Summary
Aqui, descrevemos um método detalhado para o isolamento das mitocôndrias do músculo esquelético do camundongo e a análise subsequente da respiração pela Taxa de Consumo de Oxigênio (OCR) usando assins respirométricos à base de microplacas. Este gasoduto pode ser aplicado para estudar os efeitos de múltiplas intervenções ambientais ou genéticas no metabolismo mitocondrial.
Abstract
A maior parte da energia da célula é obtida através da degradação da glicose, ácidos graxos e aminoácidos por diferentes vias que convergem para o sistema de fosforilação oxidativa mitocondrial (OXPHOS), que é regulado em resposta às demandas celulares. A molécula lipídica Coenzyme Q (CoQ) é essencial nesse processo, transferindo elétrons para o complexo III na cadeia de transporte de elétrons (ETC) através de ciclos constantes de oxidação/redução. O estado mitocôndria e, em última análise, a saúde celular podem ser avaliadas medindo o consumo de oxigênio etc usando assistos respirométricos. Esses estudos são tipicamente realizados em linhas celulares estabelecidas ou primárias que foram cultivadas por vários dias. Em ambos os casos, os parâmetros de respiração obtidos podem ter se desviado de condições fisiológicas normais em qualquer determinado órgão ou tecido.
Além disso, as características intrínsecas das fibras únicas cultivadas isoladas do músculo esquelético impedem esse tipo de análise. Este artigo apresenta um protocolo atualizado e detalhado para a análise da respiração em mitocôndrias recém-isoladas do músculo esquelético do camundongo. Também fornecemos soluções para possíveis problemas que possam surgir em qualquer etapa do processo. O método aqui apresentado poderia ser aplicado para comparar as taxas de consumo de oxigênio em diversos modelos de camundongos transgênicos e estudar a resposta mitocondrial a tratamentos medicamentosos ou outros fatores como envelhecimento ou sexo. Este é um método viável para responder a perguntas cruciais sobre metabolismo e regulação bioenergetics mitocondrial.
Introduction
Mitocôndrias são as organelas metabólicas primárias na célula1. Essas organelas especializadas em membrana usam moléculas de nutrientes para produzir energia na forma de triphosfato de adenosina (ATP) por OXPHOS. Este processo se baseia na transferência de elétrons de moléculas de doadores em uma série de reações redox no ETC2. CoQ é o único lipídio ativo de redox que é endogenosamente produzido em todas as membranas celulares e lipoproteínas circulantes que mostra função antioxidante3. É um componente essencial do ETC, transferindo elétrons do complexo I e fadh2 dependentes de NADH II para o complexo III, embora muitas outras reductases possam conduzir a redução do CoQ mitocondrial para o ubiquinol como um passo obrigatório em múltiplas vias metabólicas celulares4,5.
Ao longo do processo, um gradiente de prótons eletroquímicos é criado através da membrana interna mitocondrial, que é transformada em energia biologicamente ativa pelo complexo de sintetizador ATP V2. Consequentemente, a disfunção mitocondrial leva a uma miríade de condições patológicas que afetam principalmente tecidos com necessidades de alta energia - o cérebro, o coração e o músculo esquelético6,7. Por isso, é fundamental desenvolver métodos para analisar com precisão os bioenergésicos mitocondriais para investigar seu papel na saúde e na doença, particularmente em tecidos altamente energéticos, como os músculos esqueléticos.
O eletrodo de oxigênio do tipo Clark tem sido usado clássicamente no estudo da respiração mitocondrial8. No entanto, este sistema tem sido progressivamente deslocado por tecnologias de maior resolução, com tecnologias de consumo de oxigênio baseadas em microplaca, como os analisadores XF Agilent Seahorse sendo especialmente populares9. No campo muscular esquelético, esses estudos são tipicamente conduzidos em células cultivadas, principalmente na linha de células mioblast do camundongo imortalizada C2C12 ou culturas primárias derivadas de células satélite10,11. No entanto, esses estudos não recapitulam totalmente a situação in vivo, especialmente quando se investigam a biologia mitocondrial e funcionam no nível tecidual sobre insultos específicos, intervenções nãogenéticas ou manipulações genéticas.
Além disso, os ensaios de respiração nas células são mais complexos devido a fatores adicionais, incluindo a demanda extra-mitocondrial de ATP e ensaios substratos ou eventos de sinalização, o que poderia enganar a interpretação dos resultados. Alternativamente, também é possível usar pacotes únicos ou de miofibers recém-isolados dos músculos. No entanto, o método de isolamento é tecnicamente desafiador e só é viável para alguns tipos musculares. Neste caso, os músculos flexor digitorum brevis (FDB) e extensor digitorum longus (EDL) são usados principalmente10,12,13, embora alguns relatórios descrevam o uso de outros tipos musculares também14,15.
O perfil bioenergésico das seções musculares esqueléticas também foi relatado16. A maior vantagem deste método é que músculos intactos podem ser estudados (os autores mostram que o corte através de fibras não perturba os resultados quando comparado com miofibers isolados). No entanto, o acesso mitocondrial a substratos e inibidores de ensaios é limitado e, portanto, apenas alguns parâmetros podem ser medidos16. Por fim, mitocôndrias isoladas também podem ser empregadas9,17,18,19. Neste caso, mitocôndrias perdem seu ambiente citosolico, o que pode afetar sua função. Em contraste, este método garante o acesso a substratos e inibidores, permite a análise de uma infinidade de tipos de amostragem e normalmente requer menos material.
Este artigo descreve um método para realizar o perfil bioenergéstico de mitocôndrias isoladas do músculo esquelético do rato usando assins respirométricos à base de microplacas (Figura 1). Em particular, três protocolos são detalhados: o Ensaio de Acoplamento, CA para avaliar o grau de acoplamento entre o ETC e o maquinário OXPHOS; o Ensaio de Fluxo de Elétrons, EFA para medir a atividade dos complexos etc individuais; e o ensaio BOX para determinar a capacidade mitocondrial de β-oxidação. Notavelmente, apenas pequenas quantidades de amostras são necessárias em comparação com métodos convencionais de respirometria. O protocolo de isolamento utilizado aqui foi modificado a partir do método publicado em outros lugares18.
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Protocol
A coleta de camundongos e a coleta de tecidos foram realizadas por meio de protocolos aprovados pelo Comitê de Ética da Universidad Pablo de Olavide (Sevilla, Espanha; protocolos 24/04/2018/056 e 03/12/2021/033) de acordo com o Decreto Real Espanhol 53/2013, Diretiva Europeia 2010/63/UE, e outras diretrizes relevantes.
1. Preparação de estoques, buffers e reagentes para os ensaios de respiração
- Prepare as seguintes soluções de estoque, que podem ser armazenadas na temperatura indicada por meses. Use H2O ultrauso em todos os casos.
- Dissolver comprimidos de soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) em H2O (1 comprimido por 200 mL de H2O) para preparar 1x PBS. Autoclave a solução e armazene-a à temperatura ambiente (RT).
- Dissolva 2 g de pelotas NaOH em 50 mL de H2O para preparar 1 M NaOH.
- Prepare 0,1 M, 1 M, 5 M e 10 M KOH para calibração de pH.
- Adicione 14,612 g de EDTA a 70 mL de H2O. Adicione pelotas NaOH até que o pH atinja 8,0 para que o EDTA se dissolva completamente. Adicione satis quântico H2O (QS) a 100 mL. Autoclave a solução resultante de 0,5 M EDTA (pH 8) e armazene-a na RT.
- Adicione 19 g de EGTA a 70 mL de H2O. Adicione pelotas NaOH até que o pH atinja 8,0 para permitir que o EGTA se dissolva totalmente. Adicione H2O QS a 100 mL. Autoclave a solução resultante de 0,5 M EGTA (pH 8) e armazene-a na RT.
- Adicione 2 mL de 0,5 M EDTA a 98 mL de PBS. Armazene a solução EDTA/PBS resultante de 10 mM na RT.
- Dissolva 5.958 g de HEPES em H2O de 40 mL. Ajuste o pH para 7,2 com KOH e QS a 50 mL com H2O. Filtre o buffer HEPES resultante de 0,5 M através de uma malha de 0,45 μm e armazene-o na RT.
- Dissolver 3.402 g de KH2PO4 em até 50 mL de H2O. Filtrar a solução KH2PO4 resultante de 0,5 M através de uma malha de 0,45 μm e armazená-la na RT.
- Dissolver 9.521 g de MgCl2 anidro em até 100 mL de H2O. Autoclave a solução resultante de 1 M MgCl2 e armazene-a na RT.
NOTA: Como se trata de uma reação exotérmica, proceda com cautela e dissolva o MgCl2 no gelo.
- Prepare soluções de estoque de substrato e inibidor (ver Tabela 1). Aliquot e armazene-os a -20 °C. Evite ciclos de congelamento. Como exceção, prepare sempre o ácido piruvico imediatamente antes do uso.
- Prepare-se em H2O ultrapure: 0,5 M de succinato, 0,5 M de ácido piruvico, 0,5 M de ácido mánico, 100 mM ADP, 1 M de ácido ascórbico e 50 mM N,N,N',N'-tetramethyl-para-fenileno-diamina (TMPD) (proteger da luz).
- Prepare-se em sulfóxido de 100% dimetil (DMSO): 50 mM palmitoyl-L-carnitina, 4 mM rotenona, 20 mM de cianeto carbonil -p-trifluorometoyilhydrazone (FCCP), 4 mM de oligomicina e 5 mM antimicina A.
NOTA: Não exceda a concentração final de DMSO de 0,1% nos poços de microplacas. Portanto, prepare soluções de estoque altamente concentradas para ficar abaixo desse limite.
- Prepare os buffers para isolamento de mitocôndrias e quantificação de proteínas recentemente no dia do experimento. Use H2O ultrauso em todos os casos e mantenha todos os buffers no gelo, a menos que seja indicado de outra forma.
NOTA: Para economizar tempo, todos os reagentes podem ser pesados e mantidos nos recipientes apropriados (por exemplo, tubos de 15 mL) na temperatura certa no dia anterior.- Para preparar 10% de ácidos graxos livres (FFA) BSA, dissolva completamente 150 mg de FFA BSA em 1,5 mL de H2O por inversão/roda rotativa. Não vórtice para evitar espuma.
- Para preparar 1x reagente Bradford, diluir a solução de estoque comercial de 5x com H2O e mantê-lo no escuro na RT.
- Para preparar 8x Tampão mitocôndria (MB), dissolva 4,112 g de sacarose e 763 mgs de HEPES em 15 mL de H2O. Ajuste o pH para 7,2, adicione 1,6 mL de 10% FFA BSA e QS a 20 mL com H2O.
- Para preparar 20 mL de Tampão de Isolamento 1 (IB1) (4 mL usado por amostra), dissolva 400 μL de 0,5 M EDTA, 784 mg de D-mannitol e 2,5 mL de 8x MB em 15 mL de H2O. Ajuste o pH para 7,2 e QS com H2O.
- Para preparar 5 mL de Tampão de Isolamento 2 (IB2) (500 μL usado por amostra), dissolva 30 μL de 0,5 M EGTA, 196 mg de D-mannitol e 625 μL de 8x MB em 4 mL de H2O. Ajuste o pH para 7,2 e QS com H2O.
- Para preparar 5 mL de Tampão de Ressuspensão (RB) (200 μL usado por amostra), dissolva 120 mg de sacarose, 191,3 mg de D-mannitol, 50 μL de 0,5 M HEPES e 10 μL de 0,5 M EGTA em 4 mL de H2O. Ajuste o pH para 7,2 e QS com H2O.
- Para preparar 2x Mitocondrial Assay Solution-1 (MAS-1), dissolver 1.199 g de sacarose, 2,8 g de mannitol, 1 mL de 0,5 M KH2PO4, 250 μL de 1 M MgCl2, 200 μL de 0,5 M HEPES e 100 μL de 0,5 M EGTA em 20 mL de H2O. Ajuste o pH para 7,2 e QS para 25 mL com H2O. Mantenha no gelo por períodos curtos. Por períodos mais longos, mantenha-o a 4 °C para evitar precipitação.
- Para preparar 1x Acoplamento médio de ensaio (CAM), prepare dois buffers diferentes baseados em MAS-1: 1) CAM+BSA para o ensaio CA adequado, e 2) CAM-BSA para preparar os inibidores do ensaio. Mantenha sempre a relação piruvato:malate em 10:1.
NOTA: Como a BSA pode entupir as portas de injeção, diluir os inibidores na CAM livre de BSA.- Para preparar CAM+BSA, diluir 300 μL de ácido piruvico de 0,5 M, 30 μL de ácido malic de 0,5 M e 7,5 mL de 2x MAS-1 em 6 mL de H2O. Ajuste o pH para 7,2. Adicione 300 μL de 10% FFA BSA e QS a 15 mL com H2O.
- Para preparar o CAM-BSA, diluir 120 μL de ácido piruvico de 0,5 M, 12 μL de ácido malic de 0,5 M e 3 mL de 2x MAS-1 em 2 mL de H2O. Ajuste o pH para 7,2 e QS a 6 mL com H2O.
- Para preparar o 1x Electron Flow Assay medium (EFAM), prepare tanto os buffers EFAM contendo BSA quanto os EFAM livres de BSA.
- Para preparar o EFAM+BSA, diluir 300 μL de ácido piruvico de 0,5 M, 60 μL de ácido 0,5 M de mánico, 3 μL de 20 mM FCCP e 7,5 mL de 2x MAS-1 em 6 mL de H2O. Ajuste o pH para 7,2. Adicione 300 μL de 10% FFA BSA e QS a 15 mL com H2O.
- Para preparar o EFAM-BSA, diluir 120 μL de ácido piruvico de 0,5 M, 24 μL de ácido málico de 0,5 M, 1,2 μL de 20 mM FCCP e 3 mL de 2x MAS-1 em 2 mL de H2O. Ajuste o pH para 7,2 e QS a 6 mL com H2O.
- Para preparar 1x β-oxidação (BOXM), prepare soluções BOXM contendo BSA e sem BSA.
- Para preparar o BOXM+BSA, diluir 12 μL de palmitoyl-L-carnitina de 50 mM, 30 μL de ácido malic de 0,5 M e 7,5 mL de 2x MAS-1 em 7 mL de H2O. Ajuste o pH para 7,2. Adicione 300 μL de 10% FFA BSA e QS a 15 mL com H2O.
- Para preparar BOXM-BSA, diluir 4,8 μL de palmitoyl-L-carnitina de 50 mM, 12 μL de ácido málico de 0,5 M e 3 mL de 2x MAS-1 em 2 mL de H2O. Ajuste o pH para 7,2 e QS a 6 mL com H2O.
2. Dissecção muscular, homogeneização e isolamento mitocondrial
- Coloque todos os materiais e tampões no gelo. Certifique-se de que todos os materiais são gelados durante todo o procedimento para proteger mitocôndrias de danos.
- Coloque três béquers de 50 mL por amostra no gelo e adicione as seguintes soluções: 10 mL de PBS no béquer 1, 10 mL de 10 mM EDTA/PBS no béquer 2, e 4 mL de IB1 no béquer 3.
- Eutanize o rato por luxação cervical. Evite a eutanásia de CO2 , pois os músculos esqueléticos podem se tornar hipóxicos, interferindo nas análises respiratórias.
- Pulverize a linha traseira direita com 70% de etanol para evitar que a pele se desça, e tape membro na placa de dissecção da rolha. Fita o membro dianteiro esquerdo também.
- Faça uma incisão com um bisturi descartável estéril através da pele do joelho aos dedos dos dois.
- Segure a pele com fórceps dentadas ao nível do tornozelo e corte-a com uma tesoura fina ao redor do tornozelo.
- Alivie a pele da musculatura subjacente com pinças de ponta fina em uma mão enquanto puxa-a para cima com fórceps dentados na outra mão.
- Disseque todos os músculos esqueléticos do tornozelo ao joelho (Figura 2).
- Remova todo o tecido conjuntivo sobre o músculo tibialis anterior (TA) para facilitar a extração muscular usando pinças finas e tesouras.
- Encontre os quatro tendões distais do músculo EDL e se estel-os perto de suas inserções nos dedos dos dedos. Localize o tendão distal do TA e corte-o perto de sua inserção, sempre abaixo do tornozelo.
- Puxe cuidadosamente os tendões TA e EDL acima do tornozelo para liberar as pontas soltas.
- Segure as pontas soltas dos tendões e alivie os músculos para longe do resto da musculatura e ossos puxando-os para cima. Use pinças finas ou tesouras para facilitar o processo. Prossiga com cuidado para evitar a contração da miofibra.
- Corte o tendão proximal do EDL e do músculo TA o mais próximo possível da rótula.
- Vire o mouse de cabeça para baixo para prosseguir com extração gastrocnemius (GA) e soleus muscular.
- Segure o bolso formado entre o bíceps femoral e o GA com fórceps dentados. Use uma tesoura fina para separar esses músculos e visualizar o tendão proximal do GA.
- Segure o tendão de Aquiles com fórceps finos e corte-o cuidadosamente com uma tesoura fina. Solte os músculos GA e soleus do osso subjacente puxando-os através de seus tendões. Corte o tendão proximal de GA liberando-o junto com o soleus subjacente.
- Disseca cuidadosamente os músculos restantes do tendão ao tendão após o mesmo procedimento até que apenas os ossos permaneçam.
- Recue o mouse na posição inicial para dissecar o músculo quadríceps.
- Descarte o tecido adiposo sobre o quadríceps no lado proximal usando fórceps dentados e tesoura fina.
- Insira pinças finas entre o quadríceps e o fêmur e mova-as em ambas as direções ao longo do eixo do fêmur para separar o músculo do osso.
- Segure os tendões musculares do quadríceps distal com fórceps dentados e corte o tendão com uma tesoura fina o mais próximo possível da rótula.
- Puxe o quadríceps para cima e liberte-o na inserção proximal com uma tesoura fina.
- Repita as etapas 4-8 desta seção com o bloco traseiro esquerdo.
- Enxágüe todos os músculos em Beaker 1 primeiro e depois em Beaker 2.
- Transfira todos os músculos para Beaker 3 e pique finamente todos os músculos com uma tesoura afiada no gelo.
- Transfira a suspensão para um tubo C (tampa roxa), mantendo-a sempre no gelo.
- Feche bem o tubo C e coloque-o de cabeça para baixo na manga do homogeneizador. Certifique-se de que o material amostral está na área do rotador/estator. Selecione o programa de 1 min chamado m_mito_tissue_01.
- Divida o homogeneizar em dois tubos de microcentrifuuge pré-2 mL e centrífugas a 700 × g por 10 min a 4 °C em uma centrífuga de mesa.
- Transfira os supernantes para novos tubos pré-2 mL pré-edes, evitando cuidadosamente gordura e tecido não homogeneizado. Armazene as pelotas a -80 °C para determinação de pureza de fragmentação (fração N) (Figura 3).
- Centrifugar os supernantes a 10.500 × g por 10 min a 4 °C.
- Transfira os supernantes para novos tubos pré-2 mL e rotule-os como Supernatant Número 1 (SN1). Armazene-os a -80 °C para determinação de pureza de fragmentação (Figura 3).
- Resuspend e combine ambas as pelotas em um volume total de 500 μL de IB2 no gelo.
- Centrifugar a 10.500 × g por 10 min a 4°C.
- Transfira o supernatante para um novo tubo pré-2 mL pré-2ml e rotule-o como Supernatant Número 2 (SN2). Armazene-o a -80 °C para determinação de pureza de fragmentação (Figura 3).
- Resuspend a última pelota mitocondrial em 200 μL de RB. Reserve rapidamente 10 μL para quantificação de proteínas e adicione imediatamente 10 μL de 10% FFA BSA à suspensão mitocondrial restante para evitar danos.
- Determine a concentração de proteínas usando o ensaio de Bradford.
- Para a curva padrão, prepare 30 μL de diluições seriais de concentração conhecida de uma proteína no tampão RB. Por exemplo, use 1 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,25 mg/mL, 0,125 mg/mL, 0,0625 mg/mL e 0 mg/mL de BSA.
- Prepare 1:3 e 1:6 diluições seriais das amostras mitocondriais em tampão RB.
- Em uma placa de fundo plano de 96 poços, primeira carga 2,5 μL de amostra/padrão por poço. Em seguida, adicione 10 μL de 1 M NaOH a cada amostra e, finalmente, 200 μL de reagente 1x Bradford. Misture bem, evitando bolhas de ar. Verifique visualmente se a cor das amostras está dentro da linha de calibração. Sempre realize a análise em triplicado.
- Incubar as placas por 5 min no RT no escuro, e ler a absorvância a 595 nm em um espectrômetro de microplato.
- Calcule a curva padrão plotando os valores de absorção (eixo y) versus a concentração proteica correspondente das diluições preparadas na etapa 22.1 nesta seção (eixo x).
- Calcule a quantidade total de proteína nas amostras mitocondriais por extrapolação com a curva padrão.
3. Preparação dos ensaios respirométricos à base de microplacar
- Hidrate o sensor de ensaio respirométrico pelo menos 12 h antes do experimento com 1 mL de tampão de calibração por poço. Incubar a 37 °C (sem CO2).
NOTA: Os sensores hidratados podem ser usados por até 72 h. O cartucho deve ser manuseado cuidadosamente durante esta etapa: se alguma coisa tocar os sensores, a sensibilidade de medição pode ser afetada. - Prechill a centrífuga preparatória com o rotor de microplaca balançando e os adaptadores de microplaca correspondentes a 4 °C.
- Ligue o computador, abra o software de análise e selecione o protocolo desejado.
NOTA: Um clique é ouvido quando o software se conecta ao instrumento de medição do consumo de oxigênio. O sensor de aquecimento deve ser verde e a 37 °C antes do início do experimento. - Prepare as soluções inibidoras dos estoques indicados na seção 1, etapa 2 de acordo com o ensaio a ser realizado. Prepare volume suficiente para cada solução. Consulte a Tabela 1 e a Tabela 2 para referência.
- Adicione o volume apropriado de cada inibidor em cada porta, insira o cartucho no instrumento de medição do consumo de oxigênio e inicie a calibração.
NOTA: Adicionar inibidor ao cartucho e inserir o cartucho no instrumento leva de 15 a 20 minutos. Certifique-se de que os componentes corretos do cartucho sejam introduzidos. A tampa do cartucho e o reforço hidráulico podem ser descartados enquanto o cartucho do sensor e o local do utilitário são necessários. - Centrifugar a suspensão mitocondrial concentrada da seção 2, passo 21 a 10.500 × g para 10 min a 4 °C.
- Resuspend a pelota mitocondrial em 100 μL de 1x CAM+BSA, 1x EFAM+BSA ou 1x BOXM+BSA, dependendo do protocolo a ser realizado.
- Diluir ainda mais a amostra mitocondrial concentrada para uma concentração final de 0,2 μg/μL no meio de ensaio correspondente.
- Semente 50 μL da suspensão (total de 10 μg de proteína) por poço em uma microplaca de 24 poços pré-24 poços no gelo. Não adicione mitocôndrias nos poços de correção de fundo; adicione apenas o meio de ensaio correspondente. Armazene a suspensão mitocondrial restante a -80 °C para determinação de pureza de fragmentação (Figura 3).
- Gire a microplaca na centrífuga pré-lícploa preparatória a 2.000 × g por 20 min a 4 °C. Contrapeso para equilibrar em conformidade.
- Aqueça o restante do ensaio a 37 °C durante a centrifugação de microplacos.
- Após a centrifugação, deixe a microplacão no banco por 5 minutos para equilibrar. Adicione 450 μL de meio de ensaio quente para um volume final de 500 μL por poço em RT. Faça isso devagar e com cuidado, adicionando o meio à parede dos poços para evitar desprender mitocôndrias.
- Coloque a microplacão imediatamente no instrumento de medição do consumo de oxigênio sem a tampa e inicie o protocolo (Tabela 3). Certifique-se de que o primeiro passo é uma incubação de 10 minutos para permitir que a microplacão aqueça.
- Uma vez terminado o experimento, remova o cartucho e a microplacão, desligue o instrumento e inicie a análise.
4. Análise dos resultados
- No caso dos ensaios CA e BOX, realize as seguintes análises:
- Registro de consumo nãomitocondrial O2 , que corresponde à média dos valores obtidos após a injeção de antimicina A e rotenona.
NOTA: Antimicina A e rotenona são inibidores complexos III e I, respectivamente. - Calcule a respiração basal subtraindo o consumo nãomitocondrial de O2 a partir de valores basais (pontos de medição 1 e 2).
- Subtrair o consumo nãomitocondrial O2 dos valores após a injeção do complexo V substrato ADP (injeção A) para determinar o estado mitocondrial III.
- Subtrair o consumo nãomitocondrial O2 dos valores de respiração pós-injeção do complexo oligomicina inibidora V (injeção B) para obter iVo de estado mitocondrial.
- Calcule o estado mitocondrial IIIu deduzindo o consumo nãomitocondrial de O2 da injeção pós-FCCP (injeção C).
NOTA: FCCP é um potente desconsfotrito de fosforilação mitocondrial. A síntese de ATP é contornada em sua presença, e o ETC atinge a atividade máxima. - Subtrair valores de respiração basal do estado mitocondrial IIIu valores para obter capacidade de reposição mitocondrial, que é a capacidade de gerar ATP extra em caso de aumento da demanda de energia.
- Divida o estado mitocondrial IIIu por valores de IVo estaduais para obter a Relação de Controle Respiratório (RCR).
NOTA: Os valores negativos ou nulos do RCR indicam que o acoplamento mitocondrial é afetado.
- Registro de consumo nãomitocondrial O2 , que corresponde à média dos valores obtidos após a injeção de antimicina A e rotenona.
- Em referência à EFA, realize os seguintes cálculos:
- Obtenha atividade residual calculando o valor médio pós rotenona e injeção de Antimicina A (injeções A e C).
- Calcular a atividade complexa I a IV (CI-CIV) subtraindo a atividade residual dos valores basais (pontos de medição 1 e 2).
- Subtrair a atividade residual dos valores pós-injeção do succinato do substrato CII (injeção B) para obter atividade CII-CIII-CIV.
- Calcule a atividade de CIV deduzindo a atividade residual dos valores obtidos após a injeção dos agentes c-redutores citocromo, ácido ascórbico e TMPD (injeção D).
- Representar todos os resultados utilizando parcelas de barras, como na Figura 4, para extrair conclusões apropriadas.
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Representative Results
O protocolo aqui apresentado permite a análise in vivo da respiração mitocondrial através do isolamento das mitocôndrias do músculo esquelético do camundongo. Um esboço do método é mostrado na Figura 1. Após dissecar músculos esqueléticos das retalhos (Figura 2), os tecidos são homogeneizados e mitocôndrias purificadas, sob condições isotônicas, através de centrífugas em série. A pureza das diferentes frações obtidas durante o processo de isolamento pode ser analisada pela mancha ocidental usando anticorpos contra diferentes marcadores de organela. A Figura 3A mostra o perfil geral da proteína das diferentes frações mostrando populações proteicas distintas nas frações isoladas.
A Figura 3B mostra que todo o conteúdo mitocondrial está na fração mitocondrial, como evidenciado pelos fortes sinais de marcadores das membranas mitocondriais externas (VDAC e TOMM20) e internas (TIMM23) e até mesmo para proteínas associadas a nucleóides (mtTFA). Todos os núcleos e citoesqueleto (β-actin) estão presentes na Fração N, que representa núcleos e material não diluído (Figura 3C). Além disso, a maioria dos marcadores de ântico endoplasmático (ER) (Calnexin), membrana plasmática (Na+/K+-ATPaseα1) ou marcadores de citoplasma (LDHA, HSP70 ou AKT) permanecem nas frações SN1 ou SN2, destacando a alta pureza obtida durante o isolamento (Figura 3C). No entanto, há alguns traços de contaminação do ER na fração mitocondrial, possivelmente devido à proximidade dessas organelas. Dado os resultados obtidos em ensaios respiratórios subsequentes, o procedimento de isolamento descrito aqui produz preparações mitocondriais altamente puras e viáveis.
Ambos os ensaios ca e BOX permitem o cálculo de diferentes estados mitocondriais na presença de vários substratos que estimulam vias metabólicas específicas. Especificamente, esses ensaios são realizados na presença de ácido piruvico ou cloreto palmitoyl-L-carnitina. O ácido piruvico é um substrato do ciclo de Krebs; ácido málico é um intermediário do ciclo de Krebs e um indutor naDH, enquanto palmitoyl-L-carnitina é um substrato da via de β-oxidação do ácido graxo. (Figura 4A,B). Em ambos os ensaios, o primeiro estado que pode ser medido é a taxa de respiração basal, que representa a respiração mitocondrial na presença dos substratos inicialmente adicionados ao meio de ensaio. Em seguida, o Estado mitocondrial III é alcançado, o que representa a produção de ATP a partir de ADP e fosfato inorgânico, mostrando a respiração máxima em um estado acoplado. Assim, há um aumento no consumo de oxigênio após a adição de ADP, como observado na Figura 4A,B.
Além disso, o Estado IVo indica o vazamento de prótons associado à inibição da synthase ATP por oligomicina, o que leva a uma diminuição da respiração, como observado nos gráficos CA e BOX (Figura 4A,B). A adição de FCCP leva ao Estado IIIu, que mostra a capacidade respiratória máxima que as mitocôndrias podem exibir em um estado desacoplado quando o consumo de oxigênio atinge seu nível mais alto nestes ensaios. Para calcular todos esses estados, é fundamental primeiro determinar a respiração não-iamcondrial, que é obtida no final do ensaio quando a antimicina A e a rotenona são injetadas para inibir a respiração oxidativa. Como mostrado na Figura 4A,B, esses valores precisam estar sempre abaixo da respiração basal e muito próximos de zero no caso de ensaios com mitocôndrias isoladas como esses ensaios descritos aqui. Finalmente, o parâmetro RCR deve ser calculado para avaliar a integridade mitocondrial. Isso reflete se as mitocôndrias podem reagir à ADP produzindo ATP a uma taxa alta com um baixo vazamento de prótons. Os valores médios de RCR encontrados nos ensaios CA e BOX foram de 5,78 ± 1,03 e 3,47 ± 0,42 (Figura 4A,B), respectivamente, que estão de acordo com os RCRs ótimos relatados anteriormente21,22,23,24.
Além disso, o EFA examina a atividade dos complexos etc individualmente ou em combinação através da injeção de substratos e inibidores específicos (Figura 4C). A atividade CI-CIV representa a respiração mitocondrial baseada em substratos piruvatos e malados quando nenhum complexo é inibido; neste caso, a maioria dos elétrons passam por IC. Como rotenona é um inibidor específico da IC, a IC é bloqueada após sua adição, resultando em diminuição do consumo de oxigênio (Figura 4C). A atividade CII-CIII-CIV mostra respiração quando apenas a CI é bloqueada, e o CII é ativado: o succinato, injetado através da porta B, é um substrato específico do complexo II (succinato desidrogenase). Assim, o CII é reduzido, iniciando o fluxo de elétrons de CII para CIV, enquanto a IC ainda é inibida pela injeção anterior de rotenona, produzindo um aumento no consumo de oxigênio (Figura 4C). Antimicina A adição inibe o CIII, bloqueando o fluxo de elétrons através do ETC e reduzindo o consumo de oxigênio. Além disso, a atividade de CIV é determinada quando estimulada pela oxidação do citocromo C após ser reduzida pela adição de ácido ascórbico/TMPD; A Figura 4C mostra que a ativação do CIV produz um aumento no consumo de oxigênio. Finalmente, a atividade residual refere-se ao consumo de oxigênio quando a cadeia de fosforilação oxidativa é inativada após adição de rotenona e antimicina A. Esse valor estabelece o pano de fundo para o cálculo da atividade dos complexos conforme indicado nas etapas do protocolo 2.2-2.4 na seção 4.
Figura 1: Visualização esquemática do método. Abreviaturas: OCR = taxa de consumo de oxigênio; ADP = difosfato de adenosina; OL = oligomicina; FCCP = cianeto carbonil-p-trifluorometotoxifenilhidrazone; AntA = Antimicina A; Rotenona = rotenone. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Dissecção e isolamento dos músculos esqueléticos murinos de retalhos traseiros para análises de respiração mitocondrial. (A) O retalho traseiro direito foi esticado e imobilizado com fita. (B) Uma incisão foi feita através da pele ao lado do tornozelo, parando proximal ao joelho. O tecido conjuntivo sobre a ta foi cuidadosamente removido. Os tendões EDL (C) e TA (D) foram seccionados perto de suas inserções. O tendão do TA foi puxado para aliviar o músculo longe da musculatura e osso subjacentes. Em seguida, o TA foi cortado proximally, perto da crista ventral para a tíbia. Da mesma forma, o músculo EDL foi facilitado, e o tendão proximal foi meticulosamente cortado na lateral do joelho. (F) Retrocesso direito após dissecção TA e EDL. (G) Na posterior liminar, o tendão de Aquiles foi seccionado para dissecar os músculos GA e soleus. (H) GA e soleus foram cuidadosamente liberados do osso tibial. (I) Os músculos restantes foram coletados do tornozelo ao joelho até que apenas os ossos da fíbula e tíbia permanecessem. (J) Hindlimb após dissecção. (K) Quadríceps foi dissecado. (L) Todos os músculos esqueléticos coletados para isolamento mitocondrial posterior. O processo foi realizado para ambos os blocos traseiros. Abreviaturas: TA = tibialis anterior; EDL = extensor digitorum longus; GA = gastrocnemius. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Pureza do processo de fragmentação. (A) Perfil geral de proteína manchado com azul Coomassie. (B) Perfil de pureza da proteína mitocondrial. (C) Marcadores não-imocondriais. As diferentes frações obtidas durante o isolamento das mitocôndrias foram carregadas e incubadas com anticorpos contra diferentes proteínas em frações subcelulares específicas. Abreviaturas: fração N = tecido e núcleos não homogeneizados; SN1 = supernatante número 1: citoplasma + organelas; SN2 = supernacante número 2: citoplasma + organelas; VDAC = canal de ânion dependente da tensão; TOMM20 = translocase da membrana mitocondrial externa 20; mtTFA = fator de transcrição mitocondrial A; TIMM23 = translocase da membrana mitocondrial interna 23; LDHA = lactato desidrogenase A; HSP70 = proteína de choque térmico 70; ER = órticulum endoplasmático. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Resultados representativos. Perfil bioenergénico de mitocôndrias isoladas de músculos hindlimb de um rato macho selvagem de 13 meses de idade C57BL/6N. Os pontos de injeção dos diferentes substratos e inibidores são indicados em cada ensaio. O desempenho do maquinário ETC e OXPHOS pode ser analisado utilizando piruvato e malato, ou palmitoyl-L-carnitina e malato como substratos no Ensaio de Acoplamento (A) ou β-oxidação de ensaios FA (B), respectivamente. (C) O ensaio de fluxo de elétrons permite o estudo de complexos mitocondriais individuais na presença de piruvato, malato e FCCP; 10 μg de mitocôndrias foram banhadas por poço. Os resultados são exibidos seguindo a opção de representação de ponto médio para visualizar os resultados de forma agregada. Isso contrasta com a opção ponto a ponto, o que permitiria a visualização das 9 medições consecutivas geralmente realizadas durante cada etapa de medição. O tipo de visualização pode ser alterado após a conclusão do ensaio sob as opções de gráfico de linha Cinética no software de análise. Abreviaturas: FA = ácidos graxos; OCR = taxa de consumo de oxigênio; ADP = difosfato de adenosina; FCCP = cianeto carbonil-p-trifluorometotoxifenilhidrazone; RCR = razão de controle respiratório; EFA = Ensaio de Fluxo de Elétrons; BOX = β-oxidação de FA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Ensaio de acoplamento | ||||||
| Porta | Inibidor | [Estoque] | [Porta de injeção] | [Final] | Receita | |
| Inhib | CAM-BSA | |||||
| Um | ADP | 100 mM | 50 mM | 5 mM | 650 μL | 650 μL |
| B | Oligomiina | 4 mM | 31,6 μM | 3,16 μM | 11,3 μL | 1418,7 μL |
| C | FCCP | 20 mM | 60 μM | 6 μM | 4,68 μL | 1555,32 μL |
| D | Antimicina A // Rotenone | 5 mM // 4 mM | 40 μM // 50 μM | 4 μM // 5 μM | 13,52 μL // 21,12 μL | 1655,36 μL |
| Ensaio de fluxo de elétrons | ||||||
| Porta | Inibidor | [Estoque] | [Porta de injeção] | [Final] | Receita | |
| Inhib | EFAM-BSA | |||||
| Um | Rotenona | 4 mM | 50 μM | 5 μM | 16,25 μL | 1283,7 μL |
| B | Succinato | 500 mM | 100 mM | 10 mM | 286 μL | 1144 μL |
| C | Antimicina A | 5mM | 4 μM | 4 μM | 12,48 μL | 1547,5 μL |
| D | Ascorbate // TMPD | 1 M // 50 mM | 100 mM // 1 mM | 10 mM // 100 μM | 169 μL // 33,8 μL | 1487,2 μL |
| ensaio de β-oxidação | ||||||
| Porta | Inibidor | [Estoque] | [Porta de injeção] | [Final] | Receita | |
| Inhib | BOX-BSA | |||||
| Um | ADP | 100 mM | 40 mM | 4 mM | 520 μL | 780 μL |
| B | Oligomiina | 4 mM | 31,6 μM | 3,16 μM | 11,3 μL | 1418,7 μL |
| C | FCCP | 20 mM | 60 μM | 6 μM | 4,68 μL | 1555,32 μL |
| D | Antimicina A // Rotenone | 5 mM // 4 mM | 40 μM // 20 μM | 4 μM // 2 μM | 13,52 μL // 8,45 μL | 1668 μL |
Tabela 1: Preparação de soluções inibidoras para os diferentes ensaios. A coluna [Stock] mostra as concentrações das soluções de estoque do composto indicadas na coluna Inibidor . [Porta de injeção] refere-se à concentração das soluções inibidoras a serem carregadas nas diferentes portas do cartucho, enquanto a coluna [Final] indica a concentração final dos inibidores nos poços. Por fim, as colunas receita especificam os volumes de soluções inibidoras de estoque e mídias livres de BSA que devem ser misturadas para preparar as soluções a serem carregadas nas portas de injeção. Abreviaturas: ADP = difosfato de adenosina; FCCP = cianeto carbonil-p-trifluorometotoxifenilhidrazone; TMPD = N,N,N′,N'-tetramethyl-para-fenileno-diamina; Inhib = inibidor; BSA = albumina de soro bovino; CAM-BSA = Meio de ensaio de acoplamento livre de BSA; EFAM-BSA = Meio de ensaio de fluxo de elétrons livre de BSA; BOX-BSA = BSA-free β-oxidação do meio de ensaio de ácidos graxos.
| Porta | Volume injetado | Estoque preparado (26 poços) |
| Um | 50 μL | 1300 μL |
| B | 55 μL | 1430 μL |
| C | 60 μL | 1560 μL |
| D | 65 μL | 1690 μL |
Tabela 2: Cálculo dos volumes de injeção.
| Ação | Tempo (minutos) | Repetição | Porta |
| Calibrar | 15-20 | ||
| Esperar | 10 | ||
| Mix + Espere | 1 + 3 | × 2 | |
| Misturar | 1 | ||
| Medida + Mix | 3 + 1 | × 2 | |
| Injetar | Um | ||
| Misturar | 1 | ||
| Medir | 3 | ||
| Misturar | 1 | ||
| Injetar | B | ||
| Misturar | 1 | ||
| Medir | 3 | ||
| Misturar | 1 | ||
| Injetar | C | ||
| Misturar | 1 | ||
| Medir | 3 | ||
| Misturar | 1 | ||
| Injetar | D | ||
| Mix + Medida | 1 + 3 | × 2 |
Tabela 3: Configurações de protocolo para os diferentes ensaios.
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Discussion
Todos os métodos utilizados para estudar a respiração mitocondrial têm suas limitações; portanto, é crucial selecionar o método que melhor se adequa a uma questão experimental específica. Este trabalho fornece um protocolo atualizado e detalhado para isolar mitocôndrias do músculo esquelético do rato para realizar diferentes ensaios respiratórios para investigar a função mitocondrial. De fato, o estudo de bioenergésicos mitocondriais mitocôndicos em mitocôndrias isoladas usando tecnologias baseadas em microplacas é valioso para estudar a respiração específica do tecido em termos de reprodutibilidade, confiabilidade e complexidade. Além disso, o uso de mitocôndrias isoladas confere controle sobre a disponibilidade de substratos, facilitando a compreensão dos processos biológicos subjacentes. Outro aspecto positivo do uso de mitocôndrias isoladas é que é possível estudar o Estado III porque a ATP gerada após a injeção de ADP não é convertida novamente em novo ADP, pois a maioria dos ATPases transmembranos são perdidos. Além disso, nos ensaios aqui descritos, a oligomicina é adicionada para bloquear a potencial síntese atp inespecífica20.
Várias considerações importantes precisam ser destacadas para este protocolo. Em primeiro lugar, mitocôndrias isoladas são extremamente sensíveis e devem ser tratadas com cuidado. O alto teor de sacarose e manitol nos buffers utilizados garante as condições osmóticas ideais para proteger as mitocôndrias isoladas de danos. No entanto, a duração do ensaio deve ser mantida no mínimo para preservar a viabilidade mitocondrial e evitar o descolamento da microplacão uma vez semeada. Assim, dado que as etapas do protocolo, como a preparação de mídias de ensaio e soluções de substrato e inibidor, ou o carregamento dos inibidores no cartucho de ensaio respirométrico, são demoradas, cada passo deve ser perfeitamente coordenado. Além disso, ao contrário de outros métodos baseados na digestão enzimática21,24 e homogeneização de argamassa e pilão17,19,21,23,24, o método descrito aqui conta com o uso de um homogeneizador automatizado, possibilitando a homogeneização rápida e eficiente da amostra. É importante ressaltar que as suspensões mitocondriais são menos sensíveis se altamente concentradas. Assim, apenas prepare as diluições imediatamente antes de usá-las. Finalmente, é essencial trabalhar rapidamente durante o ensaio respirométrico adequado. Normalmente, ao analisar células na cultura nesses ensaios, três etapas de medição consecutivas são realizadas após a injeção de substratos ou inibidores, o que resulta em protocolos que se estendem entre 40 e 50 min., Para garantir a viabilidade das mitocôndrias isoladas em todo o procedimento, o número de etapas de medição é muitas vezes mantido ao mínimo devido à sua vulnerabilidade19, 23,25, reduzindo o tempo necessário para concluir a análise respirométrica para ~20 min. Os protocolos descritos neste trabalho (Tabela 3) seguem essa tendência, embora outros métodos publicados anteriormente reportem perfis de OCR eficientes com etapas de medição mais longas e mais padrão26.
Por exemplo, se dois ensaios consecutivos forem executados com o mesmo conjunto de amostras no mesmo dia, prepare todos os reagentes para o segundo ensaio durante o primeiro, exceto para as diluições mitocondriais: apenas diluir, sementes e spin mitocôndrias imediatamente antes de iniciar o segundo ensaio, enquanto o instrumento está sendo calibrado. Uma vez concluído o experimento, o parâmetro RCR (seção 4, etapa 1.7) deve ser calculado para avaliar a qualidade das preparações mitocondriais utilizadas. Normalmente, os valores de RCR entre 3,5 e 5 denotam que a integridade mitocondrial é ótima e mostram respiração oxidativa acoplado funcional25. Ensaios com valores de RCR mais baixos devem ser descartados porque a integridade mitocondrial foi comprometida durante o isolamento. Nesses casos, considere lavar a pelota mitocondrial duas vezes (seção 2, etapas 19-21)22, como relatado anteriormente.
Em segundo lugar, manter o pH correto durante todo o procedimento é fundamental para obter resultados bem-sucedidos. Certifique-se de que o pH de todas as soluções está definido como indicado, ou seja, pH 7.2, e que o pH seja sempre ajustado com KOH, salvo indicação em contrário. Notavelmente, o pH dos buffers contendo BSA não deve ser medido diretamente com o medidor de pH, pois a BSA pode danificar a sonda. Assim, ajuste o pH nos buffers correspondentes antes de adicionar BSA. Para evitar alterações no pH devido à adição de BSA, use sempre o FFA BSA. Além disso, alguns lotes H2O ultrausos podem ser ácidos, de modo que o uso de pH 7 H2O comercialmente purificado é recomendado. Além disso, é necessário garantir que o medidor de pH esteja corretamente calibrado e que seja o modelo adequado para medir o pH dos produtos químicos a serem preparados.
Em terceiro lugar, é crucial realizar corretamente a etapa de coleta amostral para medição de proteínas da suspensão mitocondrial final (seção 2, etapa 21) para evitar a destruição mitocondrial. Resuspenque a pelota rapidamente, mas completamente, colete uma alíquota e adicione o FFA BSA à suspensão restante para conservar o equilíbrio osmótico e proteger as mitocôndrias de danos. Se a FFA BSA já estivesse presente no tampão de resuspensão e, portanto, durante a quantificação da proteína, o alto teor de proteínas confundiria os resultados da quantificação. É por isso que a FFA BSA precisa ser adicionada depois de definir uma alíquota de lado para quantificação.
Em quarto lugar, este método é altamente versátil e pode ser ajustado às necessidades do experimentador. Por exemplo, se o modelo animal em estudo é caracterizado pela redução da massa muscular (por exemplo, camundongos sarcopenicos), músculos adicionais podem aumentar o rendimento mitocondrial. Embora um camundongo C57BL/6N macho adulto tenha sido usado neste trabalho, animais de qualquer sexo, idade ou fundo genético, bem como tipos musculares específicos, podem ser empregados em seu lugar.
Em quinto lugar, os valores respiratórios podem diferir entre os experimentos devido a pequenas variações na composição de tampões e reagentes, que precisam ser preparados o tempo todo. Idade, sexo, antecedentes genéticos ou condições ambientais também podem ter um impacto profundo nos resultados. No entanto, um experimento bem-sucedido deve apresentar aumentos no consumo de oxigênio após a injeção de substratos complexos como ADP e succinato, diminui após a injeção de inibidores como oligomicina ou rotenona, e aumenta acentuadamente quando o potente desacoplador FCCP é adicionado. Além disso, para evitar alta variabilidade técnica, garanta a ressuspensão minuciosa das pelotas mitocondriais para obter suspensões homogêneas antes de semeá-las na microplacão.
Em sexto lugar, se os valores respiratórios basais forem baixos, considere realizar um experimento de titulação para ajustar a quantidade de proteína para semeadura. Finalmente, como este trabalho fornece um método para a obtenção de extratos mitocondriais brutos, espera-se um certo grau de impureza associado a outras organelas, principalmente ER. Um processo de fragmentação mais agressivo para remover essas impurezas seria prejudicial à viabilidade mitocondrial, dificultando o desempenho dos ensaios respiratórios. Se a pureza é uma preocupação, especialmente se não for consistente entre as amostras, os resultados do ensaio podem ser normalizados em relação à pureza mitocondrial depois de executar manchas ocidentais contra diferentes marcadores de organela (Figura 3). Para nosso conhecimento, este é o primeiro método que destaca preocupações sobre a pureza mitocondrial em extratos brutos. Normalmente, em outros protocolos para ensaios respirométricos com mitocôndrias isoladas, a mesma quantidade de extrato de proteína é semeada nos poços para comparar amostras, assumindo que a mesma quantidade de mitocôndrias é usada em todos os casos. Trata-se de uma suposição razoável, considerando que o isolamento é realizado em paralelo em todas as amostras. No entanto, o histórico genético ou ambiental das amostras estudadas pode levar a diferenças consideráveis na pureza dos extratos mitocondriais. Por exemplo, se uma dada mutação genética causa o aumento do desenvolvimento do ER citoplasmado, extratos mitocondriais brutos desses animais poderiam conter conteúdo de ER maior do que o esperado e, consequentemente, menos do que o esperado. Assim, mesmo que a mesma quantidade de proteína total do controle e amostras mutantes sejam semeadas na microplacão, o consumo de oxigênio dos mutantes seria subestimado. Assim, recomenda-se que a pureza dos extratos de todas as condições em estudo deve ser determinada. Se os valores forem comparáveis, não é necessária normalização. No entanto, se os valores de pureza entre as amostras diferem consideravelmente além do erro estatístico que o experimentador está disposto a aceitar, eles devem ser usados para normalizar os resultados de consumo de oxigênio.
O presente protocolo tem algumas limitações. Note-se que este método foi otimizado para tecido muscular esquelético isolado de camundongos. Ajustes podem ser feitos se usar tecidos diferentes ou músculo esquelético de diferentes espécies. Além disso, quando são realizadas análises em mitocôndrias isoladas, o microambiente celular normal é perdido devido à ausência de contexto celular e às outras organelas que poderiam interagir com mitocôndrias. Isso pode levar a resultados que se desviam ligeiramente das condições fisiológicas. Finalmente, como as mitocôndrias são centrífugas, elas aderem ao fundo dos poços. Embora completamente necessário, os efeitos potenciais da centrifugação em seu estado normal são desconhecidos.
É importante levar em conta que, após a realização das análises de ensaio respirométrico, uma redução no consumo de oxigênio associado à respiração ligada ao ATP ou estimulada pela FCCP em mitocôndrias isoladas pode indicar possíveis alterações mitocondriais que poderiam ser explicadas por 20: 1) transporte restrito de substratos através da membrana mitocondrial interna, 2) diminuição da atividade das enzimas envolvidas nas reações limitantes de taxas de vias metabólicas específicas, como a ETC, ciclo de Krebs, ou β-oxidação, ou 3) função ETC prejudicada, entre outras possíveis explicações.
Em resumo, o método atualizado aqui descrito representa uma maneira adequada e confiável de avaliar a função ETC e OXPHOS a partir do tecido muscular esquelético. Possui múltiplas aplicações para avaliar como modificações genéticas ou o ambiente podem afetar a respiração mitocondrial contribuindo para um fenótipo específico. Notavelmente, o presente protocolo poderia ser adaptado a outros organismos modelos ou ser usado com amostras humanas para avaliar possíveis disfunções mitocondriais associadas à doença humana.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a Juan J. Tena pelo uso do homogeneizador e das instalações de Proteomia e Pecuária CABD para suporte técnico. Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Educação, Cultura e Esportes espanhol através da bolsa FPU16/03264 a J.D.H.C., a Associação Française contre les Myopathies (AFM) através do bolsa de estudos nº 22450 à C.V.-G., uma Subvenção Institucional MDM-2016-0687 (Unidade de Excelência Maria de Maeztu, Departamento de Regulação Genética e Morfogênese na CABD) e BFU2017-83150-P para J.J.C. A Junta de Andalucía concede P18-RT-4572, o Programa de Financiamento feder da União Europeia, e o Ministério da Ciência, Inovação e Universidades espanholas concede RED2018-102576-T à P.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma | A5285 | Stock at -20 °C |
| AKT antibody | Cell Signaling Technology | C67E7 | Rabbit (Host species) |
| anti-Goat HRP | Sigma | 401504 | Rabbit (Host species) |
| anti-Mouse HRP | Cell Signaling | #7076 | Horse (Host species) |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | Stock at -20 °C |
| anti-Rabbit HRP | Cell Signaling | #7074 | Goat (Host species) |
| Ascorbic acid | Sigma | A5960 | Stock at RT |
| Bactin antibody | Sigma | MBS4-48085 | Goat (Host species) |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve |
| BSA, fraction V, Fatty Acid-Free | Calbiochem | 126575 | Stock at 4 °C |
| C tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Purple lid |
| Calnexin antibody | ThermoFisher | MA3-027 | Mouse (Host species) |
| D-mannitol | Sigma | M4125 | Stock at RT |
| EDTA | BDH | 280254D | Stock at 4 °C |
| EGTA | Sigma | E-4378 | Stock at RT |
| FCCP | Sigma | C2920 | Stock at -20 °C |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Homogenizer |
| HEPES | Sigma | H3375 | Stock at RT |
| HSP70 antibody | Proteintech | 10995-1-AP | Rabbit (Host species) |
| LDH-A antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC27230 | Goat (Host species) |
| Magnesium chloride | ChemCruz | sc-255260A | Stock at RT |
| Malic acid | Sigma | P1645 | Stock at RT |
| Microplate spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH | POLARstar OMEGA S/N 415-0292 | Stock at RT |
| Milli-Q water | Millipore system | F7HA17757A | Ultrapure water |
| mtTFA antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC23588 | Goat (Host species) |
| Na+/K+-ATPase α1 antibody | Novus Biologicals | NB300-14755 | Mouse (Host species) |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | Stock at -20 °C |
| Palmitoyl-L-carnitine | Sigma | P1645 | Stock at -20 °C |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | 1x stock at RT |
| Potassium dihydrogen phosphate | ChemCruz | sc-203211 | Stock at RT |
| Potassium hydroxide | Sigma | 60377 | Stock at RT |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | Stock at 4 °C |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Stock at -20 °C |
| Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer | Agilent Technologies | 420179 | XFe24 model |
| Seahorse XFe24 FluxPak mini | Agilent Technologies | 102342-100 | The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution |
| Succinate | Sigma | S7626 | Stock at RT |
| Sucrose | Sigma | S9378 | Stock at RT |
| TIMM23 antibody | Abcam | ab230253 | Rabbit (Host species) |
| TMPD | Sigma | T7394 | Stock at -20 °C |
| TOMM20 antibody | Abcam | ab56783 | Mouse (Host species) |
| VDAC antibody | Abcam | ab15895 | Rabbit (Host species) |
References
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