan biyolojik süreçlerin anlaşılmasını kolaylaştırır. İzole mitokondri kullanmanın bir diğer olumlu yönü, Durum III'ü incelemenin mümkün olmasıdır, çünkü ADP enjeksiyonundan sonra üretilen ATP, transmembran ATPazlarının çoğu kaybolduğu için tekrar yeni ADP'ye dönüştürülmez. Ayrıca, burada açıklanan tahlillerde, potansiyel spesifik olmayan ATP sentezini bloke etmek için oligomisin eklenir20.
Bu protokol için birkaç önemli hususun vurgulanması gerekir. İlk olarak, izole mitokondri son derece hassastır ve dikkatle ele alınmalıdır. Kullanılan tamponlardaki yüksek sakkaroz ve mannitol içeriği, izole mitokondrileri hasardan korumak için en uygun ozmotik koşulları sağlar. Bununla birlikte, mitokondriyal canlılığı korumak ve tohumlandıktan sonra mikroplakadan ayrılmayı önlemek için tahlil süresi minimumda tutulmalıdır. Bu nedenle, tahlil ortamının ve substrat ve inhibitör çözeltilerinin hazırlanması veya inhibitörlerin respirometrik tahlil kartuşuna yüklenmesi gibi protokol adımlarının zaman alıcı olduğu göz önüne alındığında, her adım mükemmel bir şekilde koordine edilmelidir. Ayrıca, enzimatik çürümeye21,24 ve harç ve havane homojenizasyonuna17,19,21,23,24 dayanan diğer yöntemlerden farklı olarak, burada açıklanan yöntem, hızlı ve verimli numune homojenizasyonu sağlayan otomatik bir homojenizatörün kullanımına dayanmaktadır. Önemli olarak, mitokondriyal süspansiyonlar yüksek konsantrasyonda ise daha az hassastır. Bu nedenle, kullanmadan hemen önce sadece seyreltmeleri hazırlayın. Son olarak, respirometrik tahlil sırasında hızlı bir şekilde çalışmak önemlidir. Genellikle, bu tahlillerde kültürdeki hücreleri analiz ederken, substratların veya inhibitörlerin enjeksiyonundan sonra üç ardışık ölçüm adımı gerçekleştirilir, bu da 40 ila 50 dakika arasında uzanan protokollerle sonuçlanır., İzole edilmiş mitokondrinin tüm prosedür boyunca yaşayabilirliğini sağlamak için, ölçüm adımlarının sayısı genellikle kırılganlıkları nedeniyle minimumda tutulur19, 23,25, respirometrik analizi tamamlamak için gereken süreyi ~ 20 dakikaya düşürür. Bu çalışmada açıklanan protokoller (Tablo 3), daha önce yayınlanmış diğer yöntemler daha uzun ve daha standart ölçüm adımlarına sahip verimli OCR profilleri bildirmesine rağmen26 bu eğilimi izlemektedir.
Örneğin, aynı gün aynı numune setiyle iki ardışık tahlil yapılacaksa, mitokondriyal seyreltmeler hariç, ilk tahlil sırasında tüm reaktifleri ikinci tahlil için hazırlayın: ikinci tahlil başlamadan hemen önce sadece mitokondrileri seyreltin, tohumlayın ve spin mitokondri, alet kalibre edilirken. Deney tamamlandıktan sonra, kullanılan mitokondriyal preparatların kalitesini değerlendirmek için RCR parametresi (bölüm 4, adım 1.7) hesaplanmalıdır. Genellikle, 3.5 ile 5 arasındaki RCR değerleri, mitokondriyal bütünlüğün optimal olduğunu ve fonksiyonel eşleşmiş oksidatif solunum gösterdiğini gösterir25. Düşük RCR değerlerine sahip tahliller atılmalıdır, çünkü izolasyon sırasında mitokondriyal bütünlük tehlikeye girmiştir. Bu durumlarda, mitokondriyal peleti daha önce bildirildiği gibi iki kez yıkamayı düşünün (bölüm 2, adım 19-21)22.
İkincisi, prosedür boyunca doğru pH'ı korumak, başarılı sonuçlar elde etmek için kritik öneme sahiptir. Tüm çözeltilerin pH'ının belirtildiği gibi, yani pH 7.2 olarak ayarlandığından ve aksi belirtilmedikçe pH'ın her zaman KOH ile ayarlandığından emin olun. Özellikle, BSA içeren tamponların pH'ı, BSA proba zarar verebileceğinden doğrudan pH metre ile ölçülmemelidir. Bu nedenle, BSA eklemeden önce ilgili tamponlardaki pH'ı ayarlayın. BSA ilavesi nedeniyle pH'taki değişiklikleri önlemek için, her zaman FFA BSA kullanın. Ayrıca, bazı ultra saf H2O partileri asidik olabilir, bu nedenle ticari olarak saflaştırılmış, pH 7 H2O kullanılması önerilir. Ayrıca, pH metrenin doğru kalibre edildiğinden ve hazırlanacak kimyasalların pH'ını ölçmek için uygun model olduğundan emin olmak gerekir.
Üçüncüsü, mitokondriyal yıkımı önlemek için son mitokondriyal süspansiyonun (bölüm 2, adım 21) protein ölçümü için numune toplama adımının doğru bir şekilde gerçekleştirilmesi çok önemlidir. Peleti hızlı ama kapsamlı bir şekilde yeniden askıya alın, bir aliquot toplayın ve ozmotik dengeyi korumak ve mitokondrileri hasardan korumak için kalan süspansiyona FFA BSA ekleyin. FFA BSA, resüsitasyon tamponunda zaten mevcut olsaydı ve bu nedenle, protein niceliği sırasında, yüksek protein içeriği nicelleştirme sonuçlarını karıştırırdı. Bu nedenle FFA BSA'nın niceleme için bir aliquot ayrıldıktan sonra eklenmesi gerekir.
Dördüncüsü, bu yöntem çok yönlüdür ve deneycinin ihtiyaçlarına göre ayarlanabilir. Örneğin, incelenen hayvan modeli azalmış kas kütlesi (örneğin, sarkopenik fareler) ile karakterize edilirse, ek kaslar mitokondriyal verimi artırabilir. Bu çalışmada yetişkin bir vahşi tip erkek C57BL / 6N fare kullanılmasına rağmen, bunun yerine herhangi bir cinsiyet, yaş veya genetik geçmişe sahip hayvanların yanı sıra belirli kas tipleri de kullanılabilir.
Beşincisi, solunum değerleri, her seferinde taze olarak hazırlanması gereken tamponların ve reaktiflerin bileşimindeki küçük değişiklikler nedeniyle deneyler arasında farklılık gösterebilir. Yaş, cinsiyet, genetik arka plan veya çevresel koşullar da sonuçlar üzerinde derin bir etkiye sahip olabilir. Bununla birlikte, başarılı bir deney, ADP ve süksinat gibi karmaşık substratların enjeksiyonundan sonra oksijen tüketiminde artışlar, oligomisin veya rotenon gibi inhibitörlerin enjeksiyonundan sonra azalma ve güçlü uncoupler FCCP eklendiğinde belirgin artışlar göstermelidir. Ayrıca, yüksek teknik değişkenliği önlemek için, mikroplakaya tohumlamadan önce homojen süspansiyonlar elde etmek için mitokondriyal peletlerin kapsamlı bir şekilde yeniden süspansiyonlanmasını sağlayın.
Altıncısı, bazal solunum değerleri düşükse, tohumlama için protein miktarını ayarlamak için bir titrasyon deneyi yapmayı düşünün. Son olarak, bu çalışma ham mitokondriyal ekstraktlar elde etmek için bir yöntem sağladığından, başta ER olmak üzere diğer organellerle ilişkili belirli bir safsızlık derecesi beklenmektedir. Bu safsızlıkları gidermek için daha agresif bir parçalanma süreci, mitokondriyal canlılığa zarar verecek ve solunum tahlillerinin performansını engelleyecektir. Saflık bir endişe ise, özellikle numuneler arasında tutarlı değilse, tahlil sonuçları, farklı organel belirteçlerine karşı batı lekeleri çalıştırıldıktan sonra mitokondriyal saflığa göre normalleştirilebilir (Şekil 3). Bildiğimiz kadarıyla, bu, ham ekstraktlarda mitokondriyal saflık ile ilgili endişeleri vurgulayan ilk yöntemdir. Genellikle, izole mitokondrili respirometrik testler için diğer protokollerde, her durumda aynı miktarda mitokondri kullanıldığı varsayılarak, numuneleri karşılaştırmak için kuyucuklarda aynı miktarda protein ekstresi ekilir. Bu, izolasyonun tüm örneklerde paralel olarak gerçekleştirildiği göz önüne alındığında makul bir varsayımdır. Bununla birlikte, incelenen örneklerin genetik veya çevresel arka planı, mitokondriyal ekstraktların saflığında önemli farklılıklara yol açabilir. Örneğin, belirli bir genetik mutasyon sitoplazmik ER'nin gelişiminin artmasına neden olursa, bu hayvanlardan elde edilen ham mitokondriyal ekstraktlar beklenenden daha büyük ER içeriği ve sonuç olarak beklenenden daha düşük mitokondriyal protein içerebilir. Bu nedenle, kontrol ve mutant örneklerden elde edilen aynı miktarda toplam protein mikroplakaya tohumlansa bile, mutantların oksijen tüketimi hafife alınacaktır. Bu nedenle, incelenen tüm koşulların ekstraktlarının saflığının belirlenmesi önerilir. Değerler karşılaştırılabilirse, normalleştirmeye gerek yoktur. Bununla birlikte, numuneler arasındaki saflık değerleri, deneycinin kabul etmeye istekli olduğu istatistiksel hatanın ötesinde önemli ölçüde farklılık gösteriyorsa, oksijen tüketimi sonuçlarını normalleştirmek için kullanılmalıdır.
Mevcut protokolün bazı sınırlamaları vardır. Not olarak, bu yöntem farelerden izole edilen iskelet kası dokusu için optimize edilmiştir. Farklı türlerden farklı dokular veya iskelet kası kullanılıyorsa ayarlamaların yapılması gerekebilir. Ek olarak, izole mitokondri üzerinde analizler yapıldığında, hücresel bağlamın ve mitokondri ile etkileşime girebilecek diğer organellerin yokluğu nedeniyle normal hücresel mikro ortam kaybolur. Bu, fizyolojik koşullardan biraz sapan sonuçlara yol açabilir. Son olarak, mitokondriler santrifüj edildiğinden, kuyuların dibine yapışırlar. Tamamen gerekli olsa da, santrifüjlemenin normal durumları üzerindeki potansiyel etkileri bilinmemektedir.
Respirometrik tahlil analizleri yapıldıktan sonra, izole mitokondride ATP'ye bağlı veya FCCP ile uyarılmış solunumla ilişkili oksijen tüketimindeki bir azalmanın, 20 ile açıklanabilecek potansiyel mitokondriyal değişiklikleri gösterebileceğini dikkate almak önemlidir: 1) substratların iç mitokondriyal membran boyunca sınırlı taşınması, 2) spesifik metabolik yolların hız sınırlayıcı reaksiyonlarında yer alan enzimlerin aktivitesinin azalması ETC, Krebs döngüsü veya β-oksidasyon veya 3) diğer olası açıklamaların yanı sıra bozulmuş ETC fonksiyonu.
Özetle, burada açıklanan güncellenmiş yöntem, iskelet kası dokusundan ETC ve OXPHOS fonksiyonunu değerlendirmek için yeterli ve güvenilir bir yolu temsil etmektedir. Genetik modifikasyonların veya çevrenin belirli bir fenotipe katkıda bulunan mitokondriyal solunumu nasıl etkileyebileceğini değerlendirmek için birden fazla uygulamaya sahiptir. Dikkat çekici bir şekilde, mevcut protokol diğer model organizmalara uyarlanabilir veya insan hastalığı ile ilişkili potansiyel mitokondriyal işlev bozukluklarını değerlendirmek için insan örnekleriyle birlikte kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, açıklayacakları herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Juan J. Tena'ya homojenizatörün kullanımı için ve teknik destek için CABD Proteomik ve Hayvancılık tesislerine teşekkür ederiz. Bu çalışma, İspanya Eğitim, Kültür ve Spor Bakanlığı tarafından FPU16/03264 - J.D.H.C., Association Française contre les Myopathies (AFM) tarafından C.V.-G.'ye burs hibesi #22450, Kurumsal Hibe MDM-2016-0687 (Maria de Maeztu Mükemmellik Birimi, CABD'de Gen Düzenleme ve Morfogenez Bölümü) ve BFU2017-83150-P ile J.J.C'ye desteklenmiştir. Endülüs Cuntası, P18-RT-4572, Avrupa Birliği'nden FEDER Finansman Programı ve İspanya Bilim, İnovasyon ve Üniversiteler Bakanlığı RED2018-102576-T'yi P.N.'ye hibe ediyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma | A5285 | Stock at -20 °C |
| AKT antibody | Cell Signaling Technology | C67E7 | Rabbit (Host species) |
| anti-Goat HRP | Sigma | 401504 | Rabbit (Host species) |
| anti-Mouse HRP | Cell Signaling | #7076 | Horse (Host species) |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | Stock at -20 °C |
| anti-Rabbit HRP | Cell Signaling | #7074 | Goat (Host species) |
| Ascorbic acid | Sigma | A5960 | Stock at RT |
| Bactin antibody | Sigma | MBS4-48085 | Goat (Host species) |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve |
| BSA, fraction V, Fatty Acid-Free | Calbiochem | 126575 | Stock at 4 °C |
| C tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Purple lid |
| Calnexin antibody | ThermoFisher | MA3-027 | Mouse (Host species) |
| D-mannitol | Sigma | M4125 | Stock at RT |
| EDTA | BDH | 280254D | Stock at 4 °C |
| EGTA | Sigma | E-4378 | Stock at RT |
| FCCP | Sigma | C2920 | Stock at -20 °C |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Homogenizer |
| HEPES | Sigma | H3375 | Stock at RT |
| HSP70 antibody | Proteintech | 10995-1-AP | Rabbit (Host species) |
| LDH-A antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC27230 | Goat (Host species) |
| Magnesium chloride | ChemCruz | sc-255260A | Stock at RT |
| Malic acid | Sigma | P1645 | Stock at RT |
| Microplate spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH | POLARstar OMEGA S/N 415-0292 | Stock at RT |
| Milli-Q water | Millipore system | F7HA17757A | Ultrapure water |
| mtTFA antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC23588 | Goat (Host species) |
| Na+/K+-ATPase α1 antibody | Novus Biologicals | NB300-14755 | Mouse (Host species) |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | Stock at -20 °C |
| Palmitoyl-L-carnitine | Sigma | P1645 | Stock at -20 °C |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | 1x stock at RT |
| Potassium dihydrogen phosphate | ChemCruz | sc-203211 | Stock at RT |
| Potassium hydroxide | Sigma | 60377 | Stock at RT |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | Stock at 4 °C |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Stock at -20 °C |
| Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer | Agilent Technologies | 420179 | XFe24 model |
| Seahorse XFe24 FluxPak mini | Agilent Technologies | 102342-100 | The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution |
| Succinate | Sigma | S7626 | Stock at RT |
| Sucrose | Sigma | S9378 | Stock at RT |
| TIMM23 antibody | Abcam | ab230253 | Rabbit (Host species) |
| TMPD | Sigma | T7394 | Stock at -20 °C |
| TOMM20 antibody | Abcam | ab56783 | Mouse (Host species) |
| VDAC antibody | Abcam | ab15895 | Rabbit (Host species) |
References
- Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
- Alberts, B., et al. The mitochondrion. Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , Garland Science. New York. (2002).
- Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. Metabolism and function of coenzyme Q. Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).
- Alcázar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency. Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).
- Banerjee, R., Purhonen, J., Kallijärvi, J. The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology. The FEBS Journal. , (2021).
- Gorman, G. S., et al.
- Villalba, J. M., Navas, P. Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes. Free Radical Biology & Medicine. 165, 312-323 (2021).
- Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6 (7), 21746 (2011).
- Pala, F., et al. Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis. Journal of Cell Science. 131 (14), 212977 (2018).
- Shintaku, J., et al. MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-ĸB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).
- Li, R., et al. Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles. The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).
- Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).
- Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
- Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells. Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).
- Shintaku, J., Guttridge, D. C. Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry. Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).
- Bharadwaj, M. S., et al. Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350 (2015).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
- Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
- Das, K. C., Muniyappa, H. Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2. Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).
- Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Methods. 3 (2), 42 (2016).
- Sakamuri, S. S. V. P., et al. Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research. Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).
- Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
- Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
- Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216 (2015).
