Summary
여기서 우리는 공기-액체 계면에서 일차 인간 비강 상피 (HNE) 세포의 단리, 증폭 및 분화 및 증폭 된 HNE를 성공적으로 동결 및 해동 할 수있게 해주는 바이오 뱅킹 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 상이한 조절제 처리시 분화된 HNE 세포의 전기생리학적 특성 및 CFTR 관련 염화물 분비 보정을 분석한다.
Abstract
인간 비강 상피 (HNE) 세포는 간단하고 비 침습적 인 비강 칫솔질로 쉽게 수집 할 수 있습니다. 환자 유래 일차 HNE 세포는 공기-액체 계면 조건에서 의사층화된 상피로 증폭 및 분화되어 낭포성 섬유증 막횡단 전도도 조절기(CFTR) 기능의 지표로서 순환 AMP 매개 염화물(Cl-) 수송을 정량화할 수 있다. 냉동 보존시 비강 양치의 품질 및 세포 밀도와 같은 중요한 단계가 효율적으로 수행되면 HNE 세포를 성공적으로 바이오 뱅크 할 수 있습니다. 또한, 단락 전류 연구는 동결 해동이 HNE 세포의 전기 생리 학적 특성과 CFTR 조절제에 대한 반응을 크게 변화시키지 않는다는 것을 보여줍니다. 본 연구에 사용된 배양 조건에서, 동결 당 2 x 10미만의 6 세포가 동결될 때, 실패율은 매우 높다. 우리는 냉동 당 적어도 3 x 106 세포를 동결하는 것이 좋습니다. 우리는 CFTR 교정기와 CFTR 강화제를 결합하는 이중 요법이 F508del-동형접합성 HNE 세포에서 CFTR 활성에 대해 필적할만한 보정 효능을 갖는다는 것을 보여준다. 삼중 요법 VX-445 + VX-661 + VX-770은 이중 요법 VX-809 + VX-770에 비해 CFTR 활성의 보정을 유의하게 증가시켰다. HNE 세포에서 CFTR 활성의 측정은 CFTR 조절제 요법을 안내하는데 유용한 유망한 전임상 바이오마커이다.
Introduction
낭포성 섬유증 (CF)은 낭포성 섬유증 막횡단 전도도 조절기 (CFTR) 유전자의 돌연변이로 인해 CFTR 단백질의 부재 또는 기능 장애를 초래하는 상염색체 열성 장애로, 상피 1,2의 정점 표면에 위치한 음이온 채널입니다. CFTR 요법의 최근 발전은 질병의 예후를 개선했으며, CFTR 교정제와 CFTR 강화제를 결합한 마지막 승인 된 약물은 가장 빈번한 돌연변이 p.Phe508del 돌연변이 (F508del)3,4를 가진 CF 환자의 폐 기능과 삶의 질을 크게 향상 시켰습니다. 이러한 유망한 치료 진행에도 불구하고, CF 환자의 약 10 %는 이러한 CFTR 조절제에 의해 구출 할 수없는 돌연변이를 가지고 있기 때문에 부적격합니다. 이러한 환자의 경우, 특정 돌연변이에 대한 가장 효율적인 조합을 찾기 위해 다른 약물 또는 약물 조합을 테스트하여 개인화 된 치료법의 중요성을 강조 할 필요가 있습니다.
인간 비강 상피 (HNE) 세포는 간단하고 비 침습적 인 비강 칫솔질에 의해 수집하기 쉽고 CFTR 기능의 지표로서 순환 AMP 매개 염화물 (Cl-) 수송의 정량화를 허용합니다. HNE 세포는 인간 기도의 정확한 모델을 산출하지만, 그들의 수명은 배양에서 제한된다. 배양 기술의 최적화 덕분에, 환자 유래 일차 HNE 세포는 미세다공성 필터5,6 상에서 Rho-associated kinase inhibitor (ROCKi)로 조건부로 재프로그래밍되고, 증폭되고, 공기-액체 계면 (ALI) 조건에서 의사-층화된 상피로 분화될 수 있다. HNE 배양을 위한 수많은 배양 프로토콜(시판, 무혈청, "수제", 피더-세포와의 공동 배양 등)이 존재하며, 배지 및 배양 조건의 선택은 성장, 세포 집단 분화 및 상피 기능에 영향을 미치기 위해 기술되었다 7,8. 여기서 프로토콜은 CFTR 기능 분석을 위해 ALI에서 분화되는 많은 수의 HNE 세포를 성공적으로 수득할 수 있는 단순화된 피더가 없는 ROCKi 증폭 방법을 제시합니다.
우리는 분화된 HNE 세포에서, CFTR 조절제를 사용한 48시간 처리가 CFTR 의존성 Cl- 전류의 전기생리학적 교정을 유도하기에 충분하고, 시험관내에서 관찰된 교정이 환자의 임상적 개선과 상관관계가 있을 수 있음을 입증하였다9. 따라서 HNE 세포는 기본적인 CF 연구뿐만 아니라 환자 별 CFTR 조절제 테스트를 통한 전임상 연구에 적합한 모델을 나타냅니다. 개인화 된 치료의 이러한 맥락에서, 프로토콜의 목표는 우리의 조건에서 자란 CF 환자의 냉동 보존 HNE 세포가 CFTR 교정 연구에 적합한 모델임을 검증하는 것이 었으며, 신선하고 냉동 해동 된 세포로부터의 CFTR 의존성 Cl- 수송을 비교할 때 유사한 결과가 예상 될 수 있습니다. 이 연구는 또한 이중 및 삼중 요법을 사용할 때 다른 CFTR 조절제의 효능을 평가했습니다.
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Protocol
모든 실험은 헬싱키 선언과 인간 연구 윤리에 관한 Huriet-Serusclat 법에 의해 설명 된 지침과 규정에 따라 수행되었습니다.
1. 플라스크 및 다른 매체의 준비
- 표 1에 기재된 바와 같이 증폭, 공기-액체 및 동결 매질을 준비한다.
- 콜라겐 50 mg을 0.2% 빙초산 100 mL에 용해시켜 인간 콜라겐 IV의 원액을 제조하였다. 적어도 1 시간 동안 자기 교반기에 혼합하고, 용액을 멸균 여과한다. 빛으로부터 보호되는 유리 병에 4 °C에서 최대 6 개월 동안 보관하십시오.
- 원액을 이중 증류수에 1:5로 희석하여 콜라겐 IV의 작업액을 준비한다. 4°C에서 최대 6개월 동안 보관하십시오.
- 플라스틱 세포 배양 플라스크 또는 트랜스웰 필터를 콜라겐 작동 용액으로 코팅하십시오. 0.33 cm2 트랜스웰 필터에 대해 100 μL,25 cm2 플라스크에 대해 500 μL, 및 75cm2 플라스크에 대해 1 mL를 플라스크의 전체 성장 표면에 고르게 분배한다.
참고 : 이것은 플라스크를 좌우로 부드럽게 기울임으로써 달성 될 수 있습니다. 대안적으로, 플라스크의 코팅을 용이하게 하기 위해, 증가된 부피가 사용될 수 있고, 전체 표면이 고르게 커버될 때, 콜라겐 용액은 지시된 부피만을 남기도록 흡인된다. 흡인된 콜라겐 용액은 그 후 즉시 다음 플라스크를 코팅하는데 사용될 수 있다(즉, 3개의 75cm2 플라스크의 경우, 3 mL의 콜라겐 용액을 첫 번째 플라스크에 고르게 분배하고, 흡인물 2 mL를 다음 플라스크에 사용하는 등). - 세포 배양 플라스크를 최소 2 h 또는 하룻밤 동안 인큐베이터에 두십시오. 콜라겐을 철저히 흡인하고 플라스크를 인큐베이터 또는 후드 아래에서 최소 20 분 또는 하룻밤 동안 건조시킵니다.
- 10 mL의 Mg2+- 및Ca2+-free DPBS로 세척하고, 인큐베이터에서 건조시키고, 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일에 보관하십시오. 플라스크를 실온(RT)에서 최대 6개월 동안 보관하십시오.
2. 비강 칫솔질
참고: 참가자가 급성 감염이 없는 동안 비강 칫솔질이 수행되는지 확인하십시오. CF 환자가 폐 감염이있는 경우, 환자의 항생제를 참조하고 증폭 배지에 항생제를 추가하십시오. 인간 비강 상피 세포는앞서 기술된 바와 같이 F508del/F508del 환자로부터 비강 양치에 의해 수집되었다.
- 환자에게 코를 불도록 요청한 다음 나파졸린 용액으로 자일로카인 5 %에 담근 면화 메쉬를 사용하여 두 콧구멍의 점막을 국소 적으로 마취하십시오.
- 세포학 브러시를 사용하여 양쪽 콧구멍의 내측 벽과 열등한 turbinate를 부드럽게 닦으십시오. 브러시를 2 mL의 상업적으로 입수가능한 플러싱 매질과 함께 15 mL 튜브에 담그고; 부드럽게 흔들어 세포를 분리합니다. 두 번째 콧구멍에서 칫솔질을 반복하십시오.
- 페니실린 (100 U / mL), 스트렙토 마이신 (100 μg / mL), 타조 실린 (10 μg / mL), 암포테리신 B (2.5 μg / mL) 및 콜리마이신 (16 μg / mL)과 같은 항생제를 플러싱 배지에 추가하십시오.
참고 : 비강 칫솔질은 RT에서 확장 및 배양을위한 전용 실험실로 배송 될 수 있으며 칫솔질 후 최대 72 시간까지 시드 할 수 있습니다.
3. HNE의 분리
참고: HNE를 세포학 브러쉬로부터 단리하고, Mg2+- 및Ca2+-비함유 DPBS로 세척하고, 0.25% 트립신으로 해리시키고, 앞서 기술된 바와 같이 25cm2 플라스틱 플라스크 상에 시딩하였다(10).
- 1000 μL 피펫콘을 통해 브러시를 반복적으로 통과시키고 2 mL의 Mg2+- 및 Ca2+-free DPBS로 헹구어 세포학 브러쉬로부터 세포를 분리한다. 4°C에서 5분 동안 500 x g에서 원심분리하고 상층액을 버린다.
- 펠렛을 0.25% 트립신에 8-12분 동안 재현탁시켜 세포를 해리시킨다. 증폭 배지 5 mL를 첨가하여 효소 반응을 중지시킨다.
- 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리하고 상층액을 버린다. 펠렛을 증폭 배지 8 mL에 재현탁시키고 시드를 25cm2 콜라겐이 코팅된 플라스크 상에 상으로 시킨다. 37°C 및 5%CO2에서 성장한다. 이것은 구절 0에 해당합니다.
- 다음날, 배지를 5 mL의 신선한 증폭 배지로 교체하고 부착, 형태학 (세포는 응집성 조약돌 외관을 가져야함) 및 수에 대해 매일 세포를 모니터링한다.
참고 : 초기 시딩 밀도는 비강 칫솔질의 품질과 상피 세포의 비율에 따라 다릅니다. 갓 분리 된 HNE 세포는 일반적으로 3-10 일 이내에 80 % -90 % 컨플루언시에 도달합니다. 느린 성장 속도는 샘플에서 불충분 한 상피 세포를 암시하며 폐기해야합니다.
4. 인간 비강 상피 세포의 증폭 및 패시징
- 콜라겐 코팅된 플라스크 상에서 37°C 및 5% CO2의 증폭 배지에서 80%-90% 컨플루언시가 될 때까지 인간 비강 상피 세포를 성장시키고, 매 48-72시간마다 배지를 변경한다. 25cm2 플라스크의 경우 증폭 배지 5mL와 75cm2 플라스크에 10mL를 사용합니다.
- 세포가 80%-90% 컨플루언시(confluency)에 도달하면, 10 mL의 Mg2+- 및Ca2+-free DPBS로 세포를 세척하고, 흡인물을 놔두고, 버린다.
- 25cm2 플라스크에 0.25% 트립신 1 mL (또는 75 cm2 플라스크의 경우 트립신 2 mL)를 첨가하고, 8-12분 동안 인큐베이터 (37°C, 5%CO2)로 복귀시킨다.
- 손바닥으로 플라스크를 단단히 두드려 세포가 분리되도록 도와줍니다.
- 증폭 배지 10 mL를 첨가하여 효소 반응을 정지시킨다. 플라스크를 격렬하게 헹구고, 10 mL 피펫을 사용하여 세포를 헹구고 분리하기 위해 플라스크 표면 위로 증폭 배지를 뽑아 내고 배출한다.
- 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리하고 상층액을 버린다.
- 펠렛을 증폭 배지의 5-10 mL에 재현탁시킨다.
- 혈구계를 사용하여 세포를 계수하십시오.
참고: 이 시점에서 셀을 동결시킬 수 있습니다(단계 5.1-5.3 참조). 추가 증폭이 필요한 경우 콜라겐 코팅 플라스크에 다시 시드하십시오 (25cm2 플라스크는 3 개의 75cm2 플라스크로 확장 될 수 있으므로 더 큰 희석은 권장되지 않습니다).
5. 원발성 비강 상피 세포의 동결 보존
참고: 바이오뱅킹 전 계대 1까지 HNE 세포를 성장시켜 해동시 세포 성장을 촉진하기에 충분한 세포를 확보하십시오. 그러나 바이오 뱅킹은 초기 통로 0 또는 통로 2에서 가능합니다. 다음의 냉동 보존 단계는 모든 구절에 적용됩니다.
- 세포 계수 후, 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리하고, 상층액을 버린다.
- 펠렛을 농축된 동결 배지 (표 1)에 재현탁시켜 mL 당 및 냉동 당 3 x 106-5 x 106 세포를 얻었다.
- -80°C에서 적절한 냉동 냉동 용기에서 분당 ∼1°C에서 온도를 감소시킴으로써 세포를 천천히 동결시킨다. 다음날, 보존된 샘플을 장기 보관을 위해 질소 저장 용기로 옮깁니다(본 연구는 17개월 보관으로 제한됩니다).
6. 냉동 증폭된 HNE 세포 해동
- 수조를 37°C로 예열한다. 표 1 에 기재된 바와 같이 증폭 배지를 준비하고 배지를 37°C로 가온한다.
- 질소 저장 탱크에서 냉동 장치를 제거하고 신속하게 수조에 넣고 바이알 전체를 물에 잠기지 않도록주의하십시오. 작은 얼어 붙은 물방울 만 남을 때 수조에서 냉동 장치를 제거하십시오. 바이알을 70% 알코올로 닦아내고, 닦아내고, 후드 아래에 두세요.
- 1 mL 피펫을 사용하여, 해동된 세포를 빈 15 mL 튜브로 옮긴다.
- 적가하는 방식으로, 1 mL의 따뜻한 증폭 배지를 첨가한다. 1분 후, 또 다른 증폭 배지 1 mL를 첨가하고, 추가로 1분 정도 기다린다.
- 증폭 배지 10 mL를 첨가하고 500 x g에서 2분 동안 원심분리한다.
- 상층액을 흡인하고 버립니다. 세포 펠릿을 적어도 1 x 10 6 cells/mL의 세포 밀도를 달성하는 데 필요한 증폭 배지의 부피에 재현탁시킨다.
- 세포를 증폭 배지를 함유하는 콜라겐 코팅된 플라스크 상에 시드한다.
- cryovial이 4 x 106 세포 이상을 함유하는 경우, 75cm2 플라스크 상에 시드하고, 증폭 배지의 10 mL에
- cryovial이 4 x 106 세포 미만을 함유하는 경우, 종자 세포를 25cm2 플라스크 상에, 증폭 배지의 5 mL에
- 37°C, 5%CO2 에서 배양하고, 다음 2-3일에 걸쳐 세포 확장을 육안으로 관찰한다.
- 이어서, 섹션 4에 상술된 바와 같이 세포 증폭을 수행한다.
참고: 4.7단계에서 세포를 수확한 세포가 거의 없는 경우. (즉, 팽창 전에 통로 0에서 동결되는 경우), 단계 6.5. 및 6.6. 생략될 수 있고, 세포는 원심분리 없이 25cm2 콜라겐 코팅된 플라스크 상에 직접 시딩될 수 있다. 그런 다음 다음 날 배지를 변경하여 디메틸 설폭사이드 (DMSO)를 제거해야합니다.
7. 공기-액체 계면에서 인간 비강 상피 세포의 분화
주: HNE는 앞서 기술한 바와 같이 공기-액체 계면에서 분화되었다10.
- 0.33cm2 콜라겐 코팅 다공성 필터에 330,000 세포/필터의 밀도로 세포를 시드하고 정점 측의 증폭 배지 300 μL와 기저 측의 공기 액체 배지 900 μL로 보충하십시오.
- 3일 후, 정점 배지를 흡인하고 세포를 공기-액체 배지에서 3-4주 동안 공기-액체 계면에서 배양하여 분화된 상피를 확립한다. 48-72 시간마다 기본 배지를 교체하십시오.
8. CFTR 변조기
- CFTR 조절제를 함유하는 공기-액체 매질을 준비한다. VX-445, VX-661 및 VX-809를 최종 농도 3 μM에서, VX-770을 100 nM에서 사용하십시오. 1μM의 최종 농도에서 교정기 ABBV-2222를 사용하고 10μM에서 강화제 ABBV-974를 사용하십시오. 모든 CFTR 조절제를 용해하려면 100% DMSO를 사용하십시오.
- 교정기 배지에서와 동일한 양의 100% DMSO를 함유하는 공기-액체 배지를 준비한다.
- 약물 또는 DMSO를 함유하는 배지를 공기-액체 계면에서 성장된 편광된 HNE 세포의 기저측측에 첨가하고, 37°C에서 5%CO2 중에서 24 시간 동안 인큐베이션한다.
- 24시간 후, 흡인물은 배지를 버리고 단계 8.1-8.2.에서와 같이 제조된 신선한 배지로 교체하고, 37°C에서 5%CO2에서 24 시간 기간 동안 추가로 인큐베이션한다.
9. 챔버 연구 사용
- 앞서 설명한 바와 같이 전압 클램프 조건 하에서 단락 전류 측정(Isc)을 측정합니다(9).
참고: 배양물의 경상피 전기 저항(TEER)은 젓가락 전압계로 측정하였으며, 적어도 200 Ω·cm2 에 도달하는 배양물만이 다음의 실험을 위해 고려되었다. 편광된 HNE 셀의 필터는 어싱 챔버에 장착되었고, 단락 전류 측정(Isc)은 전압 클램프 조건 하에서 측정되었다.
10. 면역세포화학
- 앞서 기술한 바와 같이 면역검출을 수행한다9.
주: CFTR 면역검출은 항-CFTR C 말단 (24-1) 모노클로날 항체를 사용하여 1/100 희석액에서 하룻밤 동안 수행하였다. 조나-폐색-1 (ZO-1) (1/500 희석), 알파-튜불린 (1/300 희석), Muc 5AC (1/250 희석) 및 시토케라틴 8 (1/250 희석) 염색을 추가 필터 상에서 수행하였다. PBS-Triton-X100 0.1%로 세척한 후, Alexa 488 또는 594에 접합된 염소 이차 항체를 10% 염소 혈청에 30분 동안 첨가하였다(1/1000 희석). 최종 세척 후, 필터를 지지체로부터 절단하고 DAPI를 함유하는 Vectashield 장착 매체로 장착하였다. 공초점 현미경 (63x / 1.4 오일 차동 간섭 대비 λ 블루 PL APO 목표)을 사용하여 이미지를 캡처하고 ImageJ 소프트웨어로 분석했습니다.
11. 통계 분석
- 적절한 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행하십시오.
참고: 통계 분석은 S.A.S 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 환자 당 및 조건당 여러 HNE 필터가 얻어짐에 따라, 정량적 파라미터는 환자 당 중앙값 (± SEM)으로 표현되었다. 비교(평균 ± SD)는 Wilcoxon 매칭 쌍 서명 순위 테스트 또는 짝을 이루지 않은 t-검정을 사용하여 수행하였다.
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Representative Results
공기-액체 계면에서 배양된 신선한 HNE 세포는 면역염색에 의해 평가된 바와 같이 편광되고 분화된 호흡 상피의 전형적인 특징을 나타낸다(도 1). HNE 세포는 섬모(양성 알파-튜불린 염색) 및 비섬모 점액 생성 잔 세포(양성 Muc5Ac 면역염색)로 구성된 의사층화된 호흡기 상피의 생체내 상황을 모방하는 상피 세포의 이질층(양성 케라틴 8 면역염색)으로 재분화한다. 전체 상피는 단단한 접합부를 나타낸다 (ZO-1, zona-occludens-1 염색에 의해 평가됨). 강한 정점 CFTR 염색은 야생형 (WT) HNE 세포에서 볼 수 있으며, 정점 표면과 세포질에서 모두 감소된 CFTR 염색은 F508del/F508del HNE에서 관찰된다.
우리는 긍정적 인 결과를 샘플로 간주하여 성공적으로 확장 될뿐만 아니라 공기 - 액체 계면에서 3 주 후에 의사 층화 된 상피로 성공적으로 차별화되고 단락 전류 측정이 가능한 200 Ω ·cm2 이상의 TEER를 제시했습니다. 소수의 전용 실험실만이 단락 전류 측정에 의한 CFTR 관련 Cl- 분비 분석을 수행하므로 샘플은 종종 병원에서 전용 시설로 이송해야 합니다.
78개의 신선한 HNE 세포 샘플에서, 성공률은 실온에서 플러싱 배지에서 1-7일 동안 수송 후 즉시 시딩된 비강 양치와 양치에서 비교되었다. 대부분의 샘플 (55 %)은 양치 후 1 일 후에 시딩되었고, 샘플의 82 %는 48 시간 이내에 시딩되었습니다. 모든 78개의 샘플에서 성공적인 배양의 평균 백분율은 82%였고, 0일째와 5일째 사이에 시딩된 샘플에서 87%에 도달하였다(표 2).
신선 및 동결-해동 조건 둘 다에서 분화된 동일한 샘플에 대한 성공 및 실패율을 비교하였다. 신선한 조건에서 성공적으로 분화된 샘플의 83%는 또한 동결보존된 샘플에서 성공적이었다. 마찬가지로, 신선한 조건에서 분화에 실패한 샘플에서, 71%는 또한 동결-해동 조건에서도 실패하였다 (표 2). 이러한 모든 데이터는 비강 칫솔질의 품질이 성공적인 문화의 핵심 요소임을 시사합니다.
우리는 또한 cryovial 당 최적의 세포 수를 결정하기를 원했습니다. 단일 25cm2로부터의 통로 0에서 동결된 샘플은 일반적으로 플라스크 당 단지 1-1.5 x 106 세포에 도달하도록 허용한다. 샘플은 계대 1에서 동결되고 3개의 75cm2 플라스크로 증폭되어 일반적으로 10 x 10 6 세포에 도달하도록 허용하고, 따라서 적어도 3 x 106 세포를 함유하는 몇몇 바이알을 동결시킬 수 있게 한다. 이 프로토콜에 기재된 배양 조건에서, 냉동 당 2 x 10 6 및 3 x 106 세포 사이에서 동결된 샘플의 50%는 해동될 때 성장하지 못하고, 냉동 당 2 x 106 세포 미만일 때 80%에 도달하였다 (표 2).
CFTR 관련 Cl- 분비는 CFTR 기능을 반영하고 어싱 챔버에서의 단락 전류 (Isc) 실험에 의해 측정 될 수 있습니다. 포스콜린 (ΔIscForskolin) 및 CFTR 억제제 inh172 (ΔIscCFTRinh172)에 대한 반응의 Isc 변이는 CFTR 교정기 효능 평가의 주요 종점이다.
단락-전류 실험은 신선한 HNE에서 수행되었고, 증폭 배지에서 팽창되어 통로 2의 필터에 시딩되고 공기-액체 배지에서 3주 동안 공기-액체 계면에서 성장하거나, 이전에 통로 1에서 농축된 동결 배지에서 동결된 HNE로부터, 통로 3에서 다공성 필터에 해동, 팽창 및 시딩되었다. 동결보존 기간은 3 개월에서 16 개월 사이였으며 평균 9.8 개월이었습니다. 본 연구에 상술된 배양 및 동결보존 조건에서, 상이한 계대 또는 신선하거나 냉동-해동된 F508del/F508del HNE 배양물 사이에서 성장 또는 형태학의 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
DMSO 처리된 HNE 세포에서 평균 ΔIsc포스콜린 (도 2A) 및 평균 ΔIscCFTRinh172 (도 2B) 둘 다에 대해, 신선 또는 동결-해동된 HNE 사이에 유의한 차이가 관찰되지 않았다. CFTR의 기능적 교정이 동결보존에 의해 영향을 받았는지 여부를 평가하기 위해, 평균 Isc 변화는 신선 (n=78명의 환자로부터 유래된 HNE 세포) 또는 동결-해동된 HNE (n=9 환자로부터 유래된 HNE 세포)에서 DMSO 처리된 HNE 세포와 비교하여 VX-809 + VX-770 처리된 세포에서 측정되었다 (도 2). 동결-해동된 세포 및 신선 세포 둘 다 처리시 유의한 보정을 나타내었고, ΔIsc포스콜린의 현저한 증가(p<0.05)(도 2A), 및 ΔIscCFTRinh172의 현저한 감소(p<0.05)(도 2B)가 나타났다(도 2B). ΔIsc 포스콜린 (ΔIsc포스콜린 VX-809 + VX-770/ΔIsc포스콜린 DMSO)에 대한 평균 폴드 증가는 동결 해동된 HNE 세포에서 2.9 ± 1.6에 도달하였고, 신선한 HNE 세포의 폴드 증가와 유의하게 다르지 않았다 (2.5 ± 2.0). 유사하게, ΔIsc CFTRinh172 (ΔIsc CFTRinh172 VX-809 + VX-770/ΔIscCFTRinh172 DMSO)의 배 감소는 냉동 보존에 의해 유의하게 영향을 받지 않았다: 냉동-해동된 HNE에서 1.49 ± 0.9는 신선한 HNE에서 2.5 ± 3.7에 비해 유의하게 영향을 받지 않았다.
여러 조절제 요법의 기능적 교정 활성은 이 HNE 세포 모델이 상이한 치료법들 사이에서 구별될 수 있는지를 평가하기 위해 추가로 조사되었다. 여기서 HNE 세포를 신선 및 냉동-해동 조건 모두에서 결합시킨 결과는 처리에 대한 반응으로서 동결보존에 의해 크게 변화되지 않았다(도 2).
우리는 먼저 10 F508del / F508del 환자의 HNE 세포에서 VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 nM) 또는 VX-661 (3 μM) + VX-770 (100 nM)으로 48 시간 치료 후 Cl-수송에 대한 두 개의 승인 된 CFTR 조절제 요법의 교정기 반응을 평가했습니다 (그림 3). DMSO 처리된 HNE 세포와 비교하여, ΔIsc포스콜린 (도 3A) 및 ΔIscCFTRinh172 (도 3B)는 VX-809 + VX-770 및 VX-661 + VX-770 둘 다에 의해 유의하게 개선되었다. 두 치료법 모두 기능적으로 CFTR-관련 Cl-분비를 유사한 수준으로 교정하였고, VX-809+VX-770의 경우 1.75 ± 1.39의 ΔIsc포스콜린의 유의한 평균 배 증가(p<0.001) 및 VX-661+VX-770의 경우 0.97 ±0.93(p<0.01)이었다. 평균 ΔIsc CFTRinh172 배 감소는 VX-809+VX-770에 대해 1.79 ± 2.04 (p< 0.001)이었고, VX-661+VX-770에 대한 1.16 ± 1.44의 평균 ΔIscCFTRinh172 배 감소와 유의하게 다르지 않았다 (p< 0.001 대 DMSO).
6명의 F508del/F508del 환자로부터의 HNE에서의 세 가지 상이한 CFTR 조절제 요법(도 4)을 추가로 비교하였다. 여기서 결과는 신선 및 냉동 해동 조건 모두에서 HNE 세포를 결합합니다. Vertex 및 Abbvie CFTR 변조기 둘 다, CFTR 보정기와 CFTR 전위차의 조합으로서 사용될 때, ΔIsc포스콜린(도 4A) 및 ΔIscCFTRinh172(도 4B)를 유사한 정도로 보정하였다. VX-809+VX-770에 의해 도 3에서 관찰된 부분 보정은 2.87 내지 1.67의 평균 ΔIsc포스콜린 폴드 증가를 갖는 이들 HNE 세포± 확인되었다 (p<0.05). ABBV-2222 (1 μM) + ABBV-974 (10 μM) 처리는 ΔIsc 포스콜린에 대한 VX-809 + VX-770 보정의 91%를 나타내는 유사한 보정을 유도하였다 (평균 ΔIsc포스콜린 폴드 증가는 2.6 ± 1.4, p < 0.05 대 DMSO) 및 ΔIsc CFTRinh172에 대한 VX-809 + VX-770의 85% (평균 ΔIscCFTRinh172 배 감소는 4.2 ± 5.7, p < 0.05 대 DMSO)를 나타내었다.
흥미롭게도, HNE를 삼중 조합 VX-445 (3 μM) + VX-661 (3 μM) + VX-770 (100 nM)으로 처리하였을 때, 보정 효능이 유의하게 개선되어 VX-809 + VX-770 ΔIsc 포스콜린 보정의 312%에 도달하여 (평균 ΔIsc포스콜린 폴드 9.0 ± 4.1, p< 0.05 대 VX-809 + VX-770) 및 ΔIsc CFTRinh172의 372% (평균 ΔIscCFTRinh172 배 감소 15.5 ± 10.5, p < 0.05 대 VX-809 + VX-770).
도 1: HNE 배양물에서의 분화 마커. CFTR (녹색), Zona-Occludens-1 (ZO-1, 적색), 알파-튜불린 (녹색), Muc5AC (적색) 및 시토케라틴 8 (K8, 녹색)의 면역형광 염색의 대표적인 공초점 현미경 이미지는 야생형 (WT) (첫 번째 패널) 및 F508del (패널 2 -4) HNE 세포에서 3주 동안 공기-액체 계면에서 성장하였다. 핵은 DAPI로 파란색으로 염색하였다. 공초점 현미경 이미지의 투영, 3차원 (3D) Z 스택의 상단 뷰 (상단 패널) 및 측면보기 (하단 패널)가 재구성됩니다. 스케일 바(20μm)는 상부 및 하부 패널 모두에 적용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: HNE 세포에서 CFTR 관련 Cl-분비에 대한 동결-해동의 효과. F508del/F508del 환자로부터 유래되고 3주 동안 공기-액체 계면에서 성장한 HNE 배양물에서의 단락 전류(Isc) 기록(평균 ± SD)의 요약. 세포를 비히클 단독 (DMSO) 또는 VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 nM) 중에서 신선 (밝은 회색, 78명의 환자로부터의 환자 유래 HNE 세포) 또는 냉동-해동 (9명의 환자로부터의 환자 유래 HNE 세포)으로 48시간 동안 처리하였다. 데이터는 급격하게 첨가된 (A) 포스콜린 (10 μM)/3-이소부틸-1-메틸크산틴 (IBMX, 100 μM), ΔIsc포스콜린 또는 (B) CFTR 억제제 inh172 (5 μM) ΔIscCFTRinh172에 대한 평균 (± SD) 반응을 나타낸다. 환자 당 및 조건 당 최소 두 개의 필터를 분석하였다. 별표는 교정자와 대조군 (DMSO 처리) * p < 0.05 (짝을 이루지 않은 t-검정) 사이의 통계적 차이를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 이중 요법에 의한 CFTR 기능의 교정. 10명의 F508del/F508del 환자로부터 유래되고 3주 동안 공기-액체 계면에서 성장한 HNE 배양물에서의 단락 전류(Isc) 기록(평균 ± SD)의 요약(신선 및 동결-해동 배양물 모두로부터의 결합 결과). 세포를 비히클 단독(DMSO)으로 48시간 동안 처리하였다; VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 nM) 또는 VX-661 (3μM) + VX-770 (100 nM). 데이터는 급성으로 첨가된 (A) 포스콜린 (10 μM)/IBMX (100 μM), ΔIsc포스콜린 또는 (B) CFTR 억제제 inh172 (5 μM), ΔIscCFTRinh172에 대한 평균 (± SD) 반응을 나타낸다. 환자 당 및 조건 당 최소 두 개의 필터를 분석하였다. 별표는 교정기와 대조군 (DMSO 처리) 사이의 통계적 차이를 나타냅니다 ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001 (Wilcoxon 일치 쌍 서명 순위 테스트). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: CFTR 교정에 대한 삼중 요법 대 이중 요법의 효율성. 6 명의 F508del / F508del 환자로부터 유래되고 3 주 동안 공기 - 액체 계면에서 성장한 HNE 배양물에서의 단락 전류 (Isc) 기록 (평균 ± SD)의 요약 (신선 및 냉동 해동 세포 모두로부터의 결합 결과). 세포를 비히클 단독(DMSO)으로 48시간 동안 처리하였다; VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 nM); ABBV-2222 (1 μM) + ABBV-974 (10 μM); 또는 VX-661 (3 μM) + VX-445 (3 μM) + VX-770 (100 nM). 데이터는 급성으로 첨가된 (A) 포스콜린 (10 μM)/IBMX (100 μM), ΔIsc포스콜린 또는 (B) CFTR 억제제 inh172 (5 μM), ΔIscCFTRinh172에 대한 평균 (± SD) 반응을 나타낸다. 환자 당 및 조건 당 최소 두 개의 필터를 분석하였다. 별표는 치료 간의 통계적 차이를 나타냅니다. * p < 0.05 (Wilcoxon 일치 쌍 서명 순위 테스트). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 미디어 구성 요소 | 최종 농도 |
| 증폭 매체 | |
| 고급 DMEM/F-12 영양소 혼합물 | 86% |
| 태아 소 혈청 | 10% |
| 페니실린 | 100 U/mL |
| 스트렙토마이신 | 100 μg/mL |
| 타조실린 | 10 μg/mL |
| 암포테리신 B | 2.5 μg/mL |
| 콜리마이신 | 16 μg/mL |
| 시프로플록사신 | 3 μg/mL |
| 하이드로코르티손 | 0.2 μM |
| 인슐린 | 5 μg/mL |
| 에피네프린 | 0.5 μg/mL |
| EGF | 10 ng/mL |
| Y-27632 (로-연관 키나제 억제제) | 10 μM |
| 공기-액체 매체 | |
| 고급 DMEM/F-12 영양소 혼합물 | 94% |
| 울트로저G | 2% |
| 페니실린 | 100 U/mL |
| 스트렙토마이신 | 100 μg/mL |
| 타조실린 | 10 μg/mL |
| 암포테리신 B | 2.5 μg/mL |
| 콜리마이신 | 16 μg/mL |
| 농축 냉동 매체 | |
| F12 영양 혼합물 | 77% |
| 헤페스 | 3% |
| 태아 소 혈청 | 10% |
| 증권 시세 표시기 | 10% |
표 1: 증폭, 공기-액체 및 농축된 동결 배지 조성. 시약 및 상응하는 최종 농도의 목록.
| 파종 전 비강 양치질의 보존 기간 (n = 78) | |
| 시드 전 일 수 | 성공률(%) |
| 0 | 83 |
| 1 | 84 |
| 2 | 67 |
| 3 | 100 |
| 4 | 89 |
| 5 | 100 |
| 7 | 0 |
| 신선하고 냉동 해동 된 조건 모두에서 자란 동일한 초기 비강 칫솔질의 결과 (n = 13) | |
| 신선한 조건에서의 결과 | 동결해동 시 성공률(%) |
| 성공 | 83 |
| 실패 | 29 |
| 셀 번호가 성공률에 미치는 영향(n = 36) | |
| 냉동 당 세포 수 | 동결해동 시 성공률(%) |
| <2 x 106 | 20 |
| 2–3 x 106 | 50 |
| 3–4 x 106 | 67 |
| >4 x 106 | 79 |
표 2: 신선하고 냉동된 해동된 HNE 세포 배양물에서의 성공률에 영향을 미치는 파라미터. 성공률은 공기-액체 계면에서 3주 후에 의사 층화된 상피로 성공적으로 확장되고 분화된 비강 칫솔질로 정의되었으며, 200 Ω·cm2보다 높은 TEER를 제시하였다. 시딩 전에, 샘플은 항생제로 플러싱 배지에서 실온에서 선적되었다. 결과는 78개의 신선한 샘플과 36개의 냉동-해동된 샘플로부터의 데이터를 나타낸다. 13개의 비강 칫솔질을 신선 및 냉동-해동 조건 모두에서 분석하였다.
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Discussion
개인화된 의학의 맥락에서 CFTR 활성을 측정하기 위한 인간 기관지 상피(HBE) 세포의 대리자로서 환자 유래 비강 상피 세포의 사용은 HNE가 배양물 9,11에서 세포의 특성을 재생산함에 따라 제안되었다. HBE 세포 배양에 비해 HNE의 강력한 장점은 이들이 쉽고 비침습적으로 샘플링된다는 것이다. HNE 세포 배양물에서의 단락 전류 측정은 상피를 가로지르는 CFTR 의존성 Cl-수송의 평가를 가능하게 하며, 이는 다양한 유전자형9를 갖는 환자에서 비강 전위차에 의해 평가된 생체내 CFTR 활성과 유의하게 상관관계가 있는 것으로 나타났다. VX-809 치료시 HNE 세포에서 CFTR 활성의 구출은 또한 루마카프토르-이바카프터 처리된 F508del 동형접합성 환자12에서 임상 결과 FEV1의 개선과 유의하게 상관관계가 있다.
중요하게도,이 연구는 갓 수확 된 HNE 세포가 운송 및 표준 운송 조건 (즉, 실온에서 72 시간 생존)을 쉽게 견딜 수 있음을 보여 주므로 다양한 지리적 위치에서 유래 한 환자의 세포를 테스트 할 수 있습니다. 성공적인 배양을위한 중요한 요소는 주로 비강 칫솔질의 품질과 샘플링시 살아있는 세포의 수입니다. HNE 세포 배양물의 성장 및 분화에 관한 다수의 프로토콜이 발표되었다; 일부는 확장 단계 동안 조건부 재 프로그래밍이 없는 경우 13,14,15,16,17,18,19,20, 일부는 피더9,11,12,21,22,23,24,25에서 조건부 리프로그래밍을 수행합니다. ,26 또는 피더-프리 5,8,27,28,29 조건, 및 몇몇 상이한 방법들을 비교하는 방법 7,8. 그들은 모두 좋은 TEER 값뿐만 아니라 정확한 분화 및 분극으로 상대적으로 많은 수의 ALI 배양물을 얻을 수 있습니다. 이 연구와 유사하게, 많은 사람들은 계대 113,28에서 동결 된 냉동 보존 된 HNE 세포를 사용했습니다. 흥미롭게도, 몇몇 저자들은 ROCKi가 해동 후 배양 배지에 첨가 될 때 냉동 보존 후 생존을 향상시키고 부착 된 채로 남아있는 세포의 수를 5,29 증가시킬 수 있다고보고하며,이 연구에 사용 된 증폭 배지가 냉동 보존에 특히 적합하다는 것을 암시합니다.
여기서, 연구는 HNE 세포가 성공적으로 바이오뱅크화될 수 있다는 것을 보여주는데, 이는 다시 비강 칫솔질의 질이라는 중요한 요소이다. 신선한 샘플의 결과와 냉동 해동 된 샘플의 결과 사이의 좋은 상관 관계가 나타나며, 이는 추가 연구를 위해 바이오 뱅크 될 HNE 세포의 품질을 최적화하기 위해 올바른 ALI 분화 및 수용 가능한 TEER 값을 달성하지 못하면 신선한 샘플에 대한 예비 연구를 수행 할 수 있음을 시사합니다. 두 번째 비강 칫솔질은 결과가 좋지 않을 확률이 높은 세포를 얼리는 것보다 바람직합니다. 냉동 보존에 대한 두 번째 중요한 요소는 세포 번호입니다. 본 연구에 사용된 배양 조건에서, 동결 당 2 x 10미만의 6 세포가 동결될 때, 실패율은 매우 높다. 냉동 당 적어도 3 x 106 세포를 동결하는 것이 좋습니다.
이 연구의 결과는 동결 해동이 HNE 세포의 전기 생리학적 특성 또는 CFTR 조절제에 대한 반응을 유의하게 변형시키지 않는다는 것을 시사한다. 동결 없이 또는 해동 후에 수득된 동일한 F508del-동형접합성 환자로부터의 HNE 세포 배양물에서의 측정의 범위는 VX-809+VX-770 처리시 다르지 않았다. Forskolin-자극된 Isc가 처리되지 않은 F508del 세포(30)의 몇 번의 해동/배양 주기 후에 안정했던 HBE 세포에 대해서도 이전에 유사한 결과가 보고되었다. 이것은 HNE 세포가 동결되어 바이오뱅크에 저장될 수 있다는 증거를 제공하고 나중에 연구한다.
점점 더 많은 연구가 HNE 세포 배양이 개인화 된 의학의 맥락에서 다른 치료법의 효능을 테스트하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다. 이 분석은 교정자와 강화제를 결합하는 이중 요법이 모두 F508del-동형접합성 HNE 세포에서 CFTR 의존성 Cl-분비에 대해 필적할만한 보정 효능을 갖는다는 것을 보여주었다. 그러나 중요한 환자 간 변동성이 발견되어 발표 된 결과 9,12,20,25가 확인되었습니다. 대조적으로, VX-445 + VX-661 + VX-770은 VX-809 + VX-770에 비해 CFTR 활성의 세 배 보정을 하였다. 삼중 조합시 HNE 세포에서 F508del-CFTR의 유사한 수준의 교정이 Laselva et al.28에 의해 또한 관찰되었다. Veit et al.26에 의해 보고된 바와 같이, VX-445 + VX-661 + VX-770 처리시 Cl-채널 기능의 보정은 훨씬 더 높았고, 평균 WT-CFTR 활성의 62%에 도달하였다(보정된 F508del-HNE에서 19-36 μA/cm2의 범위, WT-HNE에서 14-50 μA/cm2의 범위)26.
HNE 세포 배양물은 또한 다른 클래스 II 돌연변이에 대한 CFTR 조절제의 효능을 시험하는 역할을 하였다. VX-445 + VX-661 + VX-770에 대한 CFTR 활성의 중요한 개선은 G85E/G85E, V520F/1717-1G>A, Y569/Y569D, M1101K/M1101K 및 N1303K/N1303K 유전자형26을 보유하는 HNE ALI 배양물에서 관찰되었다. 유사하게, Laselva et al.28은 M1101K 및 N1303K 돌연변이를 사용한 CFTR의 유의한 교정을 나타내었지만 G85E HNE 세포에서는 유의한 보정이 없었다. 갈라파고스/애브비 교정인자는 이들 루마카프토르-이바카프터 내성 돌연변이체(31)에 대해 평가되었다. 애브비 교정기 AC2-1 및 특히 이중 교정기 AC1+AC2-1은 M1101K 및 G85E HNE 세포에서 Cl- 분비를 효과적으로 개선한 반면, N1303K 유래 세포는 AC1+AC2-2의 조합에 의해 보정되었다.
HNE 세포에서 CFTR 활성의 측정은 시험된 치료에 대한 환자의 반응에 대해 예측되는 유망한 전임상 바이오마커이다. 동결 - 해동 사이클이 보정 수준을 변경하지 않는다는 증거는 이러한 세포가 바이오 뱅크화되어 개인화 된 의학 프로그램의 맥락에서 강력한 도구로 사용될 수 있다는 증거를 제공합니다. 따라서 독특한 비강 칫솔질은 약물 효능을 비교하기에 충분한 물질을 허용 할 수 있으며, 환자를 재 샘플링 할 필요없이 신약을 사용할 수있게됨에 따라 환자의 HNE 세포가 해동 될 수 있습니다. 이것은 유아에게 특히 흥미 롭습니다.
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Disclosures
저자는이 출판물이나 과학 비디오 제작과 관련된 경쟁적인 재정적 이익을보고하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 연구에 참여한 모든 환자와 그 가족에게 진심으로 감사드립니다. 이 작품은 프랑스 협회 Vaincre la Mucoviscidose의 보조금으로 지원되었습니다. 프랑스 협회 ABCF 2 및 버텍스 제약 혁신 상.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABBV-2222 | Selleckchem | S8535 | |
| ABBV-974 | Selleckchem | S8698 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies | 12634010 | |
| Alexa 488 goat secondary antibody | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa 594 goat secondary antibody | Invitrogen | A11012 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290026 | |
| Anti-alpha-tubulin antibody | Abcam | ab80779 | |
| Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1) | R&D Systems | MAB25031 | |
| Anti-cytokeratin 8 antibody | Progen | 61038 | |
| Anti-Muc5AC antibody | Santa Cruz Biotech | sc-20118 | |
| Anti-ZO-1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-10804 | |
| Ciprofloxacin | provided by Necker Hospital Pharmacy | ||
| Colimycin | Sanofi | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Collagen type IV | Sigma-Aldrich Merck | C-7521 | |
| cytology brush | Laboratory GYNEAS | 02.104 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich Merck | D2650 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Epinephrin | Sigma-Aldrich Merck | E4375 | |
| F12-Nutrient Mixture | Life Technologies | 11765054 | |
| FBS | Life Technologies | 10270106 | |
| Ferticult | Fertipro NV | FLUSH020 | |
| Flasks 25 | Thermo Scientific | 156.367 | |
| Flasks 75 | Thermo Scientific | 156.499 | |
| Glacial acetic acid | VWR | 20104.298 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich Merck | H3375 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich Merck | SLCJ0893 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich Merck | I0516 | |
| Mg2+ and Ca2+-free DPBS | Life Technologies | 14190094 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140130 | |
| Tazocillin | Mylan | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Transwell Filters | Sigma-Aldrich Merck | CLS3470-48EA | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich Merck | T8787 | |
| Trypsin 0,25% | Life Technologies | 25200056 | |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| VX-445 | Selleckchem | S8851 | |
| VX-661 | Selleckchem | S7059 | |
| VX-770 | Selleckchem | S1144 | |
| VX-809 | Selleckchem | S1565 | |
| Xylocaine naphazoline 5% | Aspen France | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
References
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