Summary
Hier beschreiben wir die Isolierung, Amplifikation und Differenzierung von primären humanen Nasenepithelzellen (HNE) an der Luft-Flüssigkeits-Schnittstelle und ein Biobanking-Protokoll, das es ermöglicht, erfolgreich einzufrieren und dann verstärktes HNE aufzutauen. Das Protokoll analysiert die elektrophysiologischen Eigenschaften differenzierter HNE-Zellen und die CFTR-bezogene Chloridsekretionskorrektur bei verschiedenen Modulatorbehandlungen.
Abstract
Menschliche Nasenepithelzellen (HNE) lassen sich leicht durch einfaches, nicht-invasives Nasenbürsten sammeln. Patientenabgeleitete primäre HNE-Zellen können unter Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenbedingungen amplifiziert und zu einem pseudostratifizierten Epithel differenziert werden, um den zyklischen AMP-vermittelten Chloridtransport (Cl-) als Index der CFTR-Funktion (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) zu quantifizieren. Wenn kritische Schritte wie die Qualität des Nasenbürstens und die Zelldichte bei der Kryokonservierung effizient durchgeführt werden, können HNE-Zellen erfolgreich biobankiert werden. Darüber hinaus zeigen Kurzschlussstromstudien, dass das Einfrieren und Auftauen die elektrophysiologischen Eigenschaften und die Reaktion von HNE-Zellen auf CFTR-Modulatoren nicht signifikant verändert. Unter den in dieser Studie verwendeten Kulturbedingungen, wenn weniger als 2 x 106 Zellen pro Kryo eingefroren sind, ist die Ausfallrate sehr hoch. Wir empfehlen, mindestens 3 x 106 Zellen pro Kryo einzufrieren. Wir zeigen, dass duale Therapien, die einen CFTR-Korrektor mit einem CFTR-Potentiator kombinieren, eine vergleichbare Korrekturwirksamkeit für die CFTR-Aktivität in F508del-homozygoten HNE-Zellen aufweisen. Die Dreifachtherapie VX-445 + VX-661 + VX-770 erhöhte signifikant die Korrektur der CFTR-Aktivität im Vergleich zur Dualtherapie VX-809 + VX-770. Das Maß der CFTR-Aktivität in HNE-Zellen ist ein vielversprechender präklinischer Biomarker, der nützlich ist, um die CFTR-Modulatortherapie zu steuern.
Introduction
Mukoviszidose (CF) ist eine autosomal-rezessive Erkrankung, die aus Mutationen im CFTR-Gen (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) resultiert, die zum Fehlen oder zur Funktionsstörung des CFTR-Proteins führen, einem Anionenkanal an der apikalen Oberfläche von Epithel 1,2. Jüngste Fortschritte in der CFTR-Therapie haben die Prognose der Krankheit verbessert, und die letzten zugelassenen Medikamente, die CFTR-Korrektoren und CFTR-Potentiatoren kombinieren, führten zu erheblichen Verbesserungen der Lungenfunktion und Lebensqualität bei CF-Patienten mit der häufigsten Mutation p.Phe508del-Mutation (F508del)3,4. Trotz dieses vielversprechenden therapeutischen Fortschritts sind rund 10% der CF-Patienten nicht geeignet, da sie Mutationen tragen, die durch diese CFTR-Modulatoren nicht gerettet werden können. Für diese Patienten besteht die Notwendigkeit, andere Medikamente oder Arzneimittelkombinationen zu testen, um die effizienteste Kombination für bestimmte Mutationen zu finden, was die Bedeutung personalisierter Therapien unterstreicht.
Menschliche Nasenepithelzellen (HNE) lassen sich leicht durch einfaches, nicht-invasives Nasenbürsten sammeln und ermöglichen die Quantifizierung des zyklischen AMP-vermittelten Chloridtransports (Cl−) als Index der CFTR-Funktion. HNE-Zellen liefern ein genaues Modell der menschlichen Atemwege, aber ihre Lebensdauer ist in der Kultur begrenzt. Dank der Optimierung der Kulturtechniken können patientenabgeleitete primäre HNE-Zellen bedingt mit dem Rho-assoziierten Kinase-Inhibitor (ROCKi) umprogrammiert, amplifiziert und unter ALI-Bedingungen (Air-Liquid Interface) auf mikroporösen Filtern zu einem pseudostratifizierten Epithel differenziertwerden 5,6. Es gibt zahlreiche Kulturprotokolle für die HNE-Kultur (kommerziell erhältlich, serumfrei, "hausgemacht", Kokultur mit Feederzellen usw.), und es wurde beschrieben, dass die Wahl der Medien und die Kulturbedingungen das Wachstum, die Zellpopulationsdifferenzierung und die Epithelfunktion beeinflussen 7,8. Das Protokoll stellt hier eine vereinfachte, feederfreie ROCKi-Amplifikationsmethode vor, die es ermöglicht, eine große Anzahl von HNE-Zellen erfolgreich zu erhalten, die dann bei ALI für CFTR-Funktionsassays differenziert werden.
Wir haben gezeigt, dass in differenzierten HNE-Zellen eine 48-stündige Behandlung mit CFTR-Modulatoren ausreicht, um eine elektrophysiologische Korrektur des CFTR-abhängigen Cl-Stroms zu induzieren, und dass die in vitro beobachtete Korrektur mit der klinischen Verbesserung des Patienten korreliertsein kann 9. HNE-Zellen stellen daher ein geeignetes Modell nicht nur für die CF-Grundlagenforschung, sondern auch für präklinische Studien mit patientenspezifischen CFTR-Modulatortests dar. In diesem Zusammenhang mit der personalisierten Therapie bestand das Ziel des Protokolls darin, zu validieren, dass kryokonservierte HNE-Zellen von CF-Patienten, die unter unseren Bedingungen gezüchtet wurden, ein geeignetes Modell für CFTR-Korrekturstudien waren, und ähnliche Ergebnisse konnten beim Vergleich des CFTR-abhängigen Cl-Transports aus frischen und gefrorenen aufgetauten Zellen erwartet werden. Die Studie bewertete auch die Wirksamkeit verschiedener CFTR-Modulatoren bei der Verwendung von dualen und dreifachen Therapien.
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Protocol
Alle Experimente wurden nach den Richtlinien und Vorschriften durchgeführt, die in der Deklaration von Helsinki und dem Huriet-Serusclat-Gesetz über die Ethik der Humanforschung beschrieben sind.
1. Vorbereitung von Kolben und verschiedenen Medien
- Bereiten Sie Verstärkungs-, Luft-Flüssigkeits- und Gefriermedium wie in Tabelle 1 beschrieben vor.
- Bereiten Sie eine Stammlösung von menschlichem Kollagen IV vor, indem Sie 50 mg Kollagen in 100 ml 0,2% Eisessigsäure auflösen. Mischen Sie auf einem Magnetrührer für mindestens 1 h und sterilisieren Sie die Lösung. Bis zu 6 Monate bei 4 °C in einer lichtgeschützten Glasflasche aufbewahren.
- Bereiten Sie eine Arbeitslösung aus Kollagen IV vor, indem Sie die Stammlösung 1:5 in doppelt destilliertem Wasser verdünnen. Bis zu 6 Monate bei 4 °C lagern.
- Beschichten Sie Kunststoff-Zellkulturflaschen oder Transwell-Filter mit der Kollagen-Arbeitslösung. 100 μL für 0,33 cm 2 Transwell-Filter, 500 μL für 25 cm 2 Kolben und 1 ml für75 cm2 Kolben gleichmäßig auf die gesamte Wachstumsfläche des Kolbens verteilen.
HINWEIS: Dies kann erreicht werden, indem der Kolben sanft von einer Seite zur anderen geneigt wird. Alternativ kann zur Erleichterung der Beschichtung der Kolben ein erhöhtes Volumen verwendet werden, und wenn die gesamte Oberfläche gleichmäßig bedeckt ist, wird Kollagenlösung abgesaugt, um nur das angegebene Volumen zu hinterlassen. Die angesaugte Kollagenlösung kann dann sofort verwendet werden, um den nächsten Kolben zu beschichten (d. h. für drei 75 cm 2 Kolben, verteilen Sie 3 ml Kollagenlösung gleichmäßig im ersten Kolben, aspirieren Sie 2 ml, die dann für den nächsten Kolben verwendet werden, und so weiter). - Lassen Sie die Zellkulturflaschen mindestens 2 h oder über Nacht im Inkubator. Saugen Sie das Kollagen gründlich ab und lassen Sie die Kolben mindestens 20 Minuten oder über Nacht im Inkubator oder unter der Haube trocknen.
- Mit 10 ml Mg 2+- und Ca2+-freien DPBS waschen, im Inkubator trocknen lassen und zum Schutz vor Licht in Aluminiumfolie lagern. Lagern Sie die Flaschen bis zu 6 Monate bei Raumtemperatur (RT).
2. Nasenbürsten
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Nasenbürsten durchgeführt wird, während der Teilnehmer keine akute Infektion hat. Wenn CF-Patienten eine Lungeninfektion aufweisen, beziehen Sie sich auf das Antibiogramm des Patienten und fügen Sie dem Amplifikationsmedium zusätzliche Antibiotika hinzu. Menschliche Nasenepithelzellen wurden durch Nasenbürsten von F508del/F508del-Patienten gesammelt, wie zuvor beschrieben9.
- Bitten Sie den Patienten, sich die Nase zu putzen, und betäuben Sie dann topisch die Schleimhaut beider Nasenlöcher mit Baumwollnetzen, die in Xylocain 5% mit Naphazolinlösung getränkt sind.
- Bürsten Sie die mediale Wand und den unteren Nasenpanzer beider Nasenlöcher vorsichtig mit einem Zytologiepinsel. Weichen Sie die Bürste in einem 15-ml-Schlauch mit 2 ml handelsüblichem Spülmedium ein; Vorsichtig schütteln, um Zellen zu lösen. Wiederholen Sie das Bürsten im zweiten Nasenloch.
- Fügen Sie dem Spülmedium die folgenden Antibiotika hinzu: Penicillin (100 U / ml), Streptomycin (100 μg / ml), Tazocillin (10 μg / ml), Amphotericin B (2,5 μg / ml) und Colimycin (16 μg / ml).
HINWEIS: Nasenbürsten können bei RT an spezielle Labore zur Expansion und Kultur geliefert werden und können bis zu 72 Stunden nach dem Bürsten ausgesät werden.
3. Isolierung von HNE
HINWEIS: HNE wurden aus der Zytologiebürste isoliert, mit Mg 2+- und Ca2+-freiem DPBS gewaschen, mit 0,25% Trypsin dissoziiert und wie zuvor beschrieben auf einen25 cm2 großen Kunststoffkolben ausgesät10.
- Lösen Sie die Zellen von der Zytologiebürste, indem Sie die Bürste wiederholt durch einen 1000 μL Pipettenkegel führen und mit 2 ml Mg2+- und Ca2+-freiem DPBS spülen. Bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entsorgen.
- Resuspendiert das Pellet in 0,25% Trypsin für 8-12 Minuten, um Zellen zu dissoziieren. Stoppen Sie die enzymatische Reaktion, indem Sie 5 ml des Amplifikationsmediums hinzufügen.
- Bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entsorgen. Das Pellet wird in 8 ml des Verstärkungsmediums resuspendiert und auf einem 25 cm2 kollagenbeschichteten Kolben ausgesät. Wachsen bei 37 °C und 5% CO2. Dies entspricht der Passage 0.
- Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium durch 5 ml frisches Verstärkungsmedium und überwachen Sie die Zellen täglich auf Anhaftung, Morphologie (Zellen sollten ein kohäsives Kopfsteinpflasteraussehen haben) und Anzahl.
HINWEIS: Die anfängliche Aussaatdichte variiert je nach Qualität der Nasenbürste und dem Anteil der Epithelzellen. Frisch isolierte HNE-Zellen erreichen normalerweise innerhalb von 3-10 Tagen eine Konfluenz von 80% -90%. Eine langsamere Wachstumsrate deutet auf unzureichende Epithelzellen in der Probe hin und sollte verworfen werden.
4. Amplifikation und Passage menschlicher Nasenepithelzellen
- Züchten Sie menschliche Nasenepithelzellen im Amplifikationsmedium bei 37 °C und 5% CO2 auf kollagenbeschichteten Kolben bis zu 80%-90% Konfluenz, wobei das Medium alle 48-72 h gewechselt wird. Für 25 cm 2 Kolben verwenden Sie 5 ml Verstärkungsmedium und 10 ml für 75 cm2 Kolben.
- Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80% -90% erreichen, waschen Sie die Zellen mit 10 ml Mg 2 + - und Ca2 + -freiem DPBS, aspirieren und verwerfen Sie.
- 1 ml 0,25% Trypsin für einen 25 cm 2 Kolben (oder 2 ml Trypsin für einen 75 cm 2 Kolben) zugeben und für 8-12 min in den Inkubator (37 °C, 5% CO2) zurückgeben.
- Klopfen Sie fest mit der Handfläche auf den Kolben, um den Zellen zu helfen, sich zu lösen.
- Fügen Sie 10 ml des Amplifikationsmediums hinzu, um die enzymatische Reaktion zu stoppen. Spülen Sie den Kolben kräftig aus, indem Sie die 10-ml-Pipette verwenden, um das Verstärkungsmedium über die Kolbenoberfläche zu ziehen und auszustoßen, um Zellen zu spülen und zu lösen.
- Bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entsorgen.
- Resuspendiert das Pellet in 5-10 ml des Verstärkungsmediums.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
HINWEIS: Zellen können an dieser Stelle eingefroren werden (siehe Schritte 5.1-5.3). Wenn eine weitere Verstärkung erforderlich ist, werden Sie auf kollagenbeschichtete Kolben umsäen (ein 25 cm 2 Kolben kann zu drei 75 cm2 Kolben erweitert werden, eine stärkere Verdünnung wird nicht empfohlen).
5. Kryokonservierung primärer Nasenepithelzellen
HINWEIS: Züchten Sie HNE-Zellen bis zur Passage 1 vor dem Biobanking, um genügend Zellen zu erhalten, um das Zellwachstum beim Auftauen zu erleichtern. Biobanking ist jedoch bei der ersten Passage 0 oder Passage 2 möglich. Die folgenden Kryokonservierungsschritte sind an alle Passagen angepasst.
- Nach der Zellzählung bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen
- Resuspendiert das Pellet im angereicherten Gefriermedium (Tabelle 1), um 3 x 10 6-5 x 106 Zellen pro ml und pro Kryo zu erhalten.
- Langsam frieren Sie die Zellen ein, indem Sie die Temperatur auf ~ 1 ° C pro Minute in einem geeigneten Kryogefrierbehälter bei -80 ° C reduzieren. Am nächsten Tag die konservierte Probe zur Langzeitlagerung in einen Stickstofflagerbehälter geben (die vorliegende Studie ist auf 17 Monate Lagerung beschränkt).
6. Auftauen von gefrorenen verstärkten HNE-Zellen
- Das Wasserbad auf 37 °C aufwärmen. Das Verstärkungsmedium wird wie in Tabelle 1 beschrieben vorbereitet und auf 37 °C erhitzt.
- Entfernen Sie Kryoviale aus dem Stickstoffspeicher und legen Sie sie schnell in das Wasserbad, wobei Sie darauf achten, die gesamte Durchstechflasche nicht in das Wasser zu tauchen. Entfernen Sie die Kryofrüchte aus dem Wasserbad, wenn nur ein kleiner gefrorener Tröpfchen übrig bleibt. Wischen Sie die Durchstechflasche mit 70% Alkohol ab, wischen Sie sie trocken und legen Sie sie unter die Haube.
- Übertragen Sie die aufgetauten Zellen mit einer 1-ml-Pipette in eine leere 15-ml-Röhre.
- Fügen Sie tropfenweise 1 ml warmes Verstärkungsmedium hinzu. Nach 1 Minute fügen Sie weitere 1 ml Verstärkungsmedium hinzu und warten Sie eine weitere Minute.
- Fügen Sie 10 ml des Verstärkungsmediums hinzu und zentrifugieren Sie für 2 min bei 500 x g.
- Saugen Sie den Überstand auf und verwerfen Sie ihn. Resuspendiert das Zellpellet in einem Volumen von Amplifikationsmedium, das erforderlich ist, um eine Zelldichte von mindestens 1 x 106 Zellen / ml zu erreichen.
- Säen Sie die Zellen auf einen kollagenbeschichteten Kolben, der das Verstärkungsmedium enthält.
- Wenn das Kryo mehr als 4 x 10 6 Zellen enthält, Samen Sie auf einen 75 cm2 Kolben, in 10 ml des Verstärkungsmediums
- Wenn Kryo weniger als 4 x 10 6 Zellen enthält, Samenzellen auf einen 25 cm2 Kolben, in 5 ml des Verstärkungsmediums
- Inkubieren Sie bei 37 °C, 5% CO 2 und beobachten Sie visuell die Zellexpansion in den nächsten2-3 Tagen.
- Führen Sie dann eine Zellverstärkung durch, wie in Abschnitt 4 beschrieben.
HINWEIS: Wenn in Schritt 4.7 nur wenige Zellen geerntet wurden. (d. h. wenn vor der Expansion bei Durchgang 0 eingefroren wird), Schritte 6.5. und 6.6. kann weggelassen werden, und Zellen können ohne Zentrifugation direkt auf einen 25 cm2 kollagenbeschichteten Kolben ausgesät werden. Das Medium muss dann am nächsten Tag gewechselt werden, um Dimethylsulfoxid (DMSO) zu entfernen.
7. Differenzierung menschlicher Nasenepithelzellen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche
HINWEIS: HNE wurden an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche wie zuvor beschriebenunterschieden 10.
- Die Zellen werden mit einer Dichte von 330.000 Zellen/Filter auf 0,33 cm 2 kollagenbeschichtetenporösen Filtern ausgesät und mit 300 μL des Amplifikationsmediums auf der apikalen Seite und 900 μL des Luft-Flüssig-Mediums auf der basolateralen Seite ergänzt.
- Nach 3 Tagen aspirieren Sie das apikale Medium und kultivieren Sie die Zellen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche für 3-4 Wochen im Luft-Flüssig-Medium, um ein differenziertes Epithel zu etablieren. Wechseln Sie das Basalmedium alle 48-72 h.
8. CFTR-Modulatoren
- Bereiten Sie ein Luft-Flüssig-Medium vor, das CFTR-Modulatoren enthält. Verwenden Sie VX-445, VX-661 und VX-809 bei einer Endkonzentration von 3 μM und VX-770 bei 100 nM. Verwenden Sie den Korrektor ABBV-2222 bei einer Endkonzentration von 1 μM und den Potentiator ABBV-974 bei 10 μM. Verwenden Sie 100% DMSO, um alle CFTR-Modulatoren aufzulösen.
- Bereiten Sie ein Luft-Flüssig-Medium vor, das die gleiche Menge an 100% DMSO wie in Korrektormedium enthält.
- Fügen Sie das Medium, das Medikamente oder DMSO enthält, auf die basolaterale Seite der polarisierten HNE-Zellen hinzu, die an einer Luft-Flüssig-Grenzfläche gezüchtet werden, und inkubieren Sie für 24 h in 5% CO2 bei 37 ° C.
- Nach 24 h wird das Medium abgesaugt, entsorgt und durch frisches Medium ersetzt, das gemäß den Schritten 8.1-8.2. zubereitet wurde, und für einen Zeitraum von 24 h in 5 % CO2 bei 37 °C weiter inkubiert.
9. Ussing-Kammerstudien
- Messen Sie Kurzschlussstrommessungen (Isc) unter Spannungsklemmbedingungen wie zuvor beschrieben9.
HINWEIS: Der transepitheliale elektrische Widerstand (TEER) von Kulturen wurde mit einem Essstäbchenvoltmeter gemessen, und für die folgenden Experimente wurden nur Kulturen mit einem Erreichen von mindestens 200 Ω · cm2 berücksichtigt. Filter von polarisierten HNE-Zellen wurden in Ussing-Kammern montiert, und Kurzschlussstrommessungen (Isc) wurden unter Spannungsklemmbedingungen gemessen.
10. Immunzytochemie
- Führen Sie die Immundetektion wie zuvor beschriebendurch 9.
HINWEIS: Die CFTR-Immundetektion wurde mit dem monoklonalen Anti-CFTR-C-terminalen (24-1) Antikörper über Nacht bei einer 1/100-Verdünnung durchgeführt. Zona-Okklusionen-1 (ZO-1) (1/500 Verdünnung), Alpha-Tubulin (1/300 Verdünnung), Muc 5AC (1/250 Verdünnung) und Cytokeratin 8 (1/250 Verdünnung) wurden auf zusätzlichen Filtern gefärbt. Nach dem Waschen mit PBS-Triton-X100 wurden 0,1% Ziegensekundärantikörper, die an Alexa 488 oder 594 konjugiert waren, für 30 min in 10% Ziegenserum (1/1000 Verdünnung) zugegeben. Nach einer abschließenden Wäsche wurden die Filter von der Stütze geschnitten und mit einem DAPI-haltigen Vectashield-Montagemedium montiert. Ein konfokales Mikroskop (63x/1,4 Öl Differential Interferenzkontrast λ blaues PL APO Objektiv) wurde verwendet, um Bilder aufzunehmen, die mit der ImageJ-Software analysiert wurden.
11. Statistische Auswertung
- Führen Sie statistische Analysen mit geeigneter Software durch.
HINWEIS: Die statistische Analyse wurde mit der S.A.S.-Software durchgeführt. Da mehrere HNE-Filter pro Patient und pro Zustand erhalten wurden, wurden quantitative Parameter als Medianwerte (± REM) pro Patient ausgedrückt. Vergleiche (Mittelwert ± SD) wurden unter Verwendung von Wilcoxon Matched Pairs signiertem Rangtest oder ungepaartem t-Test durchgeführt.
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Representative Results
Frische HNE-Zellen, die an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche kultiviert werden, weisen typische Merkmale des polarisierten und differenzierten respiratorischen Epithels auf, wie sie durch Immunfärbung beurteilt werden (Abbildung 1). HNE-Zellen redifferenzieren sich in eine heterogene Schicht von Epithelzellen (positive Keratin-8-Immunfärbung), die die In-vivo-Situation eines pseudostratifizierten respiratorischen Epithels nachahmen, das aus flimmerbeinten (positive Alpha-Tubulin-Färbung) und nicht-Flimmerschleim-produzierenden Kelchzellen (positive Muc5Ac-Immunfärbung) besteht. Das Gesamtepithel weist Tight Junctions auf (beurteilt durch ZO-1, Zona-Okklusen-1-Färbung). Eine starke apikale CFTR-Färbung ist in Wildtyp-HNE-Zellen (WT) sichtbar, und eine verminderte CFTR-Färbung sowohl an der apikalen Oberfläche als auch im Zytoplasma wird in F508del/F508del HNE beobachtet.
Wir betrachteten positive Ergebnisse als Proben, die sich nicht nur erfolgreich ausdehnten, sondern auch erfolgreich in ein pseudostratifiziertes Epithel nach 3 Wochen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche differenzierten und einen TEER von mehr als 200 Ω · cm2 aufwiesen, was Kurzschlussstrommessungen ermöglichte. Da nur wenige dedizierte Labore CFTR-bezogene Cl-Sekretionsassays durch Kurzschlussstrommessungen durchführen, müssen Proben häufig von Krankenhäusern zu speziellen Einrichtungen transportiert werden.
In den 78 frischen HNE-Zellproben wurden die Erfolgsraten in Nasenbürsten, die sofort ausgesät wurden, und in Bürsten, die nach 1-7 Tagen Transport in Spülmedium bei Raumtemperatur ausgesät wurden, verglichen. Die Mehrheit der Proben (55%) wurden 1 Tag nach dem Bürsten ausgesät, und 82% der Proben wurden innerhalb von 48 Stunden ausgesät. Der durchschnittliche Prozentsatz der erfolgreichen Kulturen in allen 78 Proben betrug 82% und erreichte 87% in Proben, die zwischen Tag 0 und Tag 5 ausgesät wurden (Tabelle 2).
Die Erfolgs- und Misserfolgsraten für identische Proben, die sowohl unter frischen als auch unter gefrorenen aufgetauten Bedingungen unterschieden wurden, wurden verglichen. 83% der Proben, die sich unter frischen Bedingungen erfolgreich differenzierten, waren auch in kryokonservierten Proben erfolgreich. Ebenso waren bei Proben, die sich unter frischen Bedingungen nicht differenzieren konnten, 71 % auch unter Frost-Tau-Bedingungen erfolglos (Tabelle 2). All diese Daten deuten darauf hin, dass die Qualität des Nasenbürstens der Schlüsselfaktor für eine erfolgreiche Kultur ist.
Wir wollten auch die optimale Anzahl von Zellen pro Kryo bestimmen. Proben, die bei Passage 0 eingefroren sind, von einem einzigen 25 cm2 erlauben im Allgemeinen nur, 1-1,5 x 106 Zellen pro Kolben zu erreichen. Proben, die bei Passage 1 eingefroren und auf drei 75 cm2-Kolben verstärkt wurden, durften im Allgemeinen 10 x 10 6 Zellen erreichen, so dass mehrere Durchstechflaschen mit mindestens 3 x10 6 Zellen eingefroren werden konnten. Unter den in diesem Protokoll beschriebenen Kulturbedingungen wuchsen 50% der Proben, die zwischen 2 x 10 6 und 3 x 10 6 Zellen pro Kryo eingefroren waren, nicht, wenn sie aufgetaut wurden, und erreichten 80%, wenn sie unter 2 x 106 Zellen pro Kryo lagen (Tabelle 2).
CFTR-bezogene Cl-Sekretion spiegelt CFTR-Funktion wider und kann durch Kurzschlussstrom-Experimente (Isc) in Ussing-Kammern gemessen werden. Die Isc-Variation im Ansprechen auf Forskolin (ΔIscForskolin) und den CFTR-Inhibitor inh172 (ΔIscCFTRinh172) sind die Hauptendpunkte für die Beurteilung der Wirksamkeit von CFTR-Korrektoren.
Kurzschlussstromexperimente wurden entweder an frischem HNE durchgeführt, in Verstärkungsmedium expandiert und auf Filter in Passage 2 ausgesät und an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche für 3 Wochen in Luft-Flüssig-Medium gezüchtet, oder an HNE, das zuvor in Passage 1 in angereichertem Gefriermedium eingefroren, aufgetaut, expandiert und auf porösen Filtern in Passage 3 ausgesät worden war. Die Kryokonservierungszeiten reichten von 3 Monaten bis 16 Monaten, mit einem Mittelwert von 9,8 Monaten. Unter den in dieser Studie beschriebenen Kultur- und Kryokonservierungsbedingungen wurden keine signifikanten Veränderungen des Wachstums oder der Morphologie zwischen verschiedenen Passagen oder frisch oder gefroren aufgetauten F508del/F508del HNE-Kulturen beobachtet.
Sowohl für das mittlere ΔIscForskolin (Abbildung 2A) als auch für das mittlereΔIsc CFTRinh172 (Abbildung 2B) in DMSO-behandelten HNE-Zellen wurde kein signifikanter Unterschied zwischen frischem oder gefrorenem aufgetautem HNE beobachtet. Um zu beurteilen, ob die funktionelle Korrektur von CFTR durch Kryokonservierung beeinflusst wurde, wurden mittlere Isc-Veränderungen in VX-809 + VX-770 behandelten Zellen im Vergleich zu DMSO-behandelten HNE-Zellen in frischen (HNE-Zellen von n = 78 Patienten) oder gefroren-aufgetauten HNE (HNE-Zellen von n = 9 Patienten) gemessen (Abbildung 2). Sowohl gefrorene als auch frische Zellen zeigten während der Behandlung eine signifikante Korrektur mit einem signifikanten Anstieg von ΔIscForskolin (p < 0,05) (Abbildung 2A) und einer signifikanten Abnahme des ΔIscCFTRinh172 (p < 0,05) (Abbildung 2B). Der mittlere Faltenanstieg für ΔIscForskolin (ΔIsc Forskolin VX-809 + VX-770/ΔIscForskolin DMSO) erreichte 2,9 ± 1,6 in gefroren-aufgetauten HNE-Zellen und unterschied sich nicht signifikant von der Faltenzunahme in frischen HNE-Zellen (2,5 ± 2,0). In ähnlicher Weise wurde die Faltenabnahme von ΔIsc CFTRinh172 (ΔIsc CFTRinh172 VX-809 + VX-770/ΔIscCFTRinh172 DMSO) nicht signifikant durch Kryokonservierung beeinflusst: 1,49± 0,9 in gefroren-aufgetautem HNE im Vergleich zu 2,5 ± 3,7 in frischem HNE.
Die funktionelle Korrekturaktivität mehrerer Modulatortherapien wurde weiter untersucht, um zu beurteilen, ob dieses HNE-Zellmodell zwischen verschiedenen Behandlungen unterscheiden könnte. Die Ergebnisse hier kombinieren HNE-Zellen aus frischen und gefrorenen aufgetauten Bedingungen, da das Ansprechen auf die Behandlung durch Kryokonservierung nicht signifikant verändert wurde (Abbildung 2).
Wir bewerteten zunächst das korrektorische Ansprechen von zwei zugelassenen CFTR-Modulatortherapien auf Cl-Transport nach einer 48-stündigen Behandlung mit entweder VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 nM) oder VX-661 (3 μM) + VX-770 (100 nM) in HNE-Zellen von 10 F508del/F508del-Patienten (Abbildung 3). Im Vergleich zu DMSO-behandelten HNE-Zellen wurden ΔIscForskolin (Abbildung 3A) und ΔIscCFTRinh172 (Abbildung 3B) sowohl durch VX-809 + VX-770 als auch durch VX-661 + VX-770 signifikant verbessert. Beide Behandlungen korrigierten funktionell die CFTR-bedingte Cl-Sekretion auf ein ähnliches Niveau, mit einem signifikanten mittleren Anstieg des ΔIscForskolin von 1,75 ± 1,39 für VX-809 + VX-770 (p < 0,001) und 0,97 ± 0,93 für VX-661 + VX-770 (p < 0,01). Die mittlere ΔIsc CFTRinh172-fache Abnahme betrug 1,79 ± 2,04 für VX-809 + VX-770 (p < 0,001) und unterschied sich nicht signifikant von der mittleren ΔIscCFTRinh172-fachen Abnahme von 1,16 ± 1,44 für VX-661 +VX-770 (p < 0,001 vs. DMSO).
Drei verschiedene CFTR-Modulatortherapien in HNE von sechs F508del/F508del-Patienten (Abbildung 4) wurden weiter verglichen. Die Ergebnisse hier kombinieren HNE-Zellen aus frischen und gefrorenen aufgetauten Bedingungen. Sowohl die CFTR-Modulatoren von Vertex als auch von Abbvie korrigierten, wenn sie als Kombination aus einem CFTR-Korrektor und einem CFTR-Potentiator verwendet wurden, ΔIscForskolin (Abbildung 4A) undΔIsc CFTRinh172 (Abbildung 4B) in ähnlichem Maße. Die in Abbildung 3 beobachtete partielle Korrektur durch VX-809 + VX-770 wurde in diesen HNE-Zellen mit einem mittleren ΔIscForskolin-Faltenanstieg von 2,87 ± 1,67 bestätigt (p < 0,05). Die Behandlung mit ABBV-2222 (1 μM) + ABBV-974 (10 μM) induzierte eine ähnliche Korrektur, die 91% der VX-809 + VX-770-Korrektur für ΔIscForskolin (mittlere ΔIscForskolin-Faltenerhöhung von 2,6 ± 1,4, p < 0,05 vs. DMSO) und 85% VX-809 + VX-770 für ΔIsc CFTRinh172 (mittlere ΔIscCFTRinh172-fache Abnahme von 4,2 ± 5,7, p < 0,05 vs. DMSO) darstellte.
Interessanterweise verbesserte sich die Korrekturwirksamkeit, wenn HNE mit der Dreifachkombination VX-445 (3 μM) + VX-661 (3 μM) + VX-770 (100 nM) behandelt wurde, signifikant und erreichte 312% der VX-809 + VX-770 ΔIsc Forskolin-Korrektur (mittlere ΔIscForskolin-Faltenerhöhung von 9,0 ± 4,1, p < 0,05 vs. VX-809 + VX-770) und 372% der ΔIsc CFTRinh172 (mittlere ΔIsc CFTRinh172-fache Abnahme von 15,5 ± 10,5), p < 0,05 gegen VX-809 + VX-770).
Abbildung 1: Differenzierungsmarker in HNE-Kulturen. Repräsentative konfokale Mikroskopiebilder der immunfluoreszierenden Färbung von CFTR (grün), Zona-Okklopen-1 (ZO-1, rot), Alpha-Tubulin (grün), Muc5AC (rot) und Cytokeratin 8 (K8, grün) in Wildtyp- (WT) (erstes Panel) und F508del (Panel 2-4) HNE-Zellen, die 3 Wochen lang an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche gezüchtet wurden. Kerne wurden mit DAPI blau gefärbt. Projektionen von konfokalen Mikroskopiebildern, Draufsicht (obere Panels) und Seitenansicht (untere Panels) von dreidimensionalen (3D) Z-Stacks-Rekonstitutionen. Die Skalierungsleiste (20 μm) gilt sowohl für die oberen als auch für die unteren Bereiche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Wirkung des Einfrierens und Auftauens auf die CFTR-bedingte Cl-Sekretion in HNE-Zellen . Zusammenfassung der Kurzschlussstromaufzeichnungen (Isc) (Mittelwert ± SD) in HNE-Kulturen, die von F508del/F508del-Patienten stammen und 3 Wochen lang an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche gezüchtet wurden. Die Zellen wurden 48 h lang mit Vehikel allein (DMSO) oder VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 nM) in frischen (hellgrauen, patientenabgeleiteten HNE-Zellen von 78 Patienten) oder gefroren-aufgetaut (dunkelgraue, patientenabgeleitete HNE-Zellen von 9 Patienten) behandelt. Die Daten stellen die mittlere (± SD) Reaktion auf akut zugesetztes (A) Forskolin (10 μM)/3-isobutyl-1-methylxanthin (IBMX, 100 μM), ΔIscForskolin oder (B) CFTR-Inhibitor inh172 (5 μM) ΔIscCFTRinh172 dar. Pro Patient und Zustand wurden mindestens zwei Filter analysiert. Sternchen zeigen den statistischen Unterschied zwischen Korrektoren und Kontrollpersonen (DMSO-behandelt) * p < 0,05 (ungepaarter t-Test). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Korrektur der CFTR-Funktion durch duale Therapien. Zusammenfassung der Kurzschlussstromaufzeichnungen (Isc) (Mittelwert ± SD) in HNE-Kulturen, die von 10 F508del/F508del-Patienten stammen und 3 Wochen lang an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche gezüchtet wurden (kombinierte Ergebnisse von frischen und gefroren-aufgetauten Kulturen). Die Zellen wurden 48 h lang mit dem Vehikel allein (DMSO) behandelt; VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 nM) oder VX-661 (3μM) + VX-770 (100 nM). Die Daten stellen die mittlere (± SD) Reaktion auf akut zugesetzte (A) Forskolin (10 μM)/IBMX (100 μM), ΔIscForskolin oder (B) CFTR-Inhibitor inh172 (5 μM), ΔIscCFTRinh172 dar. Pro Patient und Zustand wurden mindestens zwei Filter analysiert. Sternchen zeigen einen statistischen Unterschied zwischen Korrektoren und Kontrollpersonen (DMSO-behandelt) ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001 (Wilcoxon matched pairs signed rank test). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Effizienz der Dreifachtherapie im Vergleich zu dualen Therapien bei der CFTR-Korrektur. Zusammenfassung der Kurzschlussstromaufzeichnungen (Isc) (Mittelwert ± SD) in HNE-Kulturen, die von 6 F508del/F508del-Patienten stammen und 3 Wochen lang an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche gezüchtet wurden (kombinierte Ergebnisse aus frischen und gefroren-aufgetauten Zellen). Die Zellen wurden 48 h lang mit dem Vehikel allein (DMSO) behandelt; VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 nM); ABBV-2222 (1 μM) + ABBV-974 (10 μM); oder VX-661 (3 μM) + VX-445 (3 μM) + VX-770 (100 nM). Die Daten stellen die mittlere (± SD) Reaktion auf akut zugesetzte (A) Forskolin (10 μM)/IBMX (100 μM), ΔIscForskolin oder (B) CFTR-Inhibitor inh172 (5 μM), ΔIscCFTRinh172 dar. Pro Patient und Zustand wurden mindestens zwei Filter analysiert. Sternchen weisen auf einen statistischen Unterschied zwischen den Behandlungen hin. * p < 0,05 (Wilcoxon matched pairs signed rank test). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Medienkomponente | Endkonzentration |
| AMPLIFIKATIONSMEDIUM | |
| Fortschrittliche DMEM/F-12 Nährstoffmischung | 86% |
| Fetales Rinderserum | 10% |
| Penizillin | 100 U/ml |
| Streptomycin | 100 μg/ml |
| Tazocillin | 10 μg/ml |
| Amphotericin B | 2,5 μg/ml |
| Colimycin | 16 μg/ml |
| Ciprofloxacin | 3 μg/ml |
| Hydrocortison | 0,2 μM |
| Insulin | 5 μg/ml |
| Adrenalin | 0,5 μg/ml |
| EGF | 10 ng/ml |
| Y-27632 (Rho-assoziierter Kinase-Hemmer) | 10 μM |
| LUFT-FLÜSSIG-MEDIUM | |
| Fortschrittliche DMEM/F-12 Nährstoffmischung | 94% |
| UltroserG | 2% |
| Penizillin | 100 U/ml |
| Streptomycin | 100 μg/ml |
| Tazocillin | 10 μg/ml |
| Amphotericin B | 2,5 μg/ml |
| Colimycin | 16 μg/ml |
| ANGEREICHERTES GEFRIERMEDIUM | |
| F12 Nährstoffmischung | 77% |
| HEPES | 3% |
| Fetales Rinderserum | 10% |
| DMSO | 10% |
Tabelle 1: Zusammensetzung des Verstärkungs-, Luft-Flüssig- und angereicherten Gefriermediums. Liste der Reagenzien und der entsprechenden Endkonzentrationen.
| Dauer der Konservierung der Nasenbürste vor der Aussaat (n = 78) | |
| Tage vor der Aussaat | Erfolgsquoten (%) |
| 0 | 83 |
| 1 | 84 |
| 2 | 67 |
| 3 | 100 |
| 4 | 89 |
| 5 | 100 |
| 7 | 0 |
| Ergebnisse der gleichen anfänglichen Nasenbürsten, die sowohl unter frischen als auch unter gefrorenen aufgetauten Bedingungen angebaut wurden (n = 13) | |
| Ergebnis unter neuen Bedingungen | Erfolgsquoten beim Einfrieren und Auftauen (%) |
| Erfolg | 83 |
| Versagen | 29 |
| Einfluss der Zellzahl auf die Erfolgsraten (n = 36) | |
| Anzahl der Zellen pro Kryo | Erfolgsquoten beim Einfrieren und Auftauen (%) |
| <2 x 106 | 20 |
| 2–3 x 106 | 50 |
| 3–4 x 106 | 67 |
| >4 x 106 | 79 |
Tabelle 2: Parameter, die die Erfolgsraten in frischen und gefrorenen HNE-Zellkulturen beeinflussen. Die Erfolgsraten wurden als Nasenbürsten definiert, die sich nach 3 Wochen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche erfolgreich in ein pseudostratifiziertes Epithel ausdehnten und differenzierten und einen TEER von mehr als 200 Ω·cm2 aufwiesen. Vor der Aussaat wurden die Proben bei Raumtemperatur in Spülmedium mit Antibiotika verschifft. Die Ergebnisse stellen Daten von 78 frischen Proben und 36 gefroren-aufgetauten Proben dar. 13 Nasenbürsten wurden sowohl unter frischen als auch unter gefrorenen aufgetauten Bedingungen analysiert.
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Discussion
Die Verwendung von von Patienten abgeleiteten Nasenepithelzellen als Surrogate für menschliche Bronchialepithelzellen (HBE) zur Messung der CFTR-Aktivität im Rahmen der personalisierten Medizin wurde vorgeschlagen, da HNE die Eigenschaften von Zellen in Kulturreproduziert 9,11. Der starke Vorteil von HNE gegenüber HBE-Zellkulturen besteht darin, dass sie leicht und nicht-invasiv beprobt werden können. Kurzschlussstrommessungen in HNE-Zellkulturen ermöglichen die Beurteilung des CFTR-abhängigen Cl-Transports über das Epithel, von dem gezeigt wurde, dass er signifikant mit der CFTR-in-vivo-Aktivität korreliert, die durch die nasale Potentialdifferenz bei Patienten mit verschiedenen Genotypen9 bewertet wurde. Die Rettung der CFTR-Aktivität in HNE-Zellen unter VX-809-Behandlung korrelierte auch signifikant mit der Verbesserung des klinischen Ergebnisses FEV1 bei Lumacaftor-Ivacaftor-behandelten F508del-homozygoten Patienten12.
Wichtig ist, dass diese Studie zeigt, dass frisch geerntete HNE-Zellen Transport- und Standardversandbedingungen leicht vertragen (d.h. sie überleben 72 h bei Raumtemperatur), was die Untersuchung von Patientenzellen aus verschiedenen geografischen Standorten ermöglicht. Die kritischen Faktoren für eine erfolgreiche Kultur sind vor allem die Qualität des Nasenbürstens und die Anzahl der lebenden Zellen bei der Probenahme. Eine Reihe von Protokollen wurde über die Züchtung und Differenzierung von HNE-Zellkulturen veröffentlicht; einige ohne bedingte Neuprogrammierung während der Erweiterungsphase 13,14,15,16,17,18,19,20, einige mit bedingter Neuprogrammierung im Feeder9,11,12,21,22,23,24,25 ,26 oder feederfreie 5,8,27,28,29 Bedingungen, und mehrere vergleichen verschiedene Methoden 7,8. Sie alle ermöglichen es, eine relativ große Anzahl von ALI-Kulturen mit korrekter Differenzierung und Polarisation sowie guten TEER-Werten zu erhalten. Ähnlich wie in dieser Studie verwendeten viele kryokonservierte HNE-Zellen, die in Passage 1 13,28 eingefroren waren. Interessanterweise berichten mehrere Autoren, dass ROCKi das Überleben nach der Kryokonservierung verbessern kann, wenn es dem Post-Tau-Kulturmedium hinzugefügt wird, und die Anzahl der Zellen erhöhen kann, die an 5,29 gebunden bleiben, was darauf hindeutet, dass das in dieser Studie verwendete Amplifikationsmedium besonders für die Kryokonservierung geeignet ist.
Hier zeigt die Studie, dass HNE-Zellen erfolgreich biobankiert werden können, wobei der kritische Faktor wiederum die Qualität der Nasenbürstenbildung ist. Es zeigt sich eine gute Korrelation zwischen dem Ergebnis frischer Proben und gefrorenen Proben, was darauf hindeutet, dass zur Optimierung der Qualität von HNE-Zellen, die für weitere Studien biobankiert werden, eine Vorstudie an frischen Proben durchgeführt werden könnte, wenn sie keine korrekte ALI-Differenzierung und keinen akzeptablen TEER-Wert erreichen; Ein zweites Nasenbürsten wäre vorzuziehen, anstatt Zellen einzufrieren, die eine hohe Wahrscheinlichkeit für ein schlechtes Ergebnis haben. Ein zweiter kritischer Faktor für die Kryokonservierung ist die Zellzahl; Unter den in dieser Studie verwendeten Kulturbedingungen, wenn weniger als 2 x 106 Zellen pro Kryo eingefroren werden, ist die Ausfallrate sehr hoch. Das Einfrieren von mindestens 3 x 106 Zellen pro Kryo wird empfohlen.
Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass das Auftauen von Gefrieren die elektrophysiologischen Eigenschaften oder die Reaktion von HNE-Zellen auf CFTR-Modulatoren nicht signifikant verändert. Der Messbereich in HNE-Zellkulturen desselben F508del-homozygoten Patienten, der ohne Einfrieren oder nach Auftauen erhalten wurde, unterschied sich bei der Behandlung mit VX-809 + VX-770 nicht. Ähnliche Ergebnisse wurden zuvor für HBE-Zellen berichtet, bei denen Forskolin-stimuliertes Isc nach mehreren Tau-/Kulturzyklen von nicht behandelten F508del-Zellenstabil war 30. Dies liefert Hinweise darauf, dass HNE-Zellen eingefroren und in einer Biobank gelagert und später untersucht werden können.
Immer mehr Studien zeigen, dass mit HNE-Zellkulturen die Wirksamkeit verschiedener Therapien im Rahmen der personalisierten Medizin getestet werden kann. Die Analyse zeigte, dass duale Therapien, die einen Korrektor mit einem Potentiator kombinieren, alle eine vergleichbare Korrekturwirksamkeit für CFTR-abhängige Cl-Sekretion in F508del-homozygoten HNE-Zellen aufweisen. Es wurde jedoch eine wichtige interpatientische Variabilität festgestellt, die die veröffentlichten Ergebnisse 9,12,20,25 bestätigte. Im Gegensatz dazu verdreifachte VX-445 + VX-661 + VX-770 die Korrektur der CFTR-Aktivität im Vergleich zu VX-809 + VX-770. Ein ähnliches Maß an Korrektur von F508del-CFTR in HNE-Zellen bei Dreifachkombination wurde auch von Laselva et al.28 beobachtet. Wie von Veit et al.26 berichtet, war die Korrektur der Cl-Kanal-Funktion unter VX-445 + VX-661 + VX-770-Behandlung noch höher und erreichte 62% der mittleren WT-CFTR-Aktivität (Bereich von 19-36 μA/cm2 in korrigierter F508del-HNE und 14-50 μA/cm2 in WT-HNE)26.
HNE-Zellkulturen dienten auch dazu, die Wirksamkeit von CFTR-Modulatoren für andere Klasse-II-Mutationen zu testen. Eine wichtige Verbesserung der CFTR-Aktivität bei VX-445 + VX-661 + VX-770 wurde in HNE ALI-Kulturen beobachtet, die G85E/G85E, V520F/1717-1G>A, Y569/Y569D, M1101K/M1101K und N1303K/N1303K Genotypen26 beherbergen. In ähnlicher Weise zeigten Laselva et al.28 eine signifikante Korrektur von CFTR mit M1101K- und N1303K-Mutationen, aber keine signifikante Korrektur in G85E-HNE-Zellen. Galapagos/AbbVie-Korrektoren wurden für diese Lumacaftor-Ivacaftor-resistenten Mutantenuntersucht 31. Der AbbVie-Korrektor AC2-1 und insbesondere der Bi-Korrektor AC1+AC2-1 verbesserten effektiv die Cl-Sekretion in M1101K- und G85E-HNE-Zellen, während von N1303K abgeleitete Zellen durch eine Kombination von AC1+AC2-2 korrigiert wurden.
Messungen der CFTR-Aktivität in HNE-Zellen sind vielversprechende präklinische Biomarker, die für das Ansprechen des Patienten auf die getestete Behandlung prädiktiv sind. Beweise dafür, dass Gefrier-Tau-Zyklen das Korrekturniveau nicht verändern, liefern Hinweise darauf, dass diese Zellen biobankiert und als leistungsfähiges Werkzeug im Kontext personalisierter Medizinprogramme verwendet werden können. Ein einzigartiges Nasenbürsten könnte daher genügend Material zum Vergleich der Arzneimittelwirksamkeit ermöglichen, und die HNE-Zellen des Patienten könnten aufgetaut werden, wenn neue Medikamente verfügbar werden, ohne dass die Patienten erneut beprobt werden müssen. Dies ist besonders bei Säuglingen interessant.
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Disclosures
Die Autoren berichten von keinen konkurrierenden finanziellen Interessen im Zusammenhang mit dieser Publikation oder wissenschaftlichen Videoproduktion.
Acknowledgments
Wir danken allen Patienten und ihren Familien herzlich für die Teilnahme an der Studie. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des französischen Verbandes Vaincre la Mucoviscidose unterstützt; Französischer Verband ABCF 2 und Vertex Pharmaceuticals Innovation Awards.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABBV-2222 | Selleckchem | S8535 | |
| ABBV-974 | Selleckchem | S8698 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies | 12634010 | |
| Alexa 488 goat secondary antibody | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa 594 goat secondary antibody | Invitrogen | A11012 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290026 | |
| Anti-alpha-tubulin antibody | Abcam | ab80779 | |
| Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1) | R&D Systems | MAB25031 | |
| Anti-cytokeratin 8 antibody | Progen | 61038 | |
| Anti-Muc5AC antibody | Santa Cruz Biotech | sc-20118 | |
| Anti-ZO-1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-10804 | |
| Ciprofloxacin | provided by Necker Hospital Pharmacy | ||
| Colimycin | Sanofi | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Collagen type IV | Sigma-Aldrich Merck | C-7521 | |
| cytology brush | Laboratory GYNEAS | 02.104 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich Merck | D2650 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Epinephrin | Sigma-Aldrich Merck | E4375 | |
| F12-Nutrient Mixture | Life Technologies | 11765054 | |
| FBS | Life Technologies | 10270106 | |
| Ferticult | Fertipro NV | FLUSH020 | |
| Flasks 25 | Thermo Scientific | 156.367 | |
| Flasks 75 | Thermo Scientific | 156.499 | |
| Glacial acetic acid | VWR | 20104.298 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich Merck | H3375 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich Merck | SLCJ0893 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich Merck | I0516 | |
| Mg2+ and Ca2+-free DPBS | Life Technologies | 14190094 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140130 | |
| Tazocillin | Mylan | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Transwell Filters | Sigma-Aldrich Merck | CLS3470-48EA | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich Merck | T8787 | |
| Trypsin 0,25% | Life Technologies | 25200056 | |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| VX-445 | Selleckchem | S8851 | |
| VX-661 | Selleckchem | S7059 | |
| VX-770 | Selleckchem | S1144 | |
| VX-809 | Selleckchem | S1565 | |
| Xylocaine naphazoline 5% | Aspen France | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
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