Summary
Her beskriver vi en detaljert metode for mitokondrierisolasjon fra mus skjelettmuskulatur og den påfølgende analysen av respirasjon av oksygenforbrukshastighet (OCR) ved hjelp av mikroplatebaserte respirometriske analyser. Denne rørledningen kan brukes til å studere effekten av flere miljømessige eller genetiske intervensjoner på mitokondriemetabolisme.
Abstract
Mesteparten av cellens energi oppnås ved nedbrytning av glukose, fettsyrer og aminosyrer ved forskjellige veier som konvergerer på mitokondrieoksidativ fosforylering (OXPHOS) -systemet, som reguleres som svar på cellulære krav. Lipidmolekylet Coenzyme Q (CoQ) er avgjørende i denne prosessen ved å overføre elektroner til kompleks III i elektrontransportkjeden (ETC) gjennom konstante oksidasjons-/reduksjonssykluser. Mitokondrier status og til slutt cellulær helse kan vurderes ved å måle ETC oksygenforbruk ved hjelp av respirometriske analyser. Disse studiene utføres vanligvis i etablerte eller primære cellelinjer som har vært dyrket i flere dager. I begge tilfeller kan de oppnådde åndedrettsparametrene ha avviket fra normale fysiologiske tilstander i et gitt organ eller vev.
I tillegg hindrer de iboende egenskapene til dyrkede enkeltfibre isolert fra skjelettmuskulatur denne typen analyse. Dette papiret presenterer en oppdatert og detaljert protokoll for analyse av åndedrett i nyisolerte mitokondrier fra mus skjelettmuskulatur. Vi tilbyr også løsninger på potensielle problemer som kan oppstå når som helst i prosessen. Metoden som presenteres her kan brukes til å sammenligne oksygenforbruk i forskjellige transgene musemodeller og studere mitokondrieresponsen på narkotikabehandlinger eller andre faktorer som aldring eller sex. Dette er en mulig metode for å svare på viktige spørsmål om mitokondriebioenergetikk metabolisme og regulering.
Introduction
Mitokondrier er de primære metabolske organellene i cellen1. Disse spesialiserte membran-lukkede organellene bruker næringsmolekyler til å produsere energi i form av adenosin tripfosfat (ATP) av OXPHOS. Denne prosessen er avhengig av overføring av elektroner fra donormolekyler i en rekke redoksreaksjoner i ETC2. CoQ er den eneste redoksaktive lipiden som er endogent produsert i alle cellulære membraner og sirkulerende lipoproteiner som viser antioksidantfunksjon3. Det er en viktig komponent i ETC, overføring av elektroner fra NADH-avhengig kompleks I og FADH2-avhengig kompleks II til kompleks III, selv om mange andre reduktaser kan drive reduksjonen av mitokondrie CoQ til ubiquinol som et obligatorisk skritt i flere cellulære metabolske veier4,5.
Gjennom hele prosessen opprettes en elektrokjemisk protongradient over mitokondrie indre membran, som omdannes til biologisk aktiv energi av ATP-syntasekomplekset V2. Følgelig fører mitokondrie dysfunksjon til et utall patologiske forhold som hovedsakelig påvirker vev med høye energibehov - hjernen, hjertet og skjelettmuskelen6,7. Derfor er det grunnleggende å utvikle metoder for å nøyaktig analysere mitokondriebioenergetikk for å undersøke sin rolle i helse og sykdom, spesielt i svært energiske vev som skjelettmuskler.
Den Clark-type oksygenelektroden har blitt klassisk brukt i studiet av mitokondrie respirasjon8. Imidlertid har dette systemet blitt gradvis fordrevet av teknologier med høyere oppløsning, med mikroplatebaserte oksygenforbruksteknologier som Agilent Seahorse XF-analysatorer som er spesielt populære9. I skjelettmuskulaturfeltet utføres disse studiene vanligvis i dyrkede celler, hovedsakelig i C2C12 udødeliggjort mus myoblastcellelinje eller primærkulturer avledet fra satellittceller10,11. Imidlertid rekapitulerer disse studiene ikke situasjonen i vivo, spesielt når du undersøker mitokondriebiologi og funksjon på vevsnivå på spesifikke fornærmelser, ikke-genetiske intervensjoner eller genetiske manipulasjoner.
Videre er respirasjonsanalyser i celler mer komplekse på grunn av tilleggsfaktorer, inkludert ekstra mitokondriebehov av ATP og analysesubstrater eller signalhendelser, noe som kan villede tolkningen av resultatene. Alternativt er det også mulig å bruke enkelt- eller bunter av nyisolerte myofibers fra muskler. Isolasjonsmetoden er imidlertid teknisk utfordrende og bare mulig for noen få muskeltyper. I dette tilfellet brukes flexor digitorum brevis (FDB) og extensor digitorum longus (EDL) muskler hovedsakelig 10,12,13, selv om noen få rapporter beskriver bruken av andre muskeltyper også14,15.
Bioenergetisk profilering av skjelettmuskulaturseksjoner er også rapportert16. Den største fordelen med denne metoden er at intakte muskler kan studeres (forfatterne viser at kutting gjennom fibre ikke forstyrrer resultatene sammenlignet med isolerte myofibers). Imidlertid er mitokondrietilgangen til substrater og analysehemmere begrenset, og dermed kan bare noen få parametere måles16. Til slutt kan isolerte mitokondrier også brukes9,17,18,19. I dette tilfellet mister mitokondrier sitt cytosoliske miljø, noe som kan påvirke deres funksjon. I motsetning garanterer denne metoden tilgang til substrater og inhibitorer, muliggjør analyse av en mengde prøvetyper, og krever vanligvis mindre materiale.
Dette dokumentet beskriver en metode for å utføre bioenergetisk profilering av isolerte mitokondrier fra mus skjelettmuskulatur ved hjelp av mikroplatebaserte respirometriske analyser (figur 1). Spesielt er tre protokoller detaljerte: Koblingsanalysen, CA for å vurdere graden av kobling mellom ETC og OXPHOS-maskineriet; Electron Flow Assay, EFA for å måle aktiviteten til de enkelte ETC-kompleksene; og BOX-analysen for å bestemme mitokondriedon β-oksidasjonskapasitet. Spesielt er det bare nødvendig med små mengder prøver sammenlignet med konvensjonelle respirometrimetoder. Isolasjonsprotokollen som brukes her, er endret fra metoden som er publisert andre steder18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mushus og vevsinnsamling ble utført ved hjelp av protokoller godkjent av Universidad Pablo de Olavide Ethics Committee (Sevilla, Spania, protokoller 24/04/2018/056 og 12/03/2021/033) i samsvar med spansk kongelig resolusjon 53/2013, Europeisk direktiv 2010/63/EU, og andre relevante retningslinjer.
1. Utarbeidelse av aksjer, buffere og reagenser for respirasjonsanalysene
- Forbered følgende lagerløsninger, som kan lagres ved angitt temperatur i flere måneder. Bruk ultrapure H2O i alle tilfeller.
- Løs opp fosfatbufrede saltvannstabletter (PBS) i H2O (1 tablett per 200 ml H2O) for å klargjøre 1x PBS. Autoklaver løsningen og oppbevar den ved romtemperatur (RT).
- Løs opp 2 g NaOH pellets i 50 ml H2O for å forberede 1 M NaOH.
- Forbered 0,1 M-, 1 M-, 5 M- og 10 M KOH-lagre for pH-kalibrering.
- Tilsett 14,612 g EDTA til 70 ml H2O. Tilsett NaOH-pellets til pH når 8,0 slik at EDTA oppløses helt. Legg H2O kvante tilfredsstiller (QS) til 100 ml. Autoklaver den resulterende 0,5 M EDTA (pH 8)-løsningen og oppbevar den på RT.
- Tilsett 19 g EGTA til 70 ml H2O. Tilsett NaOH-pellets til pH når 8.0 slik at EGTA kan oppløses helt. Legg H2O QS til 100 ml. Autoklaver den resulterende 0,5 M EGTA (pH 8)-løsningen og oppbevar den på RT.
- Tilsett 2 ml 0,5 M EDTA til 98 ml PBS. Oppbevar den resulterende 10 mM EDTA/PBS-løsningen på RT.
- Løs opp 5,958 g HEPES i 40 ml H2O. Juster pH til 7,2 med KOH og QS til 50 ml med H2O. Filtrer den resulterende 0,5 M HEPES-bufferen gjennom et 0,45 μm nett og oppbevar den på RT.
- Løs opp 3,402 g KH2PO4 i opptil 50 ml H2O. Filtrer den resulterende 0,5 M KH2PO4-løsningen gjennom et 0,45 μm nett og lagre den på RT.
- Løs opp 9,521 g vannfri MgCl2 i opptil 100 ml H2O. Autoklaver den resulterende 1 M MgCl2-oppløsningen og oppbevar den på RT.
MERK: Da dette er en eksotermisk reaksjon, fortsett med forsiktighet og løs opp MgCl2 på is.
- Klargjør lagerløsninger for substrat og inhibitor (se tabell 1). Aliquot og lagre dem ved -20 °C. Unngå fryse-tine sykluser. Som et unntak, forbered alltid pyruvinsyre umiddelbart før bruk.
- Forbered deg i ultrapure H2O: 0,5 M succinat, 0,5 M pyruvinsyre, 0,5 M malinsyre, 100 mM ADP, 1 M askorbinsyre og 50 mM N,N,N′,N′-tetrametyl-para-fenyleng-diamin (TMPD) (beskytte mot lys).
- Forbered i 100% dimetylsulfoksid (DMSO): 50 mM palmitoyl-L-karnitin, 4 mM rotenon, 20 mM karbonylcyanid-p-trifluorometoksyfenylhydrazon (FCCP), 4 mM oligomycin og 5 mM Antimycin A.
MERK: Ikke overskrid 0,1 % endelig DMSO-konsentrasjon i mikroplatebrønnene. Forbered derfor høyt konsentrerte lagerløsninger for å holde seg under denne grensen.
- Forbered bufferne for mitokondrierisolasjon og protein kvantifisering ferskt på eksperimentets dag. Bruk ultrapure H2O i alle tilfeller og hold alle buffere på is med mindre annet er oppgitt.
MERK: For å spare tid kan alle reagenser veies og oppbevares i de aktuelle beholderne (f.eks. 15 ml rør) ved riktig temperatur dagen før.- For å forberede 10% frie fettsyrer (FFA) BSA, oppløs grundig 150 mg FFA BSA i 1,5 ml H2O ved inversjon / roterende hjul. Ikke virvel for å unngå skumming.
- For å forberede 1x Bradford reagens, fortynn den 5x kommersielle lagerløsningen med H2O og hold den i mørket på RT.
- For å forberede 8x mitokondrier Buffer (MB), oppløse 4.112 g sukrose og 763 mg HEPES i 15 ml H2O. Juster pH til 7,2, tilsett 1,6 ml 10% FFA BSA og QS til 20 ml med H2O.
- For å forberede 20 ml isolasjonsbuffer 1 (IB1) (4 ml brukt per prøve), oppløs 400 μL 0,5 M EDTA, 784 mg D-mannitol og 2,5 ml 8x MB i 15 ml H2O. Juster pH til 7,2 og QS med H2O.
- For å forberede 5 ml isolasjonsbuffer 2 (IB2) (500 μL brukt per prøve), oppløs 30 μL 0,5 M EGTA, 196 mg D-mannitol og 625 μL 8x MB i 4 ml H2O. Juster pH til 7,2 og QS med H2O.
- For å forberede 5 ml resuspensionbuffer (RB) (200 μL brukt per prøve), oppløs 120 mg sukrose, 191,3 mg D-mannitol, 50 μL 0,5 M HEPES og 10 μL 0,5 M EGTA i 4 ml H2O. Juster pH til 7,2 og QS med H2O.
- For å forberede 2x mitokondrieanalyseoppløsning-1 (MAS-1), oppløs 1,199 g sukrose, 2,8 g mannitol, 1 ml 0,5 M KH2PO4, 250 μL 1 M MgCl2, 200 μL 0,5 M HEPES og 100 μL 0,5 M EGTA i 20 ml H2O. Juster pH til 7,2 og QS til 25 ml med H2O. Oppbevares i is i korte perioder. I lengre perioder, hold den ved 4 °C for å unngå nedbør.
- For å forberede 1x koblingsanalysemedium (CAM), lag to forskjellige MAS-1-baserte buffere: 1) CAM + BSA for CA-analysen riktig, og 2) CAM-BSA for å forberede analysehemmerne. Hold alltid pyruvat:malate forholdet på 10:1.
MERK: Siden BSA kan tette injeksjonsportene, fortynn inhibitorene i BSA-fri KAM.- For å forberede CAM+BSA, fortynn 300 μL 0,5 M pyruvinsyre, 30 μL 0,5 M malinsyre og 7,5 ml 2x MAS-1 i 6 ml H2O. Juster pH til 7,2. Tilsett 300 μL 10% FFA BSA og QS til 15 ml med H2O.
- For å forberede CAM-BSA, fortynn 120 μL 0,5 M pyruvinsyre, 12 μL 0,5 M malinsyre og 3 ml 2x MAS-1 i 2 ml H2O. Juster pH til 7,2 og QS til 6 ml med H2O.
- For å forberede 1x Electron Flow Assay medium (EFAM), klargjør både BSA-inneholdende og BSA-frie EFAM-buffere.
- For å forberede EFAM+BSA, fortynn 300 μL 0,5 M pyruvinsyre, 60 μL 0,5 M malinsyre, 3 μL 20 mM FCCP og 7,5 ml 2x MAS-1 i 6 ml H2O. Juster pH til 7,2. Tilsett 300 μL 10% FFA BSA og QS til 15 ml med H2O.
- For å forberede EFAM-BSA, fortynne 120 μL 0,5 M pyruvinsyre, 24 μL 0,5 M malinsyre, 1,2 μL 20 mM FCCP og 3 ml 2x MAS-1 i 2 ml H2O. Juster pH til 7,2 og QS til 6 ml med H2O.
- For å forberede 1x β-oksidasjonsmedium (BOXM), klargjør BSA-inneholdende og BSA-frie BOXM-løsninger.
- For å forberede BOXM+BSA, fortynn 12 μL 50 mM palmitoyl-L-karnitin, 30 μL 0,5 M malinsyre og 7,5 ml 2x MAS-1 i 7 ml H2O. Juster pH til 7,2. Tilsett 300 μL 10% FFA BSA og QS til 15 ml med H2O.
- For å forberede BOXM-BSA, fortynn 4,8 μL 50 mM palmitoyl-L-karnitin, 12 μL 0,5 M malinsyre og 3 ml 2x MAS-1 i 2 ml H2O. Juster pH til 7,2 og QS til 6 ml med H2O.
2. Muskel disseksjon, homogenisering og mitokondrie isolasjon
- Plasser alle materialer og buffere på is. Forsikre deg om at alle materialer er iskalde under hele prosedyren for å beskytte mitokondrier mot skade.
- Legg tre 50 ml beger per prøve på is, og legg til følgende løsninger: 10 ml PBS i beger 1, 10 ml 10 mM EDTA/PBS i beger 2 og 4 ml IB1 i beger 3.
- Euthanize musen ved cervical dislokasjon. Unngå CO2-eutanasi da skjelettmuskulaturen kan bli hypoksisk og forstyrre respirasjonsanalyser.
- Spray høyre bakben med 70% etanol for å forhindre pels fra shedding, og tape lem til kork disseksjonsbrettet. Tape venstre forben også.
- Lag et snitt med en steril engangs skalpell gjennom huden fra kne til tå.
- Ta tak i huden med tann tang på ankelnivå og kutt den med fin saks rundt ankelen.
- Lett huden bort fra den underliggende muskulaturen med finspiss pinsett i den ene hånden mens du trekker den opp med tann tang i den andre hånden.
- Disseker alle skjelettmuskler fra ankel til kne (figur 2).
- Fjern alt bindevev over tibialis fremre (TA) muskel for å lette muskelutvinning ved hjelp av fine pinsett og saks.
- Finn de fire distale sener av EDL muskelen og seksjon dem nær sine innsettinger i tåene. Finn TA distal sene og kutt den nær innsettingen, alltid under ankelen.
- Trekk ta- og EDL-senene forsiktig over ankelen for å frigjøre de løse endene.
- Grip de løse endene av senene og lette musklene bort fra resten av muskulaturen og beinene ved å trekke dem opp. Bruk fine pinsett eller saks for å lette prosessen. Fortsett med forsiktighet for å unngå myofiber sammentrekning.
- Klipp den proksimale senen på EDL og TA-muskelen så nært som mulig til kneskålen.
- Snu musen opp ned for å fortsette med gastrocnemius (GA) og soleus muskel ekstraksjon.
- Grip lommen dannet mellom biceps femoris og GA med tann tang. Bruk fin saks for å skille disse musklene og visualisere den proksimale GA-senen.
- Grip akillessenen med fine tang og kutt den forsiktig med fin saks. Slipp GA- og soleusmuskulaturen fra det underliggende beinet ved å trekke dem opp gjennom senene. Klipp den proksimale GA-senen som frigjør den sammen med den underliggende sålen.
- Disseker forsiktig de resterende musklene fra sene til sene etter samme prosedyre til bare bein forblir.
- Fest musen på nytt i startposisjon for å dissekere quadriceps-muskelen.
- Kast fettvevet over quadriceps på den proksimale siden ved hjelp av tannede tang og fin saks.
- Sett inn fine pinsett mellom quadriceps og lårbenet og flytt dem i begge retninger langs lårbenaksen for å skille muskelen fra beinet.
- Grip de distale quadriceps muskel sener med tann tang og kutte senen med fin saks så nært som mulig til kneskålen.
- Trekk quadriceps opp og frigjøre den ved proksimal innsetting med fin saks.
- Gjenta trinn 4-8 fra denne delen med venstre bakben.
- Skyll alle musklene i Beaker 1 først og deretter i Beaker 2.
- Overfør alle muskler til Beaker 3 og fin hakk alle muskler med skarp saks på is.
- Overfør suspensjonen til et C Tube (lilla lokk), og hold den alltid i is.
- Lukk C-røret tett og fest det opp ned på homogenisatorens hylse. Pass på at prøvematerialet er i rotatoren/statoren. Velg 1-min-programmet som heter m_mito_tissue_01.
- Del homogenatet i to 2 ml prechilled mikrocentrifuge rør og sentrifuge ved 700 × g i 10 min ved 4 °C i en sentrifuge på bordplaten.
- Overfør supernatantene til nye 2 ml prechilled rør, forsiktig unngå fett og ikke-homogenisert vev. Oppbevar pelletsene ved -80 °C for fragmenteringsrenhetsbestemmelse (brøk N) (figur 3).
- Sentrifuger supernatantene ved 10.500 × g i 10 min ved 4 °C.
- Overfør supernatantene til nye 2 ml prechilled rør og merk dem som Supernatant Nummer 1 (SN1). Oppbevar dem ved -80 °C for fragmenteringsrenhet (figur 3).
- Resuspend og kombiner begge pellets i et totalt volum på 500 μL IB2 i is.
- Sentrifuge ved 10.500 × g i 10 min ved 4°C.
- Overfør supernatanten til et nytt 2 ml forhåndsklokket rør og merk det som Supernatant Nummer 2 (SN2). Oppbevar den ved -80 °C for fragmentering av renhet (figur 3).
- Resuspend den endelige mitokondrie pellet i 200 μL av RB. Sett raskt av 10 μL for protein kvantifisering og tilsett umiddelbart 10 μL 10% FFA BSA til den gjenværende mitokondriefjæringen for å forhindre skade.
- Bestem proteinkonsentrasjon ved hjelp av Bradford-analysen.
- For standardkurven, lag 30 μL serielle fortynninger av kjent konsentrasjon av et protein i RB-buffer. Bruk for eksempel 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml, 0,0625 mg/ml og 0 mg/ml BSA.
- Forbered 1:3 og 1:6 serielle fortynninger av mitokondrieprøvene i RB-bufferen.
- I en 96-brønns flatbunnsplate, last først 2,5 μL prøve / standard per brønn. Deretter legger du til 10 μL 1 M NaOH i hver prøve og til slutt 200 μL 1x Bradford reagens. Bland godt, unngå luftbobler. Kontroller visuelt at fargen på prøvene er innenfor kalibreringslinjen. Utfør alltid analysen i triplikat.
- Inkuber platene i 5 min ved RT i mørket, og les absorbansen ved 595 nm i et mikroplatespektrofotometer.
- Beregn standardkurven ved å tegne inn absorbansverdiene (y-aksen) kontra den tilsvarende proteinkonsentrasjonen av fortynningene som er utarbeidet i trinn 22.1 i denne delen (x-akse).
- Beregn den totale mengden protein i mitokondrieprøvene ved ekstrapolering med standardkurven.
3. Utarbeidelse av de mikroplatebaserte respirometriske analysene
- Hydrater den respirometriske analysesensoren minst 12 timer før eksperimentet med 1 ml kalibreringsbuffer per brønn. Inkuber ved 37 °C (ingen CO2).
MERK: Hydrerte sensorer kan brukes i opptil 72 timer. Patronen bør håndteres nøye i løpet av dette trinnet: Hvis noe berører sensorene, kan målesensibiliteten påvirkes. - Prechill den forberedende sentrifugen med den svingende mikroplaterotoren og de tilsvarende mikroplateadapterne ved 4 °C.
- Slå på datamaskinen, åpne analyseprogramvaren, og velg ønsket protokoll.
MERK: Et klikk høres når programvaren kobles til oksygenforbruksmålingsinstrumentet. Varmesensoren skal være grønn og ved 37 °C før eksperimentet starter. - Forbered inhibitorløsningene fra bestandene som er angitt i avsnitt 1, trinn 2 i henhold til analysen som skal utføres. Forbered nok volum for hver løsning. Se tabell 1 og tabell 2 for referanse.
- Tilsett riktig volum av hver inhibitor i hver port, sett patronen inn i oksygenforbruksmålingsinstrumentet og start kalibreringen.
MERK: Det tar15-20 minutter å legge til hemmer i patronen og sette patronen inn i instrumentet. Kontroller at de riktige patronkomponentene er innført. Patronlokket og hydroboosteren kan kastes mens sensorkassett og brukssted er nødvendig. - Sentrifuger den konsentrerte mitokondriefjæringen i seksjon 2, trinn 21 ved 10.500 × g i 10 min ved 4 °C.
- Resuspend mitokondriepellet i 100 μL av 1x CAM + BSA, 1x EFAM + BSA eller 1x BOXM + BSA, avhengig av protokollen som skal utføres.
- Fortynn den konsentrerte mitokondrieprøven ytterligere til en endelig konsentrasjon på 0,2 μg/μL i det tilsvarende analysemediet.
- Frø 50 μL av suspensjonen (totalt 10 μg protein) per brønn i en prechilled 24-brønns mikroplate på is. Ikke legg til mitokondrier i bakgrunnskorreksjonsbrønnene; bare tilsett det tilsvarende analysemediet. Oppbevar den gjenværende mitokondriefjæringen ved -80 °C for bestemmelse av fragmenteringsrenhet (figur 3).
- Snurr mikroplaten i den prechilled forberedende sentrifugen ved 2000 × g i 20 min ved 4 °C. Motvekt for å balansere tilsvarende.
- Varm opp det gjenværende analysemediet ved 37 °C under mikroplatesenrifugering.
- Etter sentrifugering, la mikroplaten stå på benken i 5 min for å likevekte. Tilsett 450 μL varmt analysemedium for et sluttvolum på 500 μL per brønn ved RT. Gjør dette sakte og forsiktig, og legg mediet til brønnens vegg for å unngå å løsne mitokondrier.
- Plasser mikroplaten umiddelbart i det oksygenforbruksmålingsinstrumentet uten lokket, og start protokollen (tabell 3). Forsikre deg om at det første trinnet er en 10 min inkubasjon slik at mikroplaten kan varmes opp.
- Når eksperimentet er ferdig, fjerner du patronen og mikroplaten, slår av instrumentet og starter analysen.
4. Analyse av resultatene
- Når det gjelder CA- og BOX-analysene, utfører du følgende analyser:
- Registrer nonmitochondrial O2 forbruk, som tilsvarer gjennomsnittet av verdiene oppnådd etter Antimycin A og rotenone injeksjon.
MERK: Antimycin A og rotenon er henholdsvis komplekse III- og I-hemmere. - Beregn basal respirasjon ved å trekke fra ikke-mitochondrial O2-forbruk fra basale verdier (målepunkt 1 og 2).
- Trekk ikke-mitondrialt O2-forbruk fra verdiene etter injeksjonen av det komplekse V-substratet ADP (injeksjon A) for å bestemme mitokondrietilstand III.
- Trekk ikke-mitondrialt O2-forbruk fra respirasjonsverdiene etter injeksjon av den komplekse V-hemmeren oligomycin (injeksjon B) for å oppnå mitokondrietilstand IVo.
- Beregn mitokondrietilstand IIIu ved å trekke fra ikke-mitochondrial O2-forbruk fra respirasjon etter FCCP-injeksjon (injeksjon C).
MERK: FCCP er en potent mitokondrie oksidativ fosforylering uncoupler. ATP-syntesen omgår i sin tilstedeværelse, og ETC oppnår maksimal aktivitet. - Trekk basale respirasjonsverdier fra mitokondrietilstanden IIIu-verdier for å oppnå mitokondrie-ledig kapasitet, som er kapasiteten til å generere ekstra ATP i tilfelle økt energibehov.
- Del mitokondrietilstand IIIu etter statlige IVo-verdier for å oppnå respiratorisk kontrollforhold (RCR).
MERK: Negative eller null RCR-verdier indikerer at mitokondriekobling påvirkes.
- Registrer nonmitochondrial O2 forbruk, som tilsvarer gjennomsnittet av verdiene oppnådd etter Antimycin A og rotenone injeksjon.
- Med referanse til EFA, utfør følgende beregninger:
- Oppnå restaktivitet ved å beregne gjennomsnittlig verdi etter rotenon og Antimycin A injeksjon (injeksjoner A og C).
- Beregn kompleks aktivitet I til IV (CI-CIV) ved å trekke restaktivitet fra basale verdier (målepunkt 1 og 2).
- Trekk restaktivitet fra verdiene etter injeksjon av CII-substratet succinat (injeksjon B) for å oppnå CII-CIII-CIV-aktivitet.
- Beregn CIV-aktivitet ved å trekke restaktiviteten fra verdiene som er oppnådd etter injisering av cytokrom c-reduksjonsmidler, askorbinsyre og TMPD (injeksjon D).
- Representer alle resultater ved hjelp av stolpeplott, som i figur 4, for å trekke ut passende konklusjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen som presenteres her tillater in vivo analyse av mitokondrie respirasjon gjennom isolering av mitokondrier fra musen skjelettmuskulatur. En oversikt over metoden vises i figur 1. Etter dissekering av skjelettmuskulaturen fra bakbenene (figur 2) blir vev homogenisert og mitokondrier renset, under isotoniske forhold, gjennom serielle sentrifugeringer. Renheten til de forskjellige fraksjonene oppnådd under isolasjonsprosessen kan analyseres av vestlig blot ved hjelp av antistoffer mot forskjellige organellemarkører. Figur 3A viser den generelle proteinprofilen fra de ulike fraksjonene som viser distinkte proteinpopulasjoner i fraksjonene isolert.
Figur 3B viser at alt mitokondrieinnhold er i mitokondriefraksjonen, som det fremgår av de sterke signalene for markører av ytre (VDAC og TOMM20) og indre (TIMM23) mitokondriemembraner, og til og med for nukleoid-assosierte proteiner (mtTFA). Alle kjerner og cytoskjelett (β-aktin) finnes i Brøk N, som representerer kjerner og uoppløst materiale (figur 3C). Videre forblir de fleste endoplasmiske retikulummarkørene (ER) (Calnexin), plasmamembranen (Na+/K+-ATPaseα1) eller cytoplasmamarkørene (LDHA, HSP70 eller AKT) i SN1- eller SN2-fraksjonene, og fremhever den høye renheten oppnådd under isolasjon (figur 3C). Imidlertid er det noen spor av ER-forurensning i mitokondriefraksjonen, muligens på grunn av nærheten til disse organellene. Gitt resultatene oppnådd i etterfølgende respiratoriske analyser, gir isolasjonsprosedyren beskrevet her svært rene, levedyktige mitokondriepreparater.
Både CA- og BOX-analyser tillater beregning av forskjellige mitokondrietilstander i nærvær av flere substrater som stimulerer spesifikke metabolske veier. Spesielt utføres disse analysene i nærvær av pyruvinsyre eller palmitoyl-L-karnitinklorid. Pyruvinsyre er et substrat av Krebs-syklusen; malinsyre er en Krebs syklus mellomledd og en NADH induktor, mens palmitoyl-L-karnitin er et substrat av fettsyren β-oksidasjonsveien. (Figur 4A,B). I begge analysene er den første tilstanden som kan måles, basal respirasjonshastigheten, som representerer mitokondrie respirasjon i nærvær av substratene som først ble lagt til analysemediet. Deretter oppnås mitokondrietilstand III, som representerer ATP-produksjon fra ADP og uorganisk fosfat, som viser maksimal respirasjon i koblet tilstand. Dermed er det en økning i oksygenforbruket etter ADP-tillegg, som observert i figur 4A, B.
Videre indikerer State IVo protonlekkasjen forbundet med hemming av ATP-syntase ved oligomycin, noe som fører til en reduksjon i åndedrett, som observert i CA- og BOX-grafene (figur 4A, B). Tillegg av FCCP fører til State IIIu, som viser maksimal respiratorisk kapasitet som mitokondrier kan vise i en usammenhengende tilstand når oksygenforbruket når sitt høyeste nivå i disse analysene. For å beregne alle disse tilstandene er det først å bestemme ikke-mitochondrial respirasjon, som oppnås på slutten av analysen når Antimycin A og rotenon injiseres for å hemme oksidativ respirasjon. Som vist i figur 4A,B, må disse verdiene alltid være under basal åndedrett og svært nær null i tilfelle av analyser med isolerte mitokondrier som disse analysene beskrevet her. Til slutt må RCR-parameteren beregnes for å vurdere mitokondrieintegritet. Det gjenspeiler om mitokondrier kan reagere på ADP ved å produsere ATP i høy hastighet med lav protonlekkasje. Gjennomsnittsverdiene for RCR som ble funnet i CA- og BOX-analysene var henholdsvis 5,78 ± 1,03 og 3,47 ± 0,42 (figur 4A,B), som er i samsvar med optimale RCR-er rapportert tidligere21,22,23,24.
I tillegg undersøker EFA aktiviteten til ETC-kompleksene individuelt eller i kombinasjon gjennom injeksjon av spesifikke substrater og inhibitorer (figur 4C). CI-CIV aktivitet representerer mitokondrie respirasjon basert på pyruvat og malate substrater når ingen komplekser er hemmet; I dette tilfellet går de fleste elektronene gjennom CI. Siden rotenon er en spesifikk hemmer av CI, blokkeres CI etter tilsetningen, noe som resulterer i redusert oksygenforbruk (figur 4C). CII-CIII-CIV-aktivitet viser åndedrett når bare CI er blokkert, og CII er aktivert: succinat, injisert gjennom port B, er et spesifikt substrat av kompleks II (succinat dehydrogenase). Dermed reduseres CII, og starter elektronstrømmen fra CII til CIV, mens CI fortsatt hemmes av den forrige rotenoninjeksjonen, noe som gir en økning i oksygenforbruket (figur 4C). Antimycin Et tillegg hemmer CIII, blokkerer elektronstrømmen gjennom ETC og reduserer oksygenforbruket. Videre bestemmes CIV-aktivitet når den stimuleres av cytokrom C-oksidasjon etter å ha blitt redusert ved tilsetning av askorbinsyre / TMPD; Figur 4C viser at CIV-aktivering gir en økning i oksygenforbruket. Til slutt refererer restaktivitet til oksygenforbruk når den oksidative fosforyleringskjeden inaktiveres etter rotenon og Antimycin A-tilsetning. Denne verdien angir bakgrunnen for beregningen av komplekseaktiviteten som angitt i protokolltrinnene 2.2-2.4 i avsnitt 4.
Figur 1: Skjematisk visualisering av metoden. Forkortelser: OCR = oksygenforbruk; ADP = adenosin difosfat; OL = oligomycin; FCCP = karbonylcyanid-p-trifluorometoksyfenylhydrazon; AntA = Antimycin A; Rot = rotenon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Disseksjon og isolering av murine skjelettmuskler fra bakben for mitokondrie respirasjonsanalyser. (A) Høyre bakben ble strukket og immobilisert med tape. (B) Et snitt ble gjort gjennom huden fra ved siden av ankelen, og stoppet proksimalt til kneet. Bindevev som overbegikk TA ble forsiktig fjernet. EDL (C) og TA (D) sener ble seksjonert nær innsettingene. TA-senen ble trukket opp for å lette muskelen bort fra den underliggende muskulaturen og beinet. Deretter ble TA kuttet proksimalt, nær ventralkampen til tibia. På samme måte ble EDL-muskelen lettet bort, og den proksimale senen ble omhyggelig kuttet ved siden av kneet. (F) Høyre bakben etter TA- og EDL-disseksjon. (G) I bakre bakben ble akillessenen seksjonert for å dissekere GA- og soleusmuskler. (H) GA og soleus ble forsiktig frigjort fra det tibiale beinet. (I) De resterende musklene ble samlet fra ankel til kne til bare fibula og tibial bein forble. (J) Hindlimb etter disseksjon. (K) Quadriceps ble dissekert. (L) Alle skjelettmuskler samlet inn for bakre mitokondrieisolasjon. Prosessen ble utført for begge bakbenene. Forkortelser: TA = tibialis fremre; EDL = extensor digitorum longus; GA = gastrocnemius. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Renhet i fragmenteringsprosessen. (A) Generell proteinprofil farget med Coomassie blå. (B) Mitokondrieprotein renhetsprofil. (C) Ikke-mitochondriale markører. De forskjellige fraksjonene oppnådd under mitokondrierisolasjon ble lastet og inkubert med antistoffer mot forskjellige proteiner i spesifikke subcellulære fraksjoner. Forkortelser: brøkdel N = ikke-homogenisert vev og kjerner; SN1 = supernatant nummer 1: cytoplasma + organeller; SN2 = supernatant nummer 2: cytoplasma + organeller; VDAC = spenningsavhengig anionkanal; TOMM20 = translokasjon av ytre mitokondriemembran 20; mtTFA = mitokondrietranskripsjonsfaktor A; TIMM23 = translokasjon av indre mitokondriemembran 23; LDHA = laktat dehydrogenase A; HSP70 = varmesjokkprotein 70; ER = endoplasmisk retikulum. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative resultater. Bioenergetisk profilering av mitokondrier isolert fra bakbensmuskler av en 13 måneder gammel mannlig vill type C57BL / 6N mus. Injeksjonspunktene til de forskjellige substratene og inhibitorene er angitt i hver analyse. Ytelsen til ETC- og OXPHOS-maskineriet kan analyseres ved hjelp av pyruvat og malate, eller palmitoyl-L-karnitin og malate som substrater i henholdsvis Koblingsanalysen (A) eller β-oksidasjon av FA-analyser (B). (C) Elektronstrømanalysen tillater studiet av individuelle mitokondriekomplekser i nærvær av pyruvat, malate og FCCP; 10 μg mitokondrier ble belagt per brønn. Resultatene vises etter alternativet for midtpunktrepresentasjon for å visualisere resultatene i aggregert form. Dette er i motsetning til punkt-til-punkt-alternativet, som vil muliggjøre visualisering av de 9 påfølgende målingene som vanligvis utføres under hvert måletrinn. Typen visualisering kan endres etter å ha fullført analysen under de kinetiske linjediagramalternativene i analyseprogramvaren. Forkortelser: FA = fettsyrer; OCR = oksygenforbruk; ADP = adenosin difosfat; FCCP = karbonylcyanid-p-trifluorometoksyfenylhydrazon; RCR = respiratorisk kontrollforhold; EFA = Elektronstrømanalyse; BOX = β-oksidasjon av FA. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Koplingsanalyse | ||||||
| Havn | Inhibitor | [Lager] | [Injeksjonsport] | [Endelig] | Oppskrift | |
| Inhib | KAM-BSA | |||||
| En | ADP | 100 mM | 50 mM | 5 mM | 650 μL | 650 μL |
| B | Oligomycin | 4 mM | 31,6 μM | 3,16 μM | 11,3 μL | 1418,7 μL |
| C | FCCP | 20 mM | 60 μM | 6 μM | 4,68 μL | 1555,32 μL |
| D | Antimycin A // Rotenone | 5 mM // 4 mM | 40 μM // 50 μM | 4 μM // 5 μM | 13.52 μL // 21.12 μL | 1655,36 μL |
| Elektronstrømningsanalyse | ||||||
| Havn | Inhibitor | [Lager] | [Injeksjonsport] | [Endelig] | Oppskrift | |
| Inhib | EFAM-BSA | |||||
| En | Rotenone | 4 mM | 50 μM | 5 μM | 16,25 μL | 1283,7 μL |
| B | Succinate | 500 mM | 100 mM | 10 mM | 286 μL | 1144 μL |
| C | Antimycin A | 5mM | 4 μM | 4 μM | 12,48 μL | 1547,5 μL |
| D | Ascorbate // TMPD | 1 M // 50 mM | 100 mM // 1 mM | 10 mM // 100 μM | 169 μL // 33,8 μL | 1487,2 μL |
| β-oksidasjonsanalyse | ||||||
| Havn | Inhibitor | [Lager] | [Injeksjonsport] | [Endelig] | Oppskrift | |
| Inhib | BOKS-BSA | |||||
| En | ADP | 100 mM | 40 mM | 4 mM | 520 μL | 780 μL |
| B | Oligomycin | 4 mM | 31,6 μM | 3,16 μM | 11,3 μL | 1418,7 μL |
| C | FCCP | 20 mM | 60 μM | 6 μM | 4,68 μL | 1555,32 μL |
| D | Antimycin A // Rotenone | 5 mM // 4 mM | 40 μM // 20 μM | 4 μM // 2 μM | 13,52 μL // 8,45 μL | 1668 μL |
Tabell 1: Fremstilling av inhibitorløsninger for de ulike analysene. [Stock]- kolonnen viser konsentrasjonene av lagerløsningene til forbindelsen som er angitt i Inhibitor-kolonnen . [Injeksjonsport] refererer til konsentrasjonen av inhibitorløsningene som skal lastes i de forskjellige portene på patronen, mens [Final]- kolonnen indikerer den endelige konsentrasjonen av inhibitorene i brønnene. Til slutt angir Oppskrift-kolonnene volumene av lagerhemmerløsninger og BSA-frie medier som må blandes for å forberede løsningene som skal lastes inn i injeksjonsportene. Forkortelser: ADP = adenosin difosfat; FCCP = karbonylcyanid-p-trifluorometoksyfenylhydrazon; TMPD = N,N,N′,N′-tetrametyl-para-fenylenyl-diamin; Inhib = hemmer; BSA = bovint serumalbumin; CAM-BSA = BSA-fritt koblingsanalysemedium; EFAM-BSA = BSA-fritt elektronstrømanalysemedium; BOX-BSA = BSA-fri β-oksidasjon av fettsyreanalysemedium.
| Havn | Volum injisert | Lager klargjort (26 brønner) |
| En | 50 μL | 1300 μL |
| B | 55 μL | 1430 μL |
| C | 60 μL | 1560 μL |
| D | 65 μL | 1690 μL |
Tabell 2: Beregning av injeksjonsvolumer.
| Handling | Klokkeslett (minutter) | Gjentakelse | Havn |
| Kalibrere | 15-20 | ||
| Vent | 10 | ||
| Mix + Vent | 1 + 3 | × 2 | |
| Blande | 1 | ||
| Mål + blanding | 3 + 1 | × 2 | |
| Sprøyte inn | En | ||
| Blande | 1 | ||
| Måle | 3 | ||
| Blande | 1 | ||
| Sprøyte inn | B | ||
| Blande | 1 | ||
| Måle | 3 | ||
| Blande | 1 | ||
| Sprøyte inn | C | ||
| Blande | 1 | ||
| Måle | 3 | ||
| Blande | 1 | ||
| Sprøyte inn | D | ||
| Blanding + mål | 1 + 3 | × 2 |
Tabell 3: Protokollinnstillinger for de ulike analysene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alle metoder som brukes til å studere mitokondrie respirasjon har sine begrensninger; Derfor er det avgjørende å velge metoden som passer best til et bestemt eksperimentelt spørsmål. Dette arbeidet gir en oppdatert og detaljert protokoll for å isolere mitokondrier fra mus skjelettmuskulatur for å utføre forskjellige respiratoriske analyser for å undersøke mitokondriefunksjon. Faktisk er studiet av mitokondriebioenergetikk i isolerte mitokondrier ved hjelp av mikroplatebaserte teknologier verdifullt for å studere vevsspesifikk åndedrett når det gjelder reproduserbarhet, pålitelighet og kompleksitet. Videre gir bruk av isolerte mitokondrier kontroll over substrattilgjengelighet, noe som letter forståelsen av de underliggende biologiske prosessene. Et annet positivt aspekt ved bruk av isolerte mitokondrier er at det er mulig å studere tilstand III fordi ATP generert etter ADP-injeksjon ikke omdannes igjen til ny ADP, da de fleste transmembrane ATPases går tapt. Videre, i analysene beskrevet her, legges oligomycin til for å blokkere potensiell ikke-spesifikk ATP-syntese20.
Flere viktige hensyn må trekkes frem for denne protokollen. For det første er isolerte mitokondrier ekstremt følsomme og bør håndteres med forsiktighet. Det høye innholdet av sukrose og mannitol i bufferne som brukes sikrer de optimale osmotiske forholdene for å beskytte de isolerte mitokondriene mot skade. Likevel bør analysens varighet holdes på et minimum for å bevare mitokondrie levedyktighet og forhindre løsrivelse fra mikroplaten når den er sådd. Gitt at protokolltrinn, for eksempel utarbeidelse av analysemedier og substrat- og hemmerløsninger, eller lasting av inhibitorene i den respirometriske analysepatronen, er tidkrevende, bør hvert trinn være perfekt koordinert. Videre, i motsetning til andre metoder basert på enzymatisk fordøyelse21,24 og mørtel og pestle homogenisering17,19,21,23,24, er metoden beskrevet her avhengig av bruk av en automatisert homogenisator, noe som muliggjør rask og effektiv prøvehomogenisering. Det er viktig at mitokondrie suspensjoner er mindre følsomme hvis de er svært konsentrerte. Dermed forbereder du bare fortynning umiddelbart før du bruker dem. Til slutt er det viktig å jobbe raskt under den respirometriske analysen riktig. Vanligvis, når du analyserer celler i kultur i disse analysene, utføres tre påfølgende måletrinn etter injeksjon av substrater eller inhibitorer, noe som resulterer i protokoller som strekker seg mellom 40 og 50 min., For å sikre levedyktigheten til de isolerte mitokondriene gjennom hele prosedyren, holdes antall måletrinn ofte til et minimum på grunn av deres sårbarhet19, 23,25, noe som reduserer tiden det tar å fullføre den respirometriske analysen til ~ 20 min. Protokollene som er beskrevet i dette arbeidet (tabell 3), følger denne trenden, selv om andre tidligere publiserte metoder rapporterer effektive OCR-profiler med lengre og mer standard måletrinn26.
For eksempel, hvis to påfølgende analyser kommer til å bli kjørt med samme sett med prøver på samme dag, forberede alle reagenser for den andre analysen i løpet av den første bortsett fra mitokondriefortynning: bare fortynne, frø og spinn mitokondrier umiddelbart før du starter den andre analysen, mens instrumentet blir kalibrert. Når eksperimentet er fullført, må RCR-parameteren (avsnitt 4, trinn 1.7) beregnes for å vurdere kvaliteten på mitokondriepreparatene som brukes. Vanligvis betegner RCR-verdier mellom 3,5 og 5 at mitokondrieintegritet er optimal og viser funksjonell koblet oksidativ respirasjon25. Analyser med lavere RCR-verdier må forkastes fordi mitokondrieintegritet ble kompromittert under isolasjon. I disse tilfellene bør du vurdere å vaske mitokondriepellet to ganger (avsnitt 2, trinn 19-21)22, som tidligere rapportert.
For det andre er det viktig å opprettholde riktig pH gjennom hele prosedyren for å oppnå vellykkede resultater. Forsikre deg om at pH for alle løsninger er satt som indikert, det vil si pH 7.2, og at pH alltid justeres med KOH med mindre annet er oppgitt. Spesielt bør pH av BSA-inneholdende buffere ikke måles direkte med pH-måleren, da BSA kan skade sonden. Juster dermed pH i de tilsvarende bufferne før du legger til BSA. For å unngå endringer i pH på grunn av BSA-tillegg, bruk alltid FFA BSA. Videre kan noen ultrapure H2O-partier være sure, så bruk av kommersielt renset, pH 7 H2O anbefales. Videre er det nødvendig å sikre at pH-måleren er riktig kalibrert og at det er riktig modell for å måle pH for kjemikaliene som skal tilberedes.
For det tredje er det avgjørende å utføre prøveinnsamlingstrinnet riktig for proteinmåling av den endelige mitokondriefjæringen (avsnitt 2, trinn 21) for å forhindre mitokondrieødeleggelse. Resuspend pellet raskt, men grundig, samle en aliquot, og legg FFA BSA til den gjenværende suspensjonen for å bevare den osmotiske balansen og beskytte mitokondriene mot skade. Hvis FFA BSA allerede var til stede i resuspensionbufferen, og dermed, under protein kvantifisering, ville det høye proteininnholdet forvirre kvantifiseringsresultatene. Dette er grunnen til at FFA BSA må legges til etter å ha satt en aliquot til side for kvantifisering.
For det fjerde er denne metoden svært allsidig og kan justeres etter eksperimentets behov. For eksempel, hvis dyremodellen som studeres er preget av redusert muskelmasse (f.eks. sarkopeniske mus), kan ytterligere muskler øke mitokondrieutbyttet. Selv om en voksen mannlig C57BL/6N-mus for voksne ble brukt i dette arbeidet, kan dyr av hvilket som helst kjønn, alder eller genetisk bakgrunn, samt spesifikke muskeltyper, brukes i stedet.
For det femte kan luftveiene variere mellom eksperimenter på grunn av små variasjoner i sammensetningen av buffere og reagenser, som må tilberedes frisk hver gang. Alder, kjønn, genetisk bakgrunn eller miljøforhold kan også ha en dyp innvirkning på resultatene. Imidlertid bør et vellykket eksperiment presentere økning i oksygenforbruket etter injeksjon av komplekse substrater som ADP og succinate, reduseres etter injeksjon av inhibitorer som oligomycin eller rotenon, og merket øker når den potente uncoupler FCCP tilsettes. Videre, for å forhindre høy teknisk variasjon, sikre grundig resuspensjon av mitokondriepellets for å oppnå homogene suspensjoner før du sår dem i mikroplaten.
For det sjette, hvis basale respiratoriske verdier er lave, bør du vurdere å utføre et titreringseksperiment for å justere mengden protein for såing. Til slutt, fordi dette arbeidet gir en metode for å oppnå rå mitokondrieekstrakter, forventes en viss grad av urenhet forbundet med andre organeller, hovedsakelig ER. En mer aggressiv fragmenteringsprosess for å fjerne disse urenheter ville være skadelig for mitokondrie levedyktighet, noe som hindrer ytelsen til respiratoriske analyser. Hvis renhet er en bekymring, spesielt hvis det ikke er konsistent mellom prøver, kan analyseresultater normaliseres i forhold til mitokondrie renhet etter å ha kjørt vestlige flekker mot forskjellige organelle markører (figur 3). Så vidt vi vet er dette den første metoden som fremhever bekymringer om mitokondrie renhet i rå ekstrakter. Vanligvis, i andre protokoller for respirometriske analyser med isolerte mitokondrier, blir samme mengde proteinekstrakt sådd i brønnene for å sammenligne prøver, forutsatt at samme mengde mitokondrier brukes i alle tilfeller. Dette er en rimelig antagelse med tanke på at isolasjon utføres parallelt i alle prøver. Imidlertid kan den genetiske eller miljømessige bakgrunnen til prøvene som studeres føre til betydelige forskjeller i renheten til mitokondrieekstraktene. For eksempel, hvis en gitt genetisk mutasjon forårsaker økt utvikling av cytoplasmatisk ER, kan rå mitokondrieekstrakter fra disse dyrene inneholde større enn forventet ER-innhold, og følgelig lavere enn forventet mitokondrieprotein. Således, selv om samme mengde totalt protein fra kontroll og mutantprøver blir sådd i mikroplaten, vil oksygenforbruket til mutantene bli undervurdert. Derfor anbefales det at renheten av ekstraktene av alle forholdene som studeres, må bestemmes. Hvis verdiene er sammenlignbare, er det ikke nødvendig med normalisering. Men hvis renhetsverdier blant prøver avviker betydelig utover den statistiske feilen eksperimentatoren er villig til å akseptere, bør de brukes til å normalisere oksygenforbruksresultatene.
Den nåværende protokollen har noen begrensninger. Vær oppmerksom på at denne metoden er optimalisert for skjelettmuskulaturvev isolert fra mus. Justeringer må kanskje gjøres ved bruk av forskjellige vev eller skjelettmuskulatur fra forskjellige arter. I tillegg, når analyser utføres på isolerte mitokondrier, går det normale cellulære mikromiljøet tapt på grunn av fravær av cellulær kontekst og de andre organellene som kan samhandle med mitokondrier. Dette kan føre til resultater som avviker noe fra fysiologiske forhold. Til slutt, når mitokondriene er sentrifugert, holder de seg til bunnen av brønnene. Selv om det er helt nødvendig, er de potensielle effektene av sentrifugering på deres normale tilstand ukjent.
Det er viktig å ta hensyn til det, etter å ha utført de respirometriske analyseanalysene, kan en reduksjon i oksygenforbruket forbundet med ATP-bundet eller FCCP-stimulert respirasjon i isolerte mitokondrier indikere potensielle mitokondrieendringer som kan forklares med20: 1) begrenset transport av substrater over den indre mitokondriemembranen, 2) redusert aktivitet av enzymene involvert i de hastighetsbegrensende reaksjonene til spesifikke metabolske veier som ETC, Krebs syklus, eller β-oksidasjon, eller 3) nedsatt ETC-funksjon, blant andre mulige forklaringer.
Oppsummert representerer den oppdaterte metoden beskrevet her en tilstrekkelig og pålitelig måte å vurdere ETC og OXPHOS-funksjon fra skjelettmuskulaturvev. Den har flere anvendelser for å evaluere hvordan genetiske modifikasjoner eller miljøet kan påvirke mitokondrie respirasjon som bidrar til en bestemt fenotype. Bemerkelsesverdig kan den nåværende protokollen tilpasses andre modellorganismer eller brukes med menneskelige prøver for å evaluere potensielle mitokondrie dysfunksjoner forbundet med menneskelig sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke Juan J. Tena for bruken av homogenisatoren og CABD Proteomics and Animal Husbandry-fasilitetene for teknisk støtte. Dette arbeidet ble støttet av det spanske utdannings-, kultur- og sportsdepartementet gjennom stipendiat FPU16/03264 til J.D.H.C., Foreningen Française contre les Myopathies (AFM) gjennom stipend #22450 til C.V.-G., et institusjonelt tilskudd MDM-2016-0687 (Maria de Maeztu Excellence Unit, Department of Gene Regulation and Morphogenesis ved CABD) og BFU2017-83150-P til J.J.C. Junta de Andalucía-stipendet P18-RT-4572, FEDER Funding Program fra EU og det spanske vitenskaps-, innovasjons- og universitetsdepartementet gir RED2018-102576-T til P.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma | A5285 | Stock at -20 °C |
| AKT antibody | Cell Signaling Technology | C67E7 | Rabbit (Host species) |
| anti-Goat HRP | Sigma | 401504 | Rabbit (Host species) |
| anti-Mouse HRP | Cell Signaling | #7076 | Horse (Host species) |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | Stock at -20 °C |
| anti-Rabbit HRP | Cell Signaling | #7074 | Goat (Host species) |
| Ascorbic acid | Sigma | A5960 | Stock at RT |
| Bactin antibody | Sigma | MBS4-48085 | Goat (Host species) |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve |
| BSA, fraction V, Fatty Acid-Free | Calbiochem | 126575 | Stock at 4 °C |
| C tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Purple lid |
| Calnexin antibody | ThermoFisher | MA3-027 | Mouse (Host species) |
| D-mannitol | Sigma | M4125 | Stock at RT |
| EDTA | BDH | 280254D | Stock at 4 °C |
| EGTA | Sigma | E-4378 | Stock at RT |
| FCCP | Sigma | C2920 | Stock at -20 °C |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Homogenizer |
| HEPES | Sigma | H3375 | Stock at RT |
| HSP70 antibody | Proteintech | 10995-1-AP | Rabbit (Host species) |
| LDH-A antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC27230 | Goat (Host species) |
| Magnesium chloride | ChemCruz | sc-255260A | Stock at RT |
| Malic acid | Sigma | P1645 | Stock at RT |
| Microplate spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH | POLARstar OMEGA S/N 415-0292 | Stock at RT |
| Milli-Q water | Millipore system | F7HA17757A | Ultrapure water |
| mtTFA antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC23588 | Goat (Host species) |
| Na+/K+-ATPase α1 antibody | Novus Biologicals | NB300-14755 | Mouse (Host species) |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | Stock at -20 °C |
| Palmitoyl-L-carnitine | Sigma | P1645 | Stock at -20 °C |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | 1x stock at RT |
| Potassium dihydrogen phosphate | ChemCruz | sc-203211 | Stock at RT |
| Potassium hydroxide | Sigma | 60377 | Stock at RT |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | Stock at 4 °C |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Stock at -20 °C |
| Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer | Agilent Technologies | 420179 | XFe24 model |
| Seahorse XFe24 FluxPak mini | Agilent Technologies | 102342-100 | The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution |
| Succinate | Sigma | S7626 | Stock at RT |
| Sucrose | Sigma | S9378 | Stock at RT |
| TIMM23 antibody | Abcam | ab230253 | Rabbit (Host species) |
| TMPD | Sigma | T7394 | Stock at -20 °C |
| TOMM20 antibody | Abcam | ab56783 | Mouse (Host species) |
| VDAC antibody | Abcam | ab15895 | Rabbit (Host species) |
References
- Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
- Alberts, B., et al. The mitochondrion. Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , Garland Science. New York. (2002).
- Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. Metabolism and function of coenzyme Q. Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).
- Alcázar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency. Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).
- Banerjee, R., Purhonen, J., Kallijärvi, J. The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology. The FEBS Journal. , (2021).
- Gorman, G. S., et al.
- Villalba, J. M., Navas, P. Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes. Free Radical Biology & Medicine. 165, 312-323 (2021).
- Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6 (7), 21746 (2011).
- Pala, F., et al. Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis. Journal of Cell Science. 131 (14), 212977 (2018).
- Shintaku, J., et al. MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-ĸB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).
- Li, R., et al. Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles. The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).
- Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).
- Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
- Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells. Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).
- Shintaku, J., Guttridge, D. C. Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry. Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).
- Bharadwaj, M. S., et al. Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350 (2015).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
- Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
- Das, K. C., Muniyappa, H. Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2. Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).
- Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Methods. 3 (2), 42 (2016).
- Sakamuri, S. S. V. P., et al. Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research. Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).
- Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
- Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
- Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216 (2015).
