Burada, proteinlerin hücre zarları veya mikro-parçacıklarla etkileşimini karakterize etmek için bir dizi yöntem açıklıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Floresan Etiketli Proteinlerin Yapay Fosfolipid Mikrovezikülleri ile Etkileşiminin Kantitatif Akış Sitometrisi Kullanılarak Analiz Edilmesi
Bu makalede
Özet
Özet
İnsan vücudunda, bağışıklık tepkisi ve kan pıhtılaşmasında rol oynayan başlıca fizyolojik reaksiyonların çoğu, hücrelerin zarları üzerinde ilerler. Herhangi bir membrana bağımlı reaksiyonda önemli bir ilk adım, proteinin fosfolipit membranına bağlanmasıdır. Lipid membranları ile protein etkileşimini incelemek için floresan olarak etiketlenmiş proteinler ve akış sitometrisi kullanılarak bir yaklaşım geliştirilmiştir. Bu yöntem, canlı hücreler ve doğal veya yapay fosfolipid vezikülleri kullanarak protein-membran etkileşimlerinin incelenmesine izin verir. Bu yöntemin avantajı, reaktiflerin ve ekipmanların basitliği ve kullanılabilirliğidir. Bu yöntemde, proteinler floresan boyalar kullanılarak etiketlenir. Bununla birlikte, hem kendi kendine yapılan hem de ticari olarak temin edilebilen, floresan etiketli proteinler kullanılabilir. Bir floresan boya ile konjugasyondan sonra, proteinler bir fosfolipid membran kaynağı (mikro-parçacıklar veya hücreler) ile inkübe edilir ve örnekler akış sitometrisi ile analiz edilir. Elde edilen veriler kinetik sabitleri ve denge Kd'yi hesaplamak için kullanılabilir. Ek olarak, fosfolipit membranındaki protein bağlanma bölgelerinin yaklaşık sayısını özel kalibrasyon boncukları kullanarak tahmin etmek mümkündür.
Giriş
Biyomembranlar, hayvan hücrelerinin iç içeriğini ve hücre dışı alanı ayırır. Membranların ayrıca hücrenin yaşam döngüsü ve organelleri sırasında oluşan mikro-parçacıkları çevrelediğini unutmayın. Hücre zarı ağırlıklı olarak lipitlerden ve proteinlerden oluşur. Membran proteinleri sinyalizasyon, yapısal, taşıma ve yapışkan fonksiyonları yerine getirir. Bununla birlikte, lipit çift katmanı, hayvan hücresinin hücre dışı boşlukla olan ilişkisi için de gereklidir. Bu makale, dış proteinlerin lipit membranı ile periferik etkileşimini incelemek için bir yöntem önermektedir.
Bir hayvan hücresinin dış zar tabakasında meydana gelen reaksiyonların en ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Floresan protein etiketleme
- Malzeme hazırlama
- 1 M Sodyum bikarbonat tamponu, pH 9.0 hazırlayın, 4 °C'de saklayın ve bir hafta içinde kullanın.
- Kullanımdan hemen önce 1,5 M hidroksilamin hidroklorür tamponu, pH 8,5 hazırlayın.
- Dimetilsülfoksit içinde 10 mg/mL'lik bir floresan boya çözeltisi hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
NOT: Bu çözelti karanlıkta -20 °C'de bir ay boyunca saklanabilir. - Saflaştırılmış antikorların veya diğer proteinlerin çözeltilerini 1-10 mg / mL'de hazırlayın.
NOT: Amonyum iyonları veya birincil aminler içeren tamponlardan kaçının. Tris veya glisero....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada tarif edilen akım sitometri yöntemi, plazma pıhtılaşma proteinlerinin aktive trombositlere bağlanmasını karakterize etmek için kullanılır. Ayrıca fosfolipid veziküller PS:PC 20:80 model sistem olarak uygulanmıştır. Bu yazıda örnek olarak yapay fosfolipid veziküller üzerinde durulmuştur. Sitometrenin parametreleri, özellikle fotoçarpan tüpü (PMT) voltajı ve kompanzasyonu, her bir spesifik cihaz, çalışmanın amacı (hücreler, yapay veya doğal mikro-parçacıklar) ve kullanılan boyalar için seçilmelidir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Önerilen yöntem, proteinlerin çeşitli kaynaklardan ve bileşimlerden fosfolipid membranlarla etkileşiminin kabaca karakterize edilmesi için uyarlanabilir. Burada tarif edilen kantitatif akım sitometrisi, çeşitli parametrelerde yüzey plazmon rezonansını (SPR) kabul eder. Özellikle, daha düşük bir hassasiyete ve zaman çözünürlüğüne sahiptir ve proteinlerin floresan etiketini gerektirir. Floresan etiketleme, birçok protein için konformasyonda bir değişikliğe ve aktivite kaybına neden olabilir ve bu nedenle dikkatli kontrol g.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Yazarlar, Rus Bilim Vakfı'nın 20-74-00133 hibesiyle desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| A23187 | Sigma Aldrich | C7522-10MG | |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester) | Thermo Fisher Scientific | A37573 | floresan boya |
| Patateslerden Apyrase | Sigma Aldrich | A2230 | |
| BD FACSCantoII | BD Bioscience | ||
| sığır serumu albümini | VWR Yaşam Bilimleri AMRESCO | -O332-0.1 | |
| Kalsiyum klorür, susuz, toz ve ge; % 97 | Sigma Aldrich | C4901-100G | |
| Cary Eclipse Floresan Spektrometresi | Agilent | ||
| D- (+) - Glikoz | Sigma Aldrich | G7528-1KG | |
| DiIC16 (3) (1,1'-Dihekzadesil-3,3,3 ', 3'-Tetrametilindokarbosiyanin Perklorat) | Thermo Fisher Scientific | D384 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D8418 | |
| EDTA disodyum tuzu | VWR Yaşam Bilimleri AMRESCO | -O105B-0.1 | |
| FACSDiva | BD Bioscience | sitometri veri toplama yazılımı | |
| FlowJo | Tree Star | sitometre yazılımı | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-500G | |
| İnsan Faktörü X | Enzim araştırması | HFX 1010 | |
| Hidroksilamin hidroklorür | Panreac | 141914.1209 | |
| L-&alfa;-fosfatidilkolin (Beyin, Domuz) | Avanti Polar Lipidler | 840053P | |
| L-&alfa;-fosfatidilserin (Beyin, Porcins) (sodyum tuzu) | Avanti Polar Lipidler | 840032P | |
| Magnezyum klorür | Sigma Aldrich | M8266-100G | |
| Mini Ekstruder | Avanti Polar Lipidler | 610020-1EA | |
| OriginPro 8 SR4 v8.0951 | OriginLab Corporation | İstatistiksel yazılım | |
| Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS) Tabletleri, Biyoteknoloji Sınıfı | VWR Yaşam Bilimleri AMRESCO | 97062-732 | |
| Potasyum klorür | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| Prostaglandin E1 | Cayman Kimyasal | 13010 | |
| Sephadex G25 | GE Healthcare | GE17-0033-01 | protein saflaştırması için jel filtrasyon ortamı |
| Trombosit saflaştırması için | Sepharose CL-2B | Sigma Aldrich | CL2B300-500ML |
| Sodyum bikarbonat | Corning | 61-065-RO | |
| Sodyum klorür | Sigma Aldrich | S3014-500G | |
| Sodyum fosfat monobazik | Sigma Aldrich | S3139-250G | |
| Membran 0.2 ve mikro ile spin kolumns; m | Sartorius | VS0171 | |
| Trisodyum sitrat dihidrat | Sigma Aldrich | S1804-1KG |
Kaynaklar
- Hoffman, M., Monroe, D. M. A cell-based model of hemostasis. Thrombosis and haemostasis. 85 (6), 958-965 (2001).
- Roberts, H. R., Hoffman, M., Monroe, D. M. A cell-based model of thrombin generation. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 32, Suppl 1 32-38 (2006).
- Pa....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
