Summary
Aquí describimos el aislamiento, la amplificación y la diferenciación de las células epiteliales nasales humanas primarias (HNE) en la interfaz aire-líquido y un protocolo de biobanco que permite congelar con éxito y luego descongelar la HNE amplificada. El protocolo analiza las propiedades electrofisiológicas de las células HNE diferenciadas y la corrección de la secreción de cloruro relacionada con CFTR en diferentes tratamientos moduladores.
Abstract
Las células epiteliales nasales humanas (HNE) son fáciles de recolectar mediante un cepillado nasal simple y no invasivo. Las células HNE primarias derivadas del paciente se pueden amplificar y diferenciar en un epitelio pseudoestratificado en condiciones de interfaz aire-líquido para cuantificar el transporte cíclico de cloruro (Cl-) mediado por AMP como un índice de la función reguladora de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR). Si los pasos críticos, como la calidad del cepillado nasal y la densidad celular tras la criopreservación, se pueden realizar de manera eficiente, las células HNE se pueden biobancar con éxito. Además, los estudios de corriente de cortocircuito demuestran que la congelación-descongelación no modifica significativamente las propiedades electrofisiológicas de las células HNE y la respuesta a los moduladores CFTR. En las condiciones de cultivo utilizadas en este estudio, cuando se congelan menos de 2 x 106 células por criovial, la tasa de fracaso es muy alta. Recomendamos congelar al menos 3 x 106 células por criovial. Demostramos que las terapias duales que combinan un corrector CFTR con un potenciador CFTR tienen una eficacia de corrección comparable para la actividad CFTR en células HNE F508del-homocigotas. La terapia triple VX-445 + VX-661 + VX-770 aumentó significativamente la corrección de la actividad de CFTR en comparación con la terapia dual VX-809 + VX-770. La medida de la actividad de CFTR en células HNE es un biomarcador preclínico prometedor útil para guiar la terapia con moduladores de CFTR.
Introduction
La fibrosis quística (FQ) es un trastorno autosómico recesivo resultante de mutaciones en el gen regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) que conduce a la ausencia o disfunción de la proteína CFTR, un canal aniónico situado en la superficie apical de los epitelios 1,2. Los recientes avances en la terapia CFTR han mejorado el pronóstico de la enfermedad, y los últimos fármacos aprobados que combinan correctores CFTR y potenciadores CFTR condujeron a mejoras importantes en la función pulmonar y la calidad de vida de los pacientes con FQ portadores de la mutación p.Phe508del más frecuente (F508del)3,4. A pesar de este prometedor progreso terapéutico, alrededor del 10% de los pacientes con FQ no son elegibles ya que portan mutaciones que no son rescatables por estos moduladores CFTR. Para estos pacientes, existe la necesidad de probar otros medicamentos o combinaciones de medicamentos para encontrar la combinación más eficiente para mutaciones específicas, destacando la importancia de las terapias personalizadas.
Las células epiteliales nasales humanas (HNE) son fáciles de recolectar mediante un cepillado nasal simple y no invasivo y permiten cuantificar el transporte cíclico de cloruro mediado por AMP (Cl−) como un índice de la función CFTR. Las células HNE producen un modelo preciso de las vías respiratorias humanas, pero su vida útil es limitada en cultivo. Gracias a la optimización de las técnicas de cultivo, las células HNE primarias derivadas del paciente pueden reprogramarse condicionalmente con inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCKi), amplificarse y diferenciarse en un epitelio pseudoestratificado en condiciones de interfaz aire-líquido (ALI) en filtros microporosos 5,6. Existen numerosos protocolos de cultivo para el cultivo de HNE (disponibles comercialmente, sin suero, "caseros", cocultivos con células alimentadoras, etc.), y se ha descrito que la elección de los medios y las condiciones de cultivo afectan el crecimiento, la diferenciación de la población celular y la función epitelial 7,8. El protocolo aquí presenta un método de amplificación ROCKi simplificado, libre de alimentación, que permite obtener con éxito un gran número de células HNE que luego se diferencian en ALI para ensayos de función CFTR.
Hemos demostrado que, en células HNE diferenciadas, un tratamiento de 48 h con moduladores CFTR es suficiente para inducir la corrección electrofisiológica de la corriente Cl dependiente de CFTR y que la corrección observada in vitro puede estar correlacionada con la mejoría clínica del paciente9. Las células HNE, por lo tanto, representan un modelo apropiado no solo para la investigación fundamental de la FQ, sino también para estudios preclínicos con pruebas de modulador CFTR específicas del paciente. En este contexto de terapia personalizada, el objetivo del protocolo fue validar que las células HNE criopreservadas de pacientes con FQ, cultivadas en nuestras condiciones, eran un modelo apropiado para los estudios de corrección de CFTR, y se podían esperar resultados similares al comparar el transporte de Cl- dependiente de CFTR de células frescas y congeladas-descongeladas. El estudio también evaluó la eficacia de diferentes moduladores CFTR cuando se utilizan terapias duales y triples.
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Protocol
Todos los experimentos se realizaron siguiendo las directrices y regulaciones descritas por la Declaración de Helsinki y la ley Huriet-Serusclat sobre ética de la investigación humana.
1. Preparación de matraces y diferentes soportes
- Preparar la amplificación, el aire-líquido y el medio de congelación como se describe en la Tabla 1.
- Prepare una solución madre de colágeno iv humano disolviendo 50 mg de colágeno en 100 ml de ácido acético glacial al 0,2%. Mezcle en un agitador magnético durante al menos 1 h y esterilice el filtro la solución. Conservar a 4 °C durante un máximo de 6 meses en una botella de vidrio, protegida de la luz.
- Prepare una solución de trabajo de colágeno IV diluyendo la solución madre 1: 5 en agua doble destilada. Conservar a 4 °C durante un máximo de 6 meses.
- Cubra los matraces de cultivo celular de plástico o los filtros transwell con la solución de trabajo de colágeno. Distribuya uniformemente 100 μL para 0,33 cm2 filtros transwell, 500 μL paramatraces 2 cm 2 y 1 mL para matraces2 cm 75 cm en toda la superficie de crecimiento del matraz.
NOTA: Esto se puede lograr inclinando suavemente el matraz de lado a lado. Alternativamente, para facilitar el recubrimiento de los matraces, se puede utilizar un mayor volumen, y cuando toda la superficie está cubierta uniformemente, se aspira la solución de colágeno para dejar solo el volumen indicado. La solución de colágeno aspirado se puede usar inmediatamente para recubrir el siguiente matraz (es decir, para tres matraces de 75 cm2 , distribuir 3 ml de solución de colágeno uniformemente en el primer matraz, aspirar 2 ml, que luego se usan para el siguiente matraz, y así sucesivamente). - Deje los matraces de cultivo celular en la incubadora durante un mínimo de 2 h o durante la noche. Aspire el colágeno a fondo y deje que los matraces se sequen en la incubadora o debajo del capó durante un mínimo de 20 minutos o durante la noche.
- Lavar con 10 ml de DPBS libres de Mg2+- y Ca2+, dejar secar en la incubadora y almacenar en papel de aluminio para proteger de la luz. Guarde los matraces durante un máximo de 6 meses a temperatura ambiente (RT).
2. Cepillado nasal
NOTA: Asegúrese de que el cepillado nasal se realiza mientras el participante no tiene una infección aguda. Si los pacientes con FQ presentan una infección pulmonar, consulte el antibiograma del paciente y agregue antibióticos adicionales al medio de amplificación. Las células epiteliales nasales humanas se recolectaron mediante cepillado nasal de pacientes con F508del/F508del como se describió anteriormente9.
- Pida al paciente que se suene la nariz, luego anestesia tópicamente la mucosa de ambas fosas nasales utilizando mallas de algodón empapadas en xilocaína al 5% con solución de nafazolina.
- Cepille suavemente la pared medial y el cornete inferior de ambas fosas nasales con un cepillo de citología. Remoje el cepillo en un tubo de 15 ml con 2 ml de medio de lavado disponible comercialmente; agitar suavemente para separar las células. Repita el cepillado en la segunda fosa nasal.
- Añadir los siguientes antibióticos al medio de lavado: Penicilina (100 U/mL), Estreptomicina (100 μg/mL), Tazocilina (10 μg/mL), Anfotericina B (2,5 μg/mL) y Colimicina (16 μg/mL).
NOTA: Los cepillados nasales se pueden enviar en RT a laboratorios dedicados para la expansión y el cultivo y se pueden sembrar hasta 72 h después del cepillado.
3. Aislamiento de HNE
NOTA: Las HNE se aislaron del cepillo de citología, se lavaron con DPBS libres de Mg 2+ y Ca2+, se disociaron con tripsina al 0,25% y se sembraron en un matraz de plástico de 25 cm2 como se describió anteriormente10.
- Separe las células del cepillo de citología pasando repetidamente el cepillo a través de un cono de pipeta de 1000 μL y enjuagando con2 ml de DPBS libre de Mg2+ y Ca 2+. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
- Resuspend el pellet en tripsina al 0,25% durante 8-12 min para disociar las células. Detenga la reacción enzimática agregando 5 ml del medio de amplificación.
- Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en 8 ml del medio de amplificación y sembrar en un matraz recubierto de colágenode 25 cm 2 . Crecer a 37 °C y 5% CO2. Esto corresponde al pasaje 0.
- Al día siguiente, reemplace el medio con 5 ml de medio de amplificación fresco y monitoree las células diariamente para la unión, la morfología (las células deben tener una apariencia de adoquín cohesivo) y el número.
NOTA: La densidad de siembra inicial varía dependiendo de la calidad del cepillado nasal y la proporción de células epiteliales. Las células HNE recién aisladas generalmente alcanzan una confluencia del 80% al 90% en 3-10 días. Una tasa de crecimiento más lenta sugiere insuficiencia de células epiteliales en la muestra y debe descartarse.
4. Amplificación y paso a través de células epiteliales nasales humanas
- Cultivar células epiteliales nasales humanas en el medio de amplificación a 37 °C y 5% de CO2 en matraces recubiertos de colágeno hasta una confluencia del 80%-90%, cambiando de medio cada 48-72 h. Para matracesde 25 cm 2 , utilice 5 ml de medio de amplificación y 10 ml para matraces de75 cm 2 .
- Cuando las células alcancen una confluencia del 80% -90%, lave las células con 10 ml de DPBS libre de Mg 2+ y Ca2+, aspire y descarte.
- Añadir 1 ml de tripsina al 0,25% para un matraz de 25 cm2 (o 2 ml de tripsina para un matraz de 75 cm2 ) y volver a la incubadora (37 °C, 5% CO2) durante 8-12 min.
- Golpee el matraz con firmeza, con la palma de la mano, para ayudar a que las células se desprendan.
- Añadir 10 ml del medio de amplificación para detener la reacción enzimática. Enjuague vigorosamente el matraz, utilizando la pipeta de 10 ml para extraer y expulsar el medio de amplificación sobre la superficie del matraz para enjuagar y separar las células.
- Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
- Resuspend el pellet en 5-10 mL del medio de amplificación.
- Cuente las células usando un hemocitómetro.
NOTA: Las celdas se pueden congelar en este punto (consulte los pasos 5.1-5.3). Si se requiere una amplificación adicional, vuelva a sembrar en matraces recubiertos de colágeno (un matrazde 25 cm 2 se puede expandir en tres matraces de 75 cm2 , no se recomienda una mayor dilución).
5. Criopreservación de células epiteliales nasales primarias
NOTA: Cultive células HNE hasta el paso 1 antes del biobanco para obtener suficientes células para facilitar el crecimiento celular cuando se descongelan. Sin embargo, la biobanca es posible en el pasaje inicial 0 o en el pasaje 2. Los siguientes pasos de criopreservación se adaptan a todos los pasajes.
- Después del recuento celular, centrífuga a 500 x g durante 5 min a 4 °C y deseche el sobrenadante
- Resuspendir el pellet en el medio de congelación enriquecido (Tabla 1) para obtener 3 x 106-5 x 106 células por ml y por criovial.
- Congele lentamente las células reduciendo la temperatura a ~ 1 ° C por minuto en un recipiente de criocongelación apropiado a -80 ° C. Al día siguiente, mueva la muestra preservada a un contenedor de almacenamiento de nitrógeno para su almacenamiento a largo plazo (el presente estudio está limitado a 17 meses de almacenamiento).
6. Descongelación de células HNE amplificadas congeladas
- Calentar el baño de agua a 37 °C. Preparar el medio de amplificación como se describe en la Tabla 1 y calentar el medio a 37 °C.
- Retire los crioviales del tanque de almacenamiento de nitrógeno y colóquelos rápidamente en el baño de agua, teniendo cuidado de no sumergir todo el vial en el agua. Retire los crioviales del baño de agua cuando solo quede una pequeña gota congelada. Limpie el vial con alcohol al 70%, seque y colóquelo debajo del capó.
- Usando una pipeta de 1 ml, transfiera las celdas descongeladas a un tubo vacío de 15 ml.
- De manera superficial, agregue 1 ml de medio de amplificación caliente. Después de 1 minuto, agregue otro medio de amplificación de 1 ml y espere un minuto adicional.
- Añadir 10 ml del medio de amplificación y centrífuga durante 2 min a 500 x g.
- Aspirar y desechar el sobrenadante. Resuspender el pellet celular en un volumen de medio de amplificación necesario para lograr una densidad celular de al menos 1 x 106 células/ml.
- Sembra las células en un matraz recubierto de colágeno que contenga el medio de amplificación.
- Si el criovial contiene más de 4 x 106 células, sembrar en un matraz de 75 cm2 , en 10 mL del medio de amplificación
- Si criovial contiene menos de 4 x 106 células, células de semilla en un matraz de25 cm 2 , en 5 ml del medio de amplificación
- Incubar a 37 °C, 5% de CO2, y observar visualmente la expansión celular durante los próximos 2-3 días.
- A continuación, realice la amplificación celular como se detalla en la sección 4.
NOTA: Si se cosecharon pocas células en el paso 4.7. (es decir, si se congela en el pasaje 0 antes de la expansión), pasos 6.5. y 6.6. se puede omitir, y las células se pueden sembrar directamente en un matraz recubierto de colágenode 25 cm 2 sin centrifugación. El medio debe cambiarse al día siguiente para eliminar el dimetilsulfóxido (DMSO).
7. Diferenciación de las células epiteliales nasales humanas en la interfaz aire-líquido
NOTA: Las HNE se diferenciaron en la interfaz aire-líquido como se describió anteriormente10.
- Sembrar las células a una densidad de 330.000 células/filtro en filtros porosos recubiertos de colágeno de 0,33 cm2 y complementar con 300 μL del medio de amplificación en el lado apical y 900 μL del medio aire-líquido en el lado basolateral.
- Después de 3 días, aspire el medio apical y cultive las células en la interfaz aire-líquido durante 3-4 semanas en el medio aire-líquido para establecer un epitelio diferenciado. Cambiar el medio basal cada 48-72 h.
8. Moduladores CFTR
- Preparar medio aire-líquido que contenga moduladores CFTR. Utilice VX-445, VX-661 y VX-809 a una concentración final de 3 μM y VX-770 a 100 nM. Utilice el corrector ABBV-2222 a 1 μM de concentración final y el potenciador ABBV-974 a 10 μM. Utilice 100% DMSO para disolver todos los moduladores CFTR.
- Preparar medio aire-líquido que contenga la misma cantidad de 100% DMSO que en el medio corrector.
- Agregue el medio que contiene medicamentos o DMSO al lado basolateral de las células HNE polarizadas cultivadas en una interfaz aire-líquido e incube durante 24 h en 5% de CO2 a 37 ° C.
- Después de 24 h, aspire y deseche el medio y reemplácelo con medio fresco preparado como en los pasos 8.1-8.2., e incube aún más durante un período de 24 h en 5% de CO2 a 37 ° C.
9. Estudios de la cámara de Ussing
- Mida las mediciones de corriente de cortocircuito (Isc) en condiciones de abrazadera de voltaje como se describió anteriormente9.
NOTA: La resistencia eléctrica transepitelial (TEER) de los cultivos se midió con un voltímetro de palillo, y solo se consideraron cultivos que alcanzaran al menos 200 Ω·cm2 para los siguientes experimentos. Los filtros de las celdas HNE polarizadas se montaron en las cámaras de Ussing, y las mediciones de corriente de cortocircuito (Isc) se midieron en condiciones de abrazadera de voltaje.
10. Inmunocitoquímica
- Realizar la inmunodetección como se describió anteriormente9.
NOTA: La inmunodetección de CFTR se realizó utilizando el anticuerpo monoclonal anti-CFTR C-terminal (24-1) durante la noche a una dilución de 1/100. La tinción de zona-ocludens-1 (ZO-1) (dilución 1/500), alfa-tubulina (dilución 1/300), Muc 5AC (dilución 1/250) y citoqueratina 8 (dilución 1/250) en filtros adicionales. Después del lavado con PBS-Triton-X100 0.1%, se agregaron anticuerpos secundarios de cabra conjugados a Alexa 488 o 594 durante 30 min en suero de cabra al 10% (dilución de 1/1000). Después de un lavado final, los filtros se cortaron del soporte y se montaron con el medio de montaje Vectashield que contenía DAPI. Se utilizó un microscopio confocal (contraste de interferencia diferencial de aceite 63x/1.4 λ objetivo azul PL APO) para capturar imágenes, que se analizaron con el software ImageJ.
11. Análisis estadístico
- Realizar análisis estadísticos utilizando el software adecuado.
NOTA: El análisis estadístico se realizó utilizando el software S.A.S. Como se obtuvieron varios filtros HNE por paciente y por condición, los parámetros cuantitativos se expresaron como valores medios (± SEM) por paciente. Las comparaciones (media ± de SD) se llevaron a cabo utilizando la prueba de rango firmado de pares emparejados de Wilcoxon o la prueba t no emparejada.
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Representative Results
Las células HNE frescas cultivadas en la interfaz aire-líquido muestran características típicas del epitelio respiratorio polarizado y diferenciado evaluado por inmunotinción (Figura 1). Las células HNE se vuelven a diferenciar en una capa heterogénea de células epiteliales (inmunotinción positiva de queratina 8) que imitan la situación in vivo de un epitelio respiratorio pseudoestratificado compuesto por células caliciformes productoras de moco ciliadas (tinción positiva de alfa-tubulina) y no ciliadas (inmunotinción positiva de Muc5Ac). El epitelio global presenta uniones estrechas (evaluadas por ZO-1, tinción zona-ocludens-1). La tinción apical fuerte de CFTR es visible en las células HNE de tipo salvaje (WT), y se observa una disminución de la tinción de CFTR tanto en la superficie apical como en el citoplasma en F508del / F508del HNE.
Se consideraron resultados positivos como muestras que no solo se expandieron con éxito, sino que también se diferenciaron con éxito en un epitelio pseudoestratificado después de 3 semanas en la interfaz aire-líquido y presentaron un TEER superior a 200 Ω·cm2, lo que permitió mediciones de corriente de cortocircuito. Como solo unos pocos laboratorios dedicados realizan ensayos de secreción de Cl relacionados con CFTR mediante mediciones de corriente de cortocircuito, las muestras a menudo requieren transporte desde hospitales a instalaciones dedicadas.
En las 78 muestras de células HNE frescas, se compararon las tasas de éxito en los cepillados nasales sembrados inmediatamente y en los cepillados sembrados después de 1-7 días de transporte en medio de lavado a temperatura ambiente. La mayoría de las muestras (55%) se sembraron 1 día después del cepillado, y el 82% de las muestras se sembraron dentro de las 48 h. El porcentaje medio de cultivos exitosos en las 78 muestras fue del 82% y alcanzó el 87% en las muestras sembradas entre el día 0 y el día 5 (Tabla 2).
Se compararon las tasas de éxito y fracaso para muestras idénticas diferenciadas tanto en condiciones frescas como congeladas y descongeladas. El 83% de las muestras que se diferenciaron con éxito en condiciones frescas también tuvieron éxito en muestras criopreservadas. Asimismo, en muestras que no lograron diferenciarse en condiciones frescas, el 71% tampoco tuvo éxito en condiciones de congelación-descongelación (Tabla 2). Todos estos datos sugieren que la calidad del cepillado nasal es el factor clave para un cultivo exitoso.
También se deseaba determinar el número óptimo de células por criovial. Las muestras congeladas en el pasaje 0, de un solo 25 cm2 generalmente solo permiten alcanzar 1-1.5 x 106 células por matraz. Las muestras congeladas en el pasaje 1 y amplificadas a tres matraces de 75 cm2 generalmente permiten alcanzar 10 x 106 células, lo que permite congelar varios viales que contienen al menos 3 x 106 células. En las condiciones de cultivo descritas en este protocolo, el 50% de las muestras congeladas entre 2 x 106 y 3 x 106 células por criovial no crecieron al descongelarse, alcanzando el 80% cuando estaban por debajo de 2 x 106 células por criovial (Tabla 2)..
La secreción de Cl relacionada con CFTR refleja la función CFTR y se puede medir mediante experimentos de corriente de cortocircuito (Isc) en cámaras de Ussing. La variación de ISC en respuesta a la forskolina (ΔIscForskolina) y el inhibidor de CFTR inh172 (ΔIscCFTRinh172) son los principales criterios de valoración para la evaluación de la eficacia del corrector CFTR.
Los experimentos de corriente de cortocircuito se realizaron en HNE fresco, expandido en medio de amplificación y sembrado en filtros en el pasaje 2 y cultivado en la interfaz aire-líquido durante 3 semanas en medio aire-líquido, o a partir de HNE que había sido previamente congelado en el pasaje 1 en medio de congelación enriquecido, descongelado, expandido y sembrado en filtros porosos en el pasaje 3. Los tiempos de criopreservación oscilaron entre 3 meses y 16 meses, con una media de 9,8 meses. En las condiciones de cultivo y criopreservación detalladas en este estudio, no se observaron cambios significativos en el crecimiento o la morfología entre diferentes pasajes o cultivos de HNE F508del/F508del frescos o congelados-descongelados.
Tanto para la media de ΔIscForskolina (Figura 2A) como para la media de ΔIscCFTRinh172 (Figura 2B) en células HNE tratadas con DMSO, no se observaron diferencias significativas entre HNE fresca o congelada-descongelada. Para evaluar si la corrección funcional de CFTR estuvo influenciada por la criopreservación, se midieron los cambios medios de ISC en células tratadas con VX-809 + VX-770 en comparación con células HNE tratadas con DMSO en HNE frescas (células HNE derivadas de n = 78 pacientes) o HNE congeladas-descongeladas (células HNE derivadas de n = 9 pacientes) (Figura 2). Tanto las células congeladas-descongeladas como las frescas mostraron una corrección significativa durante el tratamiento, con un aumento significativo de ΔIscForskolina (p < 0,05) (Figura 2A) y una disminución significativa en el ΔIscCFTRinh172 (p < 0,05) (Figura 2B). El aumento medio del pliegue para ΔIscForskolin (ΔIscForskolin VX-809 + VX-770/ΔIscForskolin DMSO) alcanzó 2,9 ± 1,6 en células HNE congeladas-descongeladas y no fue significativamente diferente del aumento de pliegue en células HNE frescas (2,5 ± 2,0). Del mismo modo, la disminución del pliegue en ΔIscCFTRinh172 (ΔIscCFTRinh172 VX-809 + VX-770/ΔIscCFTRinh172 DMSO) no se vio afectada significativamente por la criopreservación: 1,49 ± 0,9 en HNE congelada-descongelada en comparación con 2,5 ± 3,7 en HNE fresca.
La actividad de corrección funcional de varias terapias moduladoras se investigó más a fondo para evaluar si este modelo de células HNE podría discriminar entre diferentes tratamientos. Los resultados aquí combinan células HNE de condiciones frescas y congeladas-descongeladas, ya que la respuesta al tratamiento no se alteró significativamente por la criopreservación (Figura 2).
Primero evaluamos la respuesta correctora de dos terapias moduladoras CFTR aprobadas en el transporte de Cl- después de un tratamiento de 48 h con VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 nM) o VX-661 (3 μM) + VX-770 (100 nM) en células HNE de 10 pacientes con F508del/F508del (Figura 3). En comparación con las células HNE tratadas con DMSO, ΔIscForskolina (Figura 3A) y ΔIscCFTRinh172 (Figura 3B) mejoraron significativamente tanto por VX-809 + VX-770 como por VX-661 + VX-770. Ambos tratamientos corrigieron funcionalmente la secreción de Cl- relacionada con CFTR a un nivel similar, con un aumento significativo del pliegue medio en ΔIscForskolina de 1,75 ± 1,39 para VX-809 + VX-770 (p < 0,001) y 0,97 ± 0,93 para VX-661 + VX-770 (p < 0,01). La disminución media de ΔIscCFTRinh172 veces fue de 1,79 ± 2,04 para VX-809 + VX-770 (p < 0,001) y no fue significativamente diferente de la disminución media de ΔIscCFTRinh172 veces de 1,16 ± 1,44 para VX-661 + VX-770 (p < 0,001 vs. DMSO).
Se compararon además tres terapias moduladoras de CFTR diferentes en HNE de seis pacientes con F508del/F508del (Figura 4). Los resultados aquí combinan células HNE de condiciones frescas y congeladas-descongeladas. Los moduladores CFTR de Vertex y Abbvie, cuando se utilizaron como una combinación de un corrector CFTR y un potenciador CFTR, corrigieron ΔIscForskolin (Figura 4A) y ΔIscCFTRinh172 (Figura 4B) en una medida similar. La corrección parcial observada en la Figura 3 por VX-809 + VX-770 se confirmó en estas células HNE con un aumento medio del pliegue deforskolina ΔIsc de 2,87 ± 1,67 (p < 0,05). El tratamiento con ABBV-2222 (1 μM) + ABBV-974 (10 μM) indujo una corrección similar que representa el 91% de la corrección de VX-809 + VX-770 para ΔIscForskolina (aumento medio del pliegue deForskolina ΔIsc de 2,6 ± 1,4, p < 0,05 vs. DMSO) y el 85% de VX-809 + VX-770 para ΔIscCFTRinh172 (disminución media de ΔIscCFTRinh172 veces de 4,2 ± 5,7, p < 0,05 vs. DMSO).
Curiosamente, cuando las HNE fueron tratadas con la triple combinación VX-445 (3 μM) + VX-661 (3 μM) + VX-770 (100 nM), la eficacia de corrección mejoró significativamente, alcanzando el 312% de VX-809 + VX-770 ΔIscCorrección de forskolina (aumento medio del pliegue deForskolina ΔIsc de 9,0 ± 4,1, p < 0,05 vs. VX-809 + VX-770) y 372% de ΔIscCFTRinh172 (disminución media de ΔIscCFTRinh172 de 15,5 ± 10,5, p < 0.05 vs. VX-809 + VX-770).
Figura 1: Marcadores de diferenciación en cultivos de HNE. Imágenes de microscopía confocal representativas de tinción inmuno-fluorescente de CFTR (verde), Zona-Occludens-1 (ZO-1, rojo), alfa-tubulina (verde), Muc5AC (rojo) y citoqueratina 8 (K8, verde) en células HNE de tipo salvaje (WT) (primer panel) y F508del (paneles 2 -4) cultivadas en interfaz aire-líquido durante 3 semanas. Los núcleos se tiñeron de azul con DAPI. Proyecciones de imágenes de microscopía confocal, vista superior (paneles superiores) y vista lateral (paneles inferiores) de reconstituciones de pilas Z tridimensionales (3D). La barra de escala (20 μm) se aplica tanto a los paneles superiores como a los inferiores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Efecto de la congelación-descongelación sobre la secreción de Cl- relacionada con CFTR en células HNE. Resumen de los registros de corriente de cortocircuito (ISC) (media ± SD) en cultivos de HNE derivados de pacientes con F508del/F508del y cultivados en interfaz aire-líquido durante 3 semanas. Las células se trataron durante 48 h con vehículo solo (DMSO) o VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 nM) en células HNE frescas (gris claro, derivadas del paciente de 78 pacientes) o congeladas-descongeladas (células HNE de color gris oscuro derivadas de pacientes de 9 pacientes). Los datos representan la respuesta media (± SD) a la forskolina (10 μM)/3-isobutilo-1-metilxantina (IBMX, 100 μM) añadida agudamente (A),a la forskolina ΔIsc o al inhibidor de CFTR inh172 (5 μM) ΔIscCFTRinh172. Se analizaron un mínimo de dos filtros por paciente y por condición. Los asteriscos indican la diferencia estadística entre correctores y control (dmSO-tratado) * p < 0,05 (prueba t no apareada). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Corrección de la función CFTR mediante terapias duales. Resumen de los registros de corriente de cortocircuito (ISC) (media ± SD) en cultivos de HNE derivados de 10 pacientes con F508del/F508del y cultivados en interfaz aire-líquido durante 3 semanas (resultados combinados de cultivos frescos y congelados-descongelados). Las células fueron tratadas durante 48 h con vehículo solo (DMSO); VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 nM) o VX-661 (3μM) + VX-770 (100 nM). Los datos representan la respuesta media (± SD) a la forskolina (10 μM)/IBMX (100 μM), ΔIscForskolina añadida o (B) inhibidor de CFTR inh172 (5 μM), ΔIscCFTRinh172. Se analizaron un mínimo de dos filtros por paciente y por condición. Los asteriscos indican una diferencia estadística entre correctores y control (tratados con DMSO) ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001 (prueba de rango firmado por pares emparejados de Wilcoxon). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Eficiencia de la terapia triple frente a las terapias duales en la corrección de CFTR. Resumen de los registros de corriente de cortocircuito (ISC) (media ± SD) en cultivos de HNE derivados de 6 pacientes con F508del/F508del y cultivados en interfaz aire-líquido durante 3 semanas (resultados combinados de células frescas y congeladas-descongeladas). Las células fueron tratadas durante 48 h con vehículo solo (DMSO); VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 nM); ABBV-2222 (1 μM) + ABBV-974 (10 μM); o VX-661 (3 μM) + VX-445 (3 μM) + VX-770 (100 nM). Los datos representan la respuesta media (± SD) a la forskolina (10 μM)/IBMX (100 μM), ΔIscForskolina añadida o (B) inhibidor de CFTR inh172 (5 μM), ΔIscCFTRinh172. Se analizaron un mínimo de dos filtros por paciente y por condición. Los asteriscos indican una diferencia estadística entre los tratamientos. * p < 0.05 (Wilcoxon emparejó pares firmados prueba de rango). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Componente de medios | Concentración final |
| MEDIO DE AMPLIFICACIÓN | |
| Mezcla avanzada de nutrientes DMEM/F-12 | 86% |
| Suero fetal bovino | 10% |
| Penicilina | 100 U/ml |
| Estreptomicina | 100 μg/ml |
| Tazocilina | 10 μg/ml |
| Anfotericina B | 2,5 μg/ml |
| Colimicina | 16 μg/ml |
| Ciprofloxacina | 3 μg/ml |
| Hidrocortisona | 0,2 μM |
| Insulina | 5 μg/ml |
| Epinefrina | 0,5 μg/ml |
| FEAG | 10 ng/ml |
| Y-27632 (inhibidor de la quinasa asociado a Rho) | 10 μM |
| MEDIO AIRE-LÍQUIDO | |
| Mezcla avanzada de nutrientes DMEM/F-12 | 94% |
| UltroserG | 2% |
| Penicilina | 100 U/ml |
| Estreptomicina | 100 μg/ml |
| Tazocilina | 10 μg/ml |
| Anfotericina B | 2,5 μg/ml |
| Colimicina | 16 μg/ml |
| MEDIO DE CONGELACIÓN ENRIQUECIDO | |
| F12 Mezcla de nutrientes | 77% |
| HEPES | 3% |
| Suero fetal bovino | 10% |
| DMSO | 10% |
Tabla 1: Composición de amplificación, aire-líquido y medio de congelación enriquecido. Lista de reactivos y concentraciones finales correspondientes.
| Duración de la conservación del cepillado nasal antes de la siembra (n = 78) | |
| Días antes de la siembra | Tasas de éxito (%) |
| 0 | 83 |
| 1 | 84 |
| 2 | 67 |
| 3 | 100 |
| 4 | 89 |
| 5 | 100 |
| 7 | 0 |
| Resultados del mismo cepillado nasal inicial cultivado tanto en condiciones frescas como congeladas-descongeladas (n = 13) | |
| Resultado en condiciones frescas | Tasas de éxito tras la congelación-descongelación (%) |
| éxito | 83 |
| fracaso | 29 |
| Impacto del número de células en las tasas de éxito (n = 36) | |
| Número de células por criovial | Tasas de éxito tras la congelación-descongelación (%) |
| <2 x 106 | 20 |
| 2–3 x 106 | 50 |
| 3–4 x 106 | 67 |
| >4 x 106 | 79 |
Tabla 2: Parámetros que influyen en las tasas de éxito en cultivos de células HNE frescas y congeladas-descongeladas. Las tasas de éxito se definieron como cepillados nasales que se expandieron y diferenciaron con éxito en un epitelio pseudoestratificado después de 3 semanas en la interfaz aire-líquido y presentaron un TEER superior a 200 Ω·cm2. Antes de la siembra, las muestras se enviaron a temperatura ambiente en medio de lavado con antibióticos. Los resultados representan datos de 78 muestras frescas y 36 muestras congeladas-descongeladas. Se analizaron 13 cepillados nasales tanto en condiciones frescas como congeladas-descongeladas.
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Discussion
El uso de células epiteliales nasales derivadas del paciente como sustitutos de las células epiteliales bronquiales humanas (HBE) para medir la actividad de CFTR en el contexto de la medicina personalizada se ha propuesto como propiedades de reproducción de células HNE en cultivo 9,11. La gran ventaja de la HNE sobre los cultivos de células HBE es que se muestrean de forma fácil y no invasiva. Las mediciones de corriente de cortocircuito en cultivos celulares HNE permiten evaluar el transporte de Cl- dependiente de CFTR a través del epitelio, que se demostró que se correlaciona significativamente con la actividad in vivo de CFTR evaluada por la diferencia de potencial nasal en pacientes con varios genotipos9. El rescate de la actividad de CFTR en células HNE en el tratamiento con VX-809 también se correlacionó significativamente con la mejoría del resultado clínico FEV1 en pacientes homocigotos con lumacaftor-ivacaftor tratados con F508del12.
Es importante destacar que este estudio muestra que las células HNE recién cosechadas toleran fácilmente el transporte y las condiciones estándar de envío (es decir, sobreviven 72 h a temperatura ambiente), lo que permite la prueba de las células del paciente que se originan en varias ubicaciones geográficas. Los factores críticos para el cultivo exitoso son principalmente la calidad del cepillado nasal y el número de células vivas en el muestreo. Se han publicado varios protocolos sobre el cultivo y la diferenciación de cultivos de células HNE; algunos sin reprogramación condicional durante la fase de expansión 13,14,15,16,17,18,19,20, algunos con reprogramación condicional en el alimentador 9,11,12,21,22,23,24,25 ,26 o condiciones libres de alimentación 5,8,27,28,29, y varios comparando diferentes métodos 7,8. Todos ellos permiten obtener un número relativamente grande de cultivos ALI con una correcta diferenciación y polarización, así como buenos valores TEER. De manera similar a este estudio, muchos utilizaron células HNE criopreservadas congeladas en el paso 113,28. Curiosamente, varios autores informan que ROCKi puede mejorar la supervivencia después de la criopreservación cuando se agrega al medio de cultivo posterior al deshielo y aumentar el número de células que permanecen unidas 5,29, lo que sugiere que el medio de amplificación utilizado en este estudio es particularmente apropiado para la criopreservación.
Aquí, el estudio muestra que las células HNE se pueden biobancar con éxito, el factor crítico nuevamente es la calidad del cepillado nasal. Se muestra una buena correlación entre el resultado de las muestras frescas y las congeladas-descongeladas, lo que sugiere que para optimizar la calidad de las células HNE que se van a biobancar para estudios posteriores, se podría realizar un estudio preliminar en muestras frescas si no logran la diferenciación correcta de ALI y el valor TEER aceptable; sería preferible un segundo cepillado nasal en lugar de congelar las células que tienen una alta probabilidad de mal resultado. Un segundo factor crítico para la criopreservación es el número de células; en las condiciones de cultivo utilizadas en este estudio, cuando se congelan menos de 2 x 106 células por criovial, la tasa de fracaso es muy alta. Se recomienda congelar al menos 3 x 106 células por criovial.
Los resultados de este estudio sugieren que la congelación-descongelación no modifica significativamente las propiedades electrofisiológicas de las células HNE o la respuesta a los moduladores CFTR. El rango de medidas en cultivos de células HNE del mismo paciente F508del-homocigoto obtenido sin congelación o después de la descongelación no fue diferente en el tratamiento con VX-809 + VX-770. Se informaron resultados similares previamente para las células HBE donde el Isc estimulado por forskolina se mantuvo estable después de varios ciclos de deshielo / cultivo de células F508del no tratadas30. Esto proporciona evidencia de que las células HNE pueden congelarse y almacenarse en un biobanco y estudiarse más tarde.
Un número creciente de estudios muestran que los cultivos de células HNE se pueden utilizar para probar la eficacia de diferentes terapias en el contexto de la medicina personalizada. El análisis mostró que las terapias duales que combinan un corrector con un potenciador tienen una eficacia de corrección comparable para la secreción de Cl- dependiente de CFTR en células HNE homocigotas F508del. Sin embargo, se observó una importante variabilidad entre pacientes, confirmando los resultados publicados 9,12,20,25. Por el contrario, VX-445 + VX-661 + VX-770 triplicaron la corrección de la actividad de CFTR en comparación con VX-809 + VX-770. Laselva et al.28 observaron un nivel similar de corrección de F508del-CFTR en células HNE tras la triple combinación. Según lo informado por Veit et al.26, la corrección de la función del canal Cl en el tratamiento con VX-445 + VX-661 + VX-770 fue aún mayor, alcanzando el 62% de la actividad media de WT-CFTR (rango de 19-36 μA/cm2 en F508del-HNE corregido y 14-50 μA/cm2 en WT-HNE)26.
Los cultivos de células HNE también sirvieron para probar la eficacia de los moduladores CFTR para otras mutaciones de clase II. Se observó una mejora importante de la actividad de CFTR en los genotipos VX-445 + VX-661 + VX-770 en cultivos HNE ALI que albergan genotipos G85E/G85E, V520F/1717-1G>A, Y569/Y569D, M1101K/M1101K y N1303K/N1303K. Del mismo modo, Laselva et al.28 mostraron una corrección significativa de CFTR con mutaciones M1101K y N1303K pero ninguna corrección significativa en células HNE G85E. Se evaluaron correctores de Galápagos/AbbVie para estos mutantes resistentes a lumacaftor-ivacaftor31. El corrector AC2-1 de AbbVie y especialmente el corrector bicorrector AC1+AC2-1 mejoraron eficazmente la secreción de Cl- en las células HNE M1101K y G85E, mientras que las células derivadas de N1303K se corrigieron mediante una combinación de AC1+AC2-2.
Las medidas de la actividad de CFTR en células HNE son biomarcadores preclínicos prometedores predictivos para la respuesta del paciente al tratamiento probado. La evidencia de que los ciclos de congelación-descongelación no alteran el nivel de corrección proporciona evidencia de que estas células pueden ser biobancarizadas y utilizadas como una herramienta poderosa en el contexto de programas de medicina personalizada. Por lo tanto, un cepillado nasal único podría permitir suficiente material para comparar la eficacia de los medicamentos, y las células HNE del paciente podrían descongelarse a medida que nuevos medicamentos estén disponibles sin necesidad de volver a muestrear a los pacientes; esto es particularmente interesante en los bebés.
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Disclosures
Los autores informan que no hay intereses financieros en competencia relacionados con esta publicación o producción de videos científicos.
Acknowledgments
Agradecemos calurosamente a todos los pacientes y sus familias por su participación en el estudio. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Asociación Francesa Vaincre la Mucoviscidose; Asociación Francesa ABCF 2 y Vertex Pharmaceuticals Innovation Awards.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABBV-2222 | Selleckchem | S8535 | |
| ABBV-974 | Selleckchem | S8698 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies | 12634010 | |
| Alexa 488 goat secondary antibody | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa 594 goat secondary antibody | Invitrogen | A11012 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290026 | |
| Anti-alpha-tubulin antibody | Abcam | ab80779 | |
| Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1) | R&D Systems | MAB25031 | |
| Anti-cytokeratin 8 antibody | Progen | 61038 | |
| Anti-Muc5AC antibody | Santa Cruz Biotech | sc-20118 | |
| Anti-ZO-1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-10804 | |
| Ciprofloxacin | provided by Necker Hospital Pharmacy | ||
| Colimycin | Sanofi | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Collagen type IV | Sigma-Aldrich Merck | C-7521 | |
| cytology brush | Laboratory GYNEAS | 02.104 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich Merck | D2650 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Epinephrin | Sigma-Aldrich Merck | E4375 | |
| F12-Nutrient Mixture | Life Technologies | 11765054 | |
| FBS | Life Technologies | 10270106 | |
| Ferticult | Fertipro NV | FLUSH020 | |
| Flasks 25 | Thermo Scientific | 156.367 | |
| Flasks 75 | Thermo Scientific | 156.499 | |
| Glacial acetic acid | VWR | 20104.298 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich Merck | H3375 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich Merck | SLCJ0893 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich Merck | I0516 | |
| Mg2+ and Ca2+-free DPBS | Life Technologies | 14190094 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140130 | |
| Tazocillin | Mylan | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Transwell Filters | Sigma-Aldrich Merck | CLS3470-48EA | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich Merck | T8787 | |
| Trypsin 0,25% | Life Technologies | 25200056 | |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| VX-445 | Selleckchem | S8851 | |
| VX-661 | Selleckchem | S7059 | |
| VX-770 | Selleckchem | S1144 | |
| VX-809 | Selleckchem | S1565 | |
| Xylocaine naphazoline 5% | Aspen France | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
References
- Kim, S. J., Skach, W. R. Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum. Frontiers in Pharmacology. 3, 201 (2012).
- Lukacs, G. L., Verkman, A. S. CFTR: folding, misfolding and correcting the ΔF508 conformational defect. Trends in Molecular Medicine. 18 (2), 81-91 (2012).
- Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in patients with cystic fibrosis homozygous for Phe508del CFTR. The New England Journal of Medicine. 373 (3), 220-231 (2015).
- Griese, M., et al. Safety and efficacy of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor for 24 weeks or longer in people with cystic fibrosis and one or more F508del alleles: Interim results of an open-label phase 3 clinical trial. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (3), 381-385 (2021).
- Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial basal-cell proliferation and lentivirus transduction. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).
- Liu, X., et al. Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens. Nature Protocols. 12 (2), 439-451 (2017).
- Saint-Criq, V., et al. Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells. Cells. 9 (9), 2137 (2020).
- Bukowy-Bieryłło, Z. Long-term differentiating primary human airway epithelial cell cultures: how far are we. Cell Communication and Signaling: CCS. 19 (1), 1-18 (2021).
- Pranke, I. M., et al. Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators. Scientific Reports. 7 (1), 7375 (2017).
- Noel, S., et al. Correlating genotype with phenotype using CFTR-mediated whole-cell Cl− currents in human nasal epithelial cells. The Journal of Physiology. , (2021).
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).
- Pranke, I., et al. Might brushed nasal cells be a surrogate for cftr modulator clinical response. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (1), 123-126 (2019).
- de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
- Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro. Respiratory Medicine. 84 (4), 303-312 (1990).
- McDougall, C. M., et al. Nasal epithelial cells as surrogates for bronchial epithelial cells in airway inflammation studies. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 39 (5), 560-568 (2008).
- Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 7 (1), 44-53 (2008).
- Tosoni, K., Cassidy, D., Kerr, B., Land, S. C., Mehta, A. Using drugs to probe the variability of trans-epithelial airway resistance. PLOS One. 11 (2), 0149550 (2016).
- Schögler, A., et al. Characterization of pediatric cystic fibrosis airway epithelial cell cultures at the air-liquid interface obtained by non-invasive nasal cytology brush sampling. Respiratory Research. 18 (1), 215 (2017).
- Müller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50646 (2013).
- Awatade, N. T., et al. Measurements of functional responses in human primary lung cells as a basis for personalized therapy for cystic fibrosis. EBioMedicine. 2 (2), 147-153 (2014).
- Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).
- Wiszniewski, L., et al. Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (1), 39-48 (2006).
- Reynolds, S. D., et al. Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (3), 323-336 (2016).
- Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).
- Awatade, N. T., et al. Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).
- Veit, G., et al. Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination. JCI Insight. 5 (18), 139983 (2020).
- Dale, T. P., Borg D'anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research. Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).
- Laselva, O., et al. Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator. The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774 (2021).
- Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).
- Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators. Methods in Molecular Biology. 741, Clifton, N.J. 39-54 (2011).
- Laselva, O., et al. Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).
