Summary
ここでは、空気-液体界面での初代ヒト鼻上皮(HNE)細胞の単離、増幅、分化、および増幅HNEの凍結と融解に成功することを可能にするバイオバンキングプロトコルについて説明します。このプロトコルは、分化したHNE細胞の電気生理学的特性と、異なるモジュレーター処理時のCFTR関連の塩化物分泌補正を分析します。
Abstract
ヒト鼻上皮(HNE)細胞は、簡単で非侵襲的な鼻ブラッシングによって収集が容易である。患者由来の初代HNE細胞を増幅し、気液界面条件下で擬似層状上皮に分化させて、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター(CFTR)機能の指標として環状AMP媒介塩化物(Cl-)輸送を定量化することができる。鼻ブラッシングの質や凍結保存時の細胞密度などの重要なステップを効率的に行えば、HNE細胞をバイオバンク化することに成功することができます。さらに、短絡電流研究は、凍結融解がHNE細胞の電気生理学的特性およびCFTR変調器に対する応答を有意に変化させないことを実証している。本試験で用いた培養条件では、クライオバイアルあたり2 x106 細胞未満が凍結されると、故障率が非常に高い。クライオバイアルあたり少なくとも3 x106 セルを凍結することをお勧めします。我々は、CFTR補正器とCFTR増強剤を組み合わせた二重療法が、F508delホモ接合型HNE細胞におけるCFTR活性に対して同等の補正有効性を有することを示す。トリプルセラピーVX-445 + VX-661 + VX-770は、二重療法VX-809 + VX-770と比較してCFTR活性の補正を有意に増加させた。HNE細胞におけるCFTR活性の測定は、CFTRモジュレーター療法を導くのに有用な有望な前臨床バイオマーカーである。
Introduction
嚢胞性線維症(CF)は、上皮1,2の頂端表面に位置するアニオンチャネルであるCFTRタンパク質の不在または機能不全をもたらす嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター(CFTR)遺伝子の変異に起因する常染色体劣性障害である。CFTR療法における最近の進歩は、疾患の予後を改善し、CFTR矯正剤とCFTR増強剤を組み合わせた最後の承認薬は、最も頻繁な変異p.Phe508del変異(F508del)を有するCF患者の肺機能および生活の質の大幅な改善をもたらした3,4。この有望な治療の進歩にもかかわらず、CF患者の約10%は、これらのCFTRモジュレーターによって救出できない変異を有するため、不適格である。これらの患者にとって、特定の変異について最も効率的な組み合わせを見つけるために、他の薬物または薬物の組み合わせをテストする必要があり、個別化療法の重要性を強調しています。
ヒト鼻上皮(HNE)細胞は、簡単で非侵襲的な鼻ブラッシングによって収集が容易であり、CFTR機能の指標としてのサイクリックAMP媒介塩化物(Cl−)輸送の定量を可能にする。HNE細胞はヒト気道の正確なモデルをもたらすが、その寿命は培養において限られている。培養技術の最適化のおかげで、患者由来の初代HNE細胞をRho関連キナーゼ阻害剤(ROCKi)で条件付きで再プログラムし、増幅し、微多孔性フィルター5,6上の気液界面(ALI)条件下で擬似層状上皮に分化させることができる5,6。HNE培養のための多数の培養プロトコールが存在し(市販、無血清、「自家製」、「フィーダー細胞との共培養など)、培地および培養条件の選択は、増殖、細胞集団の分化および上皮機能に影響を与えることが記載されている7、8。ここでのプロトコルは、CFTR機能アッセイのためにALIで分化される多数のHNE細胞を首尾よく得ることを可能にする、単純化されたフィーダーフリーのROCKi増幅法を提示する。
我々は、分化したHNE細胞において、CFTRモジュレーターによる48時間治療がCFTR依存性Cl- 電流の電気生理学的補正を誘導するのに十分であり、 インビトロで 観察される補正が患者の臨床的改善と相関し得ることを実証した9。したがって、HNE細胞は、基礎的なCF研究だけでなく、患者固有のCFTRモジュレーター試験を伴う前臨床試験にも適切なモデルである。個別化治療のこの文脈において、プロトコールの目標は、我々の条件で増殖したCF患者由来の凍結保存HNE細胞がCFTR補正研究のための適切なモデルであり、新鮮および凍結融解細胞からのCFTR依存性Cl- 輸送を比較する場合、同様の結果が期待できることを検証することであった。この研究はまた、二重療法および三重療法を使用する場合の異なるCFTRモジュレーターの有効性を評価した。
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Protocol
すべての実験は、ヘルシンキ宣言と人間の研究倫理に関するHuriet-Serusclat法によって記述されたガイドラインと規制に従って行われました。
1. フラスコおよび異種培地の調製
- 表1に記載したように増幅、空気 - 液体、および凍結媒体を調製する。
- コラーゲン50mgを0.2%氷酢酸100mLに溶解してヒトコラーゲンIVの原液を調製する。マグネチックスターラーで少なくとも1時間混合し、溶液をフィルター滅菌する。光から保護されたガラス瓶に4°Cで最大6ヶ月間保管してください。
- 原液を二重蒸留水で1:5に希釈してコラーゲンIVの作用溶液を調製する。4°Cで最大6ヶ月間保管してください。
- プラスチック細胞培養フラスコまたはトランスウェルフィルターをコラーゲン作業溶液でコーティングする。0.33 cm 2 トランスウェルフィルターに 100 μL、25 cm 2 フラスコに 500 μL、75cm 2 フラスコに 1 mL をフラスコの成長面全体に均等に分配します。
注:これは、フラスコを左右に静かに傾けることによって達成することができる。あるいは、フラスコのコーティングを容易にするために、増加した体積を使用することができ、そして、表面全体が均等に覆われるとき、コラーゲン溶液は、指示された体積のみを残すように吸引される。吸引されたコラーゲン溶液は、その後、直ちに次のフラスコをコーティングするために使用することができる(すなわち、3つの75cm2フラスコに対して、3mLのコラーゲン溶液を最初のフラスコに均等に分配し、2mLを吸引し、次いで次のフラスコに使用される、など)。 - 細胞培養フラスコをインキュベーター内に最低2時間または一晩放置する。コラーゲンを徹底的に吸引し、フラスコをインキュベーター内またはフードの下で最低20分間または一晩乾燥させます。
- 10mLのMg2+-およびCa2+フリーDPBSで洗浄し、インキュベーター内で乾燥させ、光から保護するためにアルミニウム箔に保存する。フラスコを室温(RT)で最大6ヶ月間保管する。
2.鼻ブラッシング
注:参加者が急性感染症に罹患していない間に鼻ブラッシングが行われることを確認してください。CF患者が肺感染症を呈する場合は、患者の抗生物質を参照し、増幅培地に抗生物質を追加します。ヒト鼻上皮細胞を、前述のようにF508del/F508del患者から鼻ブラッシングによって収集した9。
- 患者に鼻を吹くように頼み、ナファゾリン溶液でキシロカイン5%に浸した綿網を使用して、両方の鼻孔の粘膜を局所麻酔する。
- 細胞診ブラシを使用して、両方の鼻孔の内側壁と下甲介を優しくブラッシングします。ブラシを市販のフラッシング培地2mLで15mLチューブに浸します。細胞を切り離すために静かに振る。2番目の鼻孔でブラッシングを繰り返します。
- ペニシリン(100 U/mL)、ストレプトマイシン(100 μg/mL)、タゾシリン(10 μg/mL)、アンホテリシンB(2.5 μg/mL)、コリマイシン(16 μg/mL)の抗生物質をフラッシング培地に加えます。
注:鼻ブラッシングは、RTで拡張と培養のために専用ラボに出荷することができ、ブラッシング後72時間まで播種することができます。
3. HNEの分離
注:HNEを細胞診ブラシから単離し、Mg2+-およびCa2+フリーDPBSで洗浄し、0.25%トリプシンで解離させ、前述のように25cm2プラスチックフラスコ上に播種した10。
- ブラシを1000 μLのピペットコーンに繰り返し通し、2 mLのMg 2+-およびCa2+フリーDPBSですすいで、細胞診ブラシから細胞を剥離します。500 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てる。
- ペレットを0.25%トリプシンに8〜12分間再懸濁し、細胞を解離させる。5 mLの増幅培地を加えて酵素反応を停止した。
- 500 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てる。ペレットを8mLの増幅培地に再懸濁し、25cm2のコラーゲンコーティングフラスコにシードする。37°Cおよび5%CO2で生育する。これはパッセージ 0 に対応します。
- 翌日、培地を5mLの新鮮な増幅培地と交換し、細胞の付着、形態(細胞は凝集した石畳の外観を有するべきである)、および数について毎日細胞を監視する。
注:初期播種密度は、鼻ブラッシングの質および上皮細胞の割合によって異なる。新たに単離されたHNE細胞は、通常、3〜10日以内に80%〜90%のコンフルエンシーに達する。遅い増殖速度は、サンプル中の不十分な上皮細胞を示唆するものであり、廃棄されるべきである。
4. ヒト鼻上皮細胞の増幅と継代
- コラーゲンコートフラスコ上で37°Cおよび5%CO2で増幅培地中でヒト鼻上皮細胞を80%〜90%コンフルエントになるまで増殖させ、48〜72時間ごとに培地を交換する。25 cm 2 フラスコの場合は、5 mL の増幅培地を使用し、75 cm2 フラスコの場合は 10 mL を使用します。
- 細胞が80%~90%のコンフルエントに達したら、10mLのMg2+-およびCa2+フリーDPBSで細胞を洗浄し、吸引し、廃棄する。
- 25 cm 2フラスコに1 mLの0.25 %トリプシンを加え(または75 cm 2フラスコに2 mLのトリプシンを加え)、インキュベーター(37°C、5% CO2)に8〜12分間戻します。
- フラスコを手のひらでしっかりと叩いて、細胞が剥離するのを助けます。
- 10 mLの増幅培地を加え、酵素反応を停止した。フラスコを激しくすすぎ、10mLピペットを使用してフラスコ表面上に増幅培地を引き上げて排出し、細胞をすすぎ、剥離する。
- 500 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てる。
- ペレットを5〜10mLの増幅培地に再懸濁する。
- 血球計数器を用いて細胞を計数する。
メモ: この時点で細胞を凍結できます (手順 5.1 ~ 5.3 を参照)。さらなる増幅が必要な場合は、コラーゲンコーティングフラスコに再シードします(25cm2フラスコを3つの75cm2フラスコに拡張することができますが、それ以上の希釈は推奨されません)。
5. 初代鼻上皮細胞の凍結保存
注:バイオバンキングの前に継代1までHNE細胞を増殖させ、解凍時に細胞増殖を促進するのに十分な細胞を得る。しかしながら、バイオバンキングは、最初の通路0または通路2で可能である。以下の凍結保存ステップは、すべての通路に適合しています。
- 細胞計数後、500 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てる
- ペレットを濃縮凍結培地に再懸濁し(表1)、mLあたりおよびクライオバイアルあたり3 x 106〜5 x 106個の細胞を得た。
- -80°Cの適切な凍結凍結容器中で毎分〜1°Cで温度を下げることによって細胞をゆっくりと凍結する。 翌日、保存した試料を長期保存のために窒素保存容器に移す(本研究は17ヶ月保存に制限されている)。
6. 凍結増幅HNE細胞の融解
- ウォーターバスを37°Cに温めます。 表1 に記載のように増幅培地を調製し、培地を37°Cに加温した。
- 窒素貯蔵タンクからクライオバイアルを取り出し、バイアル全体を水に浸さないように注意しながら、それらを水浴に素早く置きます。小さな凍った液滴だけが残っているときに、水浴からクライオバイアルを取り除きます。バイアルを70%のアルコールで拭き取り、乾拭き取り、フードの下に置きます。
- 1 mL ピペットを用いて、解凍した細胞を空の 15 mL チューブに移す。
- 滴下して、1mLの温かい増幅培地を加える。1分後、さらに1mLの増幅培地を加え、さらに1分間待ちます。
- 10mLの増幅培地を加え、500 x gで2分間遠心分離する。
- 上清を吸引して捨てる。細胞ペレットを、少なくとも1 x106 細胞/mLの細胞密度を達成するために必要な量の増幅培地に再懸濁する。
- 増幅培地を入れたコラーゲンコートフラスコに細胞を播種する。
- クライオビアルに4 x106個 以上の細胞が含まれている場合は、75 cm2 フラスコに10 mLの増幅培地でシードします。
- クライオビアルに含まれる細胞が4 x106 個未満の場合は、5 mLの増幅培地中で、25 cm 2 フラスコに細胞をシードします。
- 37°C、5%CO2 でインキュベートし、次の2〜3日間にわたる細胞増殖を目視で観察した。
- 次に、セクション4で詳述されているように細胞増幅を行う。
注:ステップ4.7で回収された細胞が少ない場合。(すなわち、膨張前の通路0で凍結する場合)、ステップ6.5。および 6.6.省略することができ、細胞は遠心分離なしで25cm2 コラーゲンコーティングフラスコに直接播種することができる。その後、ジメチルスルホキシド(DMSO)を除去するために翌日に培地を交換しなければならない。
7. 気液界面におけるヒト鼻上皮細胞の分化
注:HNEは、前述のように気液界面で分化した10。
- 0.33cm2 のコラーゲンコーティング多孔質フィルターに330,000細胞/フィルターの密度で細胞を播種し、頂端側に300 μLの増幅培地、側底側に900 μLの気液培地を補充する。
- 3日後、頂端培地を吸引し、気液培地中で3〜4週間気液界面で細胞を培養し、分化上皮を樹立した。48〜72時間ごとに基礎培地を交換してください。
8. CFTR変調器
- CFTRモジュレーターを含む空気 - 液体培地を調製する。VX-445、VX-661、およびVX-809を終濃度3μMで使用し、VX-770を100nMで使用してください。コレクタABBV-2222を終濃度1 μMで、ポテンショネータABBV-974を10 μMで使用してください。100% DMSOを使用して、すべてのCFTR変調器を溶解します。
- 補正器培地と同量の100%DMSOを含む気液培地を調製する。
- 気液界面で増殖した分極HNE細胞の側底側に薬物またはDMSOを含む培地を添加し、37°Cで5%CO2中で24 時間インキュベートする。
- 24時間後、培地を吸引・廃棄し、ステップ8.1~8.2のように調製した新鮮な培地と交換し、さらに37°Cで5%CO2中で24 時間インキュベートする。
9. 室内調査
- 前述のように、電圧クランプ条件下で短絡電流測定値(Isc)を測定します 9.
注:培養物の上皮経上皮電気抵抗(TEER)を箸電圧計で測定し、少なくとも200 Ω・cm2 に達した培養物のみを以下の実験で検討した。分極HNEセルのフィルタをUssingチャンバに取り付け、短絡電流測定(Isc)を電圧クランプ条件下で測定しました。
10. 免疫細胞化学
- 前述のように免疫検出を行う9.
注:CFTR免疫検出は、抗CFTR C末端(24-1)モノクローナル抗体を用いて1/100希釈で一晩行った。ゾナ-オクルーデン-1(ZO-1)(1/500希釈)、α-チューブリン(1/300希釈)、Muc 5AC(1/250希釈)およびサイトケラチン8(1/250希釈)染色を、追加のフィルターで行った。PBS-Triton-X100で0.1%洗浄した後、Alexa 488または594に結合させたヤギ二次抗体を10%ヤギ血清(1/1000希釈)に30分間添加した。最終洗浄後、フィルターを支持体から切断し、DAPIを含むベクタシールドマウント培地を装着した。共焦点顕微鏡(63x/1.4オイル微分干渉コントラストλブルーPL APO対物レンズ)を使用して画像をキャプチャし、ImageJソフトウェアで分析しました。
11. 統計分析
- 適切なソフトウェアを使用して統計分析を実行します。
注:統計分析は、S.A.Sソフトウェアを使用して実行しました。患者ごとおよび病態ごとに複数のHNEフィルターが得られたため、定量パラメータは患者ごとの中央値(SEM±)として表されました。比較(平均±SD)は、ウィルコクソン一致ペア符号付き順位検定または非対応t検定を用いて行った。
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Representative Results
気液界面で培養された新鮮なHNE細胞は、免疫染色によって評価されるように、分極および分化した呼吸器上皮の典型的な特徴を示す(図1)。HNE細胞は、繊毛化(陽性α-チューブリン染色)および非繊毛粘液産生杯細胞(陽性Muc5Ac免疫染色)からなる擬似重層化呼吸器上皮の in vivo 状況を模倣する上皮細胞の不均一な層(陽性ケラチン8免疫染色)に再分化する。全体的な上皮はタイトジャンクションを提示する(ZO-1、帯-オクルデン-1染色によって評価される)。強力な頂端CFTR染色は野生型(WT)HNE細胞で見られ、F508del/F508del HNEでは頂端表面と細胞質の両方でCFTR染色の減少が観察されます。
試料は、拡大に成功しただけでなく、気液界面で3週間後に擬似層状上皮に分化することに成功し、200 Ω・cm2を超えるTEERを提示し、短絡電流測定が可能になったため、肯定的な結果が得られたと考えました。短絡電流測定によるCFTR関連のCl- 分泌アッセイを行う専用ラボはごくわずかであるため、サンプルは病院から専用施設への輸送を必要とすることがよくあります。
78個の新鮮なHNE細胞サンプルにおいて、直ちに播種した鼻ブラッシングおよび室温のフラッシング培地中での輸送の1〜7日後に播種したブラッシングにおける成功率を比較した。サンプルの大部分(55%)をブラッシングの1日後に播種し、サンプルの82%を48時間以内に播種した。78サンプルすべてにおいて成功した培養の平均パーセンテージは82%であり、0日目から5日目の間に播種されたサンプルでは87%に達した(表2)。
新鮮および凍結融解条件の両方で区別された同一サンプルの成功率と失敗率を比較した。新鮮な条件下での分化に成功したサンプルの83%は、凍結保存されたサンプルでも成功しました。同様に、新鮮な条件での分化に失敗したサンプルでは、71%が凍結融解条件でも失敗しました (表2)。これらのデータはすべて、鼻ブラッシングの品質が文化を成功させるための重要な要素であることを示唆しています。
また、クライオバイアルあたりの最適な細胞数も決定したいと考えました。継代0で凍結したサンプルは、単一の25cm2から、一般に、フラスコ当たり1〜1.5 x106個の細胞に達することしか許さない。継代1で凍結したサンプルを3つの75cm2フラスコに増幅し、一般に10 x 106細胞に到達させ、したがって少なくとも3 x106細胞を含むいくつかのバイアルを凍結することを可能にする。このプロトコールに記載された培養条件では、クライオビアあたり2 x 106〜3 x 106細胞の間で凍結したサンプルの50%は解凍時に増殖に失敗し、クライオビアあたり2 x106細胞を下回ると80%に達した(表2)。
CFTR関連のCl-分泌はCFTR機能を反映しており、ウッシングチャンバーでの短絡電流(Isc)実験によって測定することができます。フォルスコリン(ΔIsc Forskolin)およびCFTR阻害剤inh172(ΔIscCFTRinh172)に応答したIsc変動は、CFTR補正剤有効性評価の主なエンドポイントである。
短絡電流実験は、新鮮なHNEについて、増幅培地中で拡大し、流路2でフィルター上に播種し、気液媒体中で3週間空気 - 液体界面で増殖させるか、または通路1で以前に凍結されていたHNEから濃縮凍結培地で、融解し、膨張させ、継代3で多孔質フィルター上に播種した。凍結保存期間は3ヶ月から16ヶ月の範囲であり、平均は9.8ヶ月であった。本研究で詳述した培養および凍結保存条件下では、異なる継代または新鮮または凍結融解したF508del/F508del HNE培養物間で増殖または形態の有意な変化は観察されなかった。
DMSO処理HNE細胞における平均ΔIscフォルスコリン(図2A)および平均ΔIscCFTRinh172(図2B)の両方について、新鮮または凍結融解HNEの間に有意差は観察されなかった。CFTRの機能的補正が凍結保存によって影響を受けたかどうかを評価するために、新鮮(n = 78患者由来のHNE細胞)または凍結融解HNE(n = 9患者由来のHNE細胞)のDMSO処理HNE細胞と比較して、VX-809 + VX-770処理細胞において平均Isc変化を測定した(図2)。凍結融解細胞および新鮮細胞の両方が、処理時に有意な補正を示し、ΔIscフォルスコリン(p<0.05)の有意な増加(図2A)およびΔIscCFTRinh172の有意な減少(p<0.05)(図2B)を示した。ΔIsc Forskolin (ΔIscForskolin VX-809 + VX-770/ΔIscForskolin DMSO) の平均倍増加は、凍結融解した HNE 細胞で 2.9 ± 1.6 に達し、新鮮な HNE 細胞のフォールド増加と有意に異ならなかった (2.5 ± 2.0)。同様に、ΔIsc CFTRinh172(ΔIscCFTRinh172 VX-809 + VX-770/ΔIscCFTRinh172 DMSO)の倍数の減少は凍結保存の影響を有意に受けなかった:凍結融解HNEでは1.49±0.9であったのに対し、新鮮なHNEでは2.5±3.7であった。
いくつかのモジュレーター療法の機能的矯正活性をさらに調査し、このHNE細胞モデルが異なる治療を区別できるかどうかを評価した。ここでの結果は、凍結保存によって処理に対する応答が有意に変化しなかったように、新鮮および凍結融解条件の両方からのHNE細胞を組み合わせる(図2)。
我々はまず、10人のF508del/F508del患者のHNE細胞において、VX-809(3μM)+ VX-770(100nM)またはVX-661(3μM)+VX-770(100nM)のいずれかによる48時間治療の後、Cl-輸送に対する2つの承認されたCFTRモジュレーター療法の矯正体応答を評価した(図3)。DMSO処理HNE細胞と比較して、ΔIscフォルスコリン(図3A)およびΔIscCFTRinh172(図3B)は、VX-809+VX-770およびVX-661+VX-770の両方によって有意に改善された。両方の治療は、CFTR関連Cl-分泌を同様のレベルに機能的に補正し、VX-809 + VX-770(p±0.001)で1.75 <1.39、VX-661 + VX-770(p± 0.01)で0.97 <0.93の有意な平均倍増加を示した。平均ΔIsc CFTRinh172倍の減少は、VX-809 + VX-770(p±0.001)について1.79<2.04であり、VX-661 + VX-770の平均ΔIscCFTRinh172倍減少の1.16±1.44(p<0.001対DMSO)と有意に異ならなかった。
6人のF508del/F508del患者(図4)からのHNEにおける3つの異なるCFTRモジュレーター療法がさらに比較された。ここでの結果は、新鮮および凍結融解条件の両方からのHNE細胞を組み合わせたものである。頂点およびアッビーCFTR変調器の両方を、CFTR補正器およびCFTRポテンショネータの組み合わせとして用いた場合、ΔIscフォルスコリン(図4A)およびΔIscCFTRinh172(図4B)を同様の程度に補正した。VX-809+VX-770によって図3で観察された部分補正は、これらのHNE細胞において、2.87±1.67(p<0.05)の平均ΔIscフォルスコリン倍増加で確認された。ABBV-2222(1μM)+ ABBV-974(10μM)治療は、ΔIscフォルスコリンに対するVX-809 + VX-770補正の91%を表す同様の補正を誘導した(平均ΔIscフォルスコリンフォールド増加は2.6 ± 1.4、p < 0.05 vs. DMSO)およびVX-809 + VX-770の85%はΔIsc CFTRinh172(平均ΔIscCFTRinh172倍減少は4.2 ± 5.7、p<0.05 vs. DMSO)である。
興味深いことに、HNEをVX-445(3μM)+VX-661(3μM)+VX-770(100nM)のトリプルコンビネーションで処理した場合、補正有効性は有意に改善され、VX-809 + VX-770の312%に達し、ΔIscフォルスコリン補正(平均ΔIscフォルスコリンフォールド増加9.0±4.1、p<0.05対VX-809+VX-770)およびΔIsc CFTRinh172の372%(平均ΔIscCFTRinh172倍減少15.5±10.5、 p < 0.05 vs. VX-809 + VX-770)。
図1:HNE培養における分化マーカー。 野生型(WT)(第1パネル)およびF508del(パネル2−4)におけるCFTR(緑色)、ゾナ−オクルーデンス−1(ZO−1、赤色)、α−チューブリン(緑色)、Muc5AC(赤色)およびサイトケラチン8(K8、緑色)の免疫蛍光染色の代表的な共焦点顕微鏡像は、気液界面で3週間増殖させた。核はDAPIで青色に染色された。共焦点顕微鏡画像の投影は、3次元(3D)Zスタックの上面図(上パネル)および側面図(下パネル)再構成する。スケールバー(20 μm)は、上部パネルと下部パネルの両方に適用されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:HNE細胞におけるCFTR関連Cl-分泌に対する凍結融解の効果。 F508del/F508del患者由来のHNE培養物における短絡電流(Isc)記録(平均±SD)の要約で、気液界面で3週間増殖させた。細胞を、新鮮な(ライトグレー、78人の患者由来の患者由来HNE細胞)または凍結融解(濃い灰色、9人の患者由来の患者由来HNE細胞)中で、ビヒクル単独(DMSO)またはVX-809(3μM)+VX-770(100nM)で48時間処理した。データは、急性添加された(A)フォルスコリン(10μM)/3−イソブチル−1−メチルキサンチン(IBMX、100μM)、ΔIscフォルスコリンまたは(B)CFTR阻害剤inh172(5μM)ΔIscCFTRinh172に対する平均(±SD)応答を表す。患者および状態ごとに少なくとも2つのフィルターが分析された。アスタリスクは、補正器と対照(DMSO処理)*p<0.05(不対応t検定)の間の統計的差を示す。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:二重療法によるCFTR機能の補正 10人のF508del/F508del患者由来のHNE培養物における短絡電流(Isc)記録(平均±SD)の要約(生液と凍結融解培養の両方から得られた結果)。細胞をビヒクル単独(DMSO)で48時間処理した;VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 nM) または VX-661 (3μM) + VX-770 (100 nM)。データは、急性添加された(A)フォルスコリン(10μM)/IBMX(100μM)、ΔIscフォルスコリン または(B)CFTR阻害剤inh172(5μM)、ΔIscCFTRinh172に対する平均(±SD)応答を表す。患者および状態ごとに少なくとも2つのフィルターが分析された。アスタリスクは、補正器と対照(DMSO処理)との間の統計的差を示す** p < 0.01、*** p < 0.001、**** p < 0.0001(ウィルコクソン一致ペア符号付きランク検定)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:CFTR補正における三重療法と二重療法の効率 6人のF508del/F508del患者由来のHNE培養物における短絡電流(Isc)記録(平均±SD)の要約(新鮮細胞と凍結融解細胞の両方からの複合結果)。細胞をビヒクル単独(DMSO)で48時間処理した;VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 nM);ABBV-2222 (1 μM) + ABBV-974 (10 μM);またはVX-661(3 μM)+ VX-445(3 μM)+ VX-770(100 nM)です。データは、急性添加された(A)フォルスコリン(10μM)/IBMX(100μM)、ΔIscフォルスコリン または(B)CFTR阻害剤inh172(5μM)、ΔIscCFTRinh172に対する平均(±SD)応答を表す。患者および状態ごとに少なくとも2つのフィルターが分析された。アスタリスクは、治療間の統計的差を示す。* p < 0.05 (ウィルコクソンが一致したペアの符号付き順位検定)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| メディアコンポーネント | 最終濃度 |
| 増幅培地 | |
| 高度なDMEM/F-12栄養素混合物 | 86% |
| ウシ胎児血清 | 10% |
| ペニシリン | 100 U/mL |
| ストレプトマイシン | 100 μg/mL |
| タゾシリン | 10 μg/mL |
| アムホテリシンB | 2.5 μg/mL |
| コリマイシン | 16 μg/mL |
| シプロフロキサシン | 3 μg/mL |
| ヒドロコルチゾン | 0.2 μM |
| インスリン | 5 μg/mL |
| エピネフリン | 0.5 μg/mL |
| ティッカー | 10 ng/mL |
| Y-27632(Rho関連キナーゼ阻害剤) | 10 μM |
| 空気 - 液体媒体 | |
| 高度なDMEM/F-12栄養素混合物 | 94% |
| ウルトローザーG | 2% |
| ペニシリン | 100 U/mL |
| ストレプトマイシン | 100 μg/mL |
| タゾシリン | 10 μg/mL |
| アムホテリシンB | 2.5 μg/mL |
| コリマイシン | 16 μg/mL |
| 濃縮凍結培地 | |
| F12栄養素混合物 | 77% |
| ヘーペス | 3% |
| ウシ胎児血清 | 10% |
| ティッカー | 10% |
表1:増幅、空気−液体、および濃縮凍結培地組成物。 試薬および対応する最終濃度のリスト。
| 播種前の鼻ブラッシングの保存期間(n=78) | |
| 種まきまでの日数 | 成功率(%) |
| 0 | 83 |
| 1 | 84 |
| 2 | 67 |
| 3 | 100 |
| 4 | 89 |
| 5 | 100 |
| 7 | 0 |
| 新鮮および凍結融解条件の両方で成長した同じ初期鼻ブラッシングからの転帰(n = 13) | |
| 新鮮な条件での成果 | 凍結融解時の成功率(%) |
| 成功 | 83 |
| 失敗 | 29 |
| 成功率に対するセル数の影響 (n = 36) | |
| クライオビアあたりの細胞数 | 凍結融解時の成功率(%) |
| <2 × 106 | 20 |
| 2–3 x 106 | 50 |
| 3–4 x 106 | 67 |
| >4 × 106 | 79 |
表2:新鮮および凍結融解HNE細胞培養における成功率に影響を与えるパラメータ。 成功率は、気液界面で3週間後に擬似層状上皮に正常に拡大および分化し、200 Ω・cm2を超えるTEERを提示した鼻ブラッシングとして定義した。播種前に、サンプルを抗生物質を含むフラッシング培地中で室温で出荷した。結果は、78の新鮮なサンプルと36の凍結解凍サンプルからのデータを表します。13の鼻ブラッシングを、新鮮および凍結融解の両方の条件下で分析した。
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Discussion
個別化医療の文脈でCFTR活性を測定するためのヒト気管支上皮(HBE)細胞の代理として患者由来の鼻上皮細胞を使用することが、HNEが培養物9、11における細胞の特性を再現することとして提案されている。HBE細胞培養に対するHNEの強力な利点は、それらが簡単かつ非侵襲的にサンプリングされることです。HNE細胞培養における短絡電流測定は、上皮を横切るCFTR依存性Cl− 輸送の評価を可能にし、これは、様々な遺伝子型を有する患者の鼻電位差によって評価されるCFTR インビボ 活性と有意に相関することが示された9。VX−809処置時のHNE細胞におけるCFTR活性のレスキューはまた、ルマカフトル−イバカフトル処置F508delホモ接合型患者における臨床転帰FEV1 の改善にも有意に相関した12。
重要なことに、この研究は、新しく採取されたHNE細胞が、輸送および標準的な出荷条件(すなわち、室温で72時間生存する)に容易に耐え、様々な地理的位置に由来する患者の細胞の試験を可能にすることを示している。培養を成功させるための重要な要素は、主に鼻ブラッシングの質とサンプリング時の生細胞の数です。HNE細胞培養物の増殖および分化に関する多くのプロトコールが公開されている。拡張フェーズ中に条件付きリプログラミングを行わないものもあり、13、14、15、16、17、18、19、20、フィーダ9、11、12、21、22、23、24、25で条件付きリプログラミングを行うものもある。、26またはフィーダーフリーの5、8、27、28、29の条件、および7、8のいくつかの異なる方法を比較する。それらはすべて、正しい分化および分極ならびに良好なTEER値を有する比較的多数のALI培養物を得ることを可能にする。この研究と同様に、多くは継代1で凍結した凍結保存HNE細胞13、28を使用した。興味深いことに、何人かの著者は、ROCKiを融解後培養培地に添加すると凍結保存後の生存率を改善し、付着したままの細胞数を5,29個増加させることができると報告しており、この研究で用いた増幅培地が凍結保存に特に適していることを示唆している。
ここで、この研究は、HNE細胞が首尾よくバイオバンク化され得ることを示しており、重要な要因は再び鼻ブラッシングの品質である。新鮮なサンプルと凍結融解したサンプルの結果との間に良好な相関関係が示されており、さらなる研究のためにバイオバンクされるHNE細胞の品質を最適化するために、正しいALI分化および許容可能なTEER値を達成できない場合、新鮮なサンプルに対して予備研究を行うことができることが示唆されている。2回目の鼻ブラッシングは、悪い結果になる可能性が高い細胞を凍結するよりも好ましいであろう。凍結保存のための第2の重要な要素は細胞数である。本試験で用いた培養条件では、クライオバイアルあたり凍結が2 x106 個未満の場合、故障率は非常に高い。クライオビアルあたり少なくとも3 x106 個の細胞を凍結することが推奨される。
この研究の結果は、凍結融解がHNE細胞の電気生理学的特性またはCFTRモジュレーターに対する応答を有意に変化させないことを示唆している。凍結せずにまたは融解後に得られた同じF508delホモ接合型患者からのHNE細胞培養における測定の範囲は、VX-809+VX-770処理時に異ならなかった。同様の結果は、フォルスコリン刺激Iscが非処理F508del細胞30のいくつかの解凍/培養サイクル後に安定であったHBE細胞について以前に報告された。これは、HNE細胞を凍結してバイオバンクに保存し、後で研究することができるという証拠を提供する。
ますます多くの研究が、HNE細胞培養物が個別化医療の文脈における異なる治療法の有効性をテストするために使用できることを示している。この解析は、補正器と増強剤を組み合わせた二重療法が、すべてF508delホモ接合型HNE細胞におけるCFTR依存性Cl-分泌に対して同等の補正有効性を有することを示した。しかし、重要な患者間変動性が認められ、公表された結果9、12、20、25が確認された。対照的に、VX-445 + VX-661 + VX-770は、VX-809 + VX-770と比較してCFTR活性の補正を3倍にした。三重併用時のHNE細胞におけるF508del-CFTRの同様のレベルの補正もLaselvaらによって観察された28。Veit et al.26によって報告されたように、VX-445 + VX-661 + VX-770処理時のCl-チャネル機能の補正はさらに高く、平均WT-CFTR活性の62%に達した(補正済みF508del-HNEでは19-36μA/cm2、WT-HNEでは14-50μA/cm2の範囲)26。
HNE細胞培養物はまた、他のクラスII変異に対するCFTRモジュレーターの有効性を試験するのにも役立った。VX-445 + VX-661 + VX-770に対するCFTR活性の重要な改善は、G85E/G85E、V520F/1717-1G>A、Y569/Y569D、M1101K/M1101K、およびN1303K/N1303K遺伝子型を保有するHNE ALI培養物において観察された26。同様に、Laselvaら28 は、M1101KおよびN1303K変異を有するCFTRの有意な補正を示したが、G85E HNE細胞において有意な補正は示さなかった。ガラパゴス/AbbVie補正因子を、これらのルマカフトル・イバカフトル耐性変異体31について評価した。AbbVie矯正器AC2-1および特にバイコレクタAC1+AC2-1は、M1101KおよびG85E HNE細胞におけるCl- 分泌を効果的に改善したが、N1303K由来細胞はAC1+AC2-2の組み合わせによって補正された。
HNE細胞におけるCFTR活性の測定値は、試験された治療に対する患者の応答を予測する有望な前臨床バイオマーカーである。凍結融解サイクルが矯正レベルを変化させないという証拠は、これらの細胞がバイオバンク化され、個別化医療プログラムの文脈で強力なツールとして使用できるという証拠を提供する。したがって、ユニークな鼻ブラッシングは、薬物の有効性を比較するのに十分な材料を可能にし、患者のHNE細胞は、患者を再サンプリングする必要なしに新薬が利用可能になったときに解凍することができる。これは乳児にとって特に興味深いことです。
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Disclosures
著者らは、この出版物または科学ビデオ制作に関連する競合する金銭的利益を報告していない。
Acknowledgments
私たちは、研究に参加してくれたすべての患者とその家族に暖かく感謝します。この研究は、フランス・ヴァンクレ・ラ・ムコビシドース協会からの助成金によって支援されました。フランス協会ABCF 2およびVertex Pharmaceuticals Innovation Awards。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABBV-2222 | Selleckchem | S8535 | |
| ABBV-974 | Selleckchem | S8698 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies | 12634010 | |
| Alexa 488 goat secondary antibody | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa 594 goat secondary antibody | Invitrogen | A11012 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290026 | |
| Anti-alpha-tubulin antibody | Abcam | ab80779 | |
| Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1) | R&D Systems | MAB25031 | |
| Anti-cytokeratin 8 antibody | Progen | 61038 | |
| Anti-Muc5AC antibody | Santa Cruz Biotech | sc-20118 | |
| Anti-ZO-1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-10804 | |
| Ciprofloxacin | provided by Necker Hospital Pharmacy | ||
| Colimycin | Sanofi | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Collagen type IV | Sigma-Aldrich Merck | C-7521 | |
| cytology brush | Laboratory GYNEAS | 02.104 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich Merck | D2650 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Epinephrin | Sigma-Aldrich Merck | E4375 | |
| F12-Nutrient Mixture | Life Technologies | 11765054 | |
| FBS | Life Technologies | 10270106 | |
| Ferticult | Fertipro NV | FLUSH020 | |
| Flasks 25 | Thermo Scientific | 156.367 | |
| Flasks 75 | Thermo Scientific | 156.499 | |
| Glacial acetic acid | VWR | 20104.298 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich Merck | H3375 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich Merck | SLCJ0893 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich Merck | I0516 | |
| Mg2+ and Ca2+-free DPBS | Life Technologies | 14190094 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140130 | |
| Tazocillin | Mylan | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Transwell Filters | Sigma-Aldrich Merck | CLS3470-48EA | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich Merck | T8787 | |
| Trypsin 0,25% | Life Technologies | 25200056 | |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| VX-445 | Selleckchem | S8851 | |
| VX-661 | Selleckchem | S7059 | |
| VX-770 | Selleckchem | S1144 | |
| VX-809 | Selleckchem | S1565 | |
| Xylocaine naphazoline 5% | Aspen France | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
References
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