Summary
Hier beschrijven we een reeks methoden voor het karakteriseren van de interactie van eiwitten met membranen van cellen of microvesicles.
Abstract
In het menselijk lichaam vinden de meeste van de belangrijkste fysiologische reacties die betrokken zijn bij de immuunrespons en bloedstolling plaats op de membranen van cellen. Een belangrijke eerste stap in elke membraanafhankelijke reactie is binding van eiwit op het fosfolipidemembraan. Een benadering voor het bestuderen van eiwitinteractie met lipidembranen is ontwikkeld met behulp van fluorescerend gelabelde eiwitten en flowcytometrie. Deze methode maakt de studie van eiwit-membraaninteracties mogelijk met behulp van levende cellen en natuurlijke of kunstmatige fosfolipide blaasjes. Het voordeel van deze methode is de eenvoud en beschikbaarheid van reagentia en apparatuur. Bij deze methode worden eiwitten gelabeld met behulp van fluorescerende kleurstoffen. Er kunnen echter zowel zelfgemaakte als commercieel verkrijgbare, fluorescerend gelabelde eiwitten worden gebruikt. Na conjugatie met een fluorescerende kleurstof worden de eiwitten geïncubeerd met een bron van het fosfolipidemembraan (microvesicles of cellen) en worden de monsters geanalyseerd door flowcytometrie. De verkregen gegevens kunnen worden gebruikt om de kinetische constanten en het evenwicht Kd te berekenen. Bovendien is het mogelijk om het geschatte aantal eiwitbindingsplaatsen op het fosfolipidemembraan te schatten met behulp van speciale kalibratieparels.
Introduction
Biomembranen scheiden de inwendige inhoud van dierlijke cellen en extracellulaire ruimte. Merk op dat membranen ook microvesicles omringen die zijn gevormd tijdens de levenscyclus van de cel en organellen. Het celmembraan bestaat voornamelijk uit lipiden en eiwitten. Membraaneiwitten voeren signaal-, structurele, transport- en kleeffuncties uit. De lipide bilayer is echter ook essentieel voor de onderlinge relatie van de dierlijke cel met de extracellulaire ruimte. Dit artikel stelt een methode voor om de perifere interactie van externe eiwitten met het lipidemembraan te bestuderen.
Het meest treffende voorbeeld van reacties op de buitenste membraanlaag van een dierlijke cel is de bloedstollingsreactie. Een belangrijk kenmerk van bloedstolling is dat alle hoofdreacties plaatsvinden op de fosfolipidemembranen van cellen en microvesicles die uit deze cellen voortkomen en niet in het plasma 1,2,3. Membraanafhankelijke reacties omvatten het proces van het starten van coagulatie (op de celmembranen van het subendotheel, ontstoken endotheel of geactiveerde immuuncellen, met de deelname van een weefselfactor), alle reacties van de belangrijkste cascade-activering van factoren IX, X, protrombine; activering van factor XI door trombine (op de membranen van geactiveerde bloedplaatjes, erytrocyten, lipoproteïnen en microvesicles); reacties van de eiwit C-route; inactivatie van stollingsenzymen (op de membranen van endotheelcellen met de deelname van trombomodulinecofactoren, endotheeleiwit C-receptor, heparansulfaat); en contactwegreacties (op membranen van bloedplaatjes en sommige microvesicles met de deelname van onbekende cofactoren). Het is dus onmogelijk om bloedstolling te onderzoeken zonder de interactie van verschillende plasma-eiwitten met het membraan van bloedcellen te bestuderen.
Dit artikel beschrijft een op flowcytometrie gebaseerde methode voor het karakteriseren van de interactie van eiwitten met lipidemembranen van cellen of microvesicles. Deze aanpak werd aanvankelijk voorgesteld om de interactie van bloedplasma met bloedplaatjes en kunstmatige fosfolipideblaasjes te bestuderen. Bovendien interageren de meeste van de bestudeerde eiwitten direct met negatief geladen membraanfosfolipiden, met name met fosfatidylserine 4,5. Bovendien zijn er eiwitten waarvan de interactie met het membraan wordt gemedieerd door speciale receptoren6.
Een belangrijk vermogen van flowcytometrie is het onderscheiden van vrije en gebonden liganden zonder extra scheiding. Dit kenmerk van cytometrie maakt de studie van ligand-evenwichtsbinding op het eindpunt mogelijk en helpt bij het uitvoeren van continue kinetische metingen. De techniek is ongekunsteld en vereist geen complexe monstervoorbereiding. Flowcytometrie wordt actief gebruikt om de dynamiek van de interactie tussen fluorescerende peptiden, receptoren en G-eiwitten in intacte en detergent-permeabele neutrofielen kwantitatief te bestuderen7. Deze benadering is ook van toepassing voor het onderzoeken van eiwit-DNA-interacties en de kinetiek van endonuclease-activiteit in realtime8. In de loop van de tijd werd deze methode gebruikt om eiwit-eiwitinteracties met hoge affiniteit kwantitatief te bestuderen met gezuiverde lipideblaasjes9, of, meer in het algemeen, met membraaneiwitten uitgedrukt in een zeer efficiënt Sf9-celexpressiesysteem10. Kwantitatieve methoden zijn ook beschreven voor het karakteriseren van eiwit-liposoom interacties met behulp van flowcytometrie voor transmembraaneiwitten11.
Deze techniek maakt gebruik van zelfgemaakte kalibratieparels om te voorkomen dat in de handel verkrijgbare kralen wordengebruikt 7. De eerder gebruikte kalibratieparels7 waren bedoeld om te werken met fluoresceïne, wat het assortiment toegankelijke fluorescerende liganden op de eiwitten aanzienlijk beperkte. Bovendien biedt dit artikel een nieuwe manier om kinetische gegevens te verkrijgen en te analyseren voor een redelijke tijdsresolutie. Hoewel deze methode wordt beschreven voor kunstmatige fosfolipide blaasjes, zijn er geen duidelijke beperkingen voor het aanpassingsvermogen aan cellen, natuurlijke blaasjes of kunstmatige fosfolipide blaasjes met een andere lipidesamenstelling. De hierin beschreven methode maakt het mogelijk de parameters van interactie (kaan, kuit) en evenwicht (Kd) te schatten en vergemakkelijkt de kwantitatieve karakterisering van het aantal eiwitbindingsplaatsen op het membraan. Merk op dat deze techniek een geschatte schatting geeft van het aantal bindingsplaatsen. De voordelen van de methode zijn de relatieve eenvoud, toegankelijkheid en aanpasbaarheid aan inheemse cellen en natuurlijke en kunstmatige microvesicles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fluorescerende eiwitetikettering
- Materiaalvoorbereiding
- Bereid 1 M natriumbicarbonaatbuffer, pH 9,0, bewaar het bij 4 °C en gebruik het binnen een week.
- Bereid 1,5 M hydroxylaminehydrochloridebuffer, pH 8,5, onmiddellijk voor gebruik.
- Bereid een 10 mg/ml oplossing van fluorescerende kleurstof (zie de tabel met materialen) in dimethylsulfoxide.
OPMERKING: Deze oplossing kan een maand worden bewaard bij -20 °C in het donker. - Bereid oplossingen van gezuiverde antilichamen of andere eiwitten op 1-10 mg / ml.
OPMERKING: Vermijd buffers die ammoniumionen of primaire amines bevatten. Vervang de buffers die Tris of glycerol bevatten door fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) door dialyse. Noch natriumazide (≤3 mM) noch thimerosal (≤1 mM) zullen de conjugatiereactie significant beïnvloeden. - Incubeer het gelfiltratiemedium (zie de tabel met materialen) voor eiwitzuivering in PBS 's nachts bij kamertemperatuur of gedurende 2 uur bij 60 °C. Breng het gelfiltratiemedium aan op spinkolommen met membranen van 0,2 μm.
- Bereken de hoeveelheid reactieve kleurstof die voor elke reactie moet worden gebruikt op basis van de concentratie eiwit die moet worden geëtiketteerd met behulp van Eq (1).
WaarbijV-kleurstof het volume van de kleurstofvoorraadoplossing is; Cpr, Vpr en MWpr = de concentratie, het volume en het molaire gewicht van het eiwit; MWkleurstof is het molaire gewicht van de kleurstof; 100 is een eenheidsomrekeningsfactor; MR is de molaire verhouding van kleurstof tot eiwit in het reactiemengsel.
OPMERKING: De volgende MR's worden aanbevolen voor IgG-etiketteringsreacties: MR = 40 als het antilichaam 1-3 mg / ml is of MR = 30 als het antilichaam 4-10 mg / ml is. Voor stollingsfactoren wordt meestal MR = 5 gebruikt. - Conjugatiereactie
- Meng in een reactiebuis de eiwitoplossing met een 10x lager volume van 1 M bicarbonaatoplossing.
- Voeg de vereiste hoeveelheid fluorescerende kleurstof (zie stap 1.2) toe onder continu roeren.
- Incubeer het reactiemengsel bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 1 uur, beschermd tegen licht en met continu roeren.
- Voeg voor elke 200 μL eiwitoplossing 5 μL 1,5 M hydroxylaminehydrochloride toe.
- Incubeer het reactiemengsel bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 30 minuten, beschermd tegen licht en met continu roeren.
- Bereid de spinkolom voor.
- Voeg 500 μL gelfiltratiemedium voor eiwitzuivering toe aan een kolom. Centrifugeer de kolom gedurende 3 minuten bij 1.000 × g.
- Gooi de buffer uit de opvangbuis. Als de kolom niet vol is, voeg dan meer gelfiltratiemedium toe en centrifugeer de kolom gedurende 3 minuten bij 1.000 × g. Herhaal deze stap totdat de kolom vol is.
- Zuivering
- Centrifugeer het reactiemengsel (vanaf stap 1.3.5) gedurende 5 minuten bij 17.000 × g en verwijder het neerslag.
- Breng het supernatant over naar de spinkolom met gelfiltratiemedium. Laat de oplossing intrekken in het gelbed.
- Gebruik een lege opvangbuis voor de spinkolom en centrifugeer deze gedurende 5 minuten bij 1.000 × g. Verzamel na centrifugatie het gelabelde eiwit uit de verzamelbuis.
- Bepaling van de mate van etikettering
- Corrigeer voor de bijdrage van de kleurstof aan de absorptie bij A280 door de absorptie van vrije kleurstof bij 280 nm (A280) en de λmax voor de kleurstof (Amax) te meten (zie Eq (2)).
(2) - Meet de absorptie van het eiwit-kleurstofconjugaat bij 280 nm (A280) en de λmax voor de kleurstof (Amax) en bereken de eiwitconcetratie met behulp van Eq (3).
(3)
Waarbij εM de molaire extinctiecoëfficiënt van het eiwit bij 280 nm is; d = de optische padlengte tijdens de meting van de absorptie; CF is de bijdrage van de kleurstof aan de absorptie bij A280 (stap 1.6.1). - Bereken de mate van labeling (DOL) met behulp van Eq (4).
(4)
Waarbij ε M-kleurstof de molaire extinctiecoëfficiënt van de kleurstof bij λmax nm is; d = de optische padlengte tijdens de meting van de absorptie; C-eiwit is de concentratie van het eiwit (stap 1.6.2).
- Corrigeer voor de bijdrage van de kleurstof aan de absorptie bij A280 door de absorptie van vrije kleurstof bij 280 nm (A280) en de λmax voor de kleurstof (Amax) te meten (zie Eq (2)).
(2)
(3)
(4)2. Bereiding van fosfolipide blaasjes
- Bereiding en opslag van het lipidenmengsel
- Combineer de lipiden in de juiste verhouding (fosfatidylserine/fosfatidylcholine in een verhouding van 20 mol% tot 80 mol%).
- Droog het lipidenmengsel na lyofilisatie of verdamping en bewaar het onder een inerte atmosfeer in glazen ampullen.
- Productie van lipidefilms
- Open de ampul en resuspendeer het lipidenmengsel in een kleine hoeveelheid (~ 100 μL) chloroform.
OPMERKING: Gebruik niet te veel chloroform omdat het niet volledig verdampt. - Voeg DiIC16(3) toe aan ethanol bij 0,2 mol%. Breng het lipidenmengsel over in een kolf met ronde bodem. Verdeel het mengsel dun over de zijkanten van de kolf door het te draaien. Droog de lipidenmix gedurende 30 minuten onder een argonstroom.
- Open de ampul en resuspendeer het lipidenmengsel in een kleine hoeveelheid (~ 100 μL) chloroform.
- Hydratatie van het lipidenmengsel
- Voeg een voldoende warme (~55 °C) waterige buffer (HEPES 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4) toe in een volume dat overeenkomt met de verwachte lipideconcentratie aan de kolf met de lipidenfilm. Incubeer het mengsel met vortexing op 55 °С gedurende 30 minuten voor volledige hydratatie.
- Plaats de monsterbuis in een vriezer of warme thermostaat om de lipidensuspensie 3-5 vries-dooicycli te laten ondergaan.
- Vorming van lipideblaasjes door extrusie
- Bereid de extruder voor volgens de instructies van de fabrikant. Warm alle extrudercomponenten op tot de faseovergangstemperatuur van het lipidenmengsel.
- Vul een van de extruderspuiten met het gehydrateerde lipidenmengsel. Wacht 5-10 minuten tot de temperatuur van de lipidensuspensie in evenwicht is met de temperatuur van de extruder.
- Extrudeer het lipidenmengsel minstens 10 keer door het membraan. Plaats voor de uiteindelijke extrusie de lipidensuspensie in de alternatieve spuit en zoek naar een verandering in uiterlijk van een enigszins vage naar een heldere oplossing.
- Bewaar het resulterende mengsel van lipideblaasjes bij 4 °C, bij voorkeur in een inerte atmosfeer van argon of stikstof, gedurende 3-4 dagen. Niet in de vriezer bewaren.
3. Isolatie van bloedplaatjes uit volbloed
- Verzamel volbloed van gezonde donoren in buizen die 3,2% natriumcitraat bevatten.
- Voeg prostaglandine E1 (PGE1) (1 μM) en apyrase (0,1 U/ml) toe aan het bloed, gevolgd door centrifugatie bij kamertemperatuur bij 100 × g gedurende 8 minuten.
- Neem na centrifugatie het bloedplaatjesrijke plasma en voeg natriumcitraatoplossing (106 mM, pH 5,5) toe aan een plasma/citraatverhouding van 3:1. Centrifugeer het plasma bij kamertemperatuur bij 400 × g gedurende 5 min.
- Verwijder het supernatant en resuspenseer de pellet in 300 μL tyrodebuffer zonder BSA (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,4 mM NaH2PO4, 2,5 mM CaCl2, 5 mM glucose, pH 7,4). Zuiver de bloedplaatjes uit plasma-eiwitten door gelchromatografie op het gelfiltratiemedium voor bloedplaatjeszuivering (zie de materiaaltabel).
4. Detectie van eiwit - lipide interactie door flowcytometrie
- Kinetische bindingsexperimenten
- Verdunde fosfolipide blaasjes (vanaf stap 2.4.4) in de buffer van Tyrode (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,4 mM NaH2PO4, 2,5 mM CaCl2, 5 mM glucose, 0,5% BSA, pH 7,4) tot een concentratie van 1 μM en een totaal volume van 250 μL.
- Meng fluorescerend gelabelde stollingsfactor X (fX-fd) uit stap 1 bij een concentratie van 500 nM met de fosfolipide blaasjes uit stap 4.1.1 in een verhouding van 1:1 (uiteindelijke blaasjesconcentratie 0,5 μM, fX-fd-concentratie is 250 nM fX) tot een totaal volume van 500 μL.
- Injecteer onmiddellijk de 500 μL van de gemengde suspensie (~ 20 min voor analyse met een lage stroomsnelheid) in de flowcytometer. Gebruik een laag debiet en zorg ervoor dat de drempelwaarde voor kanaal FL2 (exсitatie 488 nm, emissiefilter 585/42 nm) als waarde 200 is. Meet de gemiddelde fluorescentie in kanaal FL4 (exсitatie 633 nm, emissiefilter 660/20) voor de fluorescentiekleurstof uit de materiaaltabel.
OPMERKING: Kies een cytometer zonder autosampler. Dit versnelt het proces van injectie van het monster in de meetcel. - Wanneer verzadiging van binding is bereikt (geen significante toename van fluorescentie binnen 5 minuten), verdunt u het monster snel 20-voudig met de buffer van Tyrode en controleert u de dissociatie totdat de basisfluorescentie is bereikt (volledige dissociatie) of totdat een plateau is bereikt (geen significante afname van fluorescentie binnen 5 minuten).
OPMERKING: Voeg als controle 10 μM EDTA toe en controleer de volledige dissociatie gedurende 5 minuten.
- Evenwichtsbindingsexperimenten
OPMERKING: Gebruik de kinetische curve van binding om de tijd tot verzadiging te bepalen; de tijd voor verzadiging voor fX-fd en kunstmatige blaasjes is 20 min.- Incubeer kunstmatige fosfolipide blaasjes (5 μM) voor de bindingstest met verschillende concentraties fX-fd (van 0 tot 1.000 nM) in de buffer van Tyrode gedurende 20 minuten.
- Verdun elk monster vanaf stap 4.2.1 met 20x tot een eindvolume van 200 μL met de buffer van Tyrode. Analyseer onmiddellijk het verdunde monster door flowcytometrie binnen 30 s. Gebruik de instellingen uit stap 4.1.3.
OPMERKING: Gebruik als controle voor niet-specifieke binding vergelijkbare monsters met EDTA (10 μM) en incubeer ze gedurende 5 minuten.
5. Analyse van flowcytometriegegevens
- Exporteer experimenten in FSC-formaat van cytometrie data acquisitie software naar cytometer software voor data-analyse (zie de Tabel van Materialen). Kies | | exporteren FCS-bestanden. Open FSC-bestanden in cytometersoftware voor gegevensanalyse door de bestanden op de computer te selecteren en naar de werkruimte van het programma te slepen.
- Identificeer voor gating van de microvesicles het gebied van microvesicles door de fluorescentie van de lipofiele kleurstof DiIC16 (3). Gebruik menuopdrachten of plotknop in het werkblad om dot plot SSC te maken van FL2 (dye DilC16(3)) in logcoördinaten. Kies de knop Rechthoekige poort om een gatgebied te tekenen, zodat gebeurtenissen uit een monster zonder blaasjes niet in dit gebied worden opgenomen (figuur 1B,C).
- Analyseer de kinetische experimenten.
- Maak een dot-plot met behulp van de coördinaten van fluorescentie (FL4) in de loop van de tijd voor het gebied van de blaasjes (dubbelklik in het gebied van blaasjes in stap 5.2)
- Exporteer de gegevens over de verandering in fluorescentie in de loop van de tijd in csv-indeling. Voorbeeld | kiezen Klik met de rechtermuisknop op | | exporteren Kies FL4 en Tijd in parameters | Selecteer map voor het opslaan van | Selecteer CSV-indeling | Exporteren.
- Open het CSV-bestand in een statistische software (zie de materiaaltabel). Bereken een eenvoudig voortschrijdend gemiddelde van fluorescentie en tijd voor elke 1.000 gebeurtenissen.
- Benader een grafiek van de afhankelijkheid van de eenvoudige voortschrijdende gemiddelde fluorescentie op tijd onder de aanname van exponentiële afhankelijkheid (Analysis > Fitting >Nonlinear Curve Fit) en gebruik deze om de kinetische associatieconstante te berekenen met behulp van Eq (5).
(5)
waarbij [XB] de gebonden factorconcentratie op elk moment van de tijd (door de gebruiker gedefinieerde eenheden) is volgens het eenvoudig voortschrijdend gemiddelde uit stap 5.3.3; [X] is de toegevoegde factorconcentratie; [X]max = de maximale gebonden factorconcentratie; k is de associatieconstante; t is de tijd. - Herhaal dezelfde reeks acties (5.3.1-5.3.4) om de kinetische dissociatieconstante te berekenen met behulp van Eq (6).
(6)
Waarbij [XB] de gebonden factorconcentratie op elk moment van de tijd is; [X]0 is de gebonden factorconcentratie op het beginmoment; k de dissociatieconstante is; t is de tijd.
- Evenwichtsbindingstest
- Bepaal de gemiddelde fluorescentie van fX-fd in het gebied van de blaasjes voor elke geselecteerde concentratie fX-fd.
- Benader de afhankelijkheid van de gebonden factor fluorescentie van de concentratie van de toegevoegde factor in de aanname van eenvoudige binding op één locatie. Bereken de gemiddelde bindingsparameters met behulp van Eq (7) uit minimaal drie onafhankelijke herhalingen.
(7)
Waarbij [XB] de gebonden factorconcentratie is; [X] is de toegevoegde factorconcentratie; nx = het schijnbare aantal bindingsplaatsen per blaasje; Kd is de schijnbare dissociatieconstante.
(5)
(6)
(7)6. Fluorescentie-intensiteit omzetten in het gemiddelde aantal bindingsplaatsen
- Bereid gekalibreerde kralen voor.
- Incubeer gelgefilterde bloedplaatjes (zie stap 3.3) met A23187 (10 μM) in aanwezigheid van CaCl2 (2,5 mM) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg aan de geactiveerde bloedplaatjes de verschillende concentraties fX-fd (0 tot 1.000 nM) toe. Voeg 2% v/v formaldehyde toe en incubeer gedurende 1 uur. Stop de reactie door de bloedplaatjes te incuberen met 3 M glycine en 5% BSA gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Zuiver het mengsel van de niet-gereageerde kleurstof. Centrifugeer de bloedplaatjes gedurende 5 minuten bij 400 × g, verwijder het supernatant en resuspeneer de pellet in de buffer van Tyrode (met 0,5% BSA).
OPMERKING: Herhaal stap 6.1.3 drie keer.
- Meet eerst het fluorescentieniveau van de kalibratieparels in elk monster met behulp van een spectrofluorometer (voor fluorescerende kleurstof uit de materiaaltabel excitatie 633 nm, emissie 670 nm) en vervolgens met behulp van de flowcytometer (in kanaal FL4: excitatie 633 nm, emissiefilter 660/20). Bepaal met behulp van een celteller het aantal kralen in elk monster.
- Converteer de fluorescentie-intensiteit van elk respectievelijk kraalmonster naar de concentratie oplosbare fluorescerende kleurstof met behulp van een spectrofluorometer. Herbereken de fluorescerende kleurstofconcentratie voor het aantal fluorofoormoleculen met behulp van Eq (8).
(8)
Waarbij Nx het aantal fluorofoormoleculen is; C = de fluorescerende kleurstofconcentratie; NA is de constante van Avogadro; NA = 6.02214076×1023 mol -1. - Maak een afhankelijkheidsgrafiek van de gemiddelde fluorescentie van de kralen in een flowcytometer (stap 6.2) van het aantal fluorofoormoleculen (zie stap 6.3) voor elk monster met behulp van statistische software (zie de tabel met materialen). Deze afhankelijkheid benaderen op basis van regelproportionaliteit (analyse | Montage | Pasvorm lineair). Bereken op basis van de benadering in Eq (9) de conversiefactor van de gemiddelde fluorescentie naar bindingsplaatsen.
(9)
Waarbij MF de gemiddelde fluorescentie van kralen door flowcytometrie is; Nx is het aantal fluorofoormoleculen per kraal; CF vertegenwoordigt de conversiefactor van de gemiddelde fluorescentie naar bindingsplaatsen. CF en b worden verkregen uit de resultaten van het passen van de grafiek door lineaire proportionaliteit. - Bereken het schijnbare aantal bindingsplaatsen per vesicle van belang met behulp van Eq (10).
(10)
Waarbij nx het schijnbare aantal bindingsplaatsen per vesikel van belang is; MF is de gemiddelde fluorescentie van de blaasjes van belang door flowcytometrie; CF en b zijn conversiefactoren van de Eq (8).
(8)
(9)
(10)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hierin beschreven flowcytometriemethode wordt gebruikt om de binding van plasmastollingseiwitten aan geactiveerde bloedplaatjes te karakteriseren. Daarnaast werden fosfolipide blaasjes PS:PC 20:80 toegepast als modelsysteem. Dit artikel richt zich vooral op kunstmatige fosfolipide blaasjes als voorbeeld. De parameters van de cytometer, met name de spanning van de fotomultiplicatorbuis (PMT) en de compensatie moeten worden geselecteerd voor elk specifiek hulpmiddel, het onderzoeksobject (cellen, kunstmatige of natuurlijke microvesicles) en de gebruikte kleurstoffen. Figuur 1B,C toont een voorbeeld van het gating kunstmatige fosfolipide blaasjes die ~1 μm groot zijn met de opgenomen lipofiele fluorescerende kleurstof DiIC16 (3). Grote blaasjesgrootte en lipofiele fluorescerende kleurstof hielpen blaasjes te detecteren met behulp van een cytometer. De poort werd ingesteld op basis van een monster dat de kunstmatige lipideblaasjes van dezelfde grootte bevatte, maar zonder de fluorescerende kleurstof (figuur 1B). Alleen gebeurtenissen binnen deze poort werden gebruikt in de analyse.
De kinetiek van eiwitbinding aan blaasjes werd in de eerste fase geanalyseerd. Het monster hiervoor werd continu verzameld zoals beschreven in stap 4.1. Een typische dot-plot wordt weergegeven in figuur 1D-F. De verkregen gegevens werden geanalyseerd met behulp van de flowcytometriesoftware. De resulterende curve is weergegeven in figuur 1G. Vaste lijnen tonen de krommen van benadering, waaruit de kinetische constanten van associatie (kaan) en dissociatie (kuit) werden verkregen. Aangezien factor X reversibel en Ca2+-afhankelijk bindt aan fosfolipiden, controleerden monsters met EDTA de specificiteit en reversibiliteit van deze binding. De resulterende constanten zijn weergegeven in tabel 1.
Op basis van de kinetiek van binding werd een tijd van 20 minuten gekozen voor verdere evenwichtsexperimenten om verzadiging in binding nauwkeurig te beschrijven. De gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de factor werd vervolgens bepaald in het gebied van de blaasjes. Elk monster werd geanalyseerd in de aan- en afwezigheid van EDTA. De fluorescentie-intensiteit in aanwezigheid van EDTA werd als achtergrond genomen en afgetrokken van het totale signaal, omdat de binding van fX aan het membraan in afwezigheid van Ca2+ ionen als niet-specifiek wordt beschouwd. De resulterende fluorescentie werd met behulp van de kalibratieparels omgezet in het aantal bindingsplaatsen per blaasje.
Figuur 1: Specifieke binding van fX aan kunstmatige fosfolipide blaasjes. (A) Experimenteerschema. (B, C) Typische dot plots van fosfolipide blaasjes zonder (B) of met (C) lipofiele fluorescerende kleurstof DiIC16 (3). (D-F) Typische dot plots van factor X interactie met fosfolipide blaasjes vóór (D) of na (E) 20-voudige verdunning en in aanwezigheid EDTA (F). (G) Kinetiek van FX (250 nM) binding en dissociatie aan fosfolipide blaasjes. (H) Evenwichtsinteractie van factor X met fosfolipide blaasjes. Resultaten zijn de middelen ±SD voor n = 3 verschillende monsters. Afkortingen: FX = Factor X; Ph blaasjes = fosfolipide blaasjes; SSC = zijdelingse spreiding; a.u. = willekeurige eenheid). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Schijnbare Kd ± SEM (nM) | kop ± SEM (μM-1 s-1) | Kuit ± SEM (s-1) | Schijnbaar aantal bindingsplaatsen per blaasje ± SEM |
| 400 ± 80 | 0,371 ± 0,012 | 0,019 ± 0,004 | 8.000 ± 800 |
Tabel 1: Parameters van fX-interactie met kunstmatige fosfolipide blaasjes. Parameters werden bepaald aan de hand van de curven (zie figuur 1F,G). De resultaten zijn het gemiddelde ± SEM voor n = 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De voorgestelde methode kan worden aangepast voor een ruwe karakterisering van de interactie van eiwitten met fosfolipidemembranen uit verschillende bronnen en samenstellingen. De hier beschreven kwantitatieve flowcytometrie geeft toe aan oppervlakteplasmonresonantie (SPR) in verschillende parameters. In het bijzonder heeft het een lagere gevoeligheid en tijdresolutie en vereist het fluorescerende etikettering van eiwitten. Fluorescerende etikettering kan leiden tot een verandering in conformatie en verlies van activiteit voor veel eiwitten en vereist daarom zorgvuldige controle. Deze techniek heeft echter aanzienlijke voordelen ten opzichte van andere. Deze methode biedt de mogelijkheid om de interactie van eiwitten met het inheemse celmembraan te onderzoeken, wat niet gemakkelijk kan worden geïmplementeerd met SPR. Bovendien maakt de aanpak het mogelijk om het aantal eiwitbindingsplaatsen op het membraanoppervlak te schatten en kan het efficiënt zijn voor sommige analysetaken.
In de handel verkrijgbare kralen zijn beschikbaar voor sommige fluorescerende kleurstoffen om bindingsplaatsen te tellen. Er zijn echter geen dergelijke kralen voor veel veelgebruikte kleurstoffen. Vandaar dat zelfgemaakte kralen de beste manier zijn om dit op te lossen. Dezelfde cellen werden gebruikt om deze kralen te bereiden als voor alle andere experimenten. Omdat de kralen echter hoge centrifugatiesnelheden vereisen tijdens het wassen, kunnen fosfolipide blaasjes niet worden gebruikt. Cellen of blaasjes kunnen echter worden vervangen door kralen met amino-reactieve groepen, die kunnen worden geconjugeerd aan de gekozen kleurstof. De volgorde van acties is vergelijkbaar met die beschreven in stap 6.1.
De beperkingen van deze kwantitatieve flowcytometriemethode houden verband met de technische mogelijkheden van de gebruikte cytometer. Drie verschillende modellen flowcytometers (met de variabele lasers, detectoren, pompen) werden toegepast om deze techniek zonder enige complicatie te reproduceren. De selectie van een fluorescerend label dat geschikt is voor de gebruikte cytometer moet echter zorgvuldig worden overwogen, omdat de set lasers, detectoren en optische filters van apparaat tot apparaat verschilt, zelfs binnen hetzelfde model. Het is noodzakelijk om zich te concentreren op het vermogen van de cytometer om microdeeltjes van een specifieke diameter te meten; niet alle instrumenten zijn even goed in staat om deeltjes te detecteren bij resoluties onder 200 nm (om dit te bepalen, gebruikt u de kalibratieparels met een vaste grootte die door de fabrikant van het instrument worden geleverd). Bovendien kunnen sommige flowcytometers, die worden bemonsterd met behulp van een spuitpomp, in principe geen continue bindingskinetiek meten. In dit geval kan de kinetiek alleen punt voor punt worden geregistreerd, waarbij afzonderlijke monsters worden genomen voor meting op bepaaldetijdstippen 4,6.
Flowcytometrie wordt gebruikt om de expressie van antigenen op verschillende cellen te onderzoeken - de aan- / afwezigheid van een antigeen en het percentage celpopulaties dat dit antigeen tot expressie brengt en niet tot expressie brengt. Het vermogen van flowcytometrie om tegelijkertijd vrije en gebonden liganden te onderscheiden zonder aanvullende scheidingsprocedures biedt ook de mogelijkheid voor kwantitatieve beoordeling van ligandbindingsdynamica. De hierin voorgestelde methode beschrijft de bereiding van zelfgemaakte kalibratieparels om de binding van een fluorescerend ligand aan kunstmatige fosfolipide blaasjes te kwantificeren. Deze aanpak beperkt de keuze van in de handel verkrijgbare fluoroforen niet. Daarnaast maakt de hier beschreven techniek voor het verzamelen en analyseren van kinetische gegevens een verbeterde tijdresolutie mogelijk. De hierin beschreven methode kan dus alleen worden gebruikt als een eerste stap in het karakteriseren van eiwit-membraaninteracties of in combinatie met andere methoden (bijvoorbeeld SPR of microscopie) om de meetnauwkeurigheid te verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs werden ondersteund door een subsidie van de Russian Science Foundation 20-74-00133.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A23187 | Sigma Aldrich | C7522-10MG | |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific | A37573 | fluorescent dye |
| Apyrase from potatoes | Sigma Aldrich | A2230 | |
| BD FACSCantoII | BD Bioscience | ||
| bovine serum albumin | VWR Life Science AMRESCO | Am-O332-0.1 | |
| Calcium chloride, anhydrous, powder, ≥97% | Sigma Aldrich | C4901-100G | |
| Cary Eclipse Fluorescence Spectrometer | Agilent | ||
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528-1KG | |
| DiIC16(3) (1,1'-Dihexadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate) | Thermo Fisher Scientific | D384 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D8418 | |
| EDTA disodium salt | VWR Life Science AMRESCO | Am-O105B-0.1 | |
| FACSDiva | BD Bioscience | cytometry data acquisition software | |
| FlowJo | Tree Star | cytometer software for data analysis | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-500G | |
| Human Factor X | Enzyme research | HFX 1010 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Panreac | 141914.1209 | |
| L-α-phosphatidylcholine (Brain, Porcine) | Avanti Polar Lipids | 840053P | |
| L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 840032P | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M8266-100G | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids | 610020-1EA | |
| OriginPro 8 SR4 v8.0951 | OriginLab Corporation | Statistical software | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, Biotechnology Grade | VWR Life Science AMRESCO | 97062-732 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| Prostaglandin E1 | Cayman Chemical | 13010 | |
| Sephadex G25 | GE Healthcare | GE17-0033-01 | gel filtration medium for protein purification |
| Sepharose CL-2B | Sigma Aldrich | CL2B300-500ML | gel filtration medium for platelet purification |
| Sodium bicarbonate | Corning | 61-065-RO | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S3139-250G | |
| Spin collumns with membrane 0.2 µm | Sartorius | VS0171 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | S1804-1KG |
References
- Hoffman, M., Monroe, D. M.
- Roberts, H. R., Hoffman, M., Monroe, D. M.
- Panteleev, M. A., Dashkevich, N. M., Ataullakhanov, F. I. Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion. Thrombosis Research. 136 (4), 699-711 (2015).
- Podoplelova, N. A., et al. Hysteresis-like binding of coagulation factors X/Xa to procoagulant activated platelets and phospholipids results from multistep association and membrane-dependent multimerization. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1216-1227 (2016).
- Panteleev, M. A., Ananyeva, N. M., Greco, N. J., Ataullakhanov, F. I., Saenko, E. L. Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3 (11), 2545-2553 (2005).
- Kotova, Y., et al. Binding of coagulation factor XIII zymogen to activated platelet subpopulations: roles of integrin αIIbβ3 and fibrinogen. Thrombosis and Haemostasis. 119 (6), 906-915 (2019).
- Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry. Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (2002).
- Nolan, J. P., Shen, B., Park, M. S., Sklar, L. A. Kinetic analysis of human flap endonuclease-1 by flow cytometry. Biochemistry. 35 (36), 11668-11676 (1996).
- Sarvazyan, N. A., Lim, W. K., Neubig, R. R. Fluorescence analysis of receptor−G protein interactions in cell membranes. Biochemistry. 41 (42), 12858-12867 (2002).
- Sarvazyan, N. A., Neubig, R. R. Analysis of molecular assemblies by flow cytometry: determinants of Gi1 and by binding. Advances in Optical Biophysics. 3256, 122-131 (1998).
- De Franceschi, N., et al. ProLIF - Quantitative integrin protein-protein interactions and synergistic membrane effects on proteoliposomes. Journal of Cell Science. 132 (4), (2018).
