Summary
Qui, descriviamo un metodo dettagliato per l'isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo e la successiva analisi della respirazione mediante Oxygen Consumption Rate (OCR) utilizzando saggi respirometrici basati su micropiastre. Questa pipeline può essere applicata per studiare gli effetti di molteplici interventi ambientali o genetici sul metabolismo mitocondriale.
Abstract
La maggior parte dell'energia della cellula è ottenuta attraverso la degradazione di glucosio, acidi grassi e amminoacidi da diversi percorsi che convergono sul sistema di fosforilazione ossidativa mitocondriale (OXPHOS), che è regolato in risposta alle richieste cellulari. La molecola lipidica Coenzima Q (CoQ) è essenziale in questo processo trasferendo elettroni al complesso III nella catena di trasporto degli elettroni (ETC) attraverso cicli di ossidazione/riduzione costanti. Lo stato dei mitocondri e, in definitiva, la salute cellulare possono essere valutati misurando il consumo di ossigeno ETC utilizzando saggi respirometrici. Questi studi vengono in genere eseguiti in linee cellulari stabilite o primarie che sono state coltivate per diversi giorni. In entrambi i casi, i parametri respiratori ottenuti possono aver deviato dalle normali condizioni fisiologiche in un dato organo o tessuto.
Inoltre, le caratteristiche intrinseche delle singole fibre coltivate isolate dal muscolo scheletrico impediscono questo tipo di analisi. Questo documento presenta un protocollo aggiornato e dettagliato per l'analisi della respirazione nei mitocondri appena isolati dal muscolo scheletrico del topo. Forniamo anche soluzioni a potenziali problemi che potrebbero sorgere in qualsiasi fase del processo. Il metodo qui presentato potrebbe essere applicato per confrontare i tassi di consumo di ossigeno in diversi modelli murini transgenici e studiare la risposta mitocondriale ai trattamenti farmacologici o ad altri fattori come l'invecchiamento o il sesso. Questo è un metodo fattibile per rispondere a domande cruciali sul metabolismo e la regolazione della bioenergetica mitocondriale.
Introduction
I mitocondri sono i principali organelli metabolici nella cellula1. Questi organelli specializzati racchiusi in membrana utilizzano molecole nutritive per produrre energia sotto forma di adenosina trifosfato (ATP) da OXPHOS. Questo processo si basa sul trasferimento di elettroni da molecole donatrici in una serie di reazioni redox nell'ETC2. Il CoQ è l'unico lipide redox-attivo prodotto endogenamente in tutte le membrane cellulari e nelle lipoproteine circolanti che mostra una funzione antiossidante3. È un componente essenziale dell'ETC, trasferendo elettroni dal complesso I dipendente dal NADH e dal complesso II FADH2-dipendente al complesso III, sebbene molte altre reduttasi possano guidare la riduzione del CoQ mitocondriale all'ubichinolo come passaggio obbligatorio in più vie metaboliche cellulari4,5.
Durante tutto il processo, viene creato un gradiente protonico elettrochimico attraverso la membrana interna mitocondriale, che viene trasformata in energia biologicamente attiva dal complesso ATP sintasi V2. Di conseguenza, la disfunzione mitocondriale porta a una miriade di condizioni patologiche che colpiscono principalmente i tessuti con elevato fabbisogno energetico: cervello, cuore e muscolo scheletrico6,7. Pertanto, è fondamentale sviluppare metodi per analizzare accuratamente la bioenergetica mitocondriale per indagare il suo ruolo nella salute e nella malattia, in particolare nei tessuti altamente energetici come i muscoli scheletrici.
L'elettrodo di ossigeno di tipo Clark è stato utilizzato classicamente nello studio della respirazione mitocondriale8. Tuttavia, questo sistema è stato progressivamente sostituito da tecnologie ad alta risoluzione, con tecnologie di consumo di ossigeno basate su micropiastre come gli analizzatori Agilent Seahorse XF che sono particolarmente popolari9. Nel campo del muscolo scheletrico, questi studi sono tipicamente condotti in cellule in coltura, principalmente nella linea cellulare di mioblasti di topo immortalizzati C2C12 o in colture primarie derivate da cellule satelliti10,11. Tuttavia, questi studi non ricapitolano completamente la situazione in vivo, specialmente quando si indaga la biologia mitocondriale e la funzione a livello tissutale su insulti specifici, interventi non genetici o manipolazioni genetiche.
Inoltre, i saggi respiratori nelle cellule sono più complessi a causa di fattori aggiuntivi, tra cui la domanda extra-mitocondriale di ATP e substrati di analisi o eventi di segnalazione, che potrebbero fuorviare l'interpretazione dei risultati. In alternativa, è anche possibile utilizzare singoli o fasci di miofibre appena isolate dai muscoli. Tuttavia, il metodo di isolamento è tecnicamente impegnativo e fattibile solo per alcuni tipi di muscoli. In questo caso, i muscoli flessori digitorum brevis (FDB) ed estensori digitorum longus (EDL) sono principalmente utilizzati10,12,13, anche se alcuni rapporti descrivono l'uso di altri tipi di muscoli14,15.
È stato riportato anche il profilo bioenergetico delle sezioni del muscolo scheletrico16. Il principale vantaggio di questo metodo è che i muscoli intatti possono essere studiati (gli autori dimostrano che affettare le fibre non disturba i risultati rispetto alle miofibre isolate). Tuttavia, l'accesso mitocondriale ai substrati e agli inibitori del saggio è limitato e, pertanto, è possibile misurare solo pochi parametri16. Infine, possono essere impiegati anche mitocondri isolati9,17,18,19. In questo caso, i mitocondri perdono il loro ambiente citosolico, che potrebbe influenzare la loro funzione. Al contrario, questo metodo garantisce l'accesso a substrati e inibitori, consente l'analisi di una pletora di tipi di campioni e in genere richiede meno materiale.
Questo articolo descrive un metodo per eseguire il profilo bioenergetico di mitocondri isolati dal muscolo scheletrico del topo utilizzando saggi respirometrici basati su micropiastre (Figura 1). In particolare, vengono dettagliati tre protocolli: il Coupling Assay, CA per valutare il grado di accoppiamento tra l'ETC e il macchinario OXPHOS; l'Electron Flow Assay, EFA per misurare l'attività dei singoli complessi ETC; e il test BOX per determinare la capacità di β-ossidazione mitocondriale. In particolare, sono necessarie solo piccole quantità di campioni rispetto ai metodi di respirometria convenzionali. Il protocollo di isolamento qui utilizzato è stato modificato dal metodo pubblicato altrove18.
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Protocol
L'alloggiamento del topo e la raccolta dei tessuti sono stati eseguiti utilizzando protocolli approvati dal Comitato Etico dell'Universidad Pablo de Olavide (Siviglia, Spagna; protocolli 24/04/2018/056 e 12/03/2021/033) in conformità con il Regio Decreto Spagnolo 53/2013, la Direttiva Europea 2010/63/UE e altre linee guida pertinenti.
1. Preparazione delle scorte, dei tamponi e dei reagenti per i saggi respiratori
- Preparare le seguenti soluzioni stock, che possono essere conservate alla temperatura indicata per mesi. Utilizzare H2O ultrapuro in tutti i casi.
- Sciogliere le compresse saline tamponate con fosfato (PBS) in H2O (1 compressa per 200 ml di H2O) per preparare 1x PBS. Autoclave della soluzione e conservarla a temperatura ambiente (RT).
- Sciogliere 2 g di pellet NaOH in 50 mL di H2O per preparare 1 M NaOH.
- Preparare scorte KOH da 0,1 M, 1 M, 5 M e 10 M per la calibrazione del pH.
- Aggiungere 14,612 g di EDTA a 70 ml di H2O. Aggiungere pellet di NaOH fino a quando il pH raggiunge 8,0 in modo che l'EDTA si dissolva completamente. Aggiungere H2O quantum satis (QS) a 100 mL. Autoclave della soluzione edTA (pH 8) risultante da 0,5 M e conservarla a RT.
- Aggiungere 19 g di EGTA a 70 mL di H2O. Aggiungere pellet di NaOH fino a quando il pH raggiunge 8,0 per consentire all'EGTA di dissolversi completamente. Aggiungere H2O QS a 100 ml. Autoclave della soluzione EGTA (pH 8) risultante da 0,5 M e conservarla a RT.
- Aggiungere 2 mL di 0,5 M EDTA a 98 mL di PBS. Conservare la soluzione EDTA/PBS da 10 mM risultante in RT.
- Sciogliere 5,958 g di HEPES in 40 mL H2O. Regolare il pH a 7,2 con KOH e QS a 50 mL con H2O. Filtrare il tampone HEPES da 0,5 M risultante attraverso una rete da 0,45 μm e conservarlo a RT.
- Sciogliere 3,402 g di KH2PO4 in un massimo di 50 ml di H2O. Filtrare la soluzione di KH2PO4 da 0,5 M risultante attraverso una rete da 0,45 μm e conservarla a RT.
- Sciogliere 9,521 g di MgCl2 anidro in un massimo di 100 ml di H2O. Autoclave la soluzione risultante da 1 M MgCl2 e conservarla a RT.
NOTA: Poiché si tratta di una reazione esotermica, procedere con cautela e sciogliere mgCl2 sul ghiaccio.
- Preparare soluzioni stock di substrato e inibitori (vedere Tabella 1). Aliquotare e conservarli a -20 °C. Evitare cicli di congelamento-scongelamento. In via eccezionale, preparare sempre l'acido piruvico immediatamente prima dell'uso.
- Preparare in H2O ultrapuro: 0,5 M succinato, 0,5 M acido piruvico, 0,5 M acido malico, 100 mM ADP, 1 M acido ascorbico e 50 mM N,N,N′,N′-tetrametil-para-fenilene-diammina (TMPD) (proteggere dalla luce).
- Preparare in 100% dimetilsolfossido (DMSO): 50 mM palmitoil-L-carnitina, 4 mM rotenone, 20 mM carbonile cianuro-p-trifluorometiossifenilidrozone (FCCP), 4 mM oligomicina e 5 mM Antimicina A.
NOTA: non superare la concentrazione finale di DMSO dello 0,1% nei pozzetti micropiastre. Pertanto, preparare soluzioni stock altamente concentrate per rimanere al di sotto di questo limite.
- Preparare i tamponi per l'isolamento dei mitocondri e la quantificazione delle proteine appena il giorno dell'esperimento. Utilizzare H2O ultrapuro in tutti i casi e mantenere tutti i tamponi sul ghiaccio se non diversamente specificato.
NOTA: Per risparmiare tempo, tutti i reagenti possono essere pesati e conservati negli appositi contenitori (ad esempio, tubi da 15 ml) alla giusta temperatura del giorno precedente.- Per preparare il 10% di acidi grassi liberi (FFA) BSA, sciogliere completamente 150 mg di FFA BSA in 1,5 ml di H2O mediante ruota di inversione/rotazione. Non vortice per evitare la formazione di schiuma.
- Per preparare 1x reagente Bradford, diluire la soluzione stock commerciale 5x con H2O e tenerla al buio a RT.
- Per preparare 8x Mitochondria Buffer (MB), sciogliere 4,112 g di saccarosio e 763 mg di HEPES in 15 mL di H2O. Regolare il pH a 7,2, aggiungere 1,6 mL di 10% FFA BSA e QS a 20 mL con H2O.
- Per preparare 20 mL di Tampone di Isolamento 1 (IB1) (4 mL utilizzati per campione), sciogliere 400 μL di 0,5 M EDTA, 784 mg di D-mannitolo e 2,5 mL di 8x MB in 15 mL di H2O. Regolare il pH a 7,2 e QS con H2O.
- Per preparare 5 mL di tampone di isolamento 2 (IB2) (500 μL utilizzati per campione), sciogliere 30 μL di 0,5 M EGTA, 196 mg di D-mannitolo e 625 μL di 8x MB in 4 mL di H2O. Regolare il pH a 7,2 e QS con H2O.
- Per preparare 5 mL di tampone di risospensione (RB) (200 μL utilizzati per campione), sciogliere 120 mg di saccarosio, 191,3 mg di D-mannitolo, 50 μL di 0,5 M HEPES e 10 μL di 0,5 M EGTA in 4 mL di H2O. Regolare il pH a 7,2 e QS con H2O.
- Per preparare 2x Mitochondrial Assay Solution-1 (MAS-1), sciogliere 1,199 g di saccarosio, 2,8 g di mannitolo, 1 mL di 0,5 M KH2PO4, 250 μL di 1 M MgCl2, 200 μL di 0,5 M HEPES e 100 μL di 0,5 M EGTA in 20 mL di H2O. Regolare il pH a 7,2 e QS a 25 mL con H2O. Tenere in ghiaccio per brevi periodi. Per periodi più lunghi, tenerlo a 4 °C per evitare precipitazioni.
- Per preparare 1x Coupling Assay medium (CAM), preparare due diversi buffer basati su MAS-1: 1) CAM+BSA per il test CA vero e proprio e 2) CAM-BSA per la preparazione degli inibitori del saggio. Mantenere sempre il rapporto piruvato/malato a 10:1.
NOTA: Poiché BSA può ostruire le porte di iniezione, diluire gli inibitori in CAM senza BSA.- Per preparare CAM+BSA, diluire 300 μL di acido piruvico 0,5 M, 30 μL di acido malico 0,5 M e 7,5 mL di 2x MAS-1 in 6 mL di H2O. Regolare il pH a 7,2. Aggiungere 300 μL di 10% FFA BSA e QS a 15 mL con H2O.
- Per preparare CAM-BSA, diluire 120 μL di acido piruvico 0,5 M, 12 μL di acido malico 0,5 M e 3 mL di 2x MAS-1 in 2 mL di H2O. Regolare il pH a 7,2 e QS a 6 mL con H2O.
- Per preparare 1x Electron Flow Assay medium (EFAM), preparare sia tamponi EFAM contenenti BSA che BSA-free.
- Per preparare EFAM+BSA, diluire 300 μL di acido piruvico 0,5 M, 60 μL di acido malico 0,5 M, 3 μL di 20 mM FCCP e 7,5 mL di 2x MAS-1 in 6 mL di H2O. Regolare il pH a 7,2. Aggiungere 300 μL di 10% FFA BSA e QS a 15 mL con H2O.
- Per preparare EFAM-BSA, diluire 120 μL di acido piruvico 0,5 M, 24 μL di acido malico 0,5 M, 1,2 μL di 20 mM FCCP e 3 mL di 2x MAS-1 in 2 mL di H2O. Regolare il pH a 7,2 e QS a 6 mL con H2O.
- Per preparare 1x β-oxidation medium (BOXM), preparare soluzioni BOXM contenenti BSA e prive di BSA.
- Per preparare BOXM+BSA, diluire 12 μL di 50 mM di palmitoil-L-carnitina, 30 μL di acido malico 0,5 M e 7,5 mL di 2x MAS-1 in 7 mL di H2O. Regolare il pH a 7,2. Aggiungere 300 μL di 10% FFA BSA e QS a 15 mL con H2O.
- Per preparare BOXM-BSA, diluire 4,8 μL di 50 mM palmitoil-L-carnitina, 12 μL di acido malico 0,5 M e 3 mL di 2x MAS-1 in 2 mL di H2O. Regolare il pH a 7,2 e QS a 6 mL con H2O.
2. Dissezione muscolare, omogeneizzazione e isolamento mitocondriale
- Posizionare tutti i materiali e i tamponi sul ghiaccio. Assicurarsi che tutti i materiali siano ghiacciati durante l'intera procedura per proteggere i mitocondri dai danni.
- Posizionare tre becher da 50 mL per campione sul ghiaccio e aggiungere le seguenti soluzioni: 10 mL di PBS nel becher 1, 10 mL di 10 mM EDTA/PBS nel becher 2 e 4 mL di IB1 nel becher 3.
- Eutanasia del topo per lussazione cervicale. Evitare l'eutanasia con CO2 poiché i muscoli scheletrici potrebbero diventare ipossici, interferendo con le analisi della respirazione.
- Spruzzare l'arto posteriore destro con etanolo al 70% per evitare che la pelliccia si spargi e nastro adesivo sul pannello di dissezione del sughero. Nastro adesivo anche sull'arto anteriore sinistro.
- Fai un'incisione con un bisturi monouso sterile attraverso la pelle dal ginocchio ai piedi.
- Afferrare la pelle con una pinza dentata all'altezza della caviglia e tagliarla con forbici sottili intorno alla caviglia.
- Allontana la pelle dalla muscolatura sottostante con una pinzetta a punta fine in una mano mentre la tiri su con una pinza dentata nell'altra mano.
- Sezionare tutti i muscoli scheletrici dalla caviglia al ginocchio (Figura 2).
- Rimuovere tutto il tessuto connettivo sopra il muscolo tibiale anteriore (TA) per facilitare l'estrazione muscolare utilizzando pinzette sottili e forbici.
- Trova i quattro tendini distali del muscolo EDL e sezionali vicino ai loro inserimenti nelle dita dei piedi. Individuare il tendine distale TA e tagliarlo vicino al suo inserimento, sempre sotto la caviglia.
- Tirare con attenzione i tendini TA ed EDL sopra la caviglia per liberare le estremità allentate.
- Afferrare le estremità sciolte dei tendini e facilitare i muscoli lontano dal resto della muscolatura e delle ossa tirandoli su. Utilizzare pinzette o forbici fini per facilitare il processo. Procedere con cautela per evitare la contrazione della miofibra.
- Tagliare il tendine prossimale dell'EDL e il muscolo TA il più vicino possibile alla rotula.
- Capovolgere il mouse per procedere con l'estrazione del muscolo gastrocnemio (GA) e del soleo.
- Afferrare la tasca formata tra il bicipite femorale e il GA con pinza dentata. Usa forbici fini per separare questi muscoli e visualizzare il tendine GA prossimale.
- Afferrare il tendine di Achille con una pinza fine e tagliarlo con cura con forbici fini. Rilascia i muscoli GA e soleus dall'osso sottostante tirandoli verso l'alto attraverso i loro tendini. Tagliare il tendine GA prossimale liberandolo insieme al soleo sottostante.
- Sezionare attentamente i muscoli rimanenti dal tendine al tendine seguendo la stessa procedura fino a quando rimangono solo le ossa.
- Ri-pin il mouse nella posizione iniziale per sezionare il muscolo quadricipite.
- Scartare il tessuto adiposo sopra il quadricipite sul lato prossimale usando pinze dentate e forbici fini.
- Inserire pinzette sottili tra il quadricipite e il femore e spostarle in entrambe le direzioni lungo l'asse del femore per separare il muscolo dall'osso.
- Afferrare i tendini muscolari del quadricipite distale con una pinza dentata e tagliare il tendine con forbici sottili il più vicino possibile alla rotula.
- Tirare il quadricipite verso l'alto e liberarlo all'inserzione prossimale con forbici fini.
- Ripetere i passaggi da 4 a 8 di questa sezione con l'arto posteriore sinistro.
- Risciacquare tutti i muscoli prima in Beaker 1 e poi in Beaker 2.
- Trasferire tutti i muscoli a Beaker 3 e tritare finemente tutti i muscoli con forbici affilate sul ghiaccio.
- Trasferire la sospensione su un tubo C (coperchio viola), mantenendola sempre in ghiaccio.
- Chiudere ermeticamente il tubo C e fissarlo a testa in giù sul manicotto dell'omogeneizzatore. Assicurarsi che il materiale campione si trovi nell'area del rotatore/statore. Selezionare il programma di 1 minuto chiamato m_mito_tissue_01.
- Dividere l'omogeneizzato in due tubi microcentrifuga prechilled da 2 mL e centrifugare a 700 × g per 10 minuti a 4 °C in una centrifuga da tavolo.
- Trasferire i supernatanti in nuovi tubi prechilled da 2 ml, evitando accuratamente il tessuto grasso e non omogeneizzato. Conservare il pellet a -80 °C per la determinazione della purezza della frammentazione (frazione N) (Figura 3).
- Centrifugare i supernatanti a 10.500 × g per 10 min a 4 °C.
- Trasferire i supernatanti in nuovi tubi prechilled da 2 mL ed etichettarli come Supernatant Number 1 (SN1). Conservarli a -80 °C per la determinazione della purezza della frammentazione (Figura 3).
- Sospendere e combinare entrambi i pellet in un volume totale di 500 μL di IB2 in ghiaccio.
- Centrifugare a 10.500 × g per 10 min a 4°C.
- Trasferire il surnatante in un nuovo tubo prechilled da 2 ml ed etichettarlo come Supernatant Number 2 (SN2). Conservare a -80 °C per la determinazione della purezza della frammentazione (Figura 3).
- Risospendere il pellet mitocondriale finale in 200 μL di RB. Mettere rapidamente da parte 10 μL per la quantificazione delle proteine e aggiungere immediatamente 10 μL di FFA BSA al 10% alla sospensione mitocondriale rimanente per prevenire danni.
- Determinare la concentrazione proteica utilizzando il test di Bradford.
- Per la curva standard, preparare 30 μL di diluizioni seriali di concentrazione nota di una proteina nel tampone RB. Ad esempio, utilizzare 1 mg / mL, 0,5 mg / mL, 0,25 mg / mL, 0,125 mg / mL, 0,0625 mg / mL e 0 mg / mL di BSA.
- Preparare le diluizioni seriali 1:3 e 1:6 dei campioni mitocondriali nel tampone RB.
- In una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti, prima caricare 2,5 μL di campione/standard per pozzetto. Quindi, aggiungere 10 μL di 1 M NaOH a ciascun campione e, infine, 200 μL di 1x reagente Bradford. Mescolare bene, evitando bolle d'aria. Controllare visivamente che il colore dei campioni sia all'interno della linea di calibrazione. Eseguire sempre l'analisi in triplice copia.
- Incubare le piastre per 5 minuti a RT al buio e leggere l'assorbanza a 595 nm in uno spettrofotometro a micropiastre.
- Calcolare la curva standard tracciando i valori di assorbanza (asse y) rispetto alla corrispondente concentrazione proteica delle diluizioni preparate nel passaggio 22.1 di questa sezione (asse x).
- Calcola la quantità totale di proteine nei campioni mitocondriali estrapolando con la curva standard.
3. Preparazione dei saggi respirometrici basati su micropiastre
- Idratare il sensore del saggio respirometrico almeno 12 ore prima dell'esperimento con 1 mL di tampone di calibrazione per pozzetto. Incubare a 37 °C (senza CO2).
NOTA: i sensori idratati possono essere utilizzati fino a 72 ore. La cartuccia deve essere maneggiata con attenzione durante questa fase: se qualcosa tocca i sensori, la sensibilità di misurazione potrebbe essere influenzata. - Prechill la centrifuga preparativa con il rotore a micropiastra a benna oscillante e i corrispondenti adattatori per micropiastre a 4 °C.
- Accendere il computer, aprire il software di analisi e selezionare il protocollo desiderato.
NOTA: quando il software si collega allo strumento di misurazione del consumo di ossigeno si sente un clic. Il sensore di riscaldamento deve essere verde e a 37 °C prima dell'inizio dell'esperimento. - Preparare le soluzioni inibitorie dalle scorte indicate nella sezione 1, fase 2 in base al saggio da eseguire. Preparare un volume sufficiente per ogni soluzione. Cfr . tabella 1 e tabella 2 per riferimento.
- Aggiungere il volume appropriato di ciascun inibitore in ciascuna porta, inserire la cartuccia nello strumento di misurazione del consumo di ossigeno e avviare la calibrazione.
NOTA: l'aggiunta di un inibitore alla cartuccia e l'inserimento della cartuccia nello strumento richiedono 15-20 minuti. Assicurarsi che siano stati introdotti i componenti della cartuccia corretti. Il coperchio della cartuccia e il booster idroelettrico potrebbero essere scartati mentre sono necessari la cartuccia del sensore e il posto di utilità. - Centrifugare la sospensione mitocondriale concentrata del tratto 2, fase 21 a 10.500 × g per 10 minuti a 4 °C.
- Sospendere il pellet mitocondriale in 100 μL di 1x CAM+BSA, 1x EFAM+BSA o 1x BOXM+BSA, a seconda del protocollo da eseguire.
- Diluire ulteriormente il campione mitocondriale concentrato a una concentrazione finale di 0,2 μg/μL nel mezzo di saggio corrispondente.
- Seminare 50 μL della sospensione (totale 10 μg di proteine) per pozzetto in una micropiastra prechilled a 24 pozzetti su ghiaccio. Non aggiungere mitocondri nei pozzetti di correzione dello sfondo; aggiungere solo il mezzo di analisi corrispondente. Conservare la restante sospensione mitocondriale a -80 °C per la determinazione della purezza della frammentazione (Figura 3).
- Ruotare la micropiastra nella centrifuga preparativa prechilled a 2.000 × g per 20 minuti a 4 °C. Contrappeso per bilanciare di conseguenza.
- Riscaldare il mezzo di saggio rimanente a 37 °C durante la centrifugazione su micropiastre.
- Dopo la centrifugazione, lasciare la micropiastra sul banco per 5 minuti per equilibrare. Aggiungere 450 μL di mezzo di saggio caldo per un volume finale di 500 μL per pozzetto a RT. Fallo lentamente e con attenzione, aggiungendo il mezzo alla parete dei pozzetti per evitare di staccare i mitocondri.
- Posizionare immediatamente la micropiastra nello strumento di misurazione del consumo di ossigeno senza coperchio e avviare il protocollo (Tabella 3). Assicurarsi che il primo passo sia un'incubazione di 10 minuti per consentire alla micropiastra di riscaldarsi.
- Una volta terminato l'esperimento, rimuovere la cartuccia e la micropiastra, spegnere lo strumento e avviare l'analisi.
4. Analisi dei risultati
- Nel caso dei saggi CA e BOX, eseguire le seguenti analisi:
- Registrare il consumo nonmitocondriale di O2 , che corrisponde alla media dei valori ottenuti dopo l'iniezione di antimicina A e rotenone.
NOTA: Antimicina A e rotenone sono inibitori del complesso III e I, rispettivamente. - Calcola la respirazione basale sottraendo il consumo di O2 nonmitocondriale dai valori basali (punti di misurazione 1 e 2).
- Sottrarre il consumo nonmitocondriale di O2 dai valori dopo l'iniezione del substrato V complesso ADP (iniezione A) per determinare lo stato mitocondriale III.
- Sottrarre il consumo nonmitocondriale di O2 dai valori respiratori post iniezione dell'oligomicina inibitore del complesso V (iniezione B) per ottenere lo stato mitocondriale IVo.
- Calcolare lo stato mitocondriale IIIu deducendo il consumo nonmitocondriale di O2 dalla respirazione dopo l'iniezione di FCCP (iniezione C).
NOTA: FCCP è un potente disaccoppiatore di fosforilazione ossidativa mitocondriale. La sintesi di ATP viene bypassata in sua presenza e l'ETC raggiunge la massima attività. - Sottrarre i valori di respirazione basale dai valori dello stato mitocondriale IIIu per ottenere la capacità di riserva mitocondriale, che è la capacità di generare ATP extra in caso di aumento della domanda di energia.
- Dividere lo stato mitocondriale IIIu per i valori di IVo di stato per ottenere il Respiratory Control Ratio (RCR).
NOTA: valori RCR negativi o nulli indicano che l'accoppiamento mitocondriale è interessato.
- Registrare il consumo nonmitocondriale di O2 , che corrisponde alla media dei valori ottenuti dopo l'iniezione di antimicina A e rotenone.
- In riferimento all'EFA, eseguire i seguenti calcoli:
- Ottenere l'attività residua calcolando il valore medio dopo l'iniezione di rotenone e antimicina A (iniezioni A e C).
- Calcolare l'attività del complesso da I a IV (CI-CIV) sottraendo l'attività residua dai valori basali (punti di misura 1 e 2).
- Sottrarre l'attività residua dai valori post iniezione del substrato CII succinato (iniezione B) per ottenere l'attività CII-CIII-CIV.
- Calcolare l'attività ciV deducendo l'attività residua dai valori ottenuti dopo l'iniezione degli agenti riducenti del citocromo c, dell'acido ascorbico e del TMPD (iniezione D).
- Rappresentare tutti i risultati utilizzando grafici a barre, come nella Figura 4, per trarre conclusioni appropriate.
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Representative Results
Il protocollo qui presentato consente l'analisi in vivo della respirazione mitocondriale attraverso l'isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo. Una descrizione del metodo è illustrata nella Figura 1. Dopo aver sezionato i muscoli scheletrici dagli arti posteriori (Figura 2), i tessuti vengono omogeneizzati e i mitocondri purificati, in condizioni isotoniche, attraverso centrifugazioni seriali. La purezza delle diverse frazioni ottenute durante il processo di isolamento può essere analizzata da western blot utilizzando anticorpi contro diversi marcatori organelli. La figura 3A mostra il profilo proteico generale delle diverse frazioni che mostrano popolazioni proteiche distinte nelle frazioni isolate.
La Figura 3B mostra che tutto il contenuto mitocondriale è nella frazione mitocondriale, come evidenziato dai forti segnali per i marcatori delle membrane mitocondriali esterne (VDAC e TOMM20) e interne (TIMM23), e anche per le proteine associate ai nucleoidi (mtTFA). Tutti i nuclei e il citoscheletro (β-actina) sono presenti nella Frazione N, che rappresenta nuclei e materiale indisturbato (Figura 3C). Inoltre, la maggior parte dei marcatori del reticolo endoplasmatico (ER) (Calnexin), della membrana plasmatica (Na+/K+-ATPaseα1) o dei marcatori citoplasmatici (LDHA, HSP70 o AKT) rimangono nelle frazioni SN1 o SN2, evidenziando l'elevata purezza ottenuta durante l'isolamento (Figura 3C). Tuttavia, ci sono alcune tracce di contaminazione ER nella frazione mitocondriale, probabilmente a causa della vicinanza di questi organelli. Dati i risultati ottenuti nei successivi saggi respiratori, la procedura di isolamento qui descritta produce preparati mitocondriali altamente puri e vitali.
Sia i saggi CA che BOX consentono il calcolo di diversi stati mitocondriali in presenza di diversi substrati che stimolano specifiche vie metaboliche. Nello specifico, questi saggi vengono eseguiti in presenza di acido piruvico o cloruro di palmitoil-L-carnitina. L'acido piruvico è un substrato del ciclo di Krebs; l'acido malico è un intermediario del ciclo di Krebs e un induttore del NADH, mentre la palmitoil-L-carnitina è un substrato della via di β-ossidazione degli acidi grassi. (Figura 4A,B). In entrambi i saggi, il primo stato che può essere misurato è la frequenza respiratoria basale, che rappresenta la respirazione mitocondriale in presenza dei substrati inizialmente aggiunti al mezzo di saggio. Quindi, si ottiene lo stato mitocondriale III, che rappresenta la produzione di ATP da ADP e fosfato inorganico, mostrando la respirazione massima in uno stato accoppiato. Pertanto, vi è un aumento del consumo di ossigeno dopo l'aggiunta di ADP, come osservato nella Figura 4A, B.
Inoltre, lo stato IVo indica la perdita di protoni associata all'inibizione dell'ATP sintasi da parte dell'oligomicina, che porta ad una diminuzione della respirazione, come osservato nei grafici CA e BOX (Figura 4A,B). L'aggiunta di FCCP porta allo Stato IIIu, che mostra la capacità respiratoria massima che i mitocondri possono mostrare in uno stato disaccoppiato quando il consumo di ossigeno raggiunge il suo livello più alto in questi test. Per calcolare tutti questi stati, è fondamentale prima determinare la respirazione non semicondria, che si ottiene alla fine del test quando l'antimicina A e il rotenone vengono iniettati per inibire la respirazione ossidativa. Come mostrato nella Figura 4A,B, questi valori devono essere sempre al di sotto della respirazione basale e molto vicini allo zero nel caso di saggi con mitocondri isolati come questi saggi qui descritti. Infine, il parametro RCR deve essere calcolato per valutare l'integrità mitocondriale. Riflette se i mitocondri possono reagire all'ADP producendo ATP ad un tasso elevato con una bassa perdita di protoni. I valori medi RCR trovati nei saggi CA e BOX sono stati rispettivamente di 5,78 ± 1,03 e 3,47 ± 0,42 (Figura 4A, B), che sono in accordo con gli RCR ottimali riportati in precedenza21,22,23,24.
Inoltre, l'EFA esamina l'attività dei complessi ETC singolarmente o in combinazione attraverso l'iniezione di substrati e inibitori specifici (Figura 4C). L'attività CI-CIV rappresenta la respirazione mitocondriale basata su substrati di piruvato e malato quando nessun complesso è inibito; in questo caso, la maggior parte degli elettroni passa attraverso CI. Poiché il rotenone è un inibitore specifico dell'IC, l'IC viene bloccato dopo la sua aggiunta, con conseguente diminuzione del consumo di ossigeno (Figura 4C). L'attività CII-CIII-CIV mostra la respirazione quando solo l'IC è bloccato e il CII viene attivato: il succinato, iniettato attraverso la porta B, è un substrato specifico del complesso II (succinato deidrogenasi). Pertanto, la CII viene ridotta, avviando il flusso di elettroni da CII a CIV, mentre l'IC è ancora inibito dalla precedente iniezione di rotenone, producendo un aumento del consumo di ossigeno (Figura 4C). L'aggiunta di antimicina A inibisce il CIII, bloccando il flusso di elettroni attraverso l'ETC e riducendo il consumo di ossigeno. Inoltre, l'attività del CIV è determinata quando viene stimolata dall'ossidazione del citocromo C dopo essere stata ridotta dall'aggiunta di acido ascorbico/TMPD; La Figura 4C mostra che l'attivazione del CIV produce un aumento del consumo di ossigeno. Infine, l'attività residua si riferisce al consumo di ossigeno quando la catena di fosforilazione ossidativa viene inattivata dopo l'aggiunta di rotenone e antimicina A. Questo valore stabilisce lo sfondo per il calcolo dell'attività dei complessi come indicato nei passaggi del protocollo 2.2-2.4 nella sezione 4.
Figura 1: Visualizzazione schematica del metodo. Abbreviazioni: OCR = tasso di consumo di ossigeno; ADP = adenosina difosfato; OL = oligomicina; FCCP = cianuro di carbonile-p-trifluorometiossifenilidrato; Anta = antimicina A; Rot = rotenone. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Dissezione e isolamento dei muscoli scheletrici murini dagli arti posteriori per le analisi della respirazione mitocondriale. (A) L'arto posteriore destro è stato allungato e immobilizzato con del nastro adesivo. (B) Un'incisione è stata fatta attraverso la pelle da vicino alla caviglia, fermandosi prossimale al ginocchio. Il tessuto connettivo sovrastante l'AT è stato accuratamente rimosso. I tendini EDL (C) e TA (D) sono stati sezionati vicino alle loro inserzioni. Il tendine TA è stato tirato verso l'alto per alleviare il muscolo lontano dalla muscolatura e dall'osso sottostanti. Quindi, il TA è stato tagliato prossimalmente, vicino alla cresta ventrale alla tibia. Allo stesso modo, il muscolo EDL è stato alleviato e il tendine prossimale è stato meticolosamente tagliato sul lato del ginocchio. (F) Arto posteriore destro dopo dissezione TA ed EDL. (G) Nell'arto posteriore, il tendine di Achille è stato sezionato per sezionare i muscoli GA e soleo. (H) GA e soleus sono stati accuratamente liberati dall'osso tibiale. (I) I muscoli rimanenti sono stati raccolti dalla caviglia al ginocchio fino a quando sono rimasti solo il perone e le ossa tibiali. (J) Hindlimb dopo dissezione. (K) Il quadricipite è stato sezionato. (L) Tutti i muscoli scheletrici raccolti per l'isolamento mitocondriale posteriore. Il processo è stato eseguito per entrambi gli arti posteriori. Abbreviazioni: TA = tibiale anteriore; EDL = estensore digitorum longus; GA = gastrocnemio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Purezza del processo di frammentazione. (A) Profilo proteico generale colorato con blu di Coomassie. (B) Profilo di purezza delle proteine mitocondriali. (C) Marcatori non mitocondriali. Le diverse frazioni ottenute durante l'isolamento dei mitocondri sono state caricate e incubate con anticorpi contro diverse proteine in specifiche frazioni subcellulari. Abbreviazioni: frazione N = tessuto e nuclei non omogeneizzati; SN1 = numero surnatante 1: citoplasma + organelli; SN2 = numero surnatante 2: citoplasma + organelli; VDAC = canale anionico voltaggio-dipendente; TOMM20 = translocase della membrana mitocondriale esterna 20; mtTFA = fattore di trascrizione mitocondriale A; TIMM23 = translocase della membrana mitocondriale interna 23; LDHA = lattato deidrogenasi A; HSP70 = proteina da shock termico 70; ER = reticolo endoplasmatico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Risultati rappresentativi. Profilazione bioenergetica dei mitocondri isolati dai muscoli posteriori di un topo C57BL/6N maschio di tipo C57BL/6N di 13 mesi. I punti di iniezione dei diversi substrati e inibitori sono indicati in ciascun test. Le prestazioni dei macchinari ETC e OXPHOS possono essere analizzate utilizzando rispettivamente piruvato e malato, o palmitoil-L-carnitina e malato come substrati nel test di accoppiamento (A) o β-ossidazione dei saggi FA (B). (C) Il saggio del flusso di elettroni consente lo studio di singoli complessi mitocondriali in presenza di piruvato, malato e FCCP; 10 μg di mitocondri sono stati placcati per pozzetto. I risultati vengono visualizzati seguendo l'opzione di rappresentazione del punto medio per visualizzare i risultati in un formato aggregato. Ciò è in contrasto con l'opzione punto-punto, che consentirebbe la visualizzazione delle 9 misurazioni consecutive solitamente eseguite durante ogni fase di misurazione. Il tipo di visualizzazione può essere modificato dopo aver completato il test sotto le opzioni del grafico a linee cinetiche nel software di analisi. Abbreviazioni: FA = acidi grassi; OCR = tasso di consumo di ossigeno; ADP = adenosina difosfato; FCCP = cianuro di carbonile-p-trifluorometiossifenilidrato; RCR = rapporto di controllo respiratorio; EFA = Saggio del flusso di elettroni; BOX = β-ossidazione della FA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Test di accoppiamento | ||||||
| Porto | Inibitore | [Stock] | [Porta di iniezione] | [Finale] | Ricetta | |
| Inhib · | CAM-BSA | |||||
| Un | ADP | 100 metri | 50 metri quadrati | 5 mM | 650 μL | 650 μL |
| B | Oligomicina | 4 mM | 31,6 μM | 3,16 μM | 11,3 μL | 1418,7 μL |
| C | FCCP · | 20 mM | 60 μM | 6 μM | 4,68 μL | 1555,32 μL |
| D | Antimicina A // Rotenone | 5 mM // 4 mM | 40 μM // 50 μM | 4 μM // 5 μM | 13,52 μL // 21,12 μL | 1655,36 μL |
| Saggio del flusso di elettroni | ||||||
| Porto | Inibitore | [Stock] | [Porta di iniezione] | [Finale] | Ricetta | |
| Inhib · | EFAM-BSA | |||||
| Un | Rotenone | 4 mM | 50 μM | 5 μM | 16,25 μL | 1283,7 μL |
| B | Succinato | 500 mM | 100 metri | 10 mM | 286 μL | 1144 μL |
| C | Antimicina A | 5mM | 4 μM | 4 μM | 12,48 μL | 1547,5 μL |
| D | Ascorbato // TMPD | 1 M // 50 mM | 100 mM // 1 mM | 10 mM // 100 μM | 169 μL // 33,8 μL | 1487,2 μL |
| β-ossidazione | ||||||
| Porto | Inibitore | [Stock] | [Porta di iniezione] | [Finale] | Ricetta | |
| Inhib · | BOX-BSA | |||||
| Un | ADP | 100 metri | 40 metri quadrati | 4 mM | 520 μL | 780 μL |
| B | Oligomicina | 4 mM | 31,6 μM | 3,16 μM | 11,3 μL | 1418,7 μL |
| C | FCCP · | 20 mM | 60 μM | 6 μM | 4,68 μL | 1555,32 μL |
| D | Antimicina A // Rotenone | 5 mM // 4 mM | 40 μM // 20 μM | 4 μM // 2 μM | 13,52 μL // 8,45 μL | 1668 μL |
Tabella 1: Preparazione di soluzioni inibitorie per i diversi saggi. La colonna [Stock] mostra le concentrazioni delle soluzioni stock del composto indicate nella colonna Inibitore . [Injection Port] si riferisce alla concentrazione delle soluzioni inibitorie da caricare nelle diverse porte della cartuccia, mentre la colonna [Final] indica la concentrazione finale degli inibitori nei pozzetti. Infine, le colonne Ricetta specificano i volumi di soluzioni di inibitori di riserva e di supporti privi di BSA che devono essere miscelati per preparare le soluzioni da caricare nelle porte di iniezione. Abbreviazioni: ADP = adenosina difosfato; FCCP = cianuro di carbonile-p-trifluorometiossifenilidrato; TMPD = N,N,N′,N′-tetrametil-para-fenilene-diammina; Inhib = inibitore; BSA = albumina sierica bovina; CAM-BSA = mezzo di analisi di accoppiamento privo di BSA; EFAM-BSA = mezzo di saggio a flusso di elettroni libero da BSA; BOX-BSA = β-ossidazione senza BSA del mezzo di saggio degli acidi grassi.
| Porto | Volume iniettato | Magazzino preparato (26 pozzetti) |
| Un | 50 μL | 1300 μL |
| B | 55 μL | 1430 μL |
| C | 60 μL | 1560 μL |
| D | 65 μL | 1690 μL |
Tabella 2: Calcolo dei volumi di iniezione.
| Azione | Tempo (minuti) | Ripetizione | Porto |
| Calibrare | 15-20 | ||
| Aspettare | 10 | ||
| Mix + Aspetta | 1 + 3 | × 2 | |
| Mescolare | 1 | ||
| Misura + Mix | 3 + 1 | × 2 | |
| Iniettare | Un | ||
| Mescolare | 1 | ||
| Misura | 3 | ||
| Mescolare | 1 | ||
| Iniettare | B | ||
| Mescolare | 1 | ||
| Misura | 3 | ||
| Mescolare | 1 | ||
| Iniettare | C | ||
| Mescolare | 1 | ||
| Misura | 3 | ||
| Mescolare | 1 | ||
| Iniettare | D | ||
| Mix + Misura | 1 + 3 | × 2 |
Tabella 3: Impostazioni del protocollo per i diversi saggi.
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Discussion
Tutti i metodi utilizzati per studiare la respirazione mitocondriale hanno i loro limiti; quindi, è fondamentale selezionare il metodo che meglio si adatta a una specifica domanda sperimentale. Questo lavoro fornisce un protocollo aggiornato e dettagliato per isolare i mitocondri dal muscolo scheletrico del topo per eseguire diversi saggi respiratori per studiare la funzione mitocondriale. In effetti, lo studio della bioenergetica mitocondriale nei mitocondri isolati utilizzando tecnologie basate su micropiastre è prezioso per studiare la respirazione tessuto-specifica in termini di riproducibilità, affidabilità e complessità. Inoltre, l'uso di mitocondri isolati conferisce il controllo sulla disponibilità del substrato, facilitando la comprensione dei processi biologici sottostanti. Un altro aspetto positivo dell'uso di mitocondri isolati è che è possibile studiare lo Stato III perché l'ATP generato dopo l'iniezione di ADP non viene convertito nuovamente in nuova ADP poiché la maggior parte delle ATPasi transmembrana vengono perse. Inoltre, nei saggi qui descritti, l'oligomicina viene aggiunta per bloccare la potenziale sintesi non specifica di ATP20.
Diverse considerazioni importanti devono essere evidenziate per questo protocollo. In primo luogo, i mitocondri isolati sono estremamente sensibili e devono essere maneggiati con cura. L'alto contenuto di saccarosio e mannitolo nei tamponi utilizzati garantisce le condizioni osmotiche ottimali per proteggere i mitocondri isolati dai danni. Tuttavia, la durata del saggio deve essere mantenuta al minimo per preservare la vitalità mitocondriale e prevenire il distacco dalla micropiastra una volta seminata. Pertanto, dato che le fasi del protocollo, come la preparazione di mezzi di saggio e substrati e soluzioni inibitorie, o il caricamento degli inibitori nella cartuccia di saggio respirometrico, richiedono molto tempo, ogni fase dovrebbe essere perfettamente coordinata. Inoltre, a differenza di altri metodi basati sulla digestione enzimatica21,24 e sull'omogeneizzazione di mortai e pestelli17,19,21,23,24, il metodo qui descritto si basa sull'uso di un omogeneizzatore automatizzato, che consente un'omogeneizzazione del campione rapida ed efficiente. È importante sottolineare che le sospensioni mitocondriali sono meno sensibili se altamente concentrate. Pertanto, preparare solo le diluizioni immediatamente prima di usarle. Infine, è essenziale lavorare rapidamente durante il test respirometrico vero e proprio. Di solito, quando si analizzano le cellule in coltura in questi saggi, vengono eseguite tre fasi di misurazione consecutive dopo l'iniezione di substrati o inibitori, il che si traduce in protocolli che si estendono tra 40 e 50 min., Per garantire la vitalità dei mitocondri isolati durante l'intera procedura, il numero di fasi di misurazione è spesso ridotto al minimo a causa della loro vulnerabilità19, 23,25, riducendo il tempo necessario per completare l'analisi respirometrica a ~20 min. I protocolli descritti in questo lavoro (Tabella 3) seguono questa tendenza, anche se altri metodi pubblicati in precedenza riportano profili OCR efficienti con fasi di misurazione più lunghe e standard26.
Ad esempio, se due saggi consecutivi verranno eseguiti con lo stesso set di campioni nello stesso giorno, preparare tutti i reagenti per il secondo test durante il primo ad eccezione delle diluizioni mitocondriali: solo diluire, seminare e ruotare i mitocondri immediatamente prima di iniziare il secondo test, mentre lo strumento viene calibrato. Una volta completato l'esperimento, il parametro RCR (sezione 4, fase 1.7) deve essere calcolato per valutare la qualità dei preparati mitocondriali utilizzati. Di solito, i valori RCR compresi tra 3,5 e 5 denotano che l'integrità mitocondriale è ottimale e mostrano una respirazione ossidativa accoppiata funzionale25. I saggi con valori RCR più bassi devono essere scartati perché l'integrità mitocondriale è stata compromessa durante l'isolamento. In questi casi, considerare di lavare il pellet mitocondriale due volte (sezione 2, passaggi 19-21)22, come precedentemente riportato.
In secondo luogo, mantenere il pH corretto durante tutta la procedura è fondamentale per ottenere risultati di successo. Assicurarsi che il pH di tutte le soluzioni sia impostato come indicato, cioè pH 7,2, e che il pH sia sempre regolato con KOH se non diversamente specificato. In particolare, il pH dei tamponi contenenti BSA non deve essere misurato direttamente con il pHmetro poiché il BSA può danneggiare la sonda. Pertanto, regolare il pH nei tamponi corrispondenti prima di aggiungere BSA. Per evitare cambiamenti nel pH dovuti all'aggiunta di BSA, utilizzare sempre FFA BSA. Inoltre, alcuni lotti di H2O ultrapuro potrebbero essere acidi, quindi si raccomanda l'uso di pH 7 H2O purificati commercialmente. Inoltre, è necessario assicurarsi che il pHmetro sia correttamente calibrato e che sia il modello appropriato per misurare il pH delle sostanze chimiche da preparare.
In terzo luogo, è fondamentale eseguire correttamente la fase di raccolta del campione per la misurazione proteica della sospensione mitocondriale finale (sezione 2, fase 21) per prevenire la distruzione mitocondriale. Risospese il pellet in modo rapido ma completo, raccogliere un'aliquota e aggiungere FFA BSA alla sospensione rimanente per conservare l'equilibrio osmotico e proteggere i mitocondri dai danni. Se FFA BSA fosse già presente nel tampone di risospensione, e quindi, durante la quantificazione proteica, l'alto contenuto proteico confonderebbe i risultati della quantificazione. Questo è il motivo per cui FFA BSA deve essere aggiunto dopo aver accantonato un'aliquota per la quantificazione.
In quarto luogo, questo metodo è altamente versatile e può essere adattato alle esigenze dello sperimentatore. Ad esempio, se il modello animale in studio è caratterizzato da una ridotta massa muscolare (ad esempio, topi sarcopenici), ulteriori muscoli possono aumentare la resa mitocondriale. Sebbene in questo lavoro sia stato utilizzato un topo maschio adulto C57BL / 6N wild-type, possono essere impiegati animali di qualsiasi sesso, età o background genetico, nonché tipi muscolari specifici.
In quinto luogo, i valori respiratori possono differire tra gli esperimenti a causa di lievi variazioni nella composizione di tamponi e reagenti, che devono essere preparati freschi ogni volta. Anche l'età, il sesso, il background genetico o le condizioni ambientali possono avere un profondo impatto sui risultati. Tuttavia, un esperimento di successo dovrebbe presentare aumenti del consumo di ossigeno dopo l'iniezione di substrati complessi come ADP e succinato, diminuisce dopo l'iniezione di inibitori come oligomicina o rotenone e aumenta marcato quando viene aggiunto il potente disaccoppiatore FCCP. Inoltre, per evitare un'elevata variabilità tecnica, garantire un'accurata risospensione dei pellet mitocondriali per ottenere sospensioni omogenee prima di seminarli nella micropiastra.
Sesto, se i valori respiratori basali sono bassi, prendere in considerazione l'esecuzione di un esperimento di titolazione per regolare la quantità di proteine per la semina. Infine, poiché questo lavoro fornisce un metodo per ottenere estratti mitocondriali grezzi, ci si aspetta un certo grado di impurità associato ad altri organelli, principalmente ER. Un processo di frammentazione più aggressivo per rimuovere queste impurità sarebbe dannoso per la vitalità mitocondriale, ostacolando l'esecuzione di saggi respiratori. Se la purezza è un problema, specialmente se non è coerente tra i campioni, i risultati del test possono essere normalizzati rispetto alla purezza mitocondriale dopo aver eseguito macchie occidentali contro diversi marcatori organelli (Figura 3). Per quanto ne sappiamo, questo è il primo metodo che evidenzia le preoccupazioni sulla purezza mitocondriale negli estratti grezzi. Di solito, in altri protocolli per saggi respirometrici con mitocondri isolati, la stessa quantità di estratto proteico viene seminata nei pozzetti per confrontare i campioni, supponendo che la stessa quantità di mitocondri sia utilizzata in tutti i casi. Questa è un'ipotesi ragionevole considerando che l'isolamento viene eseguito in parallelo in tutti i campioni. Tuttavia, il background genetico o ambientale dei campioni in studio può portare a notevoli differenze nella purezza degli estratti mitocondriali. Ad esempio, se una data mutazione genetica provoca un aumento dello sviluppo di ER citoplasmatico, gli estratti mitocondriali grezzi di questi animali potrebbero contenere un contenuto di ER maggiore del previsto e, di conseguenza, una proteina mitocondriale inferiore al previsto. Pertanto, anche se la stessa quantità di proteine totali provenienti da campioni di controllo e mutanti fosse seminata nella micropiastra, il consumo di ossigeno dei mutanti sarebbe sottovalutato. Quindi, si raccomanda di determinare la purezza degli estratti di tutte le condizioni in studio. Se i valori sono comparabili, non è necessaria alcuna normalizzazione. Tuttavia, se i valori di purezza tra i campioni differiscono considerevolmente oltre l'errore statistico che lo sperimentatore è disposto ad accettare, dovrebbero essere utilizzati per normalizzare i risultati del consumo di ossigeno.
Il presente protocollo presenta alcune limitazioni. Da notare, questo metodo è stato ottimizzato per il tessuto muscolare scheletrico isolato dai topi. Potrebbe essere necessario apportare modifiche se si utilizzano tessuti o muscoli scheletrici diversi di specie diverse. Inoltre, quando le analisi vengono eseguite su mitocondri isolati, il normale microambiente cellulare viene perso a causa dell'assenza di contesto cellulare e degli altri organelli che potrebbero interagire con i mitocondri. Ciò potrebbe portare a risultati che si discostano leggermente dalle condizioni fisiologiche. Infine, quando i mitocondri sono centrifugati, aderiscono al fondo dei pozzetti. Sebbene completamente necessari, i potenziali effetti della centrifugazione sul loro stato normale sono sconosciuti.
È importante tenere conto del fatto che, dopo aver eseguito le analisi del saggio respirometrico, una riduzione del consumo di ossigeno associata alla respirazione legata all'ATP o stimolata dalla FCCP nei mitocondri isolati potrebbe indicare potenziali alterazioni mitocondriali che potrebbero essere spiegate da20: 1) trasporto limitato di substrati attraverso la membrana mitocondriale interna, 2) diminuzione dell'attività degli enzimi coinvolti nelle reazioni limitanti la velocità di specifiche vie metaboliche come il ETC, ciclo di Krebs, o β-ossidazione, o 3) funzione ETC compromessa, tra le altre possibili spiegazioni.
In sintesi, il metodo aggiornato qui descritto rappresenta un modo adeguato e affidabile per valutare la funzione di ETC e OXPHOS dal tessuto muscolare scheletrico. Ha molteplici applicazioni per valutare come le modificazioni genetiche o l'ambiente potrebbero influenzare la respirazione mitocondriale contribuendo a un fenotipo specifico. Sorprendentemente, il presente protocollo potrebbe essere adattato ad altri organismi modello o essere utilizzato con campioni umani per valutare potenziali disfunzioni mitocondriali associate a malattie umane.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Desideriamo ringraziare Juan J. Tena per l'uso dell'omogeneizzatore e le strutture CABD Proteomics and Animal Husbandry per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero spagnolo dell'Istruzione, della Cultura e dello Sport attraverso la borsa di studio FPU16/03264 a J.D.H.C., l'Associazione Française contre les Miopatie (AFM) attraverso la borsa di studio #22450 a C.V.-G., una sovvenzione istituzionale MDM-2016-0687 (Unità di eccellenza Maria de Maeztu, Dipartimento di regolazione genica e morfogenesi presso CABD) e BFU2017-83150-P a J.J.C. La sovvenzione della Junta de Andalucía P18-RT-4572, il programma di finanziamento FEDER dell'Unione europea e il Ministero spagnolo della scienza, dell'innovazione e delle università concedono RED2018-102576-T a P.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma | A5285 | Stock at -20 °C |
| AKT antibody | Cell Signaling Technology | C67E7 | Rabbit (Host species) |
| anti-Goat HRP | Sigma | 401504 | Rabbit (Host species) |
| anti-Mouse HRP | Cell Signaling | #7076 | Horse (Host species) |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | Stock at -20 °C |
| anti-Rabbit HRP | Cell Signaling | #7074 | Goat (Host species) |
| Ascorbic acid | Sigma | A5960 | Stock at RT |
| Bactin antibody | Sigma | MBS4-48085 | Goat (Host species) |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve |
| BSA, fraction V, Fatty Acid-Free | Calbiochem | 126575 | Stock at 4 °C |
| C tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Purple lid |
| Calnexin antibody | ThermoFisher | MA3-027 | Mouse (Host species) |
| D-mannitol | Sigma | M4125 | Stock at RT |
| EDTA | BDH | 280254D | Stock at 4 °C |
| EGTA | Sigma | E-4378 | Stock at RT |
| FCCP | Sigma | C2920 | Stock at -20 °C |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Homogenizer |
| HEPES | Sigma | H3375 | Stock at RT |
| HSP70 antibody | Proteintech | 10995-1-AP | Rabbit (Host species) |
| LDH-A antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC27230 | Goat (Host species) |
| Magnesium chloride | ChemCruz | sc-255260A | Stock at RT |
| Malic acid | Sigma | P1645 | Stock at RT |
| Microplate spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH | POLARstar OMEGA S/N 415-0292 | Stock at RT |
| Milli-Q water | Millipore system | F7HA17757A | Ultrapure water |
| mtTFA antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC23588 | Goat (Host species) |
| Na+/K+-ATPase α1 antibody | Novus Biologicals | NB300-14755 | Mouse (Host species) |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | Stock at -20 °C |
| Palmitoyl-L-carnitine | Sigma | P1645 | Stock at -20 °C |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | 1x stock at RT |
| Potassium dihydrogen phosphate | ChemCruz | sc-203211 | Stock at RT |
| Potassium hydroxide | Sigma | 60377 | Stock at RT |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | Stock at 4 °C |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Stock at -20 °C |
| Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer | Agilent Technologies | 420179 | XFe24 model |
| Seahorse XFe24 FluxPak mini | Agilent Technologies | 102342-100 | The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution |
| Succinate | Sigma | S7626 | Stock at RT |
| Sucrose | Sigma | S9378 | Stock at RT |
| TIMM23 antibody | Abcam | ab230253 | Rabbit (Host species) |
| TMPD | Sigma | T7394 | Stock at -20 °C |
| TOMM20 antibody | Abcam | ab56783 | Mouse (Host species) |
| VDAC antibody | Abcam | ab15895 | Rabbit (Host species) |
References
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- Alberts, B., et al. The mitochondrion. Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , Garland Science. New York. (2002).
- Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. Metabolism and function of coenzyme Q. Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).
- Alcázar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency. Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).
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