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Biochemistry

मात्रात्मक प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके कृत्रिम फॉस्फोलिपिड माइक्रोवेसिकल्स के साथ फ्लोरोसेंट-लेबल प्रोटीन की बातचीत का विश्लेषण करना

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63459
Automatic Translation
1,2, 1,4, 1,2,3, 1,2, 1,2,3,4
1Center for Theoretical Problems of Physicochemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences, 2National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology named after Dmitry Rogachev, 3Faculty of Physics, Lomonosov Moscow State University, 4Faculty of Biological and Medical Physics, Moscow Institute of Physics and Technology

Summary

यहां, हम कोशिकाओं या माइक्रोवेसिकल्स की झिल्ली के साथ प्रोटीन की बातचीत को चिह्नित करने के तरीकों के एक सेट का वर्णन करते हैं।

Abstract

मानव शरीर में, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और रक्त जमावट में शामिल अधिकांश प्रमुख शारीरिक प्रतिक्रियाएं कोशिकाओं की झिल्ली पर आगे बढ़ती हैं। किसी भी झिल्ली-निर्भर प्रतिक्रिया में एक महत्वपूर्ण पहला कदम फॉस्फोलिपिड झिल्ली पर प्रोटीन का बंधन है। लिपिड झिल्ली के साथ प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक दृष्टिकोण फ्लोरोसेंटली लेबल वाले प्रोटीन और प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके विकसित किया गया है। यह विधि जीवित कोशिकाओं और प्राकृतिक या कृत्रिम फॉस्फोलिपिड पुटिकाओं का उपयोग करके प्रोटीन-झिल्ली इंटरैक्शन के अध्ययन की अनुमति देती है। इस पद्धति का लाभ अभिकर्मकों और उपकरणों की सादगी और उपलब्धता है। इस विधि में, फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करके प्रोटीन को लेबल किया जाता है। हालांकि, स्व-निर्मित और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध दोनों, फ्लोरोसेंटली लेबल वाले प्रोटीन का उपयोग किया जा सकता है। फ्लोरोसेंट डाई के साथ संयुग्मन के बाद, प्रोटीन को फॉस्फोलिपिड झिल्ली (माइक्रोवेसिकल्स या कोशिकाओं) के स्रोत के साथ ऊष्मायन किया जाता है, और नमूनों का विश्लेषण प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा किया जाता है। प्राप्त डेटा का उपयोग गतिज स्थिरांक और संतुलन की गणना करने के लिए किया जा सकता है कघ। इसके अलावा, विशेष अंशांकन मोतियों का उपयोग करके फॉस्फोलिपिड झिल्ली पर प्रोटीन बाध्यकारी साइटों की अनुमानित संख्या का अनुमान लगाना संभव है।

Introduction

बायोमेम्ब्रेन पशु कोशिकाओं और बाह्य अंतरिक्ष की आंतरिक सामग्री को अलग करते हैं। ध्यान दें कि झिल्ली कोशिका के जीवन चक्र और ऑर्गेनेल के दौरान गठित माइक्रोवेसिकल्स को भी घेरती है। कोशिका झिल्ली मुख्य रूप से लिपिड और प्रोटीन से बना होता है। झिल्ली प्रोटीन सिग्नलिंग, संरचनात्मक, परिवहन और चिपकने वाला कार्य करते हैं। हालांकि, बाह्य अंतरिक्ष के साथ पशु कोशिका के अंतर्संबंध के लिए लिपिड बाइलेयर भी आवश्यक है। यह पत्र लिपिड झिल्ली के साथ बाहरी प्रोटीन की परिधीय बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक विधि का प्रस्ताव करता है।

एक पशु कोशिका की बाहरी झिल्ली परत पर होने वाली प्रतिक्रियाओं का सबसे हड़ताली उदाहरण रक्त जमावट प्रतिक्रिया है। रक्त जमावट की एक महत्वपूर्ण विशेषता यह है कि सभी मुख्य प्रतिक्रियाएं इन कोशिकाओं से उत्पन्न कोशिकाओं और माइक्रोवेसिकल्स के फॉस्फोलिपिड झिल्ली पर आगे बढ़ती हैं, न कि प्लाज्मा 1,2,3 में। झिल्ली-निर्भर प्रतिक्रियाओं में जमावट शुरू करने की प्रक्रिया शामिल है (सबेंडोथेलियम की कोशिका झिल्ली पर, सूजन एंडोथेलियम, या सक्रिय प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर, ऊतक कारक की भागीदारी के साथ), कारकों के मुख्य कैस्केड-सक्रियण की सभी प्रतिक्रियाएं IX, एक्स, प्रोथ्रोम्बिन; थ्रोम्बिन द्वारा कारक ग्यारहवीं की सक्रियता (सक्रिय प्लेटलेट्स, एरिथ्रोसाइट्स, लिपोप्रोटीन और माइक्रोवेसिकल्स की झिल्ली पर); प्रोटीन सी मार्ग की प्रतिक्रियाएं; जमावट एंजाइमों की निष्क्रियता (थ्रोम्बोमोडुलिन कॉफ़ैक्टर्स, एंडोथेलियल प्रोटीन सी रिसेप्टर, हेपरान सल्फेट की भागीदारी के साथ एंडोथेलियल कोशिकाओं की झिल्ली पर); और संपर्क मार्ग प्रतिक्रियाएं (प्लेटलेट्स की झिल्ली और अज्ञात कॉफ़ैक्टर्स की भागीदारी के साथ कुछ माइक्रोवेसिकल्स पर)। इस प्रकार, रक्त कोशिकाओं की झिल्ली के साथ विभिन्न प्लाज्मा प्रोटीन की बातचीत का अध्ययन किए बिना रक्त जमावट की जांच करना असंभव है।

यह पत्र कोशिकाओं या माइक्रोवेसिकल्स के लिपिड झिल्ली के साथ प्रोटीन की बातचीत की विशेषता के लिए एक प्रवाह-साइटोमेट्री-आधारित विधि का वर्णन करता है। यह दृष्टिकोण शुरू में प्लेटलेट्स और कृत्रिम फॉस्फोलिपिड पुटिकाओं के साथ रक्त प्लाज्मा की बातचीत का अध्ययन करने के लिए प्रस्तावित किया गया था। इसके अलावा, अध्ययन किए गए अधिकांश प्रोटीन नकारात्मक रूप से चार्ज झिल्ली फॉस्फोलिपिड्स के साथ सीधे बातचीत करते हैं, विशेष रूप से फॉस्फेटिडिलसेरिन 4,5 के साथ। इसके अतिरिक्त, ऐसे प्रोटीन हैं जिनकी झिल्ली के साथ बातचीत विशेष रिसेप्टर्स6 द्वारा मध्यस्थता की जाती है।

प्रवाह साइटोमेट्री की एक महत्वपूर्ण क्षमता अतिरिक्त पृथक्करण के बिना मुक्त और बाध्य लिगेंड के बीच भेदभाव कर रही है। साइटोमेट्री की यह विशेषता समापन बिंदु पर लिगैंड संतुलन बाध्यकारी के अध्ययन की अनुमति देती है और निरंतर गतिज माप करने में मदद करती है। तकनीक अपरिष्कृत है और जटिल नमूना तैयारी की आवश्यकता नहीं है। फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग सक्रिय रूप से फ्लोरोसेंट पेप्टाइड्स, रिसेप्टर्स और जी-प्रोटीन के बीच बातचीत की गतिशीलता का मात्रात्मक अध्ययन करने के लिए किया जाता है बरकरार और डिटर्जेंट-पारगम्य न्यूट्रोफिल7. यह दृष्टिकोण प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन और वास्तविक समय 8 में एंडोन्यूक्लाइज गतिविधि के कैनेटीक्स की खोज के लिए भी लागूहोता है। समय के साथ, इस पद्धति का उपयोग शुद्ध लिपिड पुटिकाओं9 के साथ उच्च आत्मीयता प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का मात्रात्मक अध्ययन करने के लिए किया गया था, या, अधिक आम तौर पर, झिल्ली प्रोटीन के साथ एक अत्यधिक कुशल एसएफ 9 सेल अभिव्यक्ति प्रणाली10 में व्यक्त किया गया था। ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके प्रोटीन-लिपोसोम इंटरैक्शन को चिह्नित करने के लिए मात्रात्मक तरीकों का भी वर्णन किया गया है11.

यह तकनीक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मोतियों का उपयोग करने से बचने के लिए स्व-निर्मित अंशांकन मोतियों का उपयोग करती है7. पहले7 इस्तेमाल किए गए अंशांकन मोती फ्लोरोसिन के साथ काम करने का इरादा रखते थे, जो प्रोटीन पर सुलभ फ्लोरोसेंट लिगेंड के वर्गीकरण को प्रतिबंधित करता था। इसके अलावा, यह पेपर उचित समय रिज़ॉल्यूशन के लिए गतिज डेटा प्राप्त करने और विश्लेषण करने का एक नया तरीका प्रदान करता है। यद्यपि इस विधि को कृत्रिम फॉस्फोलिपिड पुटिकाओं के लिए वर्णित किया गया है, लेकिन एक अलग लिपिड संरचना के साथ कोशिकाओं, प्राकृतिक पुटिकाओं या कृत्रिम फॉस्फोलिपिड पुटिकाओं के लिए इसकी अनुकूलनक्षमता के लिए कोई स्पष्ट सीमाएं नहीं हैं। यहां वर्णित विधि बातचीत (केऑन, केऑफ) और संतुलन (केडी) के मापदंडों के अनुमान की अनुमति देती है और झिल्ली पर प्रोटीन बाध्यकारी साइटों की संख्या के मात्रात्मक लक्षण वर्णन की सुविधा प्रदान करती है। ध्यान दें कि यह तकनीक बाध्यकारी साइटों की संख्या का अनुमानित अनुमान प्रदान करती है। विधि के फायदे इसकी सापेक्ष सादगी, पहुंच और देशी कोशिकाओं और प्राकृतिक और कृत्रिम माइक्रोवेसिकल्स के लिए अनुकूलनक्षमता हैं।

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Protocol

1. फ्लोरोसेंट प्रोटीन लेबलिंग

  1. सामग्री की तैयारी
    1. 1 एम सोडियम बाइकार्बोनेट बफर, पीएच 9.0 तैयार करें, इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, और एक सप्ताह के भीतर इसका उपयोग करें।
    2. उपयोग से तुरंत पहले 1.5 एम हाइड्रॉक्सिलमाइन हाइड्रोक्लोराइड बफर, पीएच 8.5 तैयार करें।
    3. डाइमिथाइलसल्फोक्साइड में फ्लोरोसेंट डाई ( सामग्री की तालिका देखें) का 10 मिलीग्राम /
      नोट: यह समाधान अंधेरे में -20 डिग्री सेल्सियस पर एक महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।
    4. एमएल पर शुद्ध एंटीबॉडी या अन्य प्रोटीन के समाधान तैयार करें।
      नोट: अमोनियम आयनों या प्राथमिक अमाइन युक्त बफर से बचें। डायलिसिस द्वारा फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के साथ ट्रिस या ग्लिसरॉल युक्त बफर को बदलें। न तो सोडियम एजाइड (≤3 एमएम) और न ही थिमेरोसल (≤1 एमएम) संयुग्मन प्रतिक्रिया को काफी प्रभावित करेगा।
    5. कमरे के तापमान पर रात भर या 60 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए पीबीएस में प्रोटीन शोधन के लिए जेल निस्पंदन माध्यम ( सामग्री की तालिका देखें) सेते हैं। 0.2 μm झिल्ली के साथ स्पिन कॉलम पर जेल निस्पंदन माध्यम लागू करें।
  2. समीकरण (1) का उपयोग करके लेबल किए जाने वाले प्रोटीन की एकाग्रता के अनुसार प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए उपयोग की जाने वाली प्रतिक्रियाशील डाई की मात्रा की गणना करें।
    Equation 1
    जहां वीडाई डाई स्टॉक समाधान की मात्रा है; सीपीआर, वीपीआर और मेगावाटपीआर प्रोटीन की एकाग्रता, मात्रा और दाढ़ वजन है; मेगावाटडाई डाई दाढ़ वजन है; 100 एक इकाई रूपांतरण कारक है; एमआर प्रतिक्रिया मिश्रण में डाई से प्रोटीन का दाढ़ अनुपात है।
    नोट: आईजीजी लेबलिंग प्रतिक्रियाओं के लिए निम्नलिखित एमआर की सिफारिश की जाती है: एमआर = 40 यदि एंटीबॉडी 1-3 मिलीग्राम / एमएल या एमआर = 30 पर है यदि एंटीबॉडी 4-10 मिलीग्राम / एमएल पर है। जमावट कारकों के लिए, एमआर = 5 आमतौर पर उपयोग किया जाता है।
  3. संयुग्मन प्रतिक्रिया
    1. एक प्रतिक्रिया ट्यूब में, प्रोटीन समाधान को 1 एम बाइकार्बोनेट समाधान की 10x कम मात्रा के साथ मिलाएं।
    2. निरंतर सरगर्मी के साथ फ्लोरोसेंट डाई की आवश्यक मात्रा जोड़ें (चरण 1.2 देखें)।
    3. लगभग 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया मिश्रण सेते हैं, प्रकाश से संरक्षित और निरंतर सरगर्मी के साथ।
    4. प्रोटीन समाधान के प्रत्येक 200 μL के लिए, 1.5 M हाइड्रॉक्सिलमाइन हाइड्रोक्लोराइड के 5 μL जोड़ें।
    5. लगभग 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया मिश्रण सेते हैं, प्रकाश से संरक्षित और निरंतर सरगर्मी के साथ।
  4. स्पिन कॉलम तैयार करें।
    1. एक स्तंभ में प्रोटीन शोधन के लिए जेल निस्पंदन माध्यम के 500 μL जोड़ें। 1,000 × ग्राम पर 3 मिनट के लिए स्तंभ अपकेंद्रित्र।
    2. संग्रह ट्यूब से बफर त्यागें। यदि कॉलम भरा नहीं है, तो अधिक जेल निस्पंदन माध्यम जोड़ें, और 1,000 × ग्राम पर 3 मिनट के लिए कॉलम अपकेंद्रित्र करें। स्तंभ भरजाने तक इस चरण को दोहराएँ।
  5. शोधन
    1. 17,000 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण (चरण 1.3.5 से) अपकेंद्रित्र और अवक्षेप को हटा दें।
    2. जेल निस्पंदन माध्यम के साथ स्पिन कॉलम में सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण। समाधान को जेल बिस्तर में अवशोषित करने की अनुमति दें।
    3. स्पिन कॉलम के लिए एक खाली संग्रह ट्यूब का उपयोग करें और इसे 1,000 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र करें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, संग्रह ट्यूब से लेबल प्रोटीन एकत्र करें।
  6. लेबलिंग की डिग्री का निर्धारण
    1. 280 एनएम (ए 280) पर मुक्त डाई के अवशोषण को मापने और डाई (ए अधिकतम) के लिए αअधिकतम को मापकर ए280 पर अवशोषण में डाई के योगदान के लिए सही है (देखें समीकरण (2))।
      Equation 2(2)
    2. 280 एनएम (ए280) पर प्रोटीन-डाई संयुग्म के अवशोषण को मापें और डाई (ए अधिकतम) के लिए λअधिकतम और समीकरण (3) का उपयोग करके प्रोटीन कंसेट्रेशन की गणना करें।
      Equation 3(3)
      जहां εएम 280 एनएम पर प्रोटीन का दाढ़ विलुप्त होने गुणांक है; डी अवशोषण के माप के दौरान ऑप्टिकल पथ की लंबाई है; सीएफ ए280 (चरण 1.6.1) पर अवशोषण के लिए डाई का योगदान है।
    3. Eq (4) का उपयोग कर लेबलिंग (डीओएल) की डिग्री की गणना करें।
      Equation 4(4)
      जहां εएम डाई αअधिकतम एनएम पर डाई का दाढ़ विलुप्त होने गुणांक है; डी अवशोषण के माप के दौरान ऑप्टिकल पथ की लंबाई है; सीप्रोटीन प्रोटीन की एकाग्रता है (चरण 1.6.2)।

2. फॉस्फोलिपिड पुटिकाओं की तैयारी

  1. लिपिड मिश्रण की तैयारी और भंडारण
    1. लिपिड को उचित अनुपात में मिलाएं (फॉस्फेटिडिलसेरिन / फॉस्फेटिडिलकोलाइन 20 मोल% से 80 मोल% के अनुपात में)।
    2. लियोफिलाइजेशन या वाष्पीकरण के बाद लिपिड मिश्रण को सुखाएं और इसे ग्लास एम्प्यूल्स में एक निष्क्रिय वातावरण के नीचे स्टोर करें।
  2. लिपिड फिल्म उत्पादन
    1. एम्प्यूल खोलें, और क्लोरोफॉर्म की थोड़ी मात्रा (~ 100 μL) में लिपिड मिश्रण को फिर से निलंबित करें।
      नोट: बहुत अधिक क्लोरोफॉर्म का उपयोग न करें क्योंकि यह पूरी तरह से वाष्पित नहीं होता है।
    2. इथेनॉल में 0.2 मोल% पर डीआईआईसी 16 (3) जोड़ें। लिपिड मिश्रण को एक गोल तल फ्लास्क में स्थानांतरित करें। मिश्रण को घुमाकर फ्लास्क के किनारों पर पतला फैलाएं। एक आर्गन धारा के तहत 30 मिनट के लिए लिपिड मिश्रण सूखी।
  3. लिपिड मिश्रण का जलयोजन
    1. लिपिड फिल्म के साथ फ्लास्क के लिए अपेक्षित लिपिड एकाग्रता के अनुरूप मात्रा में एक उपयुक्त गर्म (~ 55 डिग्री सेल्सियस) जलीय बफर (एचईपीईएस 20 एमएम, एनएसीएल 140 एमएम, पीएच 7.4) जोड़ें। पूर्ण जलयोजन के लिए 30 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर भंवर के साथ मिश्रण सेते हैं।
    2. लिपिड निलंबन को 3-5 फ्रीज-पिघलना चक्रों से गुजरने के लिए एक फ्रीजर या गर्म थर्मोस्टेट में नमूना ट्यूब रखना।
  4. एक्सट्रूज़न द्वारा लिपिड पुटिकाओं का गठन
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक्सट्रूडर तैयार करें। लिपिड मिश्रण के चरण संक्रमण तापमान के लिए सभी एक्सट्रूडर घटकों को गर्म करें।
    2. हाइड्रेटेड लिपिड मिश्रण के साथ एक्सट्रूडर सिरिंज में से एक भरें। एक्सट्रूडर के तापमान के साथ संतुलित करने के लिए लिपिड निलंबन के तापमान के लिए 5-10 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    3. झिल्ली के माध्यम से लिपिड मिश्रण को कम से कम 10 बार बाहर निकालें। अंतिम एक्सट्रूज़न के लिए, वैकल्पिक सिरिंज में लिपिड निलंबन रखें और थोड़ा अस्पष्ट से स्पष्ट समाधान तक उपस्थिति में बदलाव की तलाश करें।
    4. लिपिड पुटिकाओं के परिणामस्वरूप मिश्रण को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, अधिमानतः आर्गन या नाइट्रोजन के निष्क्रिय वातावरण में, 3-4 दिनों के लिए। फ्रीज न करें।

3. पूरे रक्त से प्लेटलेट्स का अलगाव

  1. 3.2% सोडियम साइट्रेट युक्त ट्यूबों में स्वस्थ दाताओं से पूरे रक्त को इकट्ठा करें।
  2. प्रोस्टाग्लैंडीन ई 1 (पीजीई 1) (1 μM) और एपिरेज़ (0.1 U / mL) को रक्त में जोड़ें, इसके बाद 8 मिनट के लिए 100 × ग्राम पर कमरे के तापमान पर सेंट्रीफ्यूजेशन करें।
  3. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, प्लेटलेट समृद्ध प्लाज्मा लें और सोडियम साइट्रेट समाधान (106 एमएम, पीएच 5.5) को 3: 1 के प्लाज्मा / 5 मिनट के लिए 400 × ग्राम पर कमरे के तापमान पर प्लाज्मा अपकेंद्रित्र।
  4. सतह पर तैरनेवाला निकालें, और बीएसए के बिना टायरोड के बफर के 300 μL में गोली को फिर से निलंबित करें (20 एमएम एचईपीईएस, 150 एमएम एनएसीएल, 2.7 एमएम केसीएल, 1 एमएम एमजीसीएल2, 0.4 एमएम एनएएच2पीओ4, 2.5 एमएम सीएसीएल2, 5 एमएम ग्लूकोज, पीएच 7.4)। प्लेटलेट शुद्धिकरण के लिए जेल निस्पंदन माध्यम पर जेल क्रोमैटोग्राफी द्वारा प्लाज्मा प्रोटीन से प्लेटलेट्स शुद्ध करें ( सामग्री की तालिका देखें)।

4. प्रोटीन का पता लगाना - प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा लिपिड इंटरैक्शन

  1. गतिज बाध्यकारी प्रयोग
    1. टायरोड के बफर (20 एमएम एचईपीईएस, 150 एमएम एनएसीएल, 2.7 एमएम केसीएल, 1 एमएम एमजीसीएल 2, 0.4 एमएमएनएएच2 पीओ4,2.5 एमएम सीएसीएल2, 5 एमएम ग्लूकोज, 0.5% बीएसए, पीएच 7.4) में फॉस्फोलिपिड पुटिकाओं को पतला करें।
    2. 500 μL की कुल मात्रा के लिए 1: 1 अनुपात (अंतिम पुटिका एकाग्रता 0.5 μM, fX-fd एकाग्रता एफएक्स के 250 एनएम है) में चरण 4.1.1 से फॉस्फोलिपिड पुटिकाओं के साथ 500 एनएम की एकाग्रता पर चरण 1 से फ्लोरोसेंट-लेबल जमावट कारक एक्स (एफएक्स-एफडी) मिलाएं।
    3. तुरंत प्रवाह साइटोमीटर में मिश्रित निलंबन (~ एक कम बहने की दर के साथ विश्लेषण के लिए ~ 20 मिनट) के 500 μL इंजेक्ट। कम प्रवाह दर का उपयोग करें और सुनिश्चित करें कि चैनल एफएल 2 (उत्सर्जन 488 एनएम, उत्सर्जन फ़िल्टर 585/42 एनएम) के लिए थ्रेसहोल्ड मूल्य 200 के रूप में है। सामग्री की तालिका से प्रतिदीप्ति डाई के लिए चैनल एफएल 4 (उत्सर्जन 633 एनएम, उत्सर्जन फिल्टर 660/20) में औसत प्रतिदीप्ति को मापें।
      नोट: ऑटोसैंपलर के बिना एक साइटोमीटर चुनें। यह मापने सेल में नमूने के इंजेक्शन की प्रक्रिया को गति देगा।
    4. जब बाध्यकारी की संतृप्ति प्राप्त की जाती है (5 मिनट के भीतर प्रतिदीप्ति में कोई महत्वपूर्ण वृद्धि नहीं), टायरोड के बफर के साथ नमूना 20 गुना तेजी से पतला करें, और आधारभूत प्रतिदीप्ति तक पहुंचने तक पृथक्करण की निगरानी करें (पूर्ण पृथक्करण) या जब तक एक पठार तक नहीं पहुंच जाता है (5 मिनट के भीतर प्रतिदीप्ति में कोई महत्वपूर्ण कमी नहीं)।
      नोट: एक नियंत्रण के रूप में, 10 μM ईडीटीए जोड़ें और 5 मिनट के लिए पूर्ण पृथक्करण की निगरानी करें।
  2. संतुलन बाध्यकारी प्रयोग
    नोट: संतृप्ति तक पहुंचने के लिए समय निर्धारित करने के लिए बाध्यकारी के गतिज वक्र का उपयोग करें; एफएक्स-एफडी और कृत्रिम पुटिकाओं के लिए संतृप्ति का समय 20 मिनट है।
    1. 20 मिनट के लिए टायरोड के बफर में एफएक्स-एफडी (0 से 1,000 एनएम तक) की विभिन्न सांद्रता के साथ बाध्यकारी परख के लिए कृत्रिम फॉस्फोलिपिड पुटिकाओं (5 μM) सेते हैं।
    2. टायरोड के बफर के साथ 200 μL की अंतिम मात्रा के लिए 20x द्वारा चरण 4.2.1 से प्रत्येक नमूने को पतला करें। तुरंत 30 एस के भीतर प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा पतला नमूना का विश्लेषण करें। चरण 4.1.3 से सेटिंग्स का उपयोग करें।
      नोट: निरर्थक बाध्यकारी के लिए एक नियंत्रण के रूप में, ईडीटीए (10 μM) के साथ समान नमूनों का उपयोग करें और उन्हें 5 मिनट के लिए सेते हैं।

5. प्रवाह साइटोमेट्री डेटा का विश्लेषण

  1. डेटा विश्लेषण के लिए साइटोमीटर सॉफ्टवेयर के लिए साइटोमेट्री डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर से एफएससी प्रारूप में निर्यात प्रयोग ( सामग्री की तालिका देखें)। फ़ाइल | चुनें निर्यात | एफसीएस फाइलें। कंप्यूटर पर फ़ाइलों का चयन करके और उन्हें प्रोग्राम के कार्यक्षेत्र में खींचकर डेटा विश्लेषण के लिए साइटोमीटर सॉफ़्टवेयर में एफएससी फ़ाइलें खोलें।
  2. माइक्रोवेसिकल्स के गेटिंग के लिए, लिपोफिलिक डाई डीआईआईसी16 (3) के प्रतिदीप्ति द्वारा माइक्रोवेसिकल्स के क्षेत्र की पहचान करें। लॉग निर्देशांक में एफएल 2 (डाई दिलसी16 (3)) से डॉट प्लॉट एसएससी बनाने के लिए वर्कशीट में मेनू कमांड या प्लॉट बटन का उपयोग करें। एक गेटिंग क्षेत्र आकर्षित करने के लिए आयताकार गेट बटन चुनें ताकि पुटिकाओं के बिना एक नमूने से घटनाओं को इस क्षेत्र (चित्रा 1 बी, सी) में शामिल नहीं किया जा सके।
  3. गतिज प्रयोगों का विश्लेषण करें।
    1. पुटिकाओं के क्षेत्र के लिए समय के साथ प्रतिदीप्ति (एफएल 4) के निर्देशांक का उपयोग करके एक डॉट-प्लॉट बनाएं (चरण 5.2 में पुटिकाओं के क्षेत्र में डबल-क्लिक करें)
    2. सीएसवी प्रारूप में समय के साथ प्रतिदीप्ति में परिवर्तन पर डेटा निर्यात करें। नमूना | चुनें | राइट-क्लिक करें निर्यात | पैरामीटर में FL4 और समय चुनें | | सहेजने के लिए निर्देशिका का चयन करें सीएसवी प्रारूप | का चयन करें निर्यात करें।
    3. किसी भी सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर में सीएसवी फ़ाइल खोलें ( सामग्री की तालिका देखें)। प्रत्येक 1,000 घटनाओं के लिए प्रतिदीप्ति और समय के एक सरल चलती औसत की गणना करें।
    4. घातीय निर्भरता (फिटिंग >ऑनलाइनियर वक्र फिट) की धारणा के तहत समय पर सरल चलती औसत प्रतिदीप्ति की निर्भरता > एक ग्राफ का अनुमान लगाएं और इसका उपयोग समीकरण (5) का उपयोग करके गतिज एसोसिएशन स्थिरांक की गणना करने के लिए करें।
      Equation 5(5)
      जहां [एक्सबी] चरण 5.3.3 से सरल चलती औसत के अनुसार समय के प्रत्येक क्षण (उपयोगकर्ता-परिभाषित इकाइयों) पर बाध्य कारक एकाग्रता है; [एक्स] जोड़ा कारक एकाग्रता है; [एक्स] अधिकतम अधिकतम बाध्य कारक एकाग्रता है; क एसोसिएशन स्थिरांक है; टी समय है।
    5. समीकरण (6) का उपयोग करके गतिज पृथक्करण स्थिरांक की गणना करने के लिए क्रियाओं के समान सेट (5.3.1-5.3.4) को दोहराएं।
      Equation 6(6)
      जहां [एक्सबी] समय के प्रत्येक क्षण में बाध्य कारक एकाग्रता है; [एक्स] 0 समय के प्रारंभिक क्षण में बाध्य कारक एकाग्रता है; क पृथक्करण स्थिरांक है; टी समय है।
  4. संतुलन बाध्यकारी परख
    1. एफएक्स-एफडी की प्रत्येक चयनित एकाग्रता के लिए पुटिकाओं के क्षेत्र में एफएक्स-एफडी की औसत प्रतिदीप्ति निर्धारित करें।
    2. सरल एकल-साइट बाध्यकारी की धारणा में जोड़े गए कारक की एकाग्रता से बाध्य कारक प्रतिदीप्ति की निर्भरता का अनुमान लगाएं। कम से कम तीन स्वतंत्र दोहराव से समीकरण (7) का उपयोग करके औसत बाध्यकारी मापदंडों की गणना करें।
      Equation 7(7)
      जहां [एक्सबी] बाध्य कारक एकाग्रता है; [एक्स] जोड़ा कारक एकाग्रता है; एनएक्स प्रति पुटिका बाध्यकारी साइटों की स्पष्ट संख्या है; केडी स्पष्ट पृथक्करण स्थिरांक है।

6. बाध्यकारी साइटों की औसत संख्या के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता परिवर्तित करना

  1. कैलिब्रेटेड मोती तैयार करें।
    1. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिएसीएसीएल 2 (2.5 एमएम) की उपस्थिति में ए 23187 (10 μM) के साथ जेल-फ़िल्टर्ड प्लेटलेट्स (चरण 3.3 देखें) सेते हैं।
    2. सक्रिय प्लेटलेट्स में एफएक्स-एफडी (0 से 1,000 एनएम) की विभिन्न सांद्रता जोड़ें। 2% वी / वी फॉर्मलाडेहाइड जोड़ें और 1 घंटे के लिए सेते हैं। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 3 एम ग्लाइसिन और 5% बीएसए के साथ प्लेटलेट्स को इनक्यूबेट करके प्रतिक्रिया को रोकें।
    3. बिना प्रतिक्रिया वाले डाई से मिश्रण को शुद्ध करें। 400 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए प्लेटलेट्स अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला को हटा दें, और टायरोड के बफर (0.5% बीएसए युक्त) में गोली को फिर से निलंबित करें।
      नोट: चरण 6.1.3 तीन बार दोहराएँ।
  2. पहले स्पेक्ट्रोफ्लोरोमीटर ( सामग्री की तालिका से फ्लोरोसेंट डाई के लिए, उत्तेजना 633 एनएम, उत्सर्जन 670 एनएम) का उपयोग करके प्रत्येक नमूने में अंशांकन मोतियों के प्रतिदीप्ति स्तर को मापें और फिर प्रवाह साइटोमीटर (चैनल एफएल 4 में: उत्तेजना 633 एनएम, उत्सर्जन फिल्टर 660/20) का उपयोग करें। एक सेल काउंटर का उपयोग करके, प्रत्येक नमूने में मोतियों की संख्या निर्धारित करें।
  3. एक स्पेक्ट्रोफ्लोरोमीटर का उपयोग कर घुलनशील फ्लोरोसेंट डाई की एकाग्रता के लिए प्रत्येक संबंधित मनका नमूना की प्रतिदीप्ति तीव्रता परिवर्तित करें। इक्यू (8) का उपयोग करके फ्लोरोफोर अणुओं की संख्या के लिए फ्लोरोसेंट डाई एकाग्रता की पुनर्गणना करें।
    Equation 8(8)
    जहां एनएक्स फ्लोरोफोर अणुओं की संख्या है; सी फ्लोरोसेंट डाई एकाग्रता है; एनए एवोगाड्रो स्थिरांक है; एनए = 6.02214076×1023 मोल -1।
  4. किसी भी सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके प्रत्येक नमूने के लिए फ्लोरोफोर अणुओं की संख्या पर एक प्रवाह साइटोमीटर (चरण 6.2) में मोतियों के औसत प्रतिदीप्ति का निर्भरता ग्राफ बनाएं ( सामग्री की तालिका देखें)। रेखा आनुपातिकता द्वारा इस निर्भरता का अनुमान लगाएं (विश्लेषण | फिटिंग | रैखिक फिट)। समीकरण (9) में सन्निकटन से, बाध्यकारी साइटों के लिए माध्य प्रतिदीप्ति के रूपांतरण कारक की गणना करें।
    Equation 9(9)
    जहां एमएफ प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मोतियों का औसत प्रतिदीप्ति है; एनएक्स प्रति मनका फ्लोरोफोर अणुओं की संख्या है; सीएफ बाध्यकारी साइटों के लिए माध्य प्रतिदीप्ति के रूपांतरण कारक का प्रतिनिधित्व करता है। सीएफ और बी रैखिक आनुपातिकता द्वारा ग्राफ को फिट करने के परिणामों से प्राप्त होते हैं।
  5. इक्यू (10) का उपयोग करके ब्याज के पुटिका प्रति बाध्यकारी साइटों की स्पष्ट संख्या की गणना करें।
    Equation 10(10)
    जहां एनएक्स ब्याज के पुटिका प्रति बाध्यकारी साइटों की स्पष्ट संख्या है; एमएफ प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा ब्याज के पुटिकाओं का औसत प्रतिदीप्ति है; सीएफ और बी समीकरण (8) से रूपांतरण कारक हैं।

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Representative Results

यहां वर्णित प्रवाह साइटोमेट्री विधि का उपयोग सक्रिय प्लेटलेट्स के लिए प्लाज्मा जमावट प्रोटीन के बंधन को चिह्नित करने के लिए किया जाता है। इसके अलावा, फॉस्फोलिपिड पुटिकाओं पीएस: पीसी 20: 80 को मॉडल सिस्टम के रूप में लागू किया गया था। यह पेपर मुख्य रूप से एक उदाहरण के रूप में कृत्रिम फॉस्फोलिपिड पुटिकाओं पर केंद्रित है। साइटोमीटर के पैरामीटर, विशेष रूप से, फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब (पीएमटी) वोल्टेज और मुआवजे को प्रत्येक विशिष्ट डिवाइस, अध्ययन की वस्तु (कोशिकाओं, कृत्रिम या प्राकृतिक माइक्रोवेसिकल्स), और उपयोग किए जाने वाले रंगों के लिए चुना जाना चाहिए। चित्रा 1 बी, सी कृत्रिम फॉस्फोलिपिड पुटिकाओं को गेट करने का एक उदाहरण दिखाता है जो शामिल लिपोफिलिक फ्लोरोसेंट डाई डीआईआईसी 16 (3) के साथ आकार में ~ 1 μm हैं। बड़े पुटिका आकार और लिपोफिलिक फ्लोरोसेंट डाई ने साइटोमीटर का उपयोग करके पुटिकाओं का पता लगाने में मदद की। गेट एक ही आकार के कृत्रिम लिपिड पुटिकाओं युक्त एक नमूने के आधार पर सेट किया गया था, लेकिन फ्लोरोसेंट डाई (चित्रा 1 बी) के बिना। विश्लेषण में केवल इस गेट के अंदर की घटनाओं का उपयोग किया गया था।

पुटिकाओं के लिए प्रोटीन बाध्यकारी के कैनेटीक्स का विश्लेषण पहले चरण में किया गया था। इसके लिए नमूना चरण 4.1 में वर्णित के रूप में लगातार एकत्र किया गया था। एक विशिष्ट डॉट-प्लॉट चित्रा 1 डी-एफ में दिखाया गया है। प्राप्त आंकड़ों का विश्लेषण प्रवाह साइटोमेट्री सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया गया था। परिणामी वक्र चित्रा 1 जी में दिखाया गया है। ठोस रेखाएं सन्निकटन के घटता दिखाती हैं, जिसमें से एसोसिएशन (केऑन) और पृथक्करण (के ऑफ) के गतिज स्थिरांक प्राप्तकिए गए थे। जैसा कि कारक एक्स फॉस्फोलिपिड पुटिकाओं को प्रतिवर्ती और सीए2 +-निर्भर रूप से बांधता है, ईडीटीए वाले नमूनों ने इस बंधन की विशिष्टता और प्रतिवर्तीता को नियंत्रित किया। परिणामी स्थिरांक तालिका 1 में दिखाए गए हैं।

बाध्यकारी के कैनेटीक्स के आधार पर, बाध्यकारी में संतृप्ति का सटीक वर्णन करने के लिए आगे संतुलन प्रयोगों के लिए 20 मिनट का समय चुना गया था। कारक की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता बाद में पुटिकाओं के क्षेत्र में निर्धारित की गई थी। ईडीटीए की उपस्थिति और अनुपस्थिति में प्रत्येक नमूने का विश्लेषण किया गया था। ईडीटीए की उपस्थिति में प्रतिदीप्ति तीव्रता को पृष्ठभूमि के रूप में लिया गया था और कुल संकेत से घटाया गया था क्योंकि सीए2+ आयनों की अनुपस्थिति में झिल्ली के लिए एफएक्स के बंधन को निरर्थक माना जाता है। परिणामी प्रतिदीप्ति अंशांकन मोती का उपयोग कर पुटिका प्रति बाध्यकारी साइटों की संख्या में परिवर्तित हो गया था।

Figure 1
चित्रा 1: कृत्रिम फॉस्फोलिपिड पुटिकाओं के लिए एफएक्स का विशिष्ट बंधन। (ए) प्रयोग की योजना। (बी, सी) (बी) के बिना या (सी) लिपोफिलिक फ्लोरोसेंट डाई डीआईआईसी 16 (3) के साथ फॉस्फोलिपिड पुटिकाओं के विशिष्ट डॉट भूखंड। (डी-एफ) (डी) से पहले या बाद में (ई) 20 गुना कमजोर पड़ने और उपस्थिति ईडीटीए (एफ) में फॉस्फोलिपिड पुटिकाओं के साथ कारक एक्स इंटरैक्शन के विशिष्ट डॉट प्लॉट। (जी) फॉस्फोलिपिड पुटिकाओं के लिए एफएक्स (250 एनएम) बाध्यकारी और पृथक्करण के कैनेटीक्स। (एच) फॉस्फोलिपिड पुटिकाओं के लिए कारक एक्स की संतुलन बातचीत। परिणाम एन = 3 विभिन्न नमूनों के लिए ±एसडी के साधन हैं। संक्षिप्त नाम: एफएक्स = फैक्टर एक्स; पीएच पुटिकाएं = फॉस्फोलिपिड पुटिकाएं; एसएससी = साइड स्कैटर; एयू = मनमानी इकाई)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एसईएम (एनएम) ± स्पष्ट केडी ± एसईएमपर कश्मीर (μM-1 s-1) कश्मीरबंद ± एसईएम (एस -1) एसईएम ± पुटिका प्रति बाध्यकारी साइटों की स्पष्ट संख्या
400 ± 80 0.371 ± 0.012 0.019 ± 0.004 8,000 ± 800

तालिका 1: कृत्रिम फॉस्फोलिपिड पुटिकाओं के साथ एफएक्स इंटरैक्शन के पैरामीटर। पैरामीटर घटता से निर्धारित किए गए थे ( चित्रा 1 एफ, जी देखें)। परिणाम एन = 3 के लिए एसईएम ± माध्य हैं।

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Discussion

प्रस्तावित विधि को विभिन्न स्रोतों और रचनाओं से फॉस्फोलिपिड झिल्ली के साथ प्रोटीन की बातचीत के किसी न किसी लक्षण वर्णन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यहां वर्णित मात्रात्मक प्रवाह साइटोमेट्री कई मापदंडों में सतह प्लाज्मोन अनुनाद (एसपीआर) को स्वीकार करती है। विशेष रूप से, इसमें कम संवेदनशीलता और समय संकल्प होता है और प्रोटीन के फ्लोरोसेंट लेबलिंग की आवश्यकता होती है। फ्लोरोसेंट लेबलिंग से कई प्रोटीनों के लिए विरूपण और गतिविधि के नुकसान में परिवर्तन हो सकता है और इसलिए सावधानीपूर्वक नियंत्रण की आवश्यकता होती है। हालांकि, इस तकनीक के दूसरों पर महत्वपूर्ण फायदे हैं। यह विधि देशी कोशिका झिल्ली के साथ प्रोटीन की बातचीत का पता लगाने का अवसर प्रदान करती है, जिसे एसपीआर का उपयोग करके आसानी से लागू नहीं किया जाता है। इसके अलावा, दृष्टिकोण झिल्ली की सतह पर प्रोटीन बाध्यकारी साइटों की संख्या का अनुमान लगाने की अनुमति देता है और कुछ विश्लेषण कार्यों के लिए कुशल हो सकता है।

व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मोती बाध्यकारी साइटों की गिनती करने के लिए कुछ फ्लोरोसेंट रंगों के लिए उपलब्ध हैं। हालांकि, कई व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले रंगों के लिए ऐसे कोई मोती नहीं हैं। इसलिए, स्व-निर्मित मोती इसे हल करने का सबसे अच्छा तरीका है। अन्य सभी प्रयोगों के लिए इन मोतियों को तैयार करने के लिए एक ही कोशिकाओं का उपयोग किया गया था। हालांकि, चूंकि मोतियों को धोने के दौरान उच्च सेंट्रीफ्यूजेशन गति की आवश्यकता होती है, इसलिए फॉस्फोलिपिड पुटिकाओं का उपयोग नहीं किया जा सकता है। हालांकि, कोशिकाओं या पुटिकाओं को अमीनो-प्रतिक्रियाशील समूहों के साथ मोतियों के साथ बदला जा सकता है, जिन्हें चुने हुए डाई में संयुग्मित किया जा सकता है। क्रियाओं का अनुक्रम चरण 6.1 में वर्णित लोगों के समान होगा।

इस मात्रात्मक प्रवाह साइटोमेट्री विधि की सीमाएं प्रयुक्त साइटोमीटर की तकनीकी क्षमताओं से संबंधित हैं। प्रवाह साइटोमीटर के तीन अलग-अलग मॉडल (चर लेजर, डिटेक्टरों, पंपों के साथ) बिना किसी जटिलता के इस तकनीक को पुन: पेश करने के लिए लागू किए गए थे। हालांकि, उपयोग किए जाने वाले साइटोमीटर के लिए उपयुक्त फ्लोरोसेंट लेबल के चयन पर सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए क्योंकि लेजर, डिटेक्टर और ऑप्टिकल फिल्टर का सेट डिवाइस से डिवाइस में भिन्न होता है, यहां तक कि एक ही मॉडल के भीतर भी। एक विशिष्ट व्यास के सूक्ष्म कणों को मापने के लिए साइटोमीटर की क्षमता पर ध्यान केंद्रित करना आवश्यक है; सभी उपकरण 200 एनएम से नीचे के संकल्पों पर कणों का पता लगाने में समान रूप से सक्षम नहीं हैं (यह निर्धारित करने के लिए, उपकरण के निर्माता द्वारा आपूर्ति किए गए निश्चित आकार के अंशांकन मोतियों का उपयोग करें)। इसके अतिरिक्त, कुछ प्रवाह साइटोमीटर, जिन्हें सिरिंज पंप का उपयोग करके नमूना दिया जाता है, सिद्धांत रूप में निरंतर बाध्यकारी कैनेटीक्स को माप नहीं सकते हैं। इस मामले में, कैनेटीक्स को केवल बिंदु से बिंदु दर्ज किया जा सकता है, समय 4,6 में कुछ बिंदुओं पर माप के लिए अलग-अलग नमूने लेते हैं।

प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग विभिन्न कोशिकाओं पर एंटीजन की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए किया जाता है- एंटीजन की उपस्थिति / अनुपस्थिति और सेल आबादी का प्रतिशत इस एंटीजन को व्यक्त करना और व्यक्त नहीं करना। अतिरिक्त पृथक्करण प्रक्रियाओं के बिना समवर्ती रूप से मुक्त और बाध्य लिगेंड को भेदभाव करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री की क्षमता भी लिगैंड-बाध्यकारी गतिशीलता के मात्रात्मक मूल्यांकन का अवसर प्रदान करती है। यहां प्रस्तावित विधि कृत्रिम फॉस्फोलिपिड पुटिकाओं के लिए फ्लोरोसेंट लिगैंड के बंधन को मापने के लिए स्व-निर्मित अंशांकन मोतियों की तैयारी का वर्णन करती है। यह दृष्टिकोण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फ्लोरोफोरस की पसंद को सीमित नहीं करता है। इसके अलावा, गतिज डेटा के अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए यहां वर्णित तकनीक बेहतर समय रिज़ॉल्यूशन को सक्षम बनाती है। इस प्रकार, यहां वर्णित विधि का उपयोग प्रोटीन-झिल्ली इंटरैक्शन को चिह्नित करने में या माप सटीकता में सुधार के लिए अन्य तरीकों (उदाहरण के लिए, एसपीआर या माइक्रोस्कोपी) के साथ संयोजन में पहले चरण के रूप में अकेले किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों को रूसी विज्ञान फाउंडेशन अनुदान 20-74-00133 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A23187 Sigma Aldrich C7522-10MG
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific A37573 fluorescent dye
Apyrase from potatoes Sigma Aldrich A2230
BD FACSCantoII BD Bioscience
bovine serum albumin VWR Life Science AMRESCO Am-O332-0.1
Calcium chloride, anhydrous, powder, ≥97% Sigma Aldrich C4901-100G
Cary Eclipse Fluorescence Spectrometer Agilent
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich G7528-1KG
DiIC16(3) (1,1'-Dihexadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate) Thermo Fisher Scientific D384
DMSO Sigma Aldrich D8418
EDTA disodium salt VWR Life Science AMRESCO Am-O105B-0.1
FACSDiva BD Bioscience cytometry data acquisition software
FlowJo Tree Star cytometer software for data analysis
HEPES Sigma Aldrich H4034-500G
Human Factor X Enzyme research HFX 1010
Hydroxylamine hydrochloride Panreac 141914.1209
L-α-phosphatidylcholine (Brain, Porcine) Avanti Polar Lipids 840053P
L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) Avanti Polar Lipids 840032P
Magnesium chloride Sigma Aldrich M8266-100G
Mini-Extruder Avanti Polar Lipids 610020-1EA
OriginPro 8 SR4 v8.0951 OriginLab Corporation Statistical software
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, Biotechnology Grade VWR Life Science AMRESCO 97062-732
Potassium chloride Sigma Aldrich P9541-500G
Prostaglandin E1 Cayman Chemical 13010
Sephadex G25 GE Healthcare GE17-0033-01 gel filtration medium for protein purification
Sepharose CL-2B Sigma Aldrich CL2B300-500ML gel filtration medium for platelet purification
Sodium bicarbonate Corning 61-065-RO
Sodium chloride Sigma Aldrich S3014-500G
Sodium phosphate monobasic Sigma Aldrich S3139-250G
Spin collumns with membrane 0.2 µm Sartorius VS0171
Trisodium citrate dihydrate Sigma Aldrich S1804-1KG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoffman, M., Monroe, D. M. A cell-based model of hemostasis. Thrombosis and haemostasis. 85 (6), 958-965 (2001).
  2. Roberts, H. R., Hoffman, M., Monroe, D. M. A cell-based model of thrombin generation. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 32, Suppl 1 32-38 (2006).
  3. Panteleev, M. A., Dashkevich, N. M., Ataullakhanov, F. I. Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion. Thrombosis Research. 136 (4), 699-711 (2015).
  4. Podoplelova, N. A., et al. Hysteresis-like binding of coagulation factors X/Xa to procoagulant activated platelets and phospholipids results from multistep association and membrane-dependent multimerization. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1216-1227 (2016).
  5. Panteleev, M. A., Ananyeva, N. M., Greco, N. J., Ataullakhanov, F. I., Saenko, E. L. Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3 (11), 2545-2553 (2005).
  6. Kotova, Y., et al. Binding of coagulation factor XIII zymogen to activated platelet subpopulations: roles of integrin αIIbβ3 and fibrinogen. Thrombosis and Haemostasis. 119 (6), 906-915 (2019).
  7. Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry. Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (2002).
  8. Nolan, J. P., Shen, B., Park, M. S., Sklar, L. A. Kinetic analysis of human flap endonuclease-1 by flow cytometry. Biochemistry. 35 (36), 11668-11676 (1996).
  9. Sarvazyan, N. A., Lim, W. K., Neubig, R. R. Fluorescence analysis of receptor−G protein interactions in cell membranes. Biochemistry. 41 (42), 12858-12867 (2002).
  10. Sarvazyan, N. A., Neubig, R. R. Analysis of molecular assemblies by flow cytometry: determinants of Gi1 and by binding. Advances in Optical Biophysics. 3256, 122-131 (1998).
  11. De Franceschi, N., et al. ProLIF - Quantitative integrin protein-protein interactions and synergistic membrane effects on proteoliposomes. Journal of Cell Science. 132 (4), (2018).

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Podoplelova, N., Soloveva, P.,… More

Podoplelova, N., Soloveva, P., Garzon Dasgupta, A., Filkova, A., Panteleev, M. Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (182), e63459, doi:10.3791/63459 (2022).

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